Les biomarqueurs de l'arthrose

(1)

Les biomarqueurs de l’arthrose

Prof. Y Henrotin

Bone and Cartilage Research Unit University of Liège

Belgium

www.bcru.be

1

(2)

Normal cartilage: Structure &

composition

(3)

ACTE I : Usure liée au vieillissement

3 0 10 20 30 40 50 60 70 15-24 25-34 35-44 45-54 55-64 65+ Age (années) P ré va le n ce (%) Hommes Femmes

A 65 ans, 70% des sujets ont

des signes radiologiques d’arthrose

A 65 ans, 30% des sujets ont une arthrose invalidante

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ACTE II : Pathologie mécanique

Troubles axiaux Traumatismes Surcharge pondérale Activités sportives Microtraumatismes

(5)

MMP-3 ADAMTS4 ADAMTS5 AGG COL2 Catabolisme Anabolisme Catabolisme Anabolisme MMP-3 ADAMTS4 ADAMTS5 AGG COL2 Saine _Arthrose NO PGE2 IL-6 COX2 iNOS

Acte III: un déséquilibre métabolique

du chondrocyte

Inflammation Stress mécanique

(6)

Cartilage Subchondral bone Hypertrophy/mineralisation MMP-3 MMP-13 IL-6 VEGF VEGF Tidemark PGE2 IL-1, IL-6, TNFa NO Microcristaux Fragments Osteochondraux Inflammation MMPs IL-1, TNF-a, IL-6 PGE2, VEGF Synovial membrane + RANKL IL-6 Osteoclasts Osteoblasts RANKL + + ADAMTS-4,5 MMP-1,-3,13 Aggrecan Collagen II -IL-1b NF-kB + +

(7)

Acte IV: une maladie globale de

l’articulation

Muscle Atrophie Perte de force Perte du contrôle neuromusculair Ligaments Laxité Capsule Rétraction Ligament Hoffa/tendons Inflammation Membrane synoviale Inflammation Cartilage/ Menisques Degradaion Os sous-chondral Sclérose BML/œdème Microfractures

(8)

ACT V: Une maladie métabolique et

systémique

Matrix peptides Cytokines Prostanoids Oxidized lipids Chronic low-grade inflammation Metabolic syndrome -Hypertension -Type 2 diabetes -Dyslipidemia Adipokines Cytokines Sedentarity Chronic Mechanical stress Aging

(9)

Obésité Post-Traumatique

Inflammation Hypertrophique

Bone driven

ACTE VI: Une maladie, plusieurs

phénotypes

O

•Obesité •Métabolique syndrome

I

•Inflammatoire •Systémique •Locale

T

•Post-traumatique

H

•Hypertrophique •Bone driven

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Traitements non-chirurgicaux

Modified Clegg et al. Eur J Orthop Surg Traumatol, 2013

IA

Acétaminophène

Perte de poids, exercices physiques éducation, information

Limitations

Effets secondaires (Diabète) Contre-indications

Invasives-risque infection

HA: effets symptomatiques modérés GC: effets à court terme

Effets symptomatiques modérés Action lente mais rémanente Pas d’effets secondaires Lésions gastro-intestinales Insuffisance rénale

Thromboses et infarctus du myocarde Hépatotoxicité

Compliance faible

AASAL

(11)

Comment diagnostiquer l’arthrose?

La radiographie

(12)

Comment diagnostiquer l’arthrose?

L’examen clinique Douleur au mouvement Raideur Gonflement Craquements Déformation Déviations

(13)

Comment diagnostiquer l’arthrose?

La radiologie

Ostéophytes Pincement Sclérose Géodes

(14)

Comment diagnostiquer l’arthrose?

Les marqueurs biologiques

Génétique Sanguins RMN Radiographie

Trop tard Lymphe Sang urine rein Bone cartilage Synovium

(15)

Définition

Genomic/proteomic substances Imaging, Questionnaire, VAS RNA, DNA Metabolites Proteins

X-ray MRI Ultrasound Fragments

Peptides

Soluble or « wet » biomarkers « Dry » biomarkers

« Un biomarqueur est une caractéristique qui est

mesurée et évaluée de manière objective comme un indicateur des processus physiologiques,

pathologiques ou de la réponse à un traitement»

Biomarkers Definitions Working Group I. Biomarkers and surrogate endpoints: preferred definitions and conceptual framework. Clin Pharmacol Ther 2001; 69: 89-95.

(16)

Sources et Métabolisme

16 Fluide synovial Sang Urine Release Clearance Articulations saines Autres organes Fonction hépatique /rénale Synovite Nbre d’articulation Activité de la maladie

(17)

Arthrose: une maladie de

l’articulation

…Identifier les changements

métaboliques des différents tissus

Membrane synoviale inflammation Os sous-chondral Sclérose/BML Dégradation du cartilage Fibrillation/fissuration Minéralisation/vascularisation

(18)

Diagnostic: symptômes et

signes radiologiques!

Ostéophytes Pincement

Sclérose sous chondrale Déformation Géodes Douleur Raideur Gonflement Craquements Déformation Troubles axiaux Radiographie _Symptômes

Les symptômes et les signes radiologiques apparaissent trop tardivement!

(19)

Une phase silencieuse précède l’apparition des signes radiologiques

(D Patra & L Sandell, J Knee Surg, 2011)

Pre-OA

initiation Silentmolecular phase Pre-radiographic phase Radiographic Joint replacement Genetic

biomarkers Biochemicalbiomarkers MRIImaging X-ray imaging Joint death

Genetic

predisposition Cartilage and joint tissue metabolic changes Structural changes in bone , cartilage, and other soft tissues Structural changes in bone, JSN and pain End-stage disease

…Diagnostiquer la maladie avant l’apparition

(20)

Le développement des médicaments est long…trop long

Nothing new to offer at the

patients and the OA research community

(21)

Critères principaux

d’efficacité

 Action symptomatique (3 à 6 mois)

Douleur (EVA)

Statut-algofonctionnel (index Lequesne) Appréciation globale du patient

 Action structurelle (1 à 3 ans)

Radiographie standard Pincement minimal

(22)

Limites de la mesure du

pincement articulaire

 Mesure indirecte de cartilage.

 Ne mesure pas un processus

dynamique.

 Influencé par les lésions méniscales.  Peu sensible.

 Peu reproductible.

 Peu ou pas corrélé avec la douleur ou

(23)

En résumé…

 Améliorer notre compréhension de la maladie Diagnostiquer précocement de la maladie,

avant l’apparition des changements structuraux

Prédire l’apparition et la progression de la maladie Prédire la réponse à un traitement (Théranostic) Réduire la durée et les coûts des essais cliniques

(24)

Développement

Marqueur de substitution Qualification Validation Découverte Brain/OMICS Performances analytiques du test Pertinence clinique

(25)

THE PRESENT

28 identified biochemical makers1

(26)

OA Biomarkers

lymphatics Blood ~5 liters urines kidney Bone cartilage Synovium bone sPINP uCTX-I Cartilage sColl2-1 sFibulin3 sCOMP sYKL40 sC2C uCTX-II PIIANP CPII

Synovium & inflammation sColl2-1NO2 sPIIINP sHA sCRP ultrasensible Metalloproteases sMMP1(collagenase) sMMP3 (stromelysin Cytokines, MPO Agrec-1

(27)

Sont-ils spécifiques d’un tissu?

Cartilage Coll2-1, Coll2-1NO2, CPII, TIINE,

PIIANP, C2C, C1,2C, CTX-II, HA, KS, CS-846, COMP, YKL-40

Cartilage de croissance CTX-II, C1,2C

Os CTX-II, COMP, C1,2C, NTX-I,

CTX-I, PYD, DPD, OC

Ménisque COMP, HA, C1,2C

Tendon COMP,

Membrane synoviale COMP, HA, C1,2C, YKL-40,

(28)

Quel processus évaluent-ils?

Cartilage/dégradation Coll2-1, Coll2-1NO2, CTX-II, COMP, C2C, C1,2C, TIINE, KS, CS-846, YKL-40

Cartilage/Synthèse CPII, PIIANP

Ostéophytes CTX-II, COMP, HA

Synovite HA, Glc-Gal-PYD, PIIINP

Remodelage osseux CTX-II, NTX-1, CTX-I, PICP, PINP,

(29)

Pourquoi la recherche de biomarqueurs

s’est-elle focalisée sur le collagène de type II?  La protéine la plus abondante du cartilage  Spécifique du cartilage articulaire

 Représente seulement 1% des collagènes  La dégradation du collagène de type II est

une étape clé de la pathogénie de l’arthrose

(30)

Type II collagen biomarkers

Telopeptide epitopes Cleavage neopitopes Denaturation neoepitope Propeptide epitopes

(31)

van Spil W E et al. Ann Rheum Dis 2013;72:29-36

rather bone than cartilage metabolism

(32)

BIPEDS classification

Bauer et al. Osteoarthritis Cart 2006

• Biomarker associated with extent of severity of OA

Burden of disease

• Biomarker not yet meeting criteria for another category

Investigative

• Predicts incidence of progression of disease or likelihood of response to a treatment

Prognostic

• Indicative of treatment efficacy and for which the magnitude of the change is considered pertinent to the response.

Efficacy of treatment

• Dissociate diseased from non-diseased.

Diagnostic

• Identify adverse effects and provide means of safety.one

(33)

Quatre niveaux de qualification

Exploratory

biomarker

R&D tool

In vitro/preclinical evidence

No linked to clinical outcomes in humans Demonstration biomarker Adequate preclinical sensitivity/specificity

Linked with clinical outcomes No reproducibility demonstrated

Characterization biomarker Reproducibility linked to clinical outcome in more than one prospective human study

Used in decision making and dose finding Secondary/tertiary claims

Surrogate Biomarker

Substitute for a clinical end point

Requires agreement with regulatory authorities Used for drug registration

(34)

Niveau de qualification des

biomarqueurs

uCTX-II (?), MMP-3

sHA, sKS,s/u C2C,, sYKL-40, s/u NTX-I, uPYD

uDPD, sOC, MMP-13, sColl2-1NO2, Coll2-1

sCOMP, s/u C1,2C, uTIINE, sCPII, sPIIANP, sCS-846, s/uCTX-I

Surrogate

Characterization

Demonstration

Exploratory

(35)

COMMENT DÉVELOPPER UN

NOUVEAU BIOMARQUEUR?

(36)

Post-translational modifications

Post-Translational

Modifications _{Modified Protein}

Modified Protein Modified Protein Modified Protein Modified Protein Modified Protein Modified Protein Altered Physiological Function Disease Protein Aging Comorbidities i.e diabetes Inflammation

i.e oxidative stress

 Phosphorylation  Methionine Oxidation  Deamidation*  Glycosylation  Ubiquitination  Nitration*  Chlorination  …

(37)

Coll2-1NO2: a joint inflammation related biomarkers

Deberg et al. O&C 2008

Coll2-1 HRGYPGLDG NH2 Coll2-1NO₂ HRGY(NO2)PGLDG NO + O₂. ONOO-+

HEALTHY CARTILAGE DAMAGED CARTILAGE

COLL2-1NO₂

FIBRILLATION ZONE CELL CLUSTER ZONE

Cleavage site of MMP-1, MMP-8 and MMP-13 of type II Collagen molecule

(38)

38 CONT ROL OA RA 0 100 200 300 400 500 C o ll 2 -1 c o n c e n tr a ti o n , nM

COLL 2-1 IN OA AND RA

Serum levels

*** * CONT ROL OA RA 0 100 200 300 400 500 C o ll 2 -1 c o n c e n tr a ti o n , nM

Deberg M et al. New serum biochemical markers (Coll2-1 and Coll2-1NO2) for studying oxidative-related

(39)

39 CONT ROL OA RA 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 C o ll 2 -1 N O 2 c o n c e n tr a ti o n , n M

COLL 2-1NO

₂

IN OA AND RA

Serum levels

***

* ***

(40)

40 CONTROL OA RA 0.00 0.25 0.50 0.75 1.5 2.0 C o ll 2 -1 N O2 /C o ll 2 -1 , %

COLL 2-1 NO

₂

/ COLL 2-1 RATIO

Serum levels

* _**

(41)

41 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 10 20 30 r = 0.28 p = 0.03 Coll2-1NO2 concentration, nM CR P , mg /L 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 0 5 10 15 r = 0.23 p = 0.04 Coll2-1NO2concentration, nM CR P , mg /L 0 500 1000 1500 0 10 20 30 r = -0.21_{p > 0.05} Coll2-1 concentration, nM CR P , mg /L 0 100 200 300 400 0 5 10 15 r = -0.06 p > 0.05 Coll2-1 concentration, nM CR P , mg /L OA PATIENTS (n=67) RA PATIENTS (n=19) Coll2-1 Coll2-1 Coll2-1NO2 Coll2-1NO2

(42)

Página 8 de 32

Blanco FJ et al. Nature Rheumatology Review, 2010

Diagnosis: Coll2-1NO2 discriminates Mitochondrial Haplogroups

Haplogroups J

Lower probability to develop OA Lower X-ray OA severity

(43)

MM P-1 (x1 0) MM P-3 (x1 0) MM P-1 3 (x1 00) Col l2-1 Col l2-1 NO 2 (x1 000) Col l2 ra tio (x1 000) MPO C2C CPI I C2C :CPI I (x1 000) Cat hepsi n K (x10) HA YKL-4 0 CO MP (1/1 0) Haplogroup J Haplogroup H * * * * * * MM P-1 (x1 0) MM P-3 (x1 0) MM P-1 3 (x1 00) Col l2-1 Col l2-1 NO 2 (x1 000) Col l2 ra tio (x1 000) MPO C2C CPI I C2C :CPI I (x1 000) Cat hepsi n K (x10) HA YKL-4 0 CO MP (1/1 0) Haplogroup J Haplogroup H * * * * * * Figure 1 Rego-Perez I. et al ARD, 2010 *

Diagnosis: OA patients with haplogroup J have lower levels of Coll2-1NO2

Coll2 -1 Coll2 -1 N O2

(44)

BIOVISCO study: Study design

Open-label, observational prospective study

D-15

D1 _D7 D14

D30 D60 D90

HylanGF-20

sHA, 1, sColl2-1NO2, s C2C, sCOMP, sCS-846, sCPII, CTX-II,

Fib3-1, Fib3-2 Henrotin Y et al. Journal of Orthopaedic Research

(45)

BIOVISCO study

An open label observational prospective study

Conrozier et al, J Orthp Res, 2012; Henrotin et al, J Orthp Res,2013.

D1

(after the last injection)

90 days

(after the last injection)

p-Value D1 vs D90 sColl2-1 (nM) 140.34(882.44-285.32) 128.41 (85.6-241.34) 0.05* sColl2-1NO2 (nM) 0.400 (0.050-1.010) 0.370 (0.14-0.870) 0.025* uCTX-II (ng/nmolcreat) 392.7 (90.0-816.4) 306.0 (90-1123.9) 0.02* sPIICP (ng/ml) 817.9 (131.4-1848.6) 874.8.3 (326.4-1435.0) 0.41 sC2C (ng/ml) 223.6 (99.4-329) 209.5 (135.9-291.7) 0.11 sCOMP (U/L) 10.9 (6.0-20.2) 10.5 (6.0-20.0) 0.82 sCS846 (ng/ml) 99.8 (45.9-172.3) 102.2 (53.0-190) 0.38 sHA (ng/ml) 34.1 (15.4-211) 33.3 (9.5-230.1) 0.38

 45 patients with unilateral symptomatic tibiofemoral and/or patellofemoral OA  3-weekly intraarticular injection of hyalan G20 (Synvisc®)

(46)

Effets de HA sur les taux

sériques de Coll2-1

(47)

Effets de HA sur les taux

sériques de Coll2-1NO2

(48)

Coll2-1 a l’inclusion: un marqueur

de prédiction d’efficacité du

traitement

Critère réponse: diminution de la douleur à la marche J1 – J90 ≥ 50%

(49)

Conclusions

 Coll2-1 et Coll2-1NO2 marqueurs

d’efficacité du traitement par

viscosupplémentation (Hylan GF-20)

 Le taux basal sérique de Coll2-1 est

prédictif de la réponse au traitement

 La viscosupplementation avec l’ AH

diminue in vivo le catabolisme du collagène II

(50)

Proteomic research

Gharbi et al.Frontiers in physiolohy, 2011

www

.b

cru.b

(51)

Comment rechercher un nouveau

biomarqueur?

(52)

1. IDENTIFICATION: Analyses protéomiques B. Extraction bandes intérêts OA/N > 1.5 + Digestion trypsine

A. Séparation sur gel 10 OA, 5 Normaux C. Spectrométrie de masse + Identification SwissProt 10 arthrosiques 5 Normaux

(53)

Identification des protéines d’intérêt

Rapport d’abondance

OA/N

Nom de la protéine Signification statistique Valeur de p 4,1 b-actine P < 0,0001 2,2 a1-microglobuline/bikunin receptor P<0,001 2,2 Fibuline-3 (Fib3-1) P< 0,001 2,2 Apoptosis-inducing factor-2 Fibuline-3 (Fib3-2) P<0,001 2,0 Zn-a-2-glycoprotein precursor P<0,001

40 protéines avec un rapport OA/N > 1,5

(54)

• Rapport OA/N > 2

Littérature

• Identifiée dans le cartilage arthrosique • Associée à TIMP-3

• Inhibiteur de la différentiation hypertrophique des chondrocytes

• Inhibiteur de l’angiogenèse (néovascularisation)

(55)

3. Validation des

immunodosages

Fib3-1: TCQDINECETTNECR Fib3-2: CVCPVSNAMCR Deux antiséra: AS88: Fib3-1 AS94: Fib3-2 Immunodosage Immunohistochimie

(56)

Localisation de Fib3-1 and Fib3-2 par immunohistochimie Fib3-1 Fib3-2 Normal Arthrosique surface Arthrosique Zone profonde

(57)

Performances analytiques du dosage immunologique 0 200 400 600 800 1000 1200 20 40 60 80 100 0 Fib3-1 Fib3-2 FBLN BSA Fib3-1 Competitor concentration, pM B /B 0 , % 0 200 400 600 800 1000 1200 0 20 40 60 80 100 Fib3-1 Fib3-2 FBLN BSA Fib3-2 Competitor concentration, pM B /B 0 , % Fib3-1 Fib3-2 LIMIT OF DETECTION (pM) _5.2 _8.0 CVs INTRA-ASSAY (%) _{< 10} CVs INTER-ASSAY (%) _<11 LINEARITY (%) _85.8-104.0 _80.5-105.1 ANALYTICAL RECOVERY (%) _92.3-103.2 _101.3-112.4

(58)

• 236 sujets normaux

• 76 patients arthrose fémoro-tibiale → 54 femmes; 22 hommes

→ 67,3 +/- 12,5

→ 55 bilatérale, 21 unilatérale → Critères ACR

→ RX : K&L III & IV → BMI: 28,4 +/- 5,2

(59)

Les concentrations de Fib3-1 et Fib3-2 sont augmentées chez les arthrosiques

CT OA 0 50 100 150 200 250 300 350 *** F ib 3 -2 ( p M ) CT OA 0 25 50 75 100 125 150 *** F ib 3 -1 ( p M ) OA (n=76) CTRL (n=140)

Fib3-1 (median, 25%>75% range , pM) _{85.10, 60.7 > 99.5} _{54.63, 45.59 > 69.56} Fib3-2 (median, 25%>75% range , pM) _{191.4, 162.5 > 227.5} _{144.4, 128.7 > 157.7}

Fib3-1 est influencé par le sexe et l’âge Fib3-1 et Fib3-2 ne sont pas corrélés

(60)

Fib3-2: un marqueur diagnostic de l’arthrose du genou

Fib 3-2:ROC curve

0 ₂₀ ₄₀ ₆₀ ₈₀ 100 0 20 40 60 80 100 AUC = 0.846 100 - Specificity (%) S e n s it iv it y ( % )

Fib3-1: ROC curve

0 ₂₀ ₄₀ ₆₀ ₈₀ 100 0 20 40 60 80 100 AUC = 0.759 100% - Specificity% S e n s it iv it y ( % ) Sensibility Specificity Fib3-1 (cut-off: 71.1 pM) _78.5% _68.4% Fib3-2 (cut-off: 163.7 pM) _75.0% _86.4%

(61)

• Fib3-2 est un marqueur potentiel de

diagnostic de la gonarthrose:

- Exprimé au niveau des lésions du

cartilage (peu au niveau du cartilage sain) - Pas influencé par le sexe, l’âge et l’IMC - Bonne valeur diagnostic (bonne

sensibilité, bonne spécificité)

Conclusions

(62)

Back to the

future…..to transform

the dream in reality

What do we need?

(63)

Critical needs

 Reliable structural endpoints (MRI?

Scintigraphy? Ultrasound?)

 Prospective clinical trials designed for

biomarkers qualification and representative of the general population

 Therapies with structure/disease modifying

activities

 To develop biomarkers fit-to-purpose and for

(64)

Short-term Perspectives

 New biomakers « fit-for-purpose »

developped (proteomics, metabolomics)

 Combination of biomarkers in multiplex

tests

 Agregate score including clinical, imaging

(65)

OUR WEB SITE :

WWW.ARTIALIS.COM

(66)

Thank you for your attention !

Team

International collaborations:

F Blanco (La coruna, Spain) T Conrozier (CHU Lyon, France) V Kraus (Duke University, USA) L Punzi (University of Padova, Italy)

A Mobasheri (University of Notttingham, UK) J Monfort (Hospital del mare (Spain)

P Richette (Lariboisiere, France) J Runhaar (Erasmus MC, Rotterdam)

(67)

67

Liège:

a belgium city