Les allergies alimentaires : point de vue du biologiste

Les allergies alimentaires :

Point de vue du biologiste

Romy GADISSEUR

@ ABTL – HELMO 25/04/2013

Épidémiologie de l’allergie

• Allergie alimentaire = 2-6 % des enfants.

• Asthme allergique =

1ère maladie chronique chez l’enfant.

• 50% des eczémas de l’enfant = origine allergique à un aliment

• Train de vie occidentalisé.

– Théorie hygiéniste, aseptisation

– Strachan, 1989 : Changement de « style de vie »

– Vie sédentaire & Exposition aux allergènes domestiques. – Utilisation d’antibiotiques.

– Gamme de denrées alimentaires et introduction inappropriée

– Denrées issues de l’industrie agroalimentaire (aliments masqués, modifiés).

Allergies x 2 ces 15 dernières années dans les pays développés !!

Hautarzt. 2012 Apr;63(4):288-93.

Special aspects of food allergy in children Niggemann B.

Diagnostiquer l’allergie alimentaire.

Component – Resolved -Diagnostics

Standardisation des extraits allergéniques

ANAMNESE CLINIQUE

Allergie alimentaire

•

_{Réaction immunologique à un aliment que d’autres personnes}

supportent sans problème

•

_{Le plus souvent médiée par IgE}

•

Réaction reproductible

•

Réaction même à des petites quantités d’allergène

• La fréquence des allergies aux allergènes végétaux augmente avec l’âge, parallèlement à l’acquisition de la sensibilisation aux pollens.

Pathologies alimentaires

liées à la qualité de l’aliment

• Toxicité (aliment ou contaminant):

– aiguë – chronique

• Intolérances alimentaires:

– Déficit enzymatique

• Fausse allergies alimentaires:

– Apport excessif d’histamine – Aliment histamino-libérateur

– Activation des mastocytes non-spécifique

Additifs

 Centaines de produits.

 Effets irritants ou stimulants des cellules de l’allergie

 Leur usage doit être raisonnable en quantité pour ne pas en subir les désagréments.

 HS IgE médiée : ne causent que très rarement des allergies authentiques.  Tests d’activation cellulaires disponibles !

• Colorants:

– Tartrazine • Conservateurs:

– Benzoate de Na,

– Diphényle, nitrites, nitrate de Na – Sulfites, bisulfites, métabisulfites • Anti-oxydants: – Gallate de dodécyle, – Butyl-hydroxytoluène (BHT) – Butyl-hydroxyanizole (BHA) • Renforçateurs de goût: – Glutamate de Na

Différents types de réactions immunologiques

Hypersensibilités selon Gell & Coombs.

Piqûre d’insecte Non-atopique IgE médié HS I Atopique NON ALLERGIQUE Sans mécanisme immunologique Non IgE médié

EAACI 2001:

Révision de la Nomenclature des allergies

Reference: Position paper. A revised nomenclature for allergy. An EAACI position statement from the EAACI nomenclature task force, Allergy 2001: 56: 813-824.

Hypersensi

bilité

Composantes de l’hypersensibilité immédiate

• Mécanisme de l’Hypersensibilité de Type I

– Les mastocytes tissulaires et les basophiles du sang possèdent à leur surface cellulaire des récepteurs de haute affinité pour les IgE = FcεRI.

– Pour qu’un patient développe une réaction d’hypersensibilité immédiate, il doit avoir subi le phénomène de sensibilisation lors d’un premier contact avec l’allergène.

La phase de sensibilisation

• Premier contact avec l’allergène. • Le système immunitaire est activé.

1. L’exposition à l’allergène active les cellules B et provoque la différenciation de ces cellules en plasmocytes sécréteurs d’IgE spécifiques de l’allergène présenté. 2. La fraction constante de ces anticorps se lie avec une forte affinité aux

récepteurs du Fc

ε

1. De nombreuses molécules d’IgE de spécificités diverses peuvent se lier au récepteur du Fc de l’IgE.

3. Les mastocytes et les basophiles couverts d’IgE sont dits « sensibilisés ». • Cette phase est dite silencieuse car elle n’entraine pas de signe clinique.

• Exposition ultérieure au même allergène

– Liaisons croisées (pontage) entre les IgE fixés sur la membrane des mastocytes et des basophiles sensibilisés, ce qui provoque la dégranulation de ces cellules.

– Les médiateurs pharmacologiquement actifs libérés des granules agissent sur les tissus avoisinants.

• Principaux effets : vasodilatation et contraction des muscles lisses,

– Soit systémiques, soit localisés, selon la quantité de médiateurs libérée.

Le bilan allergologique

• Examen clinique... idéalement par un spécialiste en

allergologie

• Anamnèse basée sur l’histoire clinique : Primordiale !!

– Description des symptômes – Chronologie

 délai entre exposition/symptômes, caractère répétitif, perannuel

ou saison pollinique...

 Caractère post-prandial,

– étude de l’alimentation,

– Antécédents familiaux et personnels d’atopie.

• Tests in-vivo

Tests in-vivo

du bilan allergologique

• Tests in-vivo basés sur l’histoire clinique :

– Tests cutanés

– Tests cutanés réalistes (prick-to-prick) – Tests de provocation orale

 Gold standard = double-blind placebo-controlled food challenge

• Régimes d’épreuve ou régime d’éviction (= diagnostique et thérapeutique)

– L’amélioration des symptômes sous régime d’épreuve permet d’identifier les aliments à l’origine des symptômes et conforter le diagnostic.

Le bilan allergologique

• Test in-vitro basés sur l’histoire clinique et/ou sur les résultats des tests cutanés :

– Dosage des IgE totales :

 Peu d’intérêt

– Dosage d’IgE spécifiques, dosages unitaires :

1. Mixtures d’extraits globaux (exemples : fX5, mX1, tX6, wX3, gX2, eX1 ...)

 Si allergène responsable n’est pas identifié formellement, screening de départ

2. Extraits globaux (exemples : t3, g6, f13, d1, e1, w6, m3...)

 Malades avec Tests cutanés négatifs ou tous positifs, ou malades peu compliants.  Peu discriminants pour le pronostic voire même faux (histoire du latex)

3. Protéines recombinantes ou naturelles purifiées (t215, f423, d201, e94..)

 Si source allergénique définie, si étude approfondie nécessaire  Réactions croisées cliniques

 Pronostic (PFL-PR10-LTP-Prot stockage)

 Poser l’indication d’un TPO, d’une désensibilisation  Standardisation des résultats, Contrôles de qualité

– Dosage d’IgE spécifiques par technique Multiplex  Si allergie complexe, si réactions croisées

Tests in-vitro

Le dosage des IgE avec les recombinants

• Les extraits allergéniques utilisés ne permettent pas de définir à quelle protéine le patient est spécifiquement allergique.

• Seules certaines protéines des sources allergéniques se lient aux IgE et sont à l’origine des manifestations d’hypersensibilité de type 1.

• Toutes les protéines ne sont pas des allergènes ! • Progrès en biologie moléculaire :

• Synthèse des protéines recombinantes analogues aux protéines qui induisent une réaction allergique et qui leur ressemblent au niveau immunologique.

• Production effectuée avec une qualité constante et en quantité suffisante.

 La détermination des IgE spécifiques dirigées contre ces protéines permet de déterminer un profil réactionnel individualisé pour chaque patient.

Tests in-vitro

du bilan allergologique

3

Allergen source based diagnosis SD

Extrakt von Birkenpollen

Allergen Component based diagnosis CRD

rBet v 1 rBet v 2 rBet v 4

Allergen source based diagnosis SD

Extrakt von Birkenpollen

Allergen Component based diagnosis CRD

rBet v 1 rBet v 2 rBet v 4

Allergen source based diagnosis SD

Quantitative assesment

Major allergen Cross reacting minor allergen Birch Bet v 1 Bet v 2° Bet v 4 *

°Profilin

* CalciumCalcium--bindbind. Protein. Protein

Allergens of pollen

Nomenclature des allergènes selon l’IUIS

(International Union of Immunological Societies)

• t : tree • f : food • g : grass • i : insect • w : wheat • c : cure • d : dust mite • m : moisture • e : epithelia • p : parasite • k : (professional allergens)

• t3 : Betula verucosa Bet v 1,2,4,6,7

• f17 : Corylus avelana Cor a 1,…8,...11

• f1 : Bos domesticus Bos d 1, 2, 3, …6

• e1 : Felis domesticus Fel d 1, 2, 3, …

• f13 : Arachis hypogaea Ara h 1, 2, 3, …8, …

Nomenclature empirique « Nomenclature recombinants » (IUIS) Taxon genre

Nombre associé à l’ordre de purification de la protéine

Différents types de réactions croisées

• Réactions croisées entre espèces taxonomiquement proches :

– exemple : acariens (d1,d2), graminées (dactyle, phléole), oléacées (frêne, olivier), ombellifères (céleri, armoise)

• Réactions croisées entre espèces taxonomiquement éloignées.

– Exemple : pomme/bouleau, allergie orale chez 50% des allergiques au pollen de bouleau (PR10 : Bet v 1/Mal d 1)

– Ici, la relation botanique ne permet pas d’expliquer les RC !

 Explication par la structure des allergènes et leur fonction avec notion de famille moléculaire (rassemble des protéines provenant de divers allergènes et ayant la même fonction physiologique)

Syndrome d’ allergie orale

• Par exemple associé à l’allergie à la bouleau

•

_{pommes (Mal d 1)}

•

noisette (Cor a 1)

• À éviter selon tolérance

•

Complètement

•

_{Que épluché ou cuit}

• Protéine PR-10, Bet v 1 homologue

– Instable à la chaleur, aliment cuit toléré en général.

» Breiteneder H, Biotechnol Adv, 2005

– Associé à des symptômes locaux comme le Syndrome Oral Allergique.

– Associé aux réactions allergiques aux fruits et légumes au Nord de l’Europe. Mal d 1 Dau c 1 Pru p 1 Ara h 8 Cor a 1.01 Cor a 1.04 _{Api g 1} Gly m 4 Bet v 1 Pru ar 1 Pyr c 1 _{Pru av 1}

Oral Allergy Syndrome

(OAS)

• Syndrome d’Allergie Orale : Réaction

allergique, gêne au niveau de la bouche qui apparaît instantanément ou peu de temps après l’ingestion de l’aliment.

– Un chatouillement ou sensation de brûlure au niveau des lèvres, de la bouche et/ou du pharynx.

• Associé à la sensibilisation à une ou plusieurs protéine de type PR-10 càd homologue de Bet

v 1 (bouleau).

1 60 Birch MGVFNYETET TSVIPAARLF KAFILDGDNL FPKVAPQAIS SVENIEGNGG PGTIKKISFP Hazel MGVFNYETES TSVIPAARLF KAFILDGNNL IPKVAPQAVS SVENVEGNGG PGTIKKITFS Alder MGVFNYEAET PSVIPAARLF KAFILDGDKL LPKVAPEAVS SVENIEGNGG PGTIKKITFP Hornbeam MGVFNYEAET TSVIPAARLF KAFILDGNNL IPKVAPQAVS SVENVEGNGG PGTIKKITFS Beech MGVFTYESEN TSVIPPARLF KAFVLDADNL IPKVAPQSIK STETLEGDGG PGTIKKITFG Apple MGVFNYETET TSVIPAPRLF KAFILDGDNL IPKIAPQAIK STEIIEGDGG VGTIKKVTFG Cherry MGVFTYESEF TSEIPPPRLF KAFVLDADNL VPKIAPQAIK HSEILEGDGG PGTIKKITFG Apricot MGVFTYETEF TSVIPPEKLF KAFILDADNL IPKVAPTAVK GTEILEGDGG VGTIKKVTFG Pear MGLYTFENEF TSEIPPPRLF KAFVLDADNL IPKIAPQAIK HAEILEGNGG PGTIKKITFG Medicago MGVFNFEDET TSIVAPARLY KALVTDSDNL IPKVI.DAIQ SIEIVEGNGG AGTIKKLTFV Garden pea MGVFNVEDEI TSVVAPAILY KALVTDADNL TPKVI.DAIK SIEIVEGNGG AGTIKKLTFV Soybean MGVFTFEDEI NSPVAPATLY KALVTDADNV IPKAL.DSFK SVENVEGNGG PGTIKKITFL Tomato MGVNTYTYES TTTISPTRLF KALVLDFDNL VPKLLSQHVK NNETIEGDGG VGSIKQMNFV Celery MGVQKTVVEA PSTVSAEKMY QGFLLDMDTV FPKVLPQLIK SVEILEGDGG VGTVKLVHLG Carrot MGAQSHSLEI TSSVSAEKIF SGIVLDVDTV IPKAAPGAYK SVDV.KGDGG AGTVRIITLP Asparagus MSSSAVSHEI ESSVSAARLF KASMIEWHNL APKILPEIVS SASVVAVDGG VGSIRQINFT 120 Birch EGFPFKYVKD RVDEVDHTNF KYNYSVIEGG PIGDTLEKIS NEIKIVATPD GGSILKISNK Hazel EGSPFKYVKE RVEEVDHTNF KYSYTVIEGG PVGDKVEKIC NEIKIVAAPD GGSILKISNK Alder EGSPFKYVKE RVDEVDRVNF KYSFSVIEGG AVGDALEKVC NEIKIVAAPD GGSILKISNK Hornbeam EGSPVKYVKE RVEEVDHTNF KYSYTVIEGG PVGDKVEKIC NEIKIVAAPD GGSILKITSK Beech EGSQFKYVKH RIDEVDQANF SYGYSVIEGD VVSGIIEKIS YEIKIVASPD GGSLLKSTSK Apple EGSQYGYVKQ RVNGIDKDNF TYSYSMIEGD TLSDKLEKIT YETKLIASPD GGSIIKTTSH Cherry EGSQYGYVKH KIDSIDKENY SYSYTLIEGD ALGDTLEKIS YETKLVASPS GGSIIKSTSH Apricot EGSQYAYVKH RVDGIDKDNL SYSYTLIEGD ALSDVIENIA YDIKLVASPD GGSIVKTTSH Pear EGSQYGYVKH RVDSIDEASY SYAYTLIEGD ALTDTIEKIS YEAKLVASGS .GSTIKSISH Medicago EGGETKYDLH KVDLVDDVNF AYNYSIVGGG GLPDTVEKIS FESKLSAGPD GGSIAKLTVK Garden pea EDGETKHVLH KVELVDVANL AYNYSIVGGV GFPDTVEKIS FEAKLSAGPN GGSIAKLSVK Soybean EDGETKFVLH KIESIDEANL GYSYSVVGGA ALPDTAEKIT FDSKLVAGPN GGSAGKLTVK Tomato EGGPIKYLKH KIHVIDDKNL ETKYSLIEGD ILGEKLESIT YDIKFEANDN GGCVYKTTTE Celery EATEYTTMKQ KVDVIDKAGL AYTYTTIGGD ILVDVLESVV NEFVVVPT.D GGCIVKNTTI Carrot EGSPITSMTV RTDAVNKEAL TYDSTVIDGD ILLGFIESIE THLVVVPTAD GGSITKTTAI Asparagus SAMPFPYLKE RLDFVDEANF ECKSSLIEGG DLGTKLESAS SHFKLVPSSN GGCVVKLEGI 178 Birch YHTKGDHEVK AEQVKASKEM GETLLRAVES YLLAHSDAYN ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Hazel YHTKGDHEVD AEHIKGGKEK VEGLFRAVEA YLLAHSDAYN ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Alder FHTKGDHEIN AEQIKIEKEK AVGLLKAVES YLLAHSDAYN ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Hornbeam YHTKGDHEVP AEHIKGGKER VEGLLKPVEA YLLAHTAEYN N~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Beech YHIKGNHEIK EEEVKAGKEK AAGLFKAVEA YLLAHPDAYN ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Apple YHAKGDVEIK EEHVKAGKEK ASGLFKLLEA YLLAHSDAYN ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Cherry YHTKGNVEIK EEHVKAGKEK ASNLFKLIET YLKGHPDAYN ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Apricot YHTKGDVEIK EEQVKAGKEK AAGLFKLVEA YLLANPDAYN ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Pear YHTKGDIEIK EEHVKAGKEK AHGLFKLIES YLKDHPDAYN ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Medicago YFTKGDAAPS EEEIKGGKAR GDGLFKALEG YVLANPD.Y~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Garden pea YFTKGDAAPS EEQLKTDKAK GDGLFKALEG YCLAHPD.YN ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Soybean YETKGDAEPN QDELKTGKAK ADALFKAIEA YLLAHPD.YN ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Tomato YHTKGDHVVS EEEHNVGRRE NHEYFQGCRS IPSRESFCLR LNIDEKESGL HVRNYACT Celery YNTKGDAVLP EDKIKEATEK SALAFKAVEA YLLANLQFLA ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Carrot FHTKGDAVVP EENIKFADEQ NTALFKAIEA YLIAN~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Asparagus FKALPGVETT DEVAK.GKEM MTNAIKAAEA YLVANPTAYA ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~

o Noisette, 46% o Pomme, 39% o Pêche, 24% o Cerise, 22% o Noix, 21% o Poire, 20% o Amande, 19% o Prune, 17% o Noix du Brésil, 16% o Pomme de terre, 15% o Carotte, 13% o Arachide, 10% o Fraise, 10% o Orange, 9% o Abricot, 7% PR-10 rBet v 1 rPru p 1 rGly m 4 rAra h 8 rApi g 1.01 rAln g 1 rCor a 1 nAct d 8 rMal d 1 rDau c 1

• nsLTP (Protéines de transfert lipidique non spécifique)

– Protéines stables à la chaleur et à la digestion, causent donc aussi des allergies aux aliments cuits.

– Souvent associées à des réactions systémiques, réactions plus sévères qui suivent l’OAS.

– Les LTPs causent souvent des allergies alimentaires aux fruits en l’absence d’allergie pollinique.

– Souvent, associées aux réactions allergiques aux fruits et légumes au Sud de l’Europe. Cor a 8 Pru p 3 Ara h 9 Mal d 3 Zea m 14 Pru av 3

LTP

Prédire les réactions croisées

• Profiline

– Rarement associée à des symptômes cliniques mais réactions sévères pour une minorité de cas.

– Les profilines sont présentes dans une large variété de pollens (d’arbres, d’herbacées et de graminées) et d’aliments d’origine végétales.

– Il y a une grande homologie de structure entre les profilines des différents fruits et légumes. rMal d 4 rHev b 8 rPhl p 12 rBet v 2 rMer a 1 Ara h 5 Pru p 4

rCor a 2 rOle e 2 rPyr c 4

PFL

Profiline Bet v1/Pr-10 LTP Protéines de stockage

Non spécifique

Spécifique

Sévérité de la réaction

Prédire les réactions croisées

Risques de réaction sévère? Comment explorer? Recommendations Test : Risque • Ara h 1 (f422) •Ara h 3 (f424) •Ara h 9 (f427) •Ara h 8 (f352) •Ara h 5 Arachide (f13) : Pos Ara h 2 : Pos Très haut risque de réaction sévère

Prédire les réactions croisées

• Proteines de stockage

– Présente dans les graines, ressource matérielle lors de la

croissance de la plante.

–

Parfois, stable et résistante à la chaleur causant des

réactions aux aliments cuits.

rBer e 1 Ara h 1 Ara h 2 Ara h 3 Cor a 9 rSes i 3 nGly mβ-conglycinin nGly m glycinin

• 175 TPO arachide positifs et 30 TPO arachide négatifs (enfants, jeunes adultes, 1-26 ans) corrélés rétrospectivement avec des dosages d’IgE spécifiques f13 et les

composants Ara h 1, 2, 3, 8 et 9.

1. Le titre en IgE f13 et les composants est + importants en cas de TPO positif mais la simple présence d’IgE ne l’est pas (=> sensibilisation!)

2. Le titre en IgE Ara h2 est prédictif de l’issue du TPO arachide

3. Cut off : IgE Ara h 2 = 1,63 kU/L pour une spécificité de 100% et une sensibilité de 70%. IgE f13 = 2,6kU/L

4. Données comparables à une autre cohorte publiée (Pays-Bas)

patients TPO positif patients TPO négatif

• 34 enfants <1an avec dermatite atopique, dont 29 avec AA.

 12/20 : Profil de sensibilisation à Cor a 9, sans Cor a 1.  Parfois associé aux homologues de l’arachide/soja.

results to the three hazelnut components spotted on the microchip. Figure 2 displays the correla-tion between sIgE to Cor a 9 on the microarray and sIgE hazelnut by traditional ImmunoCAP. From this figure, it emerges that sIgE to Cor a 9 is highly related to sIgE hazelnut (r = 0.88, p < 0.001). Except for one, all Cor a 9-positive sera spotted on the microarray, had a sIgE to hazelnut exceeding 5.5 kUA/l, whereas all sIgE to hazelnut for the Cor a 9-negative sera were < 2.0 kUA/l. To confirm the Cor a 9 microarray data, sera were also analyzed by a singleplexed ImmunoCAP assay coated with the samenCor a 9 component as used in the microarray. This comparative analysis demonstrated a high corre-lation (r = 0.91, p < 0.001).

Next to nCor a9, themicroarray containsthree other 11S legumin-like seed-storage proteins, i.e., nAra h 3 from peanut (Arachis hypogea), nGly m 6 from soy (Glycin max), and rAna o 2 from cashew (Anacardium occidentale). Figure 1 dis-plays the percentages of positive results for these different components. Sensitization to these leg-umin-like proteins was restricted to the infants sensitized to nCor a 9, except for one infant with a sensitization to nAra h 3 but not to nCor a 9. Actually, half of thepatients sensitized to nCor a 9demonstrated IgE reactivity to nArah 3. Fiveof these six nAra h 3-sensitized infants also demon-strated a positive sIgE result to nGly m 6 from soy. Only one nCor a 9-sensitized infant showed IgE reactivity to rAna o 2.

Table 1. Individual data of IgEsensitization byImmunoCAP to potential cross-reactive plant derived food allergens

Peanut (f13) Soy (f14) Wheat (f4) Potato (f35) Infants with hazelnut sensitization

pt 1 22.1 21.4 63.4 24.3 pt 2 14.6 6.75 100 13.7 pt 3 96.3 8.1 9.18 10.1 pt 4 >100 23.8 4.33 0.36 pt 5 3.13 <0.35 1.99 28.3 pt 6 0.41 <0.35 NA NA pt 7 1.61 0.47 9.63 NA pt 8 2.66 0.47 26.1 NA pt 9 8.07 3.73 1.21 4.2 pt 10 0.81 <0.35 <0.35 0.65 pt 11 1.66 <0.35 <0.35 3.18 pt 12 >100 2.38 <0.35 NA pt 13 13.1 <0.35 0.57 <0.35 pt 14 <0.35 <0.35 <0.35 <0.35 pt 15 <0.35 <0.35 2.01 15.2 pt 16 <0.35 <0.35 <0.35 0.48 pt 17 <0.35 NA NA NA pt 18 NA <0.35 <0.35 3.22 pt 19 0.35 NA 11.1 <0.35 pt 20 <0.35 1.91 3.63 21.6 Infants without hazelnut sensitization

pt 21 <0.35 <0.35 0.36 <0.35 pt 22 NA <0.35 <0.35 0.85 pt 23 <0.35 <0.35 <0.35 2.00 pt 24 <0.35 <0.35 <0.35 0.44 pt 25 <0.35 <0.35 1.64 0.85 pt 26 <0.35 <0.35 NA NA pt 27 <0.35 <0.35 <0.35 0.75 pt 28 <0.35 <0.35 <0.35 1.29 pt 29 <0.35 <0.35 <0.35 <0.35 Specific IgE results are expressed in kUA/l.

Pt, Patients; NA, not available.

Fig. 1. Percentages of positive sIgE results by ISAC microarray for infants with (red) or without (blue) hazelnut sensitization and infants without any food sensitization (green). CCD, cross-reactive carbohydrate determinants; Bet v 2, birch profilin.

Sensitization to Cor a 9 from hazelnut (Corylus avellana)

• 65 patients avec allergie immédiate à la noisette crue ou cuite.

• 6 groupes selon degré de sévérité + 34 patients contrôles allergiques au pollen de bouleau et toérants à la noisette crue + des contrôles non allergiques.

• Profil moléculaire avec l’ImmunoCAP ISAC

1. La présence d’IgE Cor a 9 ou Cor a 8 est restreinte à un tableau clinique sévère (R.systémique)

2. Le profil « protéine de stockage » est plus fréquent chez l’enfant alors que le profil LTP est plus fréquent chez l’adulte.

3. Dans cette série, aucune sensibilisation à Cor a 9 asymptomatique !

Biosciences). Flow cytometric analysis of basophil activation was performed. Side scatter, CD123+ _{, and HL A-DR}) _were

used to gate out the basophils. Subsequently, within this gate, the percentage of activated basophils, i.e., co-expressing CD63, was measured. Results were expressed as percentages of CD63+ _{basophils after subtraction of the negative control.}

Statistical analysis

Results were expressed as median (range). Non-parametric tests were used where appropriate. IBM SPSS 17 (IBM , Chicago, IL, USA) software was used for data analysis. Chi-squared analysis was performed to compare frequencies. A p value of < 0.05 was regarded as statistically significant. Results

Demographics and clinics

Table 1 displays the results of all 103 purified and recombi-nant components spotted on the microarray. Demographics and results (median and range) of total IgE and singleplexed sIgE to hazelnut and birch pollen of patients and control

individuals are summarized in Table 2. Twenty-nine patients in our cohort suffered from a systemic reaction [17 preschool children (median age of 2 years), six school children, and six adults] and 36 patients reported an oral allergy syndrome (three preschool children, nine school children, and 24 adults).

Sensitization to hazelnut components

The percentages of sensitization to the different purified and recombinant hazelnut components (rCor a 1.04, rCor a 8, and nCor a 9) and rBet v 1 from birch pollen are displayed in Fig. 1.

The major observation is that in our birch-endemic region, 65% of preschool children and 50% of the school children with systemic reactions on ingestion of processed hazelnut (chocolate or chocolate spread) are sensitized to Cor a 9. In hazelnut allergic adults with systemic reactions, sensitization to Cor a 9 was demonstrable in 17%. The clinical data and sensitization profiles of the Cor a 9 sensitized patients are dis-played in Table 3. All our patients sensitized to Cor a 9 reported systemic reactions on ingestion of hazelnut in its

Figure 1 The percentages of sensitization to the three different hazelnut components (nCor a 9, rCor a 8, and rCor a 1.04) and rBet v 1 from birch pollen spotted on the microarray, in healthy control individuals, patients with systemic reaction on consumption of hazelnut (Hazelnut+, SR+), hazelnut allergic patients with merely an

oral allergy syndrome (Hazelnut+, OAS+), and patients tolerant to hazelnut but allergic to birch pollen (Hazelnut) , Birch pollen+). These groups were divided into three different age categories. For exact numbers, see Table 2.

Hazelnut allergy: sensitization profiles De Knop et al.

suite...

1. La présence d’IgE contre Cor a 1 entre dans le cadre du profil PR-10 (Bet v 1-like).

1. Le profil PR-10 varie peu avec l’âge.

2. Le profil PR-10 ne renseigne pas sur le degré de gravité d’allergie à la noisette  Même reflet pour les autres AA ??

Biosciences). Flow cytometric analysis of basophil activation was performed. Side scatter, CD123+ _{, and HLA-DR}) _were

used to gate out the basophils. Subsequently, within this gate, the percentage of activated basophils, i.e., co-expressing CD63, was measured. Results were expressed as percentages of CD63+ basophils after subtraction of the negative control.

Statistical analysis

Results were expressed as median (range). Non-parametric tests were used where appropriate. IBM SPSS 17 (IBM , Chicago, IL, USA) software was used for data analysis. Chi-squared analysis was performed to compare frequencies. A p value of < 0.05 was regarded as statistically significant. Results

Demographics and clinics

Table 1 displays the results of all 103 purified and recombi-nant components spotted on the microarray. Demographics and results (median and range) of total IgE and singleplexed sIgE to hazelnut and birch pollen of patients and control

individuals are summarized in Table 2. Twenty-nine patients in our cohort suffered from a systemic reaction [17 preschool children (median age of 2 years), six school children, and six adults] and 36 patients reported an oral allergy syndrome (three preschool children, nine school children, and 24 adults).

Sensitization to hazelnut components

The percentages of sensitization to the different purified and recombinant hazelnut components (rCor a 1.04, rCor a 8, and nCor a 9) and rBet v 1 from birch pollen are displayed in Fig. 1.

The major observation is that in our birch-endemic region, 65% of preschool children and 50% of the school children with systemic reactions on ingestion of processed hazelnut (chocolate or chocolate spread) are sensitized to Cor a 9. In hazelnut allergic adults with systemic reactions, sensitization to Cor a 9 was demonstrable in 17%. The clinical data and sensitization profiles of the Cor a 9 sensitized patients are dis-played in Table 3. All our patients sensitized to Cor a 9 reported systemic reactions on ingestion of hazelnut in its

Figure 1 The percentages of sensitization to the three different hazelnut components (nCor a 9, rCor a 8, and rCor a 1.04) and rBet v 1 from birch pollen spotted on the microarray, in healthy control individuals, patients with systemic reaction on consumption of hazelnut (Hazelnut+, SR+), hazelnut allergic patients with merely an

oral allergy syndrome (Hazelnut+, OAS+), and patients tolerant to hazelnut but allergic to birch pollen (Hazelnut) , Birch pollen+). These groups were divided into three different age categories. For exact numbers, see Table 2.

Hazelnut allergy: sensitization profiles De Knop et al.

Poisson

• Souvent des quantités minimes provoquent une

réaction grave (odeur)

• Pas de différence entre poissons d’eau douce/mer

• Allergènes détruits partiellement par l’acidité de

l’estomac (IPP)

Untersmayr E, Poulsen LK, Platzer MH, Pedersen MH, Boltz-Nitulescu G, Stahl Skov P, Jensen- Jarolim E. The effects of gastric digestion on codfish allergenicity. J Allergy Clin Immunol 2005; 115: 377-82

Parvalbumine

– Allergène majeur chez les poissons.

– Marqueur de réaction croisée entre les différentes espèces de

poisson/amphibien.

– Protéine extrêmement stable à la chaleur et à la digestion

=> réactions même à l’aliment cuit !

Responsable de 95% des allergies au poisson.

CARP rCyp c 1

Parvalbumin

rCyp c 1 rGad c 1

COD rGad c1

Diagnostic différentiel

=> Intoxication au poisson

• Quelques poissons (hareng, maquereau) se dégradent

en produisant de l’histamine

• Réaction en quelques minutes :

– Vomissements

– Urticaire

– Tachycardie

– Dyspnée

Taylor SL, Stratton JE, Nordlee JA, Histamine poisoning (scombroid fish poisoning): an allergy-like intoxication. J Toxicol Clin Toxicol. 1989;27(4-5):225-40.

• Tropomyosine

– Actin-binding protein des fibres musculaires

– Allergène majeur des invertébrés comestibles, allergène mineur des acariens.

– Marqueur de réactions croisées entre les crustacés, les acariens et les blattes. rPen a 1 nPen i 1 nPen m 1 nBla g 7 rAni s 3 rDer p 10 Crab cha f 1 Hom a 1

Prédire les réactions croisées

Disponibles n Pen m 1 rDer p 10 nBla g 7 rAni s 3 rPen a 1 n Pen i 1

•

CCD, MUXF3 (cross-reacting carbohydrate determinants) :

– Marqueur de sensibilisation aux déterminants carbohydrates (Glyco-épitopes).

– Présents dans la majorité des plantes et dans le venin d’hyménoptères

– Mise en évidence d’IgEs dirigés contre des glycans :

 Causent des profils de sensibilisations croisées larges parmi les extraits allergéniques

– Responsables de réactions croisées in-vitro.

 effets « in-vivo » ?

– Rarement associé à des symptômes cliniques…

– A confronter aux informations cliniques et aux SPT…

Prédire les réactions croisées

Disponibles

MUXF3 o214 Bromelin

Recrutement de 24 patients avec histoire d’urticaire, angioedème ou anaphylaxie 3-6h après ingestion de viande

24/24 patients IgE alpha-GAL + et IgE viandes + Tests cutanés aux viandes fraîches positifs Délais ++

Exprimé à la surface des cellules et des tissus des mammifères non-primates Sensibilisation via infestation parasitaire? allergie au chat?

Soja

• Gly m1, Gly m2

• asthme en déchargeant des containers de soya

• Gly m3 (Profiline) ?

• Gly m4

• réaction croisée avec bet v1

• la plupart des sensibilisations

• réaction sévère possible

• Gly m5, Gly m6

• réaction sévère

_{Goldstandard:}

Noisette

• Cor a 1 (Bet v1)

 réaction croisée

• Cor a 8 (LTP)

  réaction sévère

Goldstandard:

Anaphylaxie au froment

• Tri a 19 / Omega 5 Gliadine

• Effort

• Confirmation du diagnostic

avec provocation + effort

Int Arch Allergy Immunol. 2012;158(1):71-6. Epub 2011 Dec 29.

Clinical Utility of IgE Antibodies to ω-5 Gliadin in the Diagnosis of Wheat Allergy: A Pediatric Multicenter Challenge Study.

Allergies & Sensibilisations

• Test d’allergie positif

 on parle de sensibilisation...

 Cliniquement réaction allergique à cet allergène

 allergie !!

•

2,5% des enfants

•

_{De l’urticaire, dermatite atopique, trouble GI, à l’anaphylaxie.}

•

_{Blanc d’œuf (f1)}

•

_{IgEs Ovomucoïde/Gal d1 positif}

– Souvent l’œuf n’est toléré ni cuit, ni cru

•

IgEs Ovomucoïde négatif

– Souvent l’œuf cuit est supporté

Goldstandard:

provocation par étapes

 L’absence d’IgE pour l’ovomucoide

témoigne d’une tolérance pour l’oeuf cuit.

 La présence d’IgE pour l’ovomucoide est corrélée à une forte probabilité d’allergie à l’oeuf persistante

Standard ImmunoCAP®, UniCAP

SINGLEPLEX

Une détermination = Un résultat Test unique contre 1 seul extrait Allergènique ou un seul composant

Dosage des IgE spécifiques

Dosage des IgE spécifiques

Concept : Singleplex versus Multiplex

Concept : Singleplex versus Multiplex

Bouleau

ImmunoCAP ISAC®

MULTIPLEX

Une détermination = + de 100 résultats ~ 112 composants

> 40 sources allergéniques

ImmunoCAP, UniCAP SINGLEPLEX + + + + + + + + + + ImmunoCAP, ISAC MULTIPLEX

ImmunoCAP, UniCAP •Echelle macroscopique (μg allergène/CAP) •CV < 15%

•Résultat fourni par méthode quantitative •Méthode automatisée

•40 μL de sérum / test + 150μL volume mort ! •Haute capacité totale de fixation •Peu de fixation non-spécifique

•Haute sensibilité => de très faibles quantités d’IgE peuvent être identifiées.

ImmunoCAP ISAC

•Echelle microscopique (100 picog. allergène/spot et >100 allergène/cm2)

•CV < 25% au-delà de 1 ISU •Résultat Semi-quantitatif •Méthode manuelle

•30μL de sérum = >112 résultats •Haute capacité totale de fixation •Peu de fixation non-spécifique •Bonne sensibilité

•Haute spécificité

•Fournit le profil de sensibilisation du patient

Diagnostic in-vitro des allergies

• Une bonne anamnèse clinique & les tests de diagnostic in-vivo permettent, en général, de diagnostiquer une allergie et de débuter un traitement.

 Néanmoins, les Tests in-vitro sont très souvent

nécessaires !

– Dosages d’IgE totaux – Dosage d’IgE spécifiques

 Mixtures d’extraits allergéniques  Extraits allergéniques

 Protéines recombinantes

ou naturelles purifiées

• Limitation lors de la prescription, INAMI : maximum 6 allergènes remboursés / prise de sang

– Chaque allergène supplémentaire est facturé à 8€04

– Mixture, extrait, composant => Même prix, même limitation !

• Une même source allergénique = parfois 5 composants à tester...multiplication des tests

Nouvel outil pour l’avenir

• Microarray

• Données cliniques (tolérance, allergie)

• Combinaison avec l’informatique

 Remplacement de la provocation ?

• Lin, Bruni, Fu, Maloney, Bardina, Boner et al. A bioinformatics approach to identify patients with symptomatic peanut allergy using peptide microarray immunoassay, J Allergy Clin Immunol. 2012 Mar 23

Microarray, Multiplex

ImmunoCAP ISAC

• Technique innovante, outil supplémentaire pour

le diagnostic in-vitro, basé exclusivement sur les composants allergéniques.

– Plateforme miniaturisée d’immunoessais

– Mesure des IgEs dirigés contre +/-50 sources

allergéniques communes, en un seul dosage.

– 112 allergènes natifs et recombinants.

 Allergènes choisis en fonction de leur pertinence

dans l’établissement d’un profil de sensibilisation.

– Tests sur 30 μL de sérum ou sang total.

– Permet de déterminer des profils de sensibilisation

+/-

+/- 20

Pollens : Cyn d 1, Phl p 1, Phl p 2, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6 et Ole e 1

Bet v 1 homologues (PR-10):

Bet v 1, Aln g 1, Cor a 1, Mal d 1, Pru p 1, Gly m 4, Ara h 8, Api g 1

Profilines :

Bet v 2, Ole e 2, Hev b 8, Mer a 1, Phl p 12

Marqueurs d’espèce : Gal d 1, Bos d

lactoferrine, Fel d 1, Fel d 4, Can f 1, Mus m 1, Alt a 1

Tropomyosine : Der p 10 Der p 1, Der f 1, Der f 2, Der p 2, Eur m 2

B. Julien (18 ans)

Grâce au CRD, nous trouvons des explications :

Nombreuses allergies alimentaires dues à la sensibilisation aux profilines, protéines PR-10 (OAS), tropomyosine (fruit de mer), lait de vache…

Nombreuses graminées, acariens, animaux domestiques… qui expliquent la rhinite perannuelle exacerbée durant le période pollinique.

Les désensibilisations

Intérêts des allergènes recombinants

• Pollen de bouleau : différents allergènes.

– rBet v 1 (t215) : majeur, PR10, OAS, reconnu par 95% des allergiques au bouleau.

– rBet v 2 (t216) : mineur, profiline.

– rBet v 4 (t220) : mineur, CaBP.

• rBet v 1 !!

– Immunothérapie spécifique plus efficace si monosensibilisé au bouleau.

R. Valenta, Diagnostic tests based on recombinant allergens:Assistants for the selection of allergy therapies -New horizons- 2002,vol1

Les désensibilisations

Intérêts des allergènes recombinants

• 746 patients en cours de désensibilisation (bouleau ou graminées), recul de 2 années.

Evolution du laboratoire

•

Dosage des IgG4 (désensibilisation).

•

_{Dosage des IgE spécifiques pour les allergènes recombinants}

ou naturels purifiés.

•

_{Dosage des tryptases.}

•

Western-blot (IgE et IgG4).

•

Cytométrie de flux

• Test d’activation des basophiles

Intérêt du dosage des IgG4

•

Augmentation observée lors de l’immunothérapie spécifique.

Aalberse RC, J Immunol 1983

•

Compétition avec les IgE :

• Pontent les récepteurs FcεRI (haute affinité pour les IgE) et FcγRIIb (faible affinité pour les IgG)

• Inhibent la transduction du récepteur FcεRI qui amène à la libération des médiateurs. Gehlahr K, J Clin Exp Allergy 1999

•

Les apiculteurs :

• Ne développent pas de manifestations cliniques après plusieurs piqûres

• Possèdent un taux élevé d’IgG4. Aalberse RC, J Immunol 1983

•

_{Des enfants exposés de manière intensive aux poils de chat ont}

augmenté leurs IgG4

• Absence de réaction pathologique au contact des chats.

Le dosage des tryptases

•

_{Sérine endoprotéases tétramériques.}

•

_{Existent sous 3 formes: α, pro-β et β.}

o La β-tryptase

o Seule forme active, stockée dans les granules des mastocytes et n’est libérée qu’en cas de dégranulation extensive.

•

Un taux sérique élevé de tryptase est observé en cas de réaction

anaphylactique sévère

Kucharewicz I, J Investig Allergol Clin Immunol. 2007

•

_{Un taux élevé de tryptases doit être considéré comme un facteur}

de risque de présenter une réaction anaphylactique grave à une

piqûre d’insecte

ImmunoCAP Tryptase

• Timing pour la collecte d’échantillons :

– 1er échantillon : dans l’intervalle

30min-3h après l’apparition des symptômes.

– 2nd échantillon : après 24-48h, afin de

confirmer le retour au taux basal.

– 3ème échantillon : après 1-2 semaines si

Le test d’activation des basophiles – BAT

-• Cytométrie en flux

• Reproduit «in-vitro» le déclenchement de la réaction d’hypersensibilité en mettant directement en contact la cellule avec les allergènes incriminés.

• Dans le diagnostic d’une allergie de type immédiat, les BAT sont un complément au dosage des IgEs.

 Conditions de l’activation du basophile « in-vitro »

– Maintenir les cellules vivantes.

– L’activation « in-vitro » se fait avec des basophiles ayant toujours un métabolisme actif.

– L’allergène doit posséder au moins deux épitopes distincts ce qui permettra un pontage entre deux molécules d’IgE fixées sur les FcεRI.

Evaluation de l’activation des basophiles

• Les anticorps monoclonaux couplés à un fluorochrome sont utilisés pour détecter leur présence sur la membrane cytoplasmique.

• Elle repose habituellement sur l’utilisation d’anticorps monoclonaux anti-CD63 conjugués à un fluorochrome ou anti-CD203c.

• Anticorps CD203c

– Dans les astrocytes, hépatocytes, prostate, utérus et colon ainsi que sur les

basophiles, les mastocytes et leurs progéniteurs, mais pas sur les autres cellules hématopoïétiques.

– Le CD203c est présent à l’état basal ; son expression membranaire augmente

de façon dose-dépendante suite à l’activation de ces cellules par les IgE.

• D’autres marqueurs (anti-IgE, anti-FcERI) sont utilisés conjointement pour permettre une bonne identification des basophiles.

Evaluation de l’activation des basophiles

• Anticorps CD63 (1er utilisé pour explorer l’activation des basophiles)

– Composants des membranes endosomales et lysosomales.

– Au niveau des cellules avec granules sécrétoires (PN neutrophiles, éosinophiles, basophiles, plaquettes), cellules dendritiques et endothéliales.

– A l’état basal, le CD63 est présent au niveau de la membrane des granulations basophiles. – Si activation du basophile : libération du contenu des granulations basophiles par

• 87 patients (8mois-15ans) présentant AA. BAT, TC, IgE et TPO. • BAT CD63 : VPP (0,95) et VPN (0,77).

• Arbre décisionnel permettrait de réduire de 2/3 les TPO nécessaires.

• La cytométrie en flux a démontré, de façon générale, et pour une gamme étendue d’allergènes, sa grande spécificité (supérieure à 80 % et fréquemment supérieure à 90 %), supérieure à celle des IgE spécifiques, qu’il s’agisse du CD63 ou du CD203c.

• Pour Ocmant et al., la sensibilité et la spécificité sont respectivement, 86 et 94 % pour l’arachide, 90 et 100 % pour l’ovalbumine. De plus, les BAT se négativent chez les enfants guéris de leur allergie.

Article original

Évaluation de la cytomètrie en flux par rapport aux tests de provocation en simple insu pour le diagnostic de l’allergie alimentaire chez l’enfant

Evaluation of flow cytometry as compared to simple blind oral provocation test for the diagnosis of food allergy in children

J. Sainte-Laudya,*, C. Ménétreyb, C. Brianchonc, A. Lienhardt-Roussieb_{, M. Cogné}a a_{Laboratoire d’immunologie et d’allergologie, hôpital universitaire Dupuytren,}

2, avenue Martin-Luther-King, 87042 Limoges cedex, France

b_{Départment de pédiatrie, hôpital Dupuytren, Limoges, France} c_{Département de pneumologie et d’allergologie, hôpital Dupuytren, Limoges, France}

Reçu le 18 février 2009 ; accepté le 6 mai 2009 Disponible sur Internet le 25 aouˆt 2009

Résumé

But de l’e´tude. – Nous avons comparé l’efficacité du test d’activation des basophiles par cytomètrie en flux (TAB) au test de provocation oral (TPO) en simple insu.

Patientsetme´thodes. – Quatre-vingt-sept testsdeprovocation ontétéréaliséschez 72patientsâgésdehuit moisà15ans. Lesalimentstestéssont principalement l’arachide, l’œuf, le poisson et le lait devache. Le TAB a été pratiqué selon le protocole IgE/CD63 et les résultats exprimés en pourcentage CD63 et en index d’activation (IA) calculé par un algorithme dédié.

Re´sultats. – Les résultats obtenus pour les TPO négatifs nous ont permis dedéfinir des seuils depositivité clinique du TAB (30 % CD63 et 100 pour l’IA), les seuils de positivité statistiques étant respectivement, de 5 % et de 16. Dans ces conditions, les valeurs prédictives positives et négativesobtenues(VPP et VPN) sont respectivement, pour lepourcentageCD63 0,95 et 0,77 etpour l’IA 0,82et 0,96. À partir decesrésultatset des résultats des tests cutanés et des IgE spécifiques obtenus parallèlement, nous avons établi un arbre décisionnel qui permettrait de réduire de deux tiers le nombre de TPO nécessaires.

Conclusions. – Parmi lesdifférentstestspratiquésdanscetteétude, lacytomètrieenflux présentelameilleureefficacité, enréférenceaux testsde provocation pratiqués en simple insu.

# 2009 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

Mots clés : Allergie alimentaire ; Enfants ; Cytomètrie en flux ; CD63 ; Index d’activation ; Test de provocation orale

Abstract

Aimof thestudy. – Wecompared the efficacy of the basophil activation test performed by flow cytometry (BAT) to simple blind oral challenge tests(OCT), themaingoal of thisstudy beingtodefinetheplaceof thismethodwithinthedifferentstepsof foodallergy diagnosisinorder tolimit the frequency of necessary oral challenge tests (OCT).

Patientsandmethods. – Eighty-sevenOPT wereperformed on72patientsaged8monthsto15yearsmainly sufferingfromfoodinduced oedema and atopic dermatitis. Culprit foods weremainly peanut, egg, milk and fish. Flow cytometry was performed according to theIgE/CD63 protocol and results were expressed in percentage CD63 and in activation index (AI) calculated according to a specific algorithm.

Results. – Resultsobtained fromthenegativeOCT ledtothedefinition of theBAT clinical positivethresholds, 30%for thepercentageCD63and 100for theAI, thestatistical thresholds being5%for thepercentageCD63 and16for theAI. In theseconditions, thepositiveandnegativevalues (PPV and NPV) observedfor theTAB were0.95 and0.77for thepercentageCD63and0.82 and0.6for theAI. Onthebasis of theseresults andof theresultsof theskintestsandspecific IgE testedinparallel, wedefinedadecision treewhichcouldleadtodecreasethenumber of necessary OPT by three.

Revue française d’allergologie 49 (2009) 454–461

* Auteur correspondant.

Adresse e-mail :[email protected](J. Sainte-Laudy). 1877-0320/$ – see front matter # 2009 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.reval.2009.05.002

Article original

Évaluation de la cytomètrie en flux par rapport aux tests de provocation en

simple insu pour le diagnostic de l’allergie alimentaire chez l’enfant

Evaluation of flow cytometry as compared to simple blind oral provocation

test for the diagnosis of food allergy in children

J. Sainte-Laudy

*

, C. Ménétrey

, C. Brianchon

,

A. Lienhardt-Roussie

, M. Cogné

a _{Laboratoire d’immunologie et d’allergologie, hôpital universitaire Dupuytren,}

2, avenue Martin-Luther-King, 87042 Limoges cedex, France

b _{Départment de pédiatrie, hôpital Dupuytren, Limoges, France}

c _{Département de pneumologie et d’allergologie, hôpital Dupuytren, Limoges, France}

Reçu le 18 février 2009 ; accepté le 6 mai 2009 Disponible sur Internet le 25 aouˆt 2009

Résumé

But de l’e´tude. – Nous avons comparé l’efficacité du test d’activation des basophiles par cytomètrie en flux (TAB) au test de provocation oral (TPO) en simple insu.

Patientsetme´thodes. – Quatre-vingt-sept testsdeprovocationontétéréaliséschez 72patientsâgésdehuitmoisà15ans. Lesalimentstestéssont principalement l’arachide, l’œuf, le poisson et le lait devache. Le TAB a été pratiqué selon le protocole IgE/CD63 et les résultats exprimés en pourcentage CD63 et en index d’activation (IA) calculé par un algorithme dédié.

Re´sultats. – Les résultats obtenus pour les TPO négatifs nous ont permis dedéfinir des seuils depositivitéclinique du TAB (30 % CD63 et 100 pour l’IA), les seuils de positivité statistiques étant respectivement, de 5 % et de 16. Dans ces conditions, les valeurs prédictives positives et négativesobtenues (VPP etVPN) sontrespectivement, pour lepourcentageCD630,95et0,77etpour l’IA 0,82et0,96. À partir decesrésultats et des résultats des tests cutanés et des IgE spécifiques obtenus parallèlement, nous avons établi un arbre décisionnel qui permettrait deréduire de deux tiers le nombre de TPO nécessaires.

Conclusions. – Parmi lesdifférentstestspratiquésdanscetteétude, lacytomètrieenflux présentelameilleureefficacité, enréférenceaux testsde provocation pratiqués en simple insu.

# 2009 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

Mots clés : Allergie alimentaire ; Enfants ; Cytomètrie en flux ; CD63 ; Index d’activation ; Test de provocation orale

Abstract

Aimof thestudy. – Wecompared theefficacy of thebasophil activation test performed by flow cytometry (BAT) to simpleblind oral challenge tests(OCT), themaingoal of thisstudy beingtodefinetheplaceof thismethodwithinthedifferent stepsof foodallergy diagnosisinorder tolimit the frequency of necessary oral challenge tests (OCT).

Patientsandmethods. – Eighty-sevenOPT wereperformedon72patientsaged8monthsto15yearsmainly sufferingfromfoodinducedoedema and atopic dermatitis. Culprit foods weremainly peanut, egg, milk and fish. Flow cytometry was performed according to theIgE/CD63 protocol and results were expressed in percentage CD63 and in activation index (AI) calculated according to a specific algorithm.

Results. – ResultsobtainedfromthenegativeOCT ledtothedefinitionof theBAT clinical positivethresholds, 30%for thepercentageCD63and 100for theAI, thestatistical thresholds being5% for thepercentageCD63and16for theAI. Intheseconditions, thepositiveandnegativevalues (PPV andNPV) observedfor theTAB were0.95and0.77for thepercentageCD63and0.82and0.6for theAI. Onthebasisof theseresultsandof theresultsof theskintestsandspecific IgE testedinparallel, wedefinedadecisiontreewhichcouldleadtodecreasethenumber of necessary OPT by three.

Revue française d’allergologie 49 (2009) 454–461

* Auteur correspondant.

Adresse e-mail : [email protected] (J. Sainte-Laudy).

1877-0320/$ – see front matter # 2009 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.reval.2009.05.002

• La majorité des patients allergiques aux PLV sont capables de tolérer le lait cuit sous certaines formes.

• Les IgE lait de vache, IgE caséine, diamètre des SPT, BAT lait de vache sont capables de différencier les différents phénotypes de patients allergiques aux PLV.

• Le BAT est plus élevé chez les patients ayant une forme clinique d’APLV plus sévère.

Age distribution by clinical outcome

Total Median age (y) Baked milk reactive 37 8.1

Tolerated muffin 31 7.4 Tolerated pizza 12 6.5 Tolerated rice pudding 44 7.6 Outgrown 8 6.6

Intérêts du Western-blot

• Visualisation des protéines contre lesquelles le patient est sensibilisé.

• « Recouvrement » des bandes contre lesquelles on observe des IgE spécifiques par des IgG4 spécifiques en cours de désensibilisation.

• Test de « matching » entre sérum du patient et le vaccin désensibilisant.

Ajout sérum

Guidelines NIAID

Intolérance

versus

allergie

alimentaire

Exemple : Intolérance alimentaire au lactose ou allergie aux protéines de lait de vache

 Réaction indésirable non-immunitaire

 Baisse d’activité de la lactase intestinale ou absence.

 Si ingestion de lactose en trop grande quantité

dépasse la capacité de l’enzyme

 Accumulation de lactose non hydrolysé:  Flore lactique troubles dus au pouvoir

osmotique

 Gaz de fermentation

 Acidité locale : diarrhées, douleurs abdominales, ballonnement

 Le régime alimentaire recommandé dans ces deux pathologies n’est pas identique.

 APLV:

 régime d’éviction strict interdisant tous

produits laitiers ou dérivés.

 Intolérance au lactose:

 Produits laitiers pauvres en lactose tolérés.  Symptômes contrôlés en  la consommation

de lactose à une dose n’entraînant pas les

Intolérance versus allergie alimentaire

Diagnostic in-vitro

Exemple : Intolérance alimentaire au lactose ou allergie aux protéines de lait de vache

– APLV: dosage des IgE spécifique du lait de vache.

 Lait de vache, f2  Bos d 4 α-lactalbumine, f76  Bos d 5 β –lactoglobuline, f77  Bos d 8 Caseine, f78  Bovine lactoferrine, f334 – Intolérance au lactose:

 Pas de tests de laboratoire

IgG spécifiques anti-aliments

• Présence d’IgG spécifique d’un aliment est considéré comme un

témoin d’exposition

• Introduction d’un aliment induit une augmentation des IgG

spécifiques des protéines de cet aliment pendant les premiers

mois, suivi d’une légère diminution, et ceci, en l’absence de

toute manifestation clinique

• (Husby S. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2000; 30 (suppl): S13-19)

• La majorité des enfants non sélectionnés, en âge scolaire,

dispose d’IgG4 vis-à-vis des protéines d’aliments courants

• (Calkhoven PG et al. Clin Exp Allergy 1991; 21: 99-107)

• Dans un groupe d’adultes, les IgG4 spécifiques d’aliments

n’étaient pas corrélés avec le taux d’IgE spécifiques ni avec la

présence de symptômes cliniques

IgG spécifiques anti-aliments

• IgG4 (Anticorps réaginiques)

•

_{Induction de la dégranulation des basophiles}

• (Fagan DL et al. J Allergy Clin Immunol 1982; 70: 399-402)

• Cellules de donneurs non atopiques ne libèrent pas

d’histamine en présence d’IgG

• (Lichtenstein LM et al. J Immunol 1992; 148: 3029-36)

• Absence d’association entre la présence d’IgG

spécifiques vis à vis d’un aliment et la positivité

d’un test de provocation orale avec cet aliment

• (Hamilton RG et al. J Allergy Clin Immunol 2010; 125: S284-96)

 De nombreux patients croient que leurs symptômes sont liés à l'ingestion d'aliments,

• Sans relation évidente entre les prises d’aliments et le déclenchement des signes.

• Dosage des IgG vis à vis des aliments représente un marché important. • Les dosages d’IgG4 contre les aliments :

 Promus pour le diagnostic d’une HS alimentaire.

 Absence d’études et de preuves du rôle des IgG4 chez l’homme dans l’HS • IgG4 positif :

 Pas de correspondance avec les symptômes cliniques.

 Pas de relation avec une allergie ou une intolérance alimentaire.

 Indique que l'organisme a été exposé de façon répétée à ces aliments.

 La présence d’IgG4 ne doit pas être considérée comme un facteur qui induit une HS, mais plutôt comme un indicateur de la tolérance immunologique à l’aliment.

Recommandations de l’Académie Européenne

d’Allergologie et d’Immunologie Clinique (EAACI)

• Régimes d’éviction selon bilan sanguin d’IgG vis-à-vis d’aliments. • Souvent étendus à plusieurs aliments,

• Altèrent la qualité de vie des patients • Source de carences nutritionnelles.

• De manière générale, en allergologie, la présence d’un test positif ne signe pas l’allergie.

• C’est la confrontation de l’histoire du patient et du test qui permettent d’approcher le diagnostic, qui sera éventuellement confirmé par un test de provocation..

AUCUNE PERTINENCE CLINIQUE

Plusieurs organismes officiels ne recommandent pas la détermination des IgG4 pour diagnostiquer les allergies ou intolérances alimentaires.

1.Testing for IgG4 against foods is not recommended as a diagnostic tool : EAACI Task Force Report. Steven O. Stapel et al. 2008.

2.Serum antibody levels for IgG4 or IgE (or other IgG sub-classes) indicate the presence of specific antibodies but do nor make a diagnosis. The presence of antibody does not indicate disease - Position papaer of AAAAI

AUCUNE PERTINENCE CLINIQUE

Plusieurs organismes officiels ne recommandent pas la détermination des IgG4 pour diagnostiquer les allergies ou intolérances alimentaires.

1.Testing for IgG4 against foods is not recommended as a diagnostic tool : EAACI Task Force Report. Steven O. Stapel et al. 2008.

2.Serum antibody levels for IgG4 or IgE (or other IgG sub-classes) indicate the presence of specific antibodies but do nor make a diagnosis. The presence of antibody does not indicate disease - Position papaer of AAAAI

Messa_{ges à}

ne pa_s

Take-home messages

• Les extraits allergéniques disponibles pour le diagnostic in-vitro des allergies sont préparés à partir de matériel biologique

– Ils contiennent des protéines allergéniques et non-allergéniques

 Leur contenu en allergène majeur/mineur n’est pas toujours bien standardisé...

• Des centaines d’allergènes décrits, >100 allergènes naturels purifiés ou produits sous forme de recombinants sont disponibles pour le diagnostic des allergies.

– Dosages d’IgE spécifiques unitaires – Multiplex

– En attendant des évidences publiées, pas dosages d’IgG !

• Les composants allergéniques, nombreuses utilités

• ITS, prédire la sévérité des allergies...

• Etablir un profil de sensibilisation expliquant les réactions croisées

• Aideobjective à la prise de décision quant à la conduite à tenir (éviction totale, essai de réintroduction...)

Take-home messages

• Trouver la cause d’une allergie est parfois extrêmement complexe...

– Surtout si les symptômes ne sont pas bien corrélés avec l’anamnèse, – Lorsque le patient est polysensibilisé,

– Lors d’anaphylaxies inexpliquées,

– Lorsque le patient ne répond pas bien au traitement,

– Lorsque les composants d’intérêt ne sont pas disponibles individuellement...

 Un diagnostic correct, dans ces cas complexes, prend parfois beaucoup de temps.

• Les Microarrays permettent d’évaluer la réactivité des IgE contre un grand nombre de composants allergéniques avec un test simple et rapide.

– Dédié à des médecins spécialistes – Allergie moléculaire – CRD –

Take-home messages

• Des techniques innovantes permettent de définir des profils de sensibilisation envers 112 composants allergéniques ; l’ImmunoCAP ISAC est un puissant outil.

• Contexte de prescription :

– Allergie IgE-médiée, symptômes immédiats. – Profil complexe.

 Allergies multiples ou allergies dont le substrat moléculaire semble flou malgré une exploration moléculaire orientée.

– Chocs d’allure anaphylactiques répétés, non élucidés par une enquête minutieuse et des tests orientés.

– Profils moléculaires non accessibles à l’exploration unitaire et dont l’éducation justifie un examen coûteux et non remboursé (fruits, sésame)

Take-home messages

• Le profil moléculaire en tant que résultat d’exploration de routine doit être regardé avec attention (quel allergène pertinent, si inattendu, titres).

• Il est informatif dans le contexte d’une population donnée (géographie, âge...) • Des seuils (cut-off cf Sampson) sont régulièrement publiés, à suivre !

• Quid du futur et des développements ?

– Doit-on suivre les sensibilisations précliniques ?

– Elargir a gamme des composants allergéniques en routine ?

Qui ? Quoi ? Où ?

Service de Chimie Clinique du CHU de Liège Endocrinologie, Allergologie, Exploration lithiase

-Biologistes

Prof Etienne CAVALIER (Chef de service) Romy GADISSEUR (Responsable laboratoire)

[email protected] 04/366.76.65 Technologues de laboratoire Anne-Catherine BEKAERT Claudette BORREMANS Agnès CARLISI Grégory COLLARD Nunzio FERRANTE Séverine GEBOES Pierre LUKAS Olivier ROUSSELLE Georges SPRONCK