Contribution de la kinase WNK1 à la guérison des plaies cornéennes

(1)

Contribution de la kinase WNK1 à la guérison des plaies

cornéennes

Mémoire

Pascale Desjardins

Maîtrise en biologie cellulaire et moléculaire - avec mémoire

Maître ès sciences (M. Sc.)

(2)

Contribution de la kinase WNK1 à la guérison des

plaies cornéennes

Mémoire

Pascale Desjardins

Sous la direction de :

Sylvain Guérin, directeur de recherche

Lucie Germain, codirectrice de recherche

(3)

Résumé

La cornée, en raison de sa localisation anatomique superficielle, est particulièrement

vulnérable à divers traumatismes, lesquels peuvent mener à des déficiences visuelles

importantes. Les changements dans la matrice extracellulaire (MEC) qui accompagnent les

lésions de l'épithélium cornéen sont perçus par les intégrines qui, en retour, activent

différentes voies signalétiques intracellulaires, menant ultimement à la réparation de

l'épithélium lésé. L’objectif de cette étude consistait, d’une part, à identifier les médiateurs

signalétiques dont l’expression et/ou l’activité était modifiée durant la guérison des plaies

cornéennes, et, d’autre part, à analyser l’impact de l’inhibition d’un de ces médiateurs

signalétiques, la kinase WNK1, sur la guérison des plaies cornéennes. L’analyse des

données obtenues en profilage génique et profilage de kinases a permis d’identifier

d’importantes altérations dans l’expression et l’activité de plusieurs médiateurs, dont la

kinase WNK1, en réponse aux changements dans la MEC qui ont lieu durant la guérison

des plaies cornéennes. En utilisant la culture de cellules épithéliales cornéennes humaines

(hCECs) en monocouche et la cornée humaine reconstruite par génie tissulaire (hTEC)

comme modèles, il a été possible de démontrer que l’inhibition pharmacologique de WNK1

par le WNK463 ralentit la fermeture des plaies cornéennes. De plus, des analyses de

buvardage Western et des mesures de taux de croissance ont permis de démontrer que

l’inhibition de WNK1 empêche l’activation de ses protéines cibles en aval SPAK et OSR1

et altère les propriétés prolifératives des hCECs. Enfin, ces résultats ont permis d’identifier

WNK1 comme un joueur important dans la guérison des plaies cornéennes, attribuant ainsi

une toute nouvelle fonction à cette kinase. De plus, ces résultats contribueront à une

meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la

cicatrisation de la cornée et pourraient mener à l'identification de nouvelles cibles

thérapeutiques dans le traitement des lésions cornéennes.

(4)

Abstract

The cornea, because of its superficial anatomical location, is continually subjected to

abrasive forces and various traumas, which can lead to significant visual impairments.

Damages to the corneal epithelium trigger important changes in the composition of the

extracellular matrix (ECM) to which the basal human corneal epithelial cells (hCECs)

attach. These changes are perceived by integrins that activate different intracellular

signalling pathways, ultimately leading to reepithelialization of the injured epithelium. The

aims of this study was, first, to identify the signalling mediators whose expression and/or

activation was altered during the healing process of the cornea, and second, to analyze the

impact of the inhibition of one of these signalling mediators, the WNK1 kinase, on the

corneal wound healing. Analysis of the gene profiling data and kinase arrays revealed

important alterations in the expression and activity of several mediators, including the

WNK1 kinase, in response to the ECM changes that occur during corneal wound healing.

Using both monolayers of hCECs and tissue-engineered human corneas (hTECs) as in vitro

models, we demonstrated that pharmacological inhibition of WNK1 by WNK463

significantly reduced the rate of corneal wound closure. In addition, Western blot analyzes

and growth rate measurements have shown that inhibition of WNK1 prevents the activation

of its downstream target proteins SPAK and OSR1, and alters the proliferative properties of

hCECs, respectively. Finally, these results allowed the identification of WNK1 as an

important player in the wound healing of the cornea, thus assigning a new function to this

kinase. These results will therefore contribute to a better understanding of the cellular and

molecular mechanisms involved in corneal wound healing and could lead to the

identification of new therapeutic targets in the treatment of corneal wounds.

(5)

Tables des matières

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(8)

Liste des tableaux

Supplementary Table 2.1. Biological functions of the proteins encoded by the differentially

expressed genes ... 75!

(9)

Liste des figures

Figure 1.1 Représentation schématique de l’anatomie du globe oculaire humain ... 3!

Figure 1.2 Représentation schématique de la partie antérieure de l’œil, à la jonction entre la

cornée et la sclère ... 4!

Figure 1.3 Structure schématique et histologique de la cornée humaine ... 6!

Figure 1.4 Représentation schématique de l’épithélium cornéen ... 8!

Figure 1.5 Le limbe constitue la niche des cellules souches épithéliales cornéennes ... 10!

Figure 1.6 Le syndrome de déficience en cellules souches limbiques ... 18!

Figure 1.7 Les différentes étapes de la réépithélialisation ... 21!

Figure 1.8 La signalisation outside-in en aval de l’activation des intégrines ... 30!

Figure 1.9 Reconstruction d’une cornée humaine selon la méthode d’auto-assemblage ... 35!

Figure 1.10 Aspect macroscopique de la cornée humaine reconstruite par auto-assemblage

... 37!

Figure 2.1 Gene profiling analysis of the mediators from the signal transduction pathways

activated by wound healing in hTECs. ... 67!

Figure 2.2 Kinases profiling analysis during corneal wound healing. ... 68!

Figure 2.3 Impact of the inhibition of WNK1 by WNK463 on wound closure of hCECs. . 69!

Figure 2.4 Impact of the inhibition of WNK1 by WNK463 on wound closure of human

tissue-engineered cornea. ... 70!

Figure 2.5 Impact of WNK463 on the proliferative properties of hCECs in monolayer

culture. ... 71!

Supplementary Figure 2.1 MTS assays ... 73!

Supplementary Figure 2.2 Microarray analysis of WNK1-activated mediators gene

expression patterns in response to corneal damage. ... 74!

Figure 3.1 Structure protéique et différents domaines de la kinase WNK1 et de l’isoforme

tronqué KS-WNK1. ... 110!

Figure 3.2 Contributions connues de WNK1 dans les différentes voies de signalisation

intracellulaire. ... 113!

(10)

Listes des abréviations

ADN/DNA

Acide désoxyribonucléique/Deoxyribonucleic acid

ARN/RNA

Acide ribonucléique/Ribonucleic acid

ARNm/mRNA

Acide ribonucléique messager/messenger Ribonucleic acid

ASK3

Apoptosis signal-regulating kinase

B2M

B2-microglobulin

CD44

Récepteur de l’acide hyaluronique

CD46

Cluster of differentiation 46

Cdc42

Cell division control protein 42 homolog

CFTR

Cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator

CI

Collagène de type I

CIV

Collagène de type IV

Cl

-

Ions chlore

CREB

C-AMP response element-binding protein

CRISPR

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats

CSECs/CESCs

Cellules souches épithéliales cornéennes/Corneal epithelial stem cells

CUL3

Culline 3

CVII

Collagène de type VII

EC CB

2

Récepteur catécholaminergique et endocannabinoïde CB

2

EGF

Epidermal growth factor

ENaC

Canaux à ions sodium

EnMT

Transition endothélio-mésenchymateuse

EPR

Épireguline

ERK

Extracellular signal-regulated kinase

FAK

Kinase d’adhésion focale; Focal adhesion kinase

FDA

Food and Drug Administration

FGF-2

Fibroblast growth factor 2

FN

Fibronectine

GOLGA1

Golgin subfamily A member 1

Grb2

Growth factor receptor-bound protein 2

HB-EGF

Heparin-binding EGF

hCECs

Cellules épithéliales cornéennes humaines; human corneal epithelial

cells

HCO

3-

Ions bicarbonates

HRP

Horseradish peroxidase

HSP27

Heat shock protein 27

hTECs

Cornées humaines reconstruites par génie tissulaire; human

tissue-engineered corneas

IL-1

Interleukine-1

IL-1!

Interleukine-1!

IL-1"

Interleukine-1"

IL-6

Interleukine-6

IL-8

Interleukine-8

(11)

JNK

c-Jun N-terminal kinase

K.O.

Knock out

K

+

_{Ions potassium}

KCC

Co-transporteurs K-Cl

kDa

Kilodalton

KLH3

Kelch-like 3

KS-WNK1

Kidney-specific WNK1

LASIK

Laser-assisted in situ keratomileusis

LD

Lamina densa

LINGO-1

Leucine rich repeat & immunoglobin-like domain-containing protein 1

LL

Lamina lucida

LM

Laminine

LOEX

Laboratoire d’organogénèse expérimentale

MAPK

Protéines kinases activées par les mitogènes; mitogen-activated protein

kinase

MEC/ECM

Matrice extracellulaire/Extracellular matrix

MEF2

Myocyte enhancer factor-2

MEK1

Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1

MMPs

Métalloprotéinases matricielles; Matrix metalloproteinases

Na

+

Ions sodium

NCC

Co-transporteurs Na-Cl

NKCC

Co-transporteurs Na-K-Cl

OSR1

Oxidative stress-responsive 1

p21

CIP

_{Cyclin-dependent kinase inhibitor 1}

p27

KIP

Cyclin-dependent kinase inhibitor 1B

PDGF

Platelet-derived growth factor

PI3K

Phosphoinositide 3-kinase

Rac1

Ras related C3 botulinum toxin substrate 1

RAP1

Ras related protein 1

RhoA

Ras homolog gene family, member A

ROMK

Renal outer medullary potassium channel

SAP1

Suppressor of phyA-105 1

SEM

Standard error of the mean

SGK1

Serum and glucocorticoid-regulated kinase 1

SH3

Domaine d’homologie Src 3

SOS

Son of Sevenless

SPAK

Ste20 related, proline and alanine-rich kinase

STAT5B

Signal transducer and activator of transcription 5B

TGF-!

Transforming growth factor !

TGF-"

Transforming growth factor "

TN-C

Ténascine C

TNF-!

Facteur de nécrose tumorale !; Tumor necrosis factor !

VEGF

Vascular endothelial growth factor

(12)

Remerciements

Tout d’abord, j’aimerais remercier mon directeur de recherche Sylvain Guérin pour m’avoir

donné l’opportunité de travailler au sein de son laboratoire lors de mon premier stage de

recherche à l’été 2015. Cette première expérience de travail en laboratoire a certainement

influencé positivement ma décision de poursuivre en recherche. Aussi, je le remercie pour

sa présence, ses encouragements et ses bonnes idées tout au long de mon projet de maîtrise.

Je remercie aussi ma co-directrice Lucie Germain pour avoir grandement contribué à

l’encadrement de qualité qui m’a été offert. Merci également à la Banque d’Yeux du

CUO-Recherche pour les tissus oculaires, de même qu’aux différents organismes

subventionnaires (IRSC et FRQS) pour les bourses octroyées au cours de ma maîtrise. Je

tiens aussi à remercier les autres membres du laboratoire, plus particulièrement Camille

Couture et Gaëtan Le-bel, pour l’aide précieuse qu’ils m’ont apportée lors de mon travail

en laboratoire ainsi que tous les étudiants ayant pu contribuer de près ou de loin à mon

projet de recherche. Enfin, sur une note plus personnelle, je remercie aussi ma famille, mes

amis et mon copain pour leur support moral et leurs encouragements.

(13)

Avant-propos

Les résultats des travaux réalisés dans le cadre de mon projet de maîtrise font l’objet d’un

article scientifique présenté au Chapitre II de mon mémoire. Cet article, qui a pour

titre Contribution of the WNK1 kinase to corneal wound healing using the

tissue-engineered human cornea as an in vitro model, a été soumis pour publication dans le

journal scientifique Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medecine. Les travaux

présentés dans cet article ont été réalisés principalement par moi-même, avec l’aide de ma

collègue Camille Couture et sous la supervision de mes deux directeurs de recherche, Lucie

Germain et Sylvain Guérin. Le texte de l’article inséré dans mon mémoire est intégralement

le même que celui qui a été soumis au journal. En tant qu’auteure principale, j’ai réalisé la

majorité des expériences qui ont permis de générer les résultats présentés dans l’article. En

effet, j’ai effectué toutes les étapes de culture nécessaires à la production des cornées

reconstruites selon la méthode d’auto-assemblage. J’ai ensuite effectué les analyses avec

l’inhibiteur sur la guérison des plaies cornéennes avec notre modèle de cornée reconstruite

ainsi qu’avec le modèle de scratch en monocouche. J’ai aussi réalisé les différentes

analyses en buvardage Western présentées dans cet article. Enfin, j’ai réalisé les mesures de

taux de croissance avec les cellules épithéliales cornéennes en monocouche ainsi que les

analyses du cycle cellulaire par quantification de l’ADN en cytométrie de flux. Quant aux

analyses en profilage génique et en profilage protéomique, elles ont été réalisées

précédemment au sein du laboratoire dans le cadre d’un projet de recherche mené par

Camille Couture, projet auquel j’ai d’ailleurs participé à titre de stagiaire à l’été 2015.

(14)

Chapitre I : Introduction

1.1 Anatomie et fonctions de l’œil

La vision constitue l’un des sens les plus importants du corps humain. Elle nous permet de

percevoir et d’interagir avec notre environnement et joue un rôle extrêmement important

dans la survie des êtres humains. Les yeux, qui assurent la vision, sont quant à eux les

organes sensoriels les plus précieux. Ce n’est pas un hasard d’ailleurs si plus de la moitié

des récepteurs sensoriels du corps y sont retrouvés (Tortora & Derrickson, 2007). L’œil est

un organe complexe formé de différentes structures spécialisées qui sont toutes essentielles

afin d’assurer le bon fonctionnement du système visuel.

1.1.1 Le globe oculaire

Le globe oculaire forme une sphère d’environ 2,5 cm de diamètre chez l’humain adulte

(Grant-Kels & Kels, 1992). Il est composé de trois tuniques et de trois milieux transparents

(Marieb & Hoehn, 2010) (Figure 1.1). Les trois tuniques sont : la tunique fibreuse, la

tunique nutritive et la tunique neurosensorielle. La tunique fibreuse constitue l’enveloppe la

plus superficielle du globe oculaire. Elle est composée de la cornée en antérieur et de la

sclérotique en postérieur. La sclérotique (aussi appelée sclère) est avasculaire et de couleur

blanche chez l’adulte. Elle est principalement composée de collagène et confère à l’œil sa

forme et sa rigidité. Elle joue également un rôle de protection pour les structures internes de

l’œil en plus de servir d’ancrage pour les muscles extrinsèques de l’œil. La cornée constitue

le prolongement convexe de la sclérotique. Bien qu’également avasculaire, la cornée est

quant à elle transparente. Son rôle est de capter et de focaliser la lumière sur le cristallin. À

la jonction entre la cornée et la sclérotique, se trouve le canal de Schlemm par où l’humeur

aqueuse est évacuée. La tunique nutritive, appelée aussi tunique vasculaire ou uvée, forme

l’enveloppe intermédiaire du globe oculaire. Elle est séparée en trois composantes

distinctes : la choroïde, le corps ciliaire et l’iris. La choroïde se situe entre la sclérotique et

la rétine et tapisse la face interne de l’œil. La choroïde est richement vascularisée, elle

assure donc la nutrition de la face postérieure de la rétine et de l’iris. La choroïde est

(15)

composée, entre autres, de mélanocytes qui produisent de la mélanine, un pigment brun

foncé. Ainsi, elle permet également d’absorber les rayons lumineux diffus et de maintenir

l’intérieur de l’œil en chambre noire. En antérieur de l’œil, la choroïde laisse place au corps

ciliaire. À l’instar de la choroïde, le corps ciliaire est pigmenté par la mélanine. Il est

composé des procès ciliaires qui renferment les capillaires qui sécrètent l’humeur aqueuse.

Le corps ciliaire comprend aussi le muscle ciliaire, qui lui, est à l’origine du processus

d’accommodation de l’œil, qui permet de s’adapter à une vision rapprochée ou éloignée. En

antérieur du corps ciliaire entre la cornée et le cristallin, on retrouve l’iris. L’iris est

composé de mélanocytes qui, selon leur concentration, donnent la teinte de l’œil. Il est

aussi composé de fibres musculaires lisses qui régulent le diamètre de la pupille. Ainsi,

l’iris agit comme diaphragme en modulant la quantité de lumière qui pénètre dans l’œil.

Enfin, la tunique neurosensorielle forme l’enveloppe interne du globe oculaire. Elle est

composée de la rétine qui tapisse les trois quarts postérieurs de l’œil. La rétine est un tissu

vascularisé sensible aux impulsions lumineuses. Ainsi, son rôle est de transformer la

lumière en signal nerveux qui sera acheminé jusqu’au cerveau par le nerf optique. Elle

comprend deux parties distinctes : la partie pigmentaire et la partie neurale. La partie

pigmentaire de la rétine est formée d’une monocouche de cellules épithéliales pigmentées

qui, comme la choroïde, participe à l’absorption des rayons lumineux diffus. La rétine

neurale, quant à elle, est composée de photorécepteurs, de neurones bipolaires et de cellules

ganglionnaires qui servent au traitement des données visuelles (Baccus, 2007). Les cellules

photo-réceptrices interviennent dans l’initiation du signal visuel et se divisent en deux

classes : les cônes et les bâtonnets. On retrouve environ 6 millions de cônes et 120 millions

de bâtonnets dans la rétine (Tortora & Derrickson, 2007). Alors que les bâtonnets

permettent de voir dans la pénombre, les cônes, eux, sont responsables de la vision des

couleurs. Au fond de la rétine, se trouve la macula, au centre de laquelle on retrouve la

fovéa, point où l’acuité visuelle atteint son maximum.

(16)

Figure 1.1 Représentation schématique de l’anatomie du globe oculaire humain

(Adaptée de Tortora & Derrickson, 2007)

L’intérieur de globe oculaire est aussi formé de trois milieux transparents que sont le

cristallin, l’humeur aqueuse et le corps vitré (Figure 1.2). Le cristallin est situé à l’arrière de

l’iris et est maintenu en place par les fibres zonulaires du ligament suspenseur du cristallin.

C’est une lentille biconvexe transparente et avasculaire qui contribue au pouvoir réfractif et

au processus d’accommodation de l’œil en se déformant sous l’action du muscle ciliaire. Le

cristallin sépare le globe oculaire en un segment antérieur et un segment postérieur. Dans le

segment antérieur, la chambre antérieure, entre l’iris et la cornée, est remplie d’humeur

aqueuse. L’humeur aqueuse est sécrétée par le corps ciliaire et s’écoule par le trabéculum

vers le canal de Schlemm (voir section 1.1.1). Sa fonction est de fournir l’oxygène et les

nutriments nécessaires à la cornée et au cristallin. De plus, l’humeur aqueuse contribue à

maintenir la pression intra-oculaire et la forme du globe oculaire. En conditions normales,

l’humeur aqueuse se renouvèle toutes les 90 minutes (Tortora & Derrickson, 2007). En

(17)

postérieur du cristallin, se trouve le corps vitré (ou chambre vitrée), qui occupe 80% du

volume de l’œil. Le corps vitré est une substance gélatineuse transparente formée

majoritairement d’eau, qui contribue à maintenir la forme et la rigidité du globe oculaire, ce

qui permet de maintenir la rétine accolée à la choroïde et qui sert également à amortir les

chocs.

Figure 1.2 Représentation schématique de la partie antérieure de l’œil, à la jonction entre la

cornée et la sclère

Le cristallin sépare la chambre postérieure, dans le segment antérieur, de la chambre vitrée.

Les flèches indiquent la circulation de l’humeur aqueuse. (Adaptée de Tortora &

Derrickson, 2007)

1.1.2 Les structures annexes de l’œil

Parmi les structures annexes de l’œil on retrouve les paupières, les cils, les sourcils, la

conjonctive, l’appareil lacrymal et les muscles extrinsèques du globe oculaire. Les

paupières, les sourcils et les cils protègent l’œil contre les corps étrangers, les rayons directs

du soleil et les gouttes de sueur. Les paupières contiennent aussi des glandes de Meibomius

(18)

qui sécrètent un liquide lubrifiant, le meibum, qui prévient l’évaporation du film lacrymal.

La conjonctive est une muqueuse transparente qui constitue en quelque sorte le

prolongement de l’épithélium cornéen et qui recouvre le devant de la sclérotique et tapisse

la surface interne des paupières. Elle est composée de cellules caliciformes produisant du

mucus qui entre dans la composition du film lacrymal. L’appareil lacrymal, quant à lui,

comprend toutes les structures impliquées dans la production et l’excrétion du film

lacrymal. Le film lacrymal est formé d’une couche lipidique, en contact avec l’air, d’une

couche aqueuse intermédiaire et d’une couche mucoïde, en contact direct avec l’épithélium

cornéen (Dilly, 1994). Le film lacrymal sécrété assure diverses fonctions, telles que la

prévention du dessèchement de l’œil, l’uniformisation de la surface épithéliale, la

protection contre les pathogènes et la nutrition de la cornée en oxygène (Tiffany, 2008).

Enfin, les mouvements du globe oculaire sont rendus possibles par six muscles

extrinsèques. Certains muscles assurent la stabilité du globe oculaire, alors que d’autres

permettent à l’œil de se mouvoir vers l’extérieur, l’intérieur, le haut ou le bas.

1.2 La cornée

La cornée forme la partie antérieure transparente du globe oculaire. Elle est avasculaire,

mais très fortement innervée. En fait, la cornée est l’un des organes les plus densément

innervés du corps humain (Bonini, Rama, Olzi, & Lambiase, 2003; Muller, Marfurt, Kruse,

& Tervo, 2003; Rozsa & Beuerman, 1982). La cornée est responsable des trois quarts du

pouvoir réfractif de l'œil (Eghrari, Riazuddin, & Gottsch, 2015). Elle joue aussi un rôle de

protection en agissant comme barrière physique et structurante de l’œil. Chez l’adulte, la

cornée a un diamètre horizontal de 11,5 mm et un diamètre vertical de 10,5 mm (Rufer,

Schroder, & Erb, 2005). Son épaisseur, qui est de 0,5 mm en son centre, augmente

graduellement jusqu’à atteindre une épaisseur de 0,7 mm en périphérie (Hogan & A.,

1971). La cornée est composée de 3 couches cellulaires différentes, que sont l’épithélium,

le stroma et l’endothélium, séparées par deux membranes, soit la membrane de Bowman et

la membrane de Descemet (Figure 1.3).

(19)

Figure 1.3 Structure schématique et histologique de la cornée humaine

D’antérieur en postérieur, la cornée est formée d’un épithélium pavimenteux stratifié, de la

membrane de Bowman, du stroma, de la membrane de Descemet et d’une monocouche de

cellules endothéliales. Barre de mesure : 50 µm. (Tirée de Ghezzi et al., 2015)

1.2.1 L’épithélium cornéen

La couche de cellules la plus antérieure de la cornée est l’épithélium cornéen. Celui-ci a

une épaisseur d’environ 50 µm et est formé de quatre à six couches de cellules épithéliales

pavimenteuses stratifiées non kératinisées (Farjo, McDermott, & Soong, 2008). Ces

cellules sont de trois types selon leur emplacement dans l’épithélium. En effet, on retrouve

les cellules dites superficielles, les cellules suprabasales et les cellules basales (Figure 1.4).

Les deux ou trois couches les plus antérieures sont composées des cellules dites

superficielles. Ces cellules sont aplaties, de forme polygonale et présentent de fins

prolongements cellulaires, qu’on appelle microvillosités, à leur surface apicale. Ces

microvillosités sont recouvertes de glycocalyx, une mince couche de polysaccharides, ce

qui permet de maximiser la surface de contact et d’optimiser l’adhérence entre la couche

mucoïde du film lacrymal et la surface cornéenne (DelMonte & Kim, 2011). Cette

interaction est critique pour le maintien d’une surface oculaire lisse et pour la conservation

des propriétés optiques de la cornée. Les cellules épithéliales superficielles sont maintenues

ensemble par des complexes de jonctions serrées, ce qui permet de prévenir l’infiltration du

(20)

film lacrymal ou l’infiltration de pathogènes dans les couches plus profondes de la cornée.

Sous les cellules épithéliales superficielles, on retrouve deux à trois couches de cellules

suprabasales, aussi appelées cellules ailées. Ces cellules, de forme moins aplatie que les

cellules superficielles, sont également liées entre elles par des complexes de jonctions

serrées. La couche la plus profonde de l’épithélium cornéen est formée d’une monocouche

de cellules basales cuboïdes. Contrairement aux cellules des autres couches, les cellules

basales possèdent une activité mitotique (Wiley, SundarRaj, Sun, & Thoft, 1991). Ce sont

d’ailleurs ces cellules qui sont à l’origine des cellules suprabasales et superficielles que l’on

retrouve dans les couches supérieures de l’épithélium cornéen. Les cellules basales sont

attachées entre elles par des complexes de jonctions adhérentes et jonctions communicantes

et sont liées à la membrane et au stroma sous-jacent via les hémidesmosomes (Gipson,

Spurr-Michaud, Tisdale, & Keough, 1989). Les cellules de l’épithélium cornéen reposent

sur une membrane basale d’environ 0,05 µm d’épaisseur. La membrane basale est sécrétée

par les cellules épithéliales basales et sert de barrière physique afin de limiter l’effet des

molécules relâchées par les cellules épithéliales sur les kératocytes du stroma. Dans la

membrane basale, on distingue la lamina lucida (LL), principalement composée de

laminines (LM), et la lamina densa (LD), principalement composée de collagène IV (CIV),

de perlécane et de nidogènes (Tuori, Uusitalo, Burgeson, Terttunen, & Virtanen, 1996).

(21)

Figure 1.4 Représentation schématique de l’épithélium cornéen

On distingue trois types de cellules épithéliales selon leur emplacement : les cellules

superficielles, les cellules ailées et les cellules basales. Les cellules superficielles sont

recouvertes de glycocalyx. Les cellules épithéliales sont attachées entre elles via des

complexes de jonctions serrées puis reliées à la membrane basale via les hémidesmosomes.

(Tirée de DelMonte & Kim, 2011)

Les cellules de l’épithélium cornéen ont une espérance de vie de 7 à 10 jours (Hanna,

Bicknell, & O'Brien, 1961). Ainsi, à chaque semaine, les cellules les plus superficielles

entrent en apoptose, sont éliminées par le processus de desquamation et sont remplacées par

les cellules des couches suprabasales. Les cellules suprabasales sont elles-mêmes

remplacées via les divisions mitotiques des cellules basales. Le renouvellement constant de

l’épithélium cornéen est rendu possible grâce à l’existence de cellules souches épithéliales

cornéennes (CSECs). Selon le modèle prédominant, aujourd’hui largement accepté dans la

communauté scientifique, ces cellules seraient situées au niveau du limbe, lui-même situé à

la jonction entre la cornée, la sclérotique et la conjonctive (W. Li, Hayashida, Chen, &

Tseng, 2007) (Figure 1.5A). Plus précisément, les CSECs se retrouveraient au creux

d’invaginations, appelées palissades de Vogt. Au niveau de ces palissades, on retrouverait

aussi, en plus des cellules souches, des mélanocytes et des cellules de Langerhans qui

joueraient un rôle de protection du réservoir de cellules souches contre les insultes

(22)

extérieures (Vantrappen, Geboes, Missotten, Maudgal, & Desmet, 1985). De plus, dans les

palissades de Vogt, les CESCs se retrouveraient à proximité des cellules du stroma

sous-jacent, ce qui, d’une part, favoriserait les interactions épithélio-mésenchymateuses et,

d’autre part, faciliterait la diffusion des signaux chimiques des vaisseaux sanguins du

stroma (sous le limbe, surtout en périphérie de la cornée) vers les cellules souches de

l’épithélium (Castro-Munozledo, 2013). La composition de la membrane basale du limbe

diffère de celle de l’épithélium cornéen. En effet, la membrane basale du limbe serait

enrichie en laminines (!2–!5, "1–"3, #1–#3), collagène IV (!1 et !2), ténascine C (TN-C)

et agrine (Kabosova et al., 2007; Ljubimov et al., 1995). Ce microenvironnement unique

formerait ainsi la niche des CESCs, laquelle serait essentielle au maintien de l’homéostasie

et du caractère indifférencié des cellules souches. Les cellules souches du limbe sont

capables de se diviser de manière symétrique et de manière asymétrique (Figure 1.5B). Une

division symétrique horizontale permet de générer une autre cellule souche qui pourra

migrer le long de la membrane basale. Les divisions dites asymétriques, quant à elles,

permettent de générer une cellule souche qui pourra maintenir la population de cellules

souches cornéennes et une autre cellule qui, elle, quittera la niche pour se différencier en

cellule amplificatrice transitoire. Ces dernières vont migrer jusqu’à la cornée centrale, à

partir d’où elles prendront le nom de cellules basales. Les cellules basales finiront par se

diviser de manière verticale et cela rendra possible la régénération de l’épithélium cornéen

(Castro-Munozledo, 2013).

(23)

Figure 1.5 Le limbe constitue la niche des cellules souches épithéliales cornéennes

A. Localisation du limbe à la surface oculaire, à la jonction cornéo-conjonctivale. (Tirée de

Pellegrini et al., 2011) B. Représentation hypothétique de la niche des CSECs. Les CSECs

sont situées dans les palissades de Vogt à la jonction cornéo-conjonctivale. Les CSECs se

différencient en cellules amplificatrices transitoires qui migrent vers la cornée centrale où

elles entreront en différenciation terminale. Dans la niche, d’autres types cellulaires

(mélanocytes, cellules de Langerhans, cellules mésenchymateuses) ainsi que des nerfs et

des vaisseaux sanguins se retrouvent à proximité des CSECs. (Tirée de Li et al., 2007)

(24)

1.2.2 La membrane de Bowman

Sous l’épithélium cornéen, on retrouve une membrane acellulaire nommée membrane de

Bowman. Cette membrane est composée principalement de collagène de type I, mais aussi

de types III, V, VI et XII (Jacobsen, Jensen, & Prause, 1984; Marshall, Konstas, & Lee,

1991; Nakayasu, Tanaka, Konomi, & Hayashi, 1986). Les fibrilles de collagène du stroma

sous-jacent s’y insèrent, ce qui suggère un rôle de la membrane de Bowman dans le

maintien structural de la cornée (Komai & Ushiki, 1991). Son épaisseur est d’environ 8 à

12 µm et tend à décroitre en fonction de l’âge (Eghrari et al., 2015). Si elle est

endommagée, la membrane de Bowman ne se renouvèle pas.

1.2.3 Le stroma cornéen

Le stroma constitue la majeure partie de la cornée, car avec ses 500 µm, c’est près de 90%

de l’épaisseur de la cornée totale qui lui est allouée (Hogan & A., 1971). Le stroma forme

un réseau complexe et unique de fibrilles de collagène arrangées en hétérodimères de

collagène de type I et de type V. Les fibrilles de collagène du stroma ont un diamètre

uniforme de 32 ± 7 nm et les fibrilles sont toutes disposées à égale distance les unes par

rapport aux autres (Birk, Fitch, Babiarz, Doane, & Linsenmayer, 1990; Fini & Stramer,

2005; Komai & Ushiki, 1991). Ces dernières s’arrangent en lamelles qui sont superposées

avec différents angles de manière parallèle à la surface. Le stroma cornéen contient entre

200 et 250 lamelles distinctes (Hamada, Giraud, Graf, & Pouliquen, 1972; Maurice, 1970).

C’est l’agencement précis et régulier des fibrilles de collagène et de la MEC à l’intérieur du

stroma qui lui confère sa transparence. Ce réseau est aussi organisé de manière à faciliter le

passage de la lumière tout en prévenant sa dispersion et confère à la cornée sa force

mécanique. En plus des fibrilles de collagène, le stroma cornéen est aussi composé de

protéoglycanes, tels que le lumicane, le kératocane et le mimécane (Michelacci, 2003). Ces

protéines contribuent au support structural du stroma en modulant le diamètre des fibrilles

de collagène auxquelles elles se lient. Le stroma contient aussi des glycosaminoglycanes,

tels que le kératane sulfate, le chondroïtine sulfate et le dermatane sulfate, qui eux, régulent

l’espacement inter-fibrillaire (Saika, Ohnishi, Ooshima, Liu, & Kao, 2002). Les kératocytes

sont les principales cellules résidentes du stroma cornéen. On les retrouve principalement

dans la partie antérieure du stroma. Les kératocytes sont responsables du maintien de

(25)

l’homéostasie du stroma, et ce par la production de collagènes, de glycosaminoglycanes et

de métalloprotéinases matricielles (MMPs) (DelMonte & Kim, 2011). À l’instar des

cellules du cristallin, les kératocytes du stroma contiennent un grande proportion de

protéines solubles nommées crystallines qui permettent de réduire la dispersion de la

lumière par les kératocytes et ainsi maintenir la transparence de la cornée (Jester et al.,

1999). Des cellules dendritiques et des macrophages résident également dans le stroma et

participent à l’immunité cornéenne (Hamrah & Dana, 2007; Hamrah, Liu, Zhang, & Dana,

2003).

1.2.4 La membrane de Descemet

La membrane de Descemet est la membrane basale de l’endothélium cornéen. Son

épaisseur est d’environ 3 µm à la naissance et s’épaissit pour atteindre 10 µm à l’âge adulte.

La membrane de Descemet est composée d’une couche antérieure mise en place durant le

développement fœtal et formée de fibrilles de collagène de type IV et de type VIII ainsi que

de protéoglycanes, puis d’une couche postérieure sécrétée par les cellules endothéliales

sous-jacentes après la naissance (Marshall et al., 1991; Sawada, Konomi, & Hirosawa,

1990). Cette membrane acellulaire assiste l’endothélium dans le maintien de la

déshydratation de la cornée.

1.2.5 L’endothélium cornéen

À la surface postérieure de la cornée, on retrouve l’endothélium cornéen. L’endothélium est

composé d’une monocouche de cellules polygonales aplaties. L’épaisseur de l’endothélium

est d’environ 10 µm à la naissance et 4 µm à l’âge adulte (DelMonte & Kim, 2011). Les

cellules de l’endothélium cornéen sont maintenues entre elles par des complexes de

jonctions serrées et communiquent entre elles via des jonctions communicantes (Barry,

Petroll, Andrews, Cavanagh, & Jester, 1995; Joyce, 2003). Ces cellules expriment aussi une

forte densité de pompes sodium-potassium (Na+, K+-ATPase) à leur membrane

basolatérale. Ces pompes ioniques permettent aux cellules endothéliales d’exercer leur

fonction principale, c’est-à-dire le maintien de l’état de déturgescence (état de

déshydratation partiel) du stroma cornéen, lequel est nécessaire afin de permettre une

(26)

transmission optimale de la lumière (Geroski, Matsuda, Yee, & Edelhauser, 1985). En effet,

le transport actif des ions du stroma vers l’humeur aqueuse de la chambre antérieure génère

un gradient osmotique qui entraîne le liquide qui traverse la barrière endothéliale du stroma

hypotonique vers l’humeur aqueuse hypertonique. Cela permet ainsi d’éviter

l’accumulation de liquide dans le stroma (œdème cornéen) et la désorganisation des

fibrilles de collagène (Bonanno, 2003; Fischbarg, 2003). La densité de cellules

endothéliales diminue avec l’âge, passant de 3000-4000 cellules/mm

2

à la naissance à

environ 2500 cellules/mm

2

à l’âge adulte (Abib & Barreto Junior, 2001; Yee, Matsuda,

Schultz, & Edelhauser, 1985). Dans une cornée normale, la densité de cellules endothéliales

décroit à raison de 0,6% par année (W. M. Bourne, Nelson, & Hodge, 1997). Contrairement

aux cellules épithéliales cornéennes, les cellules de l’endothélium cornéen ne prolifère pas

in vivo (Joyce, 2003). Ainsi, lorsque le nombre de cellules endothéliales diminue, les

cellules restantes s’étirent et grossissent afin de combler l’espace laissé par les cellules

mortes. Le vieillissement normal de l’œil et la diminution de la densité endothéliale qui s’y

rattache ne sont généralement pas suffisants pour nuire à la fonction endothéliale. Ce n’est

qu’à partir d’une densité endothéliale de 500 cellules/mm

2

que le risque d’œdème cornéen

augmente (DelMonte & Kim, 2011).

1.3 Les blessures cornéennes

En raison de sa localisation anatomique superficielle, la cornée est particulièrement

vulnérable aux forces abrasives et aux différents traumatismes qui peuvent l’affecter. En

effet, comme la cornée est directement exposée à l’environnement extérieur, il n’est pas

rare qu’elle subisse des dommages. Il est estimé qu’approximativement 20% de la

population souffrira d'une blessure oculaire au moins une fois dans sa vie (Ljubimov &

Saghizadeh, 2015). Aux États-Unis, par exemple, l’incidence des blessures oculaires est

estimée à plus d’un million par année. De ces blessures, 75% vont affecter spécifiquement

la cornée et vont être dues à des dommages abrasifs ou à l’introduction de corps étrangers

dans l’œil (McGwin & Owsley, 2005). En général, une guérison normale des plaies est

rendue possible via le renouvellement de l’épithélium cornéen par les cellules souches

cornéennes. Toutefois, en cas de blessures cornéennes graves, ou si les blessures

(27)

cornéennes ne sont pas rapidement et adéquatement traitées, elles peuvent mener à des

déficiences visuelles importantes qui peuvent aller jusqu’à la cécité. À ce jour, on estime le

nombre de personnes avec une déficience visuelle à 405 millions et le nombre de personnes

souffrant de cécité à environ 36 millions à travers le monde (R. R. A. Bourne et al., 2017).

1.3.1 Types de blessures

Les blessures cornéennes sont fréquentes et d’origines multiples. La gravité de ces

blessures dépendra en grande partie du type de lésion ainsi que de la rapidité et de la

manière dont elles seront prises en charge.

1.3.1.1 Dommages abrasifs et introduction de corps étrangers dans l’œil

Les dommages abrasifs et l’introduction de corps étrangers dans l’œil sont les plus

fréquentes causes de dommages à la cornée. Ils comptent respectivement pour 45% et 30%

des blessures oculaires (McGwin & Owsley, 2005). L’incidence de ces blessures est plus

élevée chez les jeunes hommes, particulièrement chez ceux occupant un emploi dans le

secteur manufacturier et le secteur de la construction (Ahmed, House, & Feldman, 2015).

Les abrasions cornéennes ont souvent une cause traumatique (frottements, coups, présence

d’un corps étranger), mais elles peuvent aussi se produire spontanément chez les personnes

atteintes de sècheresse oculaire. Parmi les causes les plus fréquentes des dommages

abrasifs, on retrouve le frottement des ongles sur la cornée et le port de lentilles cornéennes

(S. Y. Lee, Kim, Johnson, Mondino, & Weissman, 2012; Lin & Gardiner, 2014). Les

blessures de ce type sont aussi fréquentes dans les sports. En fait, aux États-Unis, les

blessures oculaires liées aux activités sportives représenteraient près du tiers des lésions

oculaires menant à la cécité (Commission, 2000). Parmi les sports à plus haut risque, on

retrouve le baseball, le softball, le basketball et le hockey (Cass, 2012). Bien que la

majorité des dommages abrasifs à la cornée puisse guérir spontanément en 2 à 3 jours sans

la nécessité d’avoir recours à des médicaments, certains dommages peuvent mener à des

complications plus importantes pouvant potentiellement menacer la vision. En effet, ces

blessures peuvent évoluer vers la formation d’ulcères cornéens, de kératites infectieuses ou

encore mener à un problème d’érosion récurrente de la cornée (Ahmed et al., 2015). Selon

(28)

une étude rétrospective de 2014, ces complications surviennent dans près de 18% des cas

(Lin & Gardiner, 2014). Dans le cas d’introduction de corps étranger dans l’œil, si celui-ci

n’est pas rapidement retiré du milieu oculaire, il peut mener à la formation d’une cicatrice à

la surface cornéenne (Ahmed et al., 2015).

1.3.1.2 Brûlures chimiques, thermiques et aux rayons ultraviolets

Les brûlures oculaires comptent pour 8 à 18% des traumatismes oculaires (Singh, Tyagi,

Kumar, Gupta, & Sharma, 2013). Les brûlures oculaires sont séparées en trois catégories

selon la nature de l’agent causal: chimiques, thermiques ou dues aux rayons ultraviolets.

Les brûlures chimiques sont les plus fréquentes et les agents chimiques impliqués sont soit

des acides, soit des bases. Les brûlures alcalines sont généralement plus dommageables que

les brûlures acides, car les bases pénètrent plus rapidement les milieux oculaires. En effet,

l'interaction des ions hydroxyles des bases avec les membranes cellulaires perturbe

l’intégrité membranaire et entraîne la mort cellulaire (Paterson & Pfister, 1974). La perte

des barrières cellulaires qui s’en suit permet ainsi à l’agent chimique de pénétrer jusqu’à

l’endothélium cornéen, et même d’atteindre les structures internes du segment antérieur

(Bunker, George, Kleinschmidt, Kumar, & Maitz, 2014).

Les cations des bases, eux,

interagissent avec les glycosaminoglycanes et perturbent l’hydratation du stroma, ce qui

entraîne une opacification cornéenne (Grant & Kern, 1955). Quant aux acides, ils

provoquent plutôt la dénaturation et la précipitation des protéines tissulaires, ce qui crée en

quelque sorte une barrière qui limite la pénétration de l’agent chimique dans l’œil (Singh et

al., 2013).

Parmi les bases responsables des brûlures oculaires, on retrouve l’ammoniac,

l’hydroxyde de potassium, l’hydroxyde de sodium, l’hydroxyde de calcium et

l’hypochlorite de sodium qui sont couramment utilisés dans la confection de détergents

ménagers, de produits réfrigérants et de fertilisants (Merle, Gerard, & Schrage, 2008). Du

côté des acides, l’acide sulfurique, qui est utilisé dans l’industrie du textile et qui entre dans

la confection des batteries automobiles, cause les dommages les plus importants. L’acide

fluorhydrique, l’acide chlorhydrique et l’acide acétique peuvent aussi occasionner des

lésions oculaires (Merle et al., 2008). Les brûlures thermiques sont plutôt rares et sont

généralement occasionnées par des flammes ou liquides chauds lors d’accidents

domestiques. Enfin, lors d’exposition solaire intense ou prolongée, la cornée peut

(29)

également subir une brûlure. En effet, dans de tels cas, les rayons ultraviolets sont presque

entièrement absorbés par la cornée et entraînent un œdème stromal et une photokératite,

c’est-à-dire une inflammation de la cornée. (Merle et al., 2008).

1.3.1.3 Autres blessures cornéennes

Parmi les autres types de blessures cornéennes, on retrouve les infections cornéennes, aussi

appelées kératites infectieuses, qui sont l’une des causes principales de cécité pouvant être

prévenue dans les pays en développement et les pays industrialisés (Resnikoff et al., 2004).

Ces infections sont généralement plus fréquentes chez les porteurs de lentilles cornéennes

(Dart, Radford, Minassian, Verma, & Stapleton, 2008) et peuvent aussi être la conséquence

d’un traumatisme oculaire ou d’une chirurgie antérieure (Ong & Corbett, 2015). Les

infections cornéennes peuvent être causées par une variété de pathogènes, incluant des

bactéries, des virus, des champignons et amibes. Les bactéries Pseudomonas aeruginosa et

Staphylococcus aureus sont responsables de la majorité des cas d’infections bactériennes,

qui comptent pour près de 90% des infections cornéennes dans les pays tempérés. Les

infections fongiques causées par Fusarium et Aspergillus sont, quant à elles, plus

fréquentes dans les pays tropicaux (Shah, Sachdev, Coggon, & Hossain, 2011). Les

infections cornéennes dues au virus de l’herpès simplex demeurent l’une des principales

causes de cécité unilatérale de cause infectieuse aux États-Unis et à travers le monde

(Young, Hodge, Liesegang, & Baratz, 2010). Enfin, certaines chirurgies, comme les

chirurgies de la cataracte et les chirurgies réfractives peuvent aussi causer des dommages à

la cornée. En effet, pour les chirurgies LASIK, dont la popularité ne cesse d’augmenter, la

Food and Drug Administration (FDA) estime l’incidence des complications à 2% des cas

(Ljubimov & Saghizadeh, 2015). Une étude plus réaliste a cependant démontré que ces

complications survenaient avec une fréquence variant entre 5 et 23% (Azar, Chang, & Han,

2012). Concernant les chirurgies de la cataracte, des complications surviennent dans 0,4%

des actes, ce qui correspond à plus de 50 000 cas par année aux États-Unis seulement. Les

chirurgies de la cataracte, à l’instar des chirurgies réfractives, sont elles aussi en

augmentation due au vieillissement de la population. Dans la majorité des cas, les

complications découlant de ces types de chirurgie entraînent une mauvaise cicatrisation de

la cornée, qui peut résulter en des défauts épithéliaux, des cicatrices cornéennes et une perte

de transparence (Azar et al., 2012).