Corrigé td5

TD N°5

Les enzymes compatibles et les isoschizoméres

Exercice 01 :

Un fragment de restriction d’ADN de lapin coupé par l’enzyme Kpn mesure 5100 pb et contient le gène de la β-globine. Par hybridation après transfert avec une sonde β-globine on démontre qu’après digestion par EcoR I de ce fragment, deux sous fragments (de 2500 et de 800 pb) s’hybrident avec cette sonde, alors qu’à la suite de sa digestion par BamH I, deux autre sous fragments radioactifs (de 1900 et de 3000) pb) sont produits. Sachant qu’au niveau de l’ADN complémentaire du messager de la β-globine les deux sites BamH I et EcoR I sont distants de 76 pb.

Montrer que la comparaison des cartes de restriction des deux clones permet d’établir l’existence d’un intron dans la séquence de ce gène, et de mesurer sa longueur.

Exercice 02 :

Un plasmide résistant à la kanamycine et à l’ampicilline est coupé avec l’enzyme Pst I, enzyme coupant dans le gène de résistance à l’ampicilline. L’ADN est ligaturé avec les produits de digestion de l’ADN de Drosophile par Pst I, puis utilisé pour transformer E. coli.

a) Quel est le phénotype de la souche d’E. coli utilisé dans cette expérience ?

b) Quel antibiotique, mettrez vous dans le milieu pour vous assurer que les colonies ont un plasmide ?

c) Quels phénotypes de résistance aux antibiotiques trouvera-t-on sur la boite ?

d) Quels phénotypes auront les colonies contenant de l’ADN de Drosophile ? comment appelle-t-on ces colonies ?et comment les sélectionner ?

e) Si des colonies individuelles de la boite en (c) sont cultivées et si leur ADN est extrait, quel profil observez vous après coupure par Pst I et coloration du gel d’électrophorèse au BET ?

Corrigé type

:

Exercice 01 :

La distance entre les premiers sites BamH I et EcoR I à l’intérieur du gène β globine est de 2 500 – 1 900 = 600 pb, or elle n’est que de 76 pb au niveau de l’ADN complémentaire du messager de ce gène. Il est donc clair qu’il existe au moins un intron dans la séquence du gène de la β globine situé entre les deux sites BamH I et EcoR I. La taille de cet intron est de 600 – 76 = 524 pb

Carte de restriction du segment coupé par Kpn :

Kpn Kpn 5 100 pb Kpn Kpn 2500 pb 800 pb 1 600 pb Kpn Kpn non détecté 1 900 pb 3 000 pb 200 pb

Comparaison des séquences codantes du gène au niveau de l’ADN génomique et complémentaire : 600 pb

ADN génomique

Exon 1 Intron Exon 2

ADN complémentaire EcoR I EcoR I BamH I BamH I ADN + Kpn ADN + EcoR I ADN + BamH I BamH I EcoR I BamH I EcoR I 76 pb

Exercice 02 :

a) La souche E. coli constitue l’organisme hôte dans cette expérience alors il faut absolument

qu’elle soit

Amp

S

_Kan

S

b) Pour s’assurer que les colonies ont un plasmide il faut rajouter dans le milieu la kanamycine parce que le gène de la kanamycine dans le plasmide n’est pas touché par l’insertion

c) Dans cette boite qui contient la kanamycine, les colonies qui apparaissent sont forcément résistantes à cet antibiotique mais on ne peut savoir si elles sont aussi résistantes à l’ampicilline ou sensibles. Donc il y aura deux types de colonies :

-

Amp

R

Kan

R -

Amp

S

Kan

R

d) - L’ADN de Drosophile est l’insert qui sera au niveau du gène de résistance à l’ampicilline, ce

qui inactivera ce dernier et la souche qui porte cet ADN aura le phénotype :

Amp

S

Kan

R

- Ces colonies sont appelées des clones positifs car elles contiennent le plasmide recombiné - La sélection des clones positifs peut être effectué par la méthode des répliques : le principe de cette méthode et de transférer par un disque en velours, les colonies qui sont dans la boite plus

kanamycine (c'est-à-dire

Kan

R) dans une autre boite qui contient de l’ampicilline.

Par comparaison des deux boites, les colonies qui n’ont pas poussées dans le deuxième milieu et qui

seront

Amp

S

Kan

R (clone +) peuvent être sélectionnées et transférer dans un autre milieu de culture

pour en obtenir une culture pure.

e) Puisque il existe deux types de colonies dans la boite en (c) donc on obtient deux types de profils de digestion (La digestion par Pst I libérera l’insert si il est dans le plasmide)

Colonie

Amp

S

Kan

R Colonie

Amp

R

Kan

R Bande d’ADN

plasmique

Bande d’ADN insert