Étude des interfaces des nanocatalyseurs / glucose et enzymes / O2 pour une application biopile

Texte intégral

(1)THÈSE pour l’obtention du Grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE POITIERS (Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées) (Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006) École Doctorale : Sciences pour l’Environnement - Gay Lussac Secteur de Recherche : Chimie Théorique, Physique, Analytique Présentée par :. Pradel TONDA-MIKIELA ***************************************************************************. ÉTUDE DES INTERFACES DES NANOCATALYSEURS / GLUCOSE ET ENZYMES / O2 POUR UNE APPLICATION BIOPILE *************************************************************************** Directeur de Thèse : Boniface Kokoh Codirecteurs de Thèse : Karine Servat et Teko Napporn ************************ Soutenue le 11 décembre 2012 devant la Commission d’Examen ************************ JURY Pierre GROS. Professeur, Rapporteur Université Paul Sabatier de Toulouse. Eric SIBERT. Chargé de Recherche au CNRS,-HDR, Rapporteur Université de Grenoble. Hyacinthe RANDRIAMAHAZAKA. Professeur, Examinateur Université Paris 7. Sophie TINGRY. Chargée de Recherche,-HDR, Examinateur Université de Montpellier 2. Jean-Michel LÉGER. DR au CNRS, Examinateur Université de Poitiers. K. Boniface KOKOH. Professeur, Examinateur Université de Poitiers. Karine SERVAT. Maître de Conférences, Examinateur Université de Poitiers. Teko W. NAPPORN. Chargé de Recherche au CNRS, Examinateur Université de Poitiers.

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(3) Remerciements. Ce travail a été réalisé à l’Institut de Chimie des Milieux et des Matériaux de Poitiers (UMR-CNRS 7285), dirigé par Madame Sabine Petit. Avant de présenter les travaux de ce manuscrit, je tiens à remercier celles et ceux, de près ou de loin, qui m’ont permis de réaliser ce travail. Je remercie tout d’abord Messieurs Jean-Michel Léger, ancien directeur du LaCCO et Boniface Kokoh responsable de l’équipe « E-lyse» de m’avoir accepté au sein de cette équipe et de m’avoir si bien accueilli. Mes sincères remerciements s’adressent cette fois à mes encadrants Monsieur Boniface Kokoh mon Directeur de thèse, Karine Servat et Teko Napporn, mes co-directeurs de thèse, pour m’avoir encadré durant ces trois années. Leur disponibilité constante à mon égard, leur soutien, les conseils pratiques et personnels, leur rigueur scientifique, leur pédagogie et leur aide précieuse ont permis à ce travail d’aboutir. Je tiens aussi à exprimer mes remerciements à toute l’équipe « E-Lyse » : Claudia Gomes De Morais, Nicolas Alonso-Vante, Christophe Coutanceau, Stève Baranton, Jean Christophe Guillon, Aurélien Habrioux. Je remercie également l’ANBG (Agence Nationale des Bourses du Gabon) pour le soutien financier durant mes deux premiers cycles universitaires ainsi que la Région PoitouCharentes pour m’avoir octroyé une allocation me permettant ainsi d’effectuer cette thèse durant ces trois ans. Je remercie chaleureusement les doctorants de l’équipe et amis de l’IC2MP : Patrick, Nurcan, Désiré, Paulin, Mario, Seydou, Jiwei, Thomas, Anna, Yaovi, Francis, Charly, Idalina, Laurisse, et tous les autres qui auront la gentillesse de m’excuser d’avoir oublié de les citer. Je remercie aussi toute la communauté gabonaise et les amis de Poitiers, en particulier Maïllys, Prisca, Samy, Galiciat, Michel, Emile, André et Anne Marie Taxier, pour leur amitié et leur présence ainsi qu’à tous les membres de la chorale MRC de Poitiers. Je tiens également à remercier très chaleureusement toute ma famille pour leur soutien moral et financier et pour leur amour, tout particulièrement à mon père TONDA-MIKIELA et ma maman TONDA SONGA Philomène..

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(5) Sommaire GLOSSAIRE .................................................................................................................................. 1 INTRODUCTION .......................................................................................................................... 5 I. Etude bibliographique ............................................................................................................. 9 I. 1. Introduction ..................................................................................................................... 9 I. 2. Oxydation du glucose .................................................................................................... 10 I. 2. 1 Oxydation du glucose sur les matériaux nobles ..................................................... 11 I. 2. 2 Oxydation du glucose sur les nanoparticules de platine........................................ 14 I. 2. 3 Oxydation sur les nanoparticules d’or ................................................................... 15 I. 2. 4 Oxydation du glucose sur les nanoparticules AuPt ................................................ 15 I. 3 Différentes méthodes de synthèse de nanomatériaux.................................................. 16 I. 3. 1 La méthode polyol de synthèse des nanoparticules .............................................. 16 I. 3. 2 La synthèse « water in oil microemulsion » ........................................................... 17 I. 3. 3 Synthèse par la méthode dite Slot ......................................................................... 19 I. 3. 4 Autres méthodes de synthèses .............................................................................. 20 I. 4. Réduction enzymatique de l’oxygène moléculaire ....................................................... 20 I. 5. Techniques d’immobilisation des enzymes................................................................... 22 I. 5. 1 Emprisonnement dans une matrice de polypyrrole .............................................. 23 I. 5. 2 Immobilisation de l’enzyme par adsorption .......................................................... 25 I. 5. 3 Immobilisation de l’enzyme par greffage covalent ................................................ 25 I. 6 Réduction enzymatique d’O2 par la laccase ................................................................... 26 I. 6. 1 Transfert direct d’électrons .................................................................................... 26 I. 6. 2 Transfert indirect d’électrons ................................................................................. 27 I. 7 Réduction enzymatique d’O2 par la Bilirubine oxydase (BOD) ...................................... 28 I. 7. 1 Le transfert direct d’électrons ................................................................................ 29 I. 7. 2 Le transfert indirect d’électrons ............................................................................. 29 I. 8 Les biopiles Glucose /O2 ................................................................................................. 30 I. 9. Conclusion et stratégie envisagée ................................................................................. 32.

(6) II. Techniques et méthodes expérimentales ............................................................................ 37 II. 1 Nettoyage de la verrerie................................................................................................ 37 II. 2 Caractérisation électrochimique ................................................................................... 39 II. 2. 1 Caractérisation électrochimique par voltammétrie cyclique à variation linéaire de potentiel ........................................................................................................................... 39 II.2. 3 Electrode à disque et anneau tournants (EDAT) .................................................... 40 II. 3. La spectroscopie infrarouge in situ à transformée de Fourier ..................................... 41 II. 4 CO stripping ................................................................................................................... 44 II. 5. Caractérisation physique des nanomatériaux synthétisés. ......................................... 45 II. 5. 1 La diffraction des rayons X en transmission (DRX)................................................ 45 II. 5. 2 La Microscopie Electronique à transmission MET................................................. 46 II. 5. 3 L’Analyse Thermique Différentielle et Gravimétrique (ATD-ATG) ........................ 47 II. 5. 4 Analyse par Chromatographie Liquide Ionique Haute Performance (CLIHP) ....... 47 II. 6. Conclusion .................................................................................................................... 48. III. Synthèse et caractérisations des nanoparticules à base d’or et de platine ....................... 53 III. 1. Synthèse de nanoparticules d’or, de platine et or-platine ......................................... 53 III. 2 Caractérisation physicochimique des nanoparticules monométalliques d’or, de platine et des matériaux bimétalliques or-platine............................................................... 55 III. 2. 1 Les catalyseurs monométalliques ........................................................................ 55 III. 2. 2 Nanoparticules de platine .................................................................................... 55 III. 2. 2. 1 Caractérisations physiques ............................................................................... 55 III. 2. 2. 2 Caractérisations électrochimiques ................................................................... 57 III. 2. 3 CO stripping sur Pt/C ............................................................................................ 60 III. 3. Nanoparticules d’or ..................................................................................................... 62 III. 3. 1 Caractérisation physique des nanoparticules Au/C ............................................. 62 III. 3. 2 Caractérisation électrochimique des nanoparticules de Au/C ............................ 63 III. 3. 3 CO stripping sur les nanoparticules Au/C. ............................................................ 65 III. 4 Les catalyseurs bimétalliques AuPt .............................................................................. 66 III. 4. 1 Caractérisations physiques des catalyseurs AuPt ................................................ 66 III. 4. 2 Caractérisation électrochimique. ......................................................................... 70 III. 4. 3 CO stripping sur les catalyseurs bimétalliques AuPt ............................................ 73 III. 5. Analyse par spectroscopie FTIR in-situ ........................................................................ 74 III. 5. Conclusion. .................................................................................................................. 79.

(7) IV. Oxydation du D-glucose sur des catalyseurs abiotiques à base d’or et de platine ............ 83 IV. 1. Oxydation du glucose en milieu alcalin....................................................................... 83 IV. 2. Allure des voltammogrammes sur les différents catalyseurs utilisés au cours de l’oxydation du glucose.......................................................................................................... 83 IV. 3. Influence de la température sur l’oxydation de la molécule de glucose.................... 86 IV. 4. Etude par spectroscopie IR de réflexion in situ de l’électrooxydation du .................. 89 IV. 4. 1 Oxydation du glucose sur l’électrode de Pt/C...................................................... 89 IV. 4. 2 Oxydation du glucose sur l’électrode de Au/C..................................................... 92 IV. 4. 3 Oxydation du glucose sur les catalyseurs bimétalliques...................................... 93 IV. 5. Oxydation du glucose en milieu tampon phosphate pH 7,4 ...................................... 96 IV. 5. 1 Présentation des voltammogrammes des nanomatériaux d’électrode en milieu tampon phosphate ........................................................................................................... 96 IV. 5. 2 Effet de la température sur l’oxydation du glucose sur les catalyseurs Au/C, Pt/C, Au70Pt30/C et Au50Pt50/C ................................................................................................... 97 IV. 6. Conclusion ................................................................................................................. 100. V. Réduction enzymatique de la molécule de dioxygène par la bilirubine oxydase.............. 105 V. 1. Electroréduction de la molécule d’oxygène par la bilirubine oxydase (BOD) ........... 105 V. 1. 1 Etude voltammétrique de l’acide 2,2’-azinobis-3-éthylbenzothiazoline-5sulfonique (ABTS) en milieu tampon phosphate. .......................................................... 105 V. 1. 2 Etude voltammétrique du complexe d’osmium : [Os(4,4’-dichloro-2,2’bipyridine)2(4-aminomethyl-pyridine)Cl]PF6.................................................................. 107 V. 2 Immobilisation de la BOD et du médiateur dans une matrice de Nafion® ................. 108 V. 3 Comparaison des biocathodes et d’une cathode de platine pour la réduction d’O2 . 109 V.3.1 Etude sur une électrode à disque tournant .......................................................... 109 V.3.2 Etude sur une électrode à disque et anneau tournants ....................................... 111 V. 4. Conclusion .................................................................................................................. 113. CONCLUSION GÉNÉRALE ........................................................................................................ 117. Références Bibliographiques.................................................................................................. 121.

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(9) GLOSSAIRE Acide 2,2-azinobis-3-éthylbenzothiazoline-5-sulfonique………………………………...ABTS Acide Hydroquinone Sulfonique…………………………………………………………. HQS Analyse Thermogravimétrique…………………………………………………………….ATG Bilirubine Oxydase………………………………………………….……………………..BOD Biofuel cell………………………………… ……………………….……………………..BFC Borohydrure de sodium………………………………………………………………….NaBH4 Bromure de tétraoctylamonium…………………………………………………………..TOAB Diffraction des rayons X……………………………………………...……………………DRX Dodécanthiol…………………………………………………………..……………………..DT Electrode au Calomel saturée…………………………………………...………………….ECS Electrode au chlorure d’argent…………………………………..…...……………Ag/AgCl/ClElectrode Normale à Hydrogène………………………………………….………………..ENH Electrode Réversible à Hydrogène………………………………………...……………….ERH Flavine adénine déshydrogénase……………………………………………...……………FAD Glucose déshydrogénase…………………………………………………………………..GDH Glucose oxydase……………………………………………………………….…………..GOD Microfuel cell……………………………………………………………………………...MFC Microscope électronique en transmission………………………………………………….MET Méthode échange d’anions……………………………...…………………………………MEA Nicotinamide adénine dinucléotide………………………………………………………..NAD Polyacrylamide………………………………………………..……………………………PAA Polyvinylimidazole pyrrolidone………………………………..…………………………..PVP Spectroscopie de dispersion d’énergie de rayon X ………………………………………..EDX.

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(11) INTRODUCTION.

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(13) INTRODUCTION La demande croissante en énergie ces dernières décennies a conduit plusieurs équipes de recherche à se pencher sur d’autres moyens de production d’énergie sans attendre l’épuisement programmé des énergies fossiles. L’utilisation de ressources énergétiques telles que l’hydrogène et des combustibles renouvelables permet de développer des piles à combustible plus respectueuses de l’environnement. Selon le type de combustible, on peut envisager de nombreuses applications stationnaires ou mobiles. Le glucose est un combustible non toxique, facile à stocker, disponible à grande échelle car issu de la biomasse. Le concept de biopile trouve son appellation lorsque l’un des catalyseurs la constituant est d’origine biologique. On peut classer les biopiles en trois groupes : La pile microbienne ou Microfuel cell (MFC) qui utilise différents types de bactéries, La biopile à combustible ou biofuel cell (BFC) qui fonctionne avec des enzymes à l’anode et à la cathode La biopile hybride dont l’une des électrodes est constituée d’un catalyseur enzymatique et l’autre d’un matériau abiotique. Dans la plupart des cas, c’est la réaction cathodique qui est catalysée par une enzyme (bilirubine oxydase ou laccase) car cette dernière permet de réduire l’oxygène moléculaire en eau sans intermédiaire réactionnel (H2O2). C’est sur ce dernier type de pile à combustible que porte cette thèse. Le travail présenté se décompose en cinq grandes parties : Dans le premier chapitre, un état de l’art va détailler les différents travaux traitant de l’oxydation de la molécule de glucose sur les catalyseurs enzymatiques et abiotiques ainsi que les diverses méthodes de synthèse des nanomatériaux. La réaction de réduction de l’oxygène a été très largement étudiée dans la littérature car elle représente un verrou scientifique à lever pour la fabrication des piles à combustible. Dans ce chapitre bibliographique, seule la catalyse enzymatique sera envisagée. Les différentes techniques d’immobilisation des enzymes à la surface d’un support conducteur seront abordées. Pour clore ce chapitre, un bilan des performances des biopiles glucose/Oxygène sera exposé. Les différentes techniques et méthodes expérimentales utilisées dans ce travail de thèse seront présentées dans le deuxième chapitre.. 5.

(14) Le troisième chapitre développe la nouvelle méthode de synthèse des nanoparticules « Méthode par Echange d’Anions ». Elle permettra de préparer sans apport de surfactant organique des catalyseurs mono et bimétalliques à base de platine et d’or. Le chapitre IV concerne l’oxydation électrocatalytique du combustible glucose sur les matériaux d’électrodes abiotiques. L’étude de la réaction de réduction de l’oxygène moléculaire sur la bilirubine oxydase (BOD) en présence de médiateur, soit l’ABTS, soit le complexe d’osmium, constituera le cinquième chapitre. Pour finir, une conclusion générale sera présentée ainsi que les perspectives relatives à cette étude.. 6.

(15) CHAPITRE I : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE. 8.

(16) I. Etude bibliographique I. 1. Introduction Une pile Glucose/Oxygène utilise le glucose comme combustible et l’oxygène moléculaire comme comburant pour convertir l’énergie chimique de la réaction en énergie électrique. L’oxydation du glucose peut mettre théoriquement en jeu 24 électrons permettant sa transformation en dioxyde de carbone (CO2) [1, 2]. Grâce à un enchaînement par cascade de six enzymes. (glucose. déshydrogénase,. glucose. 2-déshydrogénase,. aldolase,. déshydrogénase, aldéhyde déshydrogénase, oxalate oxydase), Shuai Xu et col.. [3]. alcool. ont mis en. évidence l’oxydation du glucose en CO2 en faible quantité ; ce qui se traduit par des faibles densités de puissance 6,74 µW.cm-2. En général le produit d’oxydation du glucose est l’acide gluconique quel que soit le catalyseur utilisé (Enzymatique ou abiotique). •. A l’anode, la réaction envisagée est l’oxydation du glucose en acide gluconique qui se fait en deux étapes :. 1ère étape : Oxydation du glucose en gluconolactone : C6H12O6 → C6H10O6 + 2 H+ + 2 e2ème étape: Hydrolyse spontanée de la gluconolactone en acide gluconique: C6H10O6 + H2O → C6H12O7 •. A la cathode, la réaction visée est la réduction de l’oxygène moléculaire en eau avec un échange de 4 électrons: O2 + 4 H+ + 4 e- → H2O. Toutefois suivant le catalyseur utilisé, cette réaction peut conduire à la production de peroxyde d’hydrogène : O2 + 2 H+ + 2 e- → H2O2. 9.

(17) •. Equation de la pile : 2 C6H12O6 + O2 → 2 C6H12O7. Les réactions anodique et cathodique peuvent être catalysées par des catalyseurs métalliques ou d’origine biologique. Par conséquent, la notion de biopile sera utilisée lorsqu’au moins l’un des catalyseurs est d’origine biologique (par exemple une enzyme dans notre cas).. e-. e-. (a) Comburant. Combustible. O2. Glucose M. E. E. M. Acide gluconique. H 2O Cathode. Anode. M: Médiateur ABTS: Acide 2,2-azinobis -3-éthylbenzothiazoline-5. e-. e-. sulfonique. (b). BOD: Bilirubine oxydase. Comburant. Combustible. O2. Glucose E. E: Enzyme. M. GOD: Glucose oxydase HQS: Acide 8-hydroxyquinoline-5-sulfonique hydraté. Catalyseur. Acide gluconique. H 2O Cathode. Anode. Figure 1 : Schémas de principe de biopiles : (a) Biopile enzymatique, (b) biopile hybride. I. 2. Oxydation du glucose L’oxydation du glucose peut se faire suivant deux voies : par voie biologique [4-8] en utilisant des composés organiques comme catalyseurs tels que les enzymes, les microorganismes, et par voie métallique. Les enzymes généralement utilisées pour l’oxydation du glucose sont la glucose oxydase (GOD) et la glucose déshydrogénase (GDH). Certains travaux ont montré que la GDH engendrait de grandes surtensions au cours de l’oxydation du glucose. Ces surtensions sont causées par la nécessité d’utiliser le cofacteur pyridinique car il s’agit d’une enzyme NAD-dépendante [9]. De même, l’utilisation d’une quinoprotéine glucose déshydrogénase reliée à un cofacteur de pyrroloquinoline quinone a 10.

(18) montré une faible stabilité, limitant son utilisation dans une biopile [10]. Lorsque la réaction d’oxydation du glucose est catalysée par la GOD, la présence de l’oxygène moléculaire entraîne la formation de peroxyde d’hydrogène qui est un produit inhibiteur de la GOD [1113]. Lorsqu’elle est immobilisée avec la flavine adénine déshydrogénase (FAD) dont le potentiel redox est de -0,36 V vs. Ag/AgCl à pH 7,2, l’oxydation du glucose s’effectue à -0,46 V vs. Ag/AgCl dans un électrolyte ayant un pH = 7.9 [14]. Sur les catalyseurs abiotiques tels que le platine, il a été démontré que le processus d’oxydation de la molécule de glucose débute à très bas potentiels, aux alentours de 0,2 V vs. ERH [15]. Des études récentes ont présenté une meilleure activité vis-à-vis de l’oxydation du glucose, en utilisant des catalyseurs métalliques à base de Au-Pt par rapport au catalyseur enzymatique. Par exemple, des puissances de 30 µW à 0,16 V pour le système constitué de la GOD, contre 72 µW à 0,38 V pour le système abiotique Au-Pt [16]. Au vu des observations faites sur les catalyseurs métalliques, ce travail de thèse s’est focalisé sur ces matériaux (or et platine), de l’état massif à l’état nanométrique.. I. 2. 1 Oxydation du glucose sur les matériaux nobles Dans les années 80 et 90, les premiers travaux relatifs à l’oxydation de la molécule de glucose sur les métaux nobles ont été réalisés, notamment sur le platine [15, 17-22] et l’or [17, 23, 24] massifs. Plusieurs observations ont été faites pour l’oxydation du glucose sur ces métaux. • Sur le platine massif, il a été établi que l’oxydation du glucose débutait à très bas potentiel, soit 0,3 V vs ERH pour une étude menée en milieu tampon phosphate [22]. Ce résultat fut confirmé plus tard par Kokoh et col. [15] en travaillant dans les mêmes conditions. Au cours de son processus d’oxydation, la réaction d’oxydation du glucose implique la déshydrogénation du carbone anomérique [19, 21] existant sous deux formes (α et β). La forme β-glucose est plus réactive que la forme α-glucose [21, 25]. Cette différence s’explique par l’orientation géométrique de l’atome d’hydrogène lié au carbone anomérique comme le montre la figure 2.. 11.

(19) Carbone anomérique. Anomère β D-(+) glucose. Anomère α D-(+) glucose. Figure 2: Représentation des anomères de la molécule du glucose Au cours de son oxydation que ce soit en milieu acide ou tampon phosphate, le produit d’oxydation est l’acide gluconique ou la δ-gluconolactone en milieu alcalin [19, 22]. Largeaud et col. [19, 26] ont proposé un mécanisme relatif à l’oxydation du glucose sur platine massif (figure 3).. + Pt. + H+ + e-. Glucose OH. O HO O. HO. + Pt + H+ + e-. OH. Glucono-δ-lactone Figure 3: Mécanisme d'oxydation du glucose sur le platine massif Il a aussi été démontré que le platine présentait quelques inconvénients notamment dans la conception d’une pile glucose/O2 implantable. En effet pour un système implantable, les ions chlorure présentent un effet inhibiteur vis-à-vis de l’oxydation du glucose par la formation des liaisons chlorure-métal à la surface du platine [27]. Par ailleurs, le platine présente une très grande sensibilité à l’empoisonnement dû aux intermédiaires chimisorbés pendant l’oxydation du glucose. Pour pallier ce problème, la surface de platine a été modifiée par certains métaux lourds comme le bismuth 12. [28]. ou l’oxyde de tungstène (WO3). [29]. sous.

(20) forme d’adatomes. Un adatome est un dépôt en sous-tension (underpotentially deposited) dont le principe consiste à déposer le métal à une valeur de potentiel supérieure au potentiel thermodynamique de son dépôt massique. Ces nouvelles électrodes modifiées vont présenter une meilleure électroactivité vis-à-vis de l’oxydation du glucose par rapport au Pt massif seul. Elles sont ainsi moins sensibles à l’empoisonnement comme si les adatomes s’adsorbaient préférentiellement sur le platine. • Les études effectuées sur l’or massif [17] ont montré que l’oxydation du glucose est très faible ou incomplète en milieu acide, modérée en milieu neutre (tampon phosphate) et forte en milieu alcalin. Ces auteurs ont également proposé un mécanisme réactionnel d’oxydation du glucose analogue à celui sur le platine. De plus, Aoun et col. [24] ont mis en évidence que l’oxydation du glucose est favorisée par l’adsorption des hydroxydes à la surface de l’or, ce qui a été confirmé par Pasta et col. [30] avec le mécanisme suivant :. Figure 4: Mécanisme d’oxydation de la D-glucose sur l’électrode d’or [30] Pour améliorer l’activité électrochimique de l’or vis-à-vis de l’oxydation du glucose, certains auteurs ont modifié la surface par l’ajout d’adatome [23, 24, 31]. Matsumoto et col. [31] ont obtenu, en ajoutant des adatomes de mercure (Hg) à la surface de l’or, une meilleure activité en comparaison avec l’électrode d’or massif pour l’oxydation du glucose en milieu alcalin. De même Aoun et col. [23, 24], travaillant dans les mêmes conditions sur une électrode de Au(111) modifiée par des adatomes de Cu, Ag, Ru, Pt, Pd and Cd, ont montré que l’électrode d’or modifiée avec 1/3 de monocouche de Ag présente une meilleure activité vis-à-vis de l’oxydation du glucose. Elle présente également un potentiel de début d’oxydation inférieur à celui de l’or massif (-0,65 contre -0,55 V vs Ag/AgCl/KCl(sat)). Les meilleures performances obtenues par ces auteurs sont dues à l’adsorption abondante des hydroxydes sur les adatomes de Hg et Ag. Bien que l’or soit, à l’état massif, plus sélectif que le platine, il a été démontré qu’il présentait une affinité pour l’adsorption des ions chlorures en milieu neutre conduisant ainsi à son inhibition [30]. 13.

(21) Au cours de ces dernières années, les métaux nanostructurés ont fait l’objet de plusieurs recherches grâce à leurs nouvelles propriétés électronique, optique et catalytique. En effet, dans le domaine nanométrique, les propriétés physique et chimique sont étroitement liées à la forme et à la taille de particules [32].. I. 2. 2 Oxydation du glucose sur les nanoparticules de platine L’activité des nanoparticules de platine vis-à-vis de l’oxydation du glucose a été étudiée par Grace et col. [33]. Ces nanoparticules synthétisées, en utilisant la tetraaniline comme agent réducteur, présentent une taille moyenne de 18 nm. Au cours de l’étude voltammétrique pour une concentration de glucose de 10 mmol.L-1 en milieu NaOH 0,1 mol.L-1, le voltammogramme obtenu présente les mêmes caractéristiques que celui obtenu sur platine massif. Toutefois sur le platine nanométrique, les densités de courant sont nettement supérieures à celles obtenues sur platine massif (20 mA.cm-2 contre 6,5 mA.cm-2). Par ailleurs, en changeant l’agent réducteur par l’hexadecaaniline [34], ils obtiennent des nanoparticules de taille plus petite (14 nm) et augmentent ainsi les densités de courant d’oxydation du glucose. Comme pour le platine massif, les nanoparticules de platine sont également sensibles à l’empoisonnement par les produits d’oxydation. Dans le but d’améliorer les performances de l’anode de la pile et de minimiser l’empoisonnement de la surface du platine, des catalyseurs bimétalliques ont été synthétisés. Ainsi, Cui et col. [35] ont préparé des nanoparticules de Pt-Pb par électrodéposition sur des nanotubes de carbone. Ces nanomatériaux ont présenté une très bonne activité vis-à-vis de la détection du glucose dans les conditions physiologiques (pH neutre) pour une concentration en glucose de 11 mmol.L-1 avec une densité de courant de 17,8 mA.cm-2 et ce, jusqu’à une limite de 1,8 µM. D’autres matériaux tels que le bismuth, le ruthénium ou l’or ont été associés à du platine pour former des catalyseurs bimétalliques. En utilisant ces nanomatériaux, Basu et col. ont montré que les catalyseurs bimétalliques AuPt présentaient une activité plus élevée au cours de l’oxydation de la molécule de glucose en milieu alcalin [36-38].. 14.

(22) I. 2. 3 Oxydation sur les nanoparticules d’or Les travaux menés par Tominaga et col. [39] sur les nanoparticules d’or pour l’oxydation du glucose en milieu alcalin et en milieu tampon phosphate pH 7, ont montré qu’en milieu alcalin au potentiel de -0,3 V vs. Ag/AgCl le produit d’oxydation majoritaire est le gluconate. Par contre pour un potentiel compris entre -0,1 et 0,3 V vs. Ag/AgCl, le produit majoritaire détecté est la gluconolactone. En synthétisant des matériaux bimétalliques Au-Ag [40], les auteurs ont montré que ces métaux présentaient un effet de synergie vis-à-vis de l’oxydation du glucose en milieu alcalin. De plus la composition Au82Ag18 et Au73Ag27 présentent un potentiel de début d’oxydation inférieur à celui de Au (-0,75 contre -0,65 V vs. Ag/AgCl). Ces résultats ont été également obtenus par Balcàzar et col. [41, 42] avec des densités de courant plus élevées sur AuAg (4 mA.cm-2) que sur Au (2,8 mA.cm-2). Habrioux et col. [43] ont effectué une étude comparative de l’activité des nanoparticules d’or synthétisées suivant deux méthodes différentes pour l’oxydation du glucose (10 mmol.L-1) en milieu NaOH 0,1 mol.L-1. Les nanoparticules d’or synthétisées par une méthode physique, la pulvérisation au magnétron, présentent une meilleure activité que celles obtenues par microémulsion qui est une méthode chimique. L’activité vis-à-vis de l’oxydation du glucose des nanoparticules obtenues par cette méthode physique dépend fortement du temps de pulvérisation. En effet, pour un temps de pulvérisation faible (10 s), les particules sont bien dispersées et non agglomérées. L’agglomération des particules débute avec l’augmentation du temps de dépôt (30 s) pour atteindre un film d’or à 90 s.. I. 2. 4 Oxydation du glucose sur les nanoparticules AuPt Les catalyseurs bimétalliques AuPt sont mentionnés dans la littérature comme présentant une très bonne activité vis-à-vis de l’oxydation de la molécule de glucose. En 2004, Möller et col. [44] ont montré un effet de synergie de la structure alliée de AuPt sur l’oxydation des molécules organiques. Les travaux de Comotti et col. [45] ont permis d’observer que l’activité de ces catalyseurs présente un taux de conversion du glucose en acide gluconique plus élevé que sur le catalyseur nanométrique à base de platine. Jin et col. [46] ont réalisé l’oxydation du glucose en milieu alcalin sur une électrode d’or et une autre à base de nanoparticules AuPt. Au cours de cette oxydation, l’électrode AuPt présente des densités de courant deux fois plus 15.

(23) élevées et un potentiel de début d’oxydation très bas ( -0,7 V contre -0,35V vs. Ag/AgCl pour Au). Habrioux et col. [16, 47], travaillant dans des conditions physiologiques, obtiennent pour les nanoparticules bimétalliques AuPt des meilleurs résultats en termes de densité de courant et de densité de puissance vis-à-vis de l’oxydation du glucose. Basu et col. [48] ont aussi énoncé que les nanoparticules Au-Pt sont capables d’oxyder la molécule de glucose à bas potentiel, comme le platine, avec des densités de courants plus élevées que sur l’électrode à base d’or. Cela se traduit, comme pour le platine, par la déshydrogénation du carbone anomérique de la molécule du glucose. L’or quant à lui, permettrait de minimiser l’empoisonnement du platine au cours du processus d’oxydation. Pour mieux comprendre la relation entre Au et Pt dans le catalyseur bimétallique Au-Pt, il est nécessaire de faire une étude de sa structure. Mott et col. [49] ont conclu qu’il y a un effet de synergie entre l’or et le platine de composition nanométrique. Bus et col. [50] précisent que la réactivité de ces nanomatériaux peut s’expliquer par les échanges électroniques entre l’orbitale 5d de l’or et l’orbitale 5d du platine, affectant ainsi leurs énergies de bandes de valence. Il a été par ailleurs démontré que lorsque ces nanomatériaux avaient une teneur élevée en or, ils présentaient des propriétés d’alliages et un effet d’enrichissement de surface en platine pour de faibles teneurs en or [51].. I. 3 Différentes méthodes de synthèse de nanomatériaux Les résultats présentés précédemment sont issus de nombreuses méthodes de synthèse qui vont être détaillées dans le paragraphe ci-dessous.. I. 3. 1 La méthode polyol de synthèse des nanoparticules La méthode de synthèse par polyol a été décrite dans la littérature dès 1989 par Fievet et col. [52]. Elle permet la réduction des sels métalliques par l’éthylène glycol comme le résument les équations suivantes :. 16.

(24) CH2OH-CH2OH. ↔. CH 3-CHO + H2O. déshydrogénation. CH2OH-CH2OH + 2 OH-. ↔. MO2 + 4 CH3-CHO. → M + 2 CH 3-CO-CO-CH3 + H2O. CH2O--CH2O- + H2O. pKa = 6,5. (Éq 1) (Éq 2) (Éq 3). L’éthylène glycol présente deux fonctions alcool primaire. D’une part, il sert de solvant pour la dissolution du sel en milieu alcalin conduisant à la formation d’une phase intermédiaire (hydroxydes et / ou oxyde de métal). D’autre part, il permet la réduction des ions métalliques en se transformant en aldéhyde (équation 3). Plusieurs métaux ont ainsi pu être synthétisés par cette méthode. Viau et col. [53] ont dans un premier temps synthétisé des microparticules de cobalt et de nickel. Plus tard, Wang et col [54] ont synthétisé des particules de platine de taille nanométrique avoisinant 1 nm. La méthode consiste à porter à reflux l’éthylène glycol à pH basique (pH = 11-12) contenant un sel de platine, le tout sous azote.. I. 3. 2 La synthèse « water in oil microemulsion » La synthèse par microémulsion est un système ternaire eau-heptane-Brij®30. Le terme microémulsion est défini comme un mélange translucide et thermodynamiquement stable de deux phases non miscibles. Après mélange des deux phases (figure 5), il s’ensuit un processus de nucléation et de croissance des nanoparticules à l’intérieur des micelles. Le mécanisme de formation des nanoparticules est basé sur deux procédés. Le premier est basé sur le diagramme proposé par LaMer et col. [55] qui montre que la première étape de formation des nanoparticules est la nucléation, suivie de leur croissance. Par conséquent la taille des particules augmente avec la concentration en sel métallique dans les micelles. Le second procédé est basé sur la thermodynamique des nanoparticules par l’intermédiaire du tensioactif. Les auteurs concluent que lorsque la concentration en sel métallique et la taille des micelles varient, la taille des nanoparticules reste constante. De ce fait, le processus de nucléation continuerait pendant la. 17.

(25) formation des nanoparticules. Grâce à cette méthode, Boutonnet et col. [56] ont pu synthétiser des nanoparticules de métaux nobles (Pt, Pd, Rh, Ir). Dans les années 90, Tojo et col. [57] ont montré qu’il existait deux mécanismes au cours de la formation des nanoparticules par microémulsion, dépendant des concentrations en réactifs utilisés. Lorsque les concentrations des réactifs sont élevées, l’étape de nucléation s’effectue avant l’étape de croissance. Pour de faibles concentrations, les étapes de nucléation et de croissance se déroulent simultanément. Il a été par ailleurs démontré que la croissance des particules se fait par autocatalyse du noyau et par échange de noyaux entre micelles.. Microémulsion ΙΙ. Microémulsion Ι Phase aqueuse Sels métallique Phase huile N-heptane. Phase aqueuse Agent réducteur (NaBH4) Mélange de Ι et ΙΙ. Phase huile N-heptane. Collision et coalescence des gouttelettes. Précipitation (métal ou oxyde de métal). . Figure 5: Formation de nanoparticules métalliques par la méthode « water in oil microemulsion » [58]. Des nouvelles études menées sur cette méthode de synthèse montrent que lorsque la concentration du tensioactif est supérieure à la concentration micellaire critique, les molécules de tensioactif forment des micelles inverses, favorisant la solubilisation de composés hydrophiles contenus dans la phase organique [58]. La collision des gouttelettes d’eau permet aussi la formation des nanoparticules dans les micelles inverses (figure 5). Pour ce qui est des faibles concentrations en tensioactif, Eriksson et col. [59] ont établi que la formation des micelles permet la solubilisation des composés lipophiles. De plus, ces auteurs ont pu 18.

(26) identifier les paramètres qui affectent la structure des micelles durant la synthèse des nanomatériaux, parmi lesquels le rapport entre eau/tensioactif qui a un effet considérable sur la taille des micelles. En effet, l’augmentation de la quantité d’eau entraîne l’augmentation de la taille des micelles. En revanche, l’augmentation de la quantité en tensioactif engendre la formation d’un grand nombre de micelles, impliquant ainsi la diminution de leur taille. En général, les tensioactifs sont classés en deux catégories [60] : − Les tensioactifs ioniques, dont la tête polaire est dissociable et peut entraîner des répulsions électrostatiques entre les réactifs contenus dans la micelle et la surface de celle-ci. Le plus communément utilisé est le bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate de sodium [61] (AOT). − Les tensioactifs non ioniques ne portant pas de charge électrique sur les parties apolaires, mais un grand nombre de molécules d’eau fortement liées. Tel est le cas des poly(éthylène glycol) dodécyl ethers, CiEj [61] (CiEj correspond au : CH3(CH2)i1O(CH2CH2O)j. H) et le Brij®30 [62-64] .. D’autres travaux ont également été réalisés sur la synthèse de nanoparticules bimétalliques telles que Pt-Ru [63], Pt-Pd [62], Pt-Au [16, 65] en utilisant cette méthode. Néanmoins, pour ce qui est des caractérisations en électrocatalyse, la présence de tensioactifs, difficiles à éliminer au cours du nettoyage, pose un problème car ils bloquent une partie des sites actifs des catalyseurs [59]. Les traitements thermiques et chimiques [62], [66] ont permis de résoudre ce problème sauf dans le cas du Brij®30 où cela provoque le frittage des particules, donc une perte de surface des électrocatalyseurs [66].. I. 3. 3 Synthèse par la méthode dite Slot Slot et col. [67] ont mis au point une méthode contrôlée de synthèse des nanoparticules d’or non supportés. Cette synthèse est réalisée grâce à deux solutions : l’une contenant le sel d’or (HAuCl4, 6 H2O) et l’autre l’acide tannique et le citrate de sodium jouant le rôle de réducteur. L’acide tannique qui est un polyphénol (masse moléculaire 1701 g.mol-1) peut également jouer le rôle de stabilisant de nanoparticules. Ils soulignent que pour cette méthode, trois paramètres clés sont à maîtriser : la température, le pH et la concentration de l’acide 19.

(27) tannique. En fixant la température (60 °C) et le pH (7,5 et 8), ils ont pu mettre en évidence l’effet de la concentration en acide tannique (d’un volume à 1 % massique ajouté/ mL) dans la solution réductrice sur la taille des nanoparticules d’or synthétisées dans une gamme de 3 à 17 nm.. I. 3. 4 Autres méthodes de synthèses D’autres auteurs ont synthétisé des nanoparticules de Au, Ag, AuAg [42, 68] et PtAg [69] à partir de la synthèse de monométallique d’or faite par Brust et col. [70]. Ainsi, partant de deux solutions : une solution de transfert de réactif contenant le sel métallique préalablement dissous dans l’eau, du bromure de tetraoctylammonium (TOAB), dodécanthiol (DT) servant de stabilisant aux particules et une solution réductrice de NaBH4. A la différence de Brust, les autres auteurs, pour se débarrasser de la chaîne carbone DT ont effectué un traitement thermique pendant 2 h à 300 °C. Au cours de ce traitement thermique, Tominaga et col. [71] ont démontré un changement du ratio atomique AuCu. Comotti et col. [45] ont synthétisé des catalyseurs mono et bimétalliques (Au, Pt, Pd et Rh) supportés sur du carbone. Ils se sont abstenus d’utiliser des tensioactifs et des agents protecteurs comme le DT difficile à éliminer. Ils ont plutôt utilisé le glucose comme agent protecteur de nanoparticules facile à éliminer après plusieurs lavages à l’eau, et le NaBH4 comme réducteur.. I. 4. Réduction enzymatique de l’oxygène moléculaire La réaction de réduction de l’oxygène moléculaire en eau présentant une faible surtension est un défi majeur dans le domaine des piles à combustible. Plusieurs travaux ont été effectués concernant la cinétique de réduction du dioxygène par des catalyseurs métalliques [72-74]. Dans ce cas le processus de réduction de la molécule d’oxygène en eau passe par un intermédiaire réactionnel : le peroxyde d’hydrogène. En utilisant des catalyseurs d’origine biologique comme les enzymes, la réaction s’effectue directement avec l’échange de quatre électrons conduisant ainsi à la formation de l’eau [75-79]. 20.

(28) L’enzyme est une protéine qui joue le rôle de catalyseur biologique en transformant un substrat S en produit P. Elle est capable d’abaisser l’énergie d’activation d’une réaction et d’accélérer jusqu’à des millions de fois des réactions chimiques. Elle présente une activité optimale à température ambiante et des pressions proches des valeurs ambiantes. Les enzymes présentent deux spécificités. La première est liée au substrat. Une enzyme est spécifique à une partie bien précise sur le substrat. Toutefois plusieurs enzymes peuvent agir sur des régions différentes du substrat. La deuxième concerne son action spécifique. Elle ne catalyse qu’un seul type de réaction chimique. Ainsi à partir d’un même substrat et avec des enzymes différentes, on obtient des produits différents. Les enzymes sont répertoriées en six classes selon leurs fonctions: •. Les oxydoréductases qui catalysent les transferts d’électrons.. •. Les transférases : enzymes capables de transférer un groupement fonctionnel d’une molécule à une autre.. •. Les hydrolases : enzymes qui provoquent et favorisent l'hydrolyse (décomposition chimique d'une substance par l'eau).. •. Les lyases catalysent la rupture de différentes liaisons chimiques formant ainsi souvent une nouvelle liaison ou un nouveau cycle.. •. Les isomérases : enzymes capables de transformer une molécule en l’un de ses isomères.. •. Les ligases qui permettent la jonction de deux molécules.. Dans le but de coupler une réaction enzymatique et électrochimique, les catalyseurs enzymatiques adéquats sont les oxydoréductases. Dans le cas de la réduction de la molécule de dioxygène, les enzymes généralement utilisées sont la laccase et la bilirubine oxydase (BOD). Ces deux enzymes font partie de la famille des « multicopper oxidase» caractérisées par quatre centres actifs Cu2+/Cu+, qui sont numérotés T1, T2 et deux sites T3 [76]. Le site T1 permet l’électrooxydation du substrat à un électron et le centre trinucléaire formé par T2 et T3 quant à lui est responsable de la réduction du dioxygène [76, 80]. Toutefois, le transfert d'électrons direct de l’enzyme à l’électrode est généralement difficile à cause des structures complexes de ses centres redox et les orientations défavorables de celle-ci au niveau des électrodes. Les questions clés de performance des biopiles sont la 21.

(29) densité de courant, la f.e.m et la durée de vie. Ces problèmes de performances se traduisent par une série de problèmes de conception d'électrodes qui comprend: •. La façon d'obtenir une conductivité électronique efficace entre l'électrode et l'enzyme.. •. La façon d'atteindre des densités de courant suffisamment élevées pour une enzyme immobilisée.. •. La façon de stabiliser l'électrode à enzyme à la dégradation et la lixiviation.. Bien que certaines enzymes aient montré un transfert électronique direct sur l’électrode, la plupart des approches pour le transfert d’électrons de l’électrode à l’enzyme, impliquent l’utilisation de médiateurs qui sont des relais moléculaires qui peuvent récolter des électrons de l’électrode et les conduire sur les sites redox de l’enzyme [77, 78, 81-83]. L’obtention d’une électrode enzymatique stable et performante constitue un problème clé dans sa conception. Pour arriver à de telles performances, il est nécessaire d’immobiliser l’enzyme à la surface de l’électrode [84, 85] ce qui permettra une bonne orientation de l’enzyme et une réduction de la distance entre le site actif de l’enzyme et la surface de l’électrode. Pour y parvenir, plusieurs méthodes d’immobilisation ont été développées dans la littérature.. I. 5. Techniques d’immobilisation des enzymes Il existe différentes techniques d’immobilisation des enzymes à la surface d’une électrode à savoir : l’emprisonnement de l’enzyme dans une matrice de polymère ou encapsulation, l’adsorption à la surface de l’électrode et le greffage covalent de l’enzyme à la surface de l’électrode (figure 6).. 22.

(30) Méthodes d’immobilisation de l’enzyme. Méthode chimique. Greffage. Méthode physique. Adsorption. E. E. E. E. E. E. Encapsulation dans une matrice. E E. Figure 6: Différentes techniques d'immobilisation de l'enzyme à la surface d'une électrode.. I. 5. 1 Emprisonnement dans une matrice de polypyrrole La technique d’immobilisation par encapsulation de l’enzyme consiste à piéger l’enzyme par exemple soit à l’intérieur du réseau tridimensionnel d’une matrice de polymère, soit dans une matrice de Nafion®, ou dans un polymère redox à base d’osmium. Pour l’immobilisation de l’enzyme dans une matrice de polymère, l’électrode est dans un premier temps plongée dans une solution contenant à la fois l’enzyme, le monomère et parfois le médiateur électrochimique. La polymérisation permet l’obtention du réseau dans lequel l’enzyme est retenue, principalement de manière physique, à cause de l’encombrement stérique. Parmi les polymères couramment utilisés, on peut citer le polypyrrole [6, 85-87], la polyaniline [88-90], le polyphénol [91, 92], le poly(3,4-éthylènedioxythiophène) [90] ou bien le poly (éthylène glycol méthacrylate) [93]. L’intérêt d’utiliser un film polymère conducteur réside dans sa capacité à former un réseau de fibres de polymères qui va permettre le transfert des électrons. L’obtention de ces fibres ou la croissance du polymère peut se faire par chronoampérométrie à un potentiel constant [13, 84, 90], par chronopotentiométrie [87] ou par voltammétrie cyclique à variation linéaire de potentiel [6, 87]. L’avantage de ces techniques de 23.

(31) polymérisation est la quantification de l’épaisseur du film de polypyrrole obtenue par la méthode d’équivalence courant-matière [87]. Quand la chronoampérométrie est utilisée, la quantité de pyrrole polymérisé est difficile à contrôler avec précision compte tenu de la variation du courant d’un échantillon à l’autre [87]. En dépit du fait que cette technique d’immobilisation soit efficace, certains auteurs l’ont optimisée par l’ajout du glutaraldéhyde permettant la réduction des pertes de l’enzyme ou du médiateur [85, 94]. Habrioux et col. [95] ont mené une étude plus approfondie, notamment sur l’effet de l’épaisseur du film de polypyrrole et l’effet de sa réticulation par le glutaraldéhyde sur une électrode de type BOD/ABTS au cours de la réduction de l’oxygène moléculaire. Pour ce qui est du comportement du film de polypyrrole, les auteurs indiquent que les densités de courant de réduction sont inversement proportionnelles à l’épaisseur du film de polypyrrole. Dans ces conditions, à un potentiel de 0,2 V vs. ECS, ils obtiennent des densités de courant de 215 µA.cm-2 pour une épaisseur de film de 3,6 µm et 340 µA.cm-2 pour une épaisseur de 1,8 µm. Les sites actifs de l’enzyme deviennent de ce fait difficiles d’accès. L’immobilisation dans une matrice de Nafion® quant à elle, consiste à bloquer l’enzyme sur l’électrode [96-98]. Luo et col. [96] ont démontré que le film de Nafion® peut faciliter l’échange d’électrons entre les sites électroactifs de l’enzyme et l’électrode. Mais la détermination de la quantité d’enzyme est difficile à quantifier une fois l’enzyme immobilisée. Des travaux antérieurs [99] ont montré que le fait de substituer le proton de la fonction sulfonique de Nafion® par un ion ammonium, permet d’augmenter le caractère hydrophobe du polymère. L’utilisation d’un polymère redox à base d’osmium pour immobiliser l’enzyme à la surface de l’électrode fut réalisée par Heller et col. [100-104]. L’avantage avec ce polymère est qu’il joue à la fois le rôle de matrice pour l’immobilisation de l’enzyme, et aussi de médiateur pour le transfert électronique entre le substrat et l’enzyme. Ainsi la distance entre le centre actif de l’enzyme et le polymère se trouve réduit, ce qui améliore la vitesse de transfert d’électrons.. 24.

(32) I. 5. 2 Immobilisation de l’enzyme par adsorption La technique d’immobilisation de l’enzyme par adsorption consiste, à fixer l’enzyme directement sur la surface d’électrode grâce à des liaisons faiblement énergétiques (liaisons hydrogène, liaisons de Van der Waals). Cette technique est facile à mettre en œuvre. Il suffit de mettre l’enzyme au contact de l’électrode. Cette approche a néanmoins un inconvénient : le risque de désorption de l’enzyme qui varie suivant son affinité avec le support et la composition du milieu. C’est pourquoi certains paramètres doivent pris en compte lors du processus d’immobilisation tels que : le pH, la force ionique du milieu et l’hydrophobicité de la surface du support [105].. I. 5. 3 Immobilisation de l’enzyme par greffage covalent L’immobilisation d’une laccase par greffage covalent a été réalisée par certains auteurs à la surface de tube de carbone dans le but d’étudier la stabilité de l’électrode [84]. Au cours de cette étude, ils ont montré que l’activité de l’électrode ainsi préparée présente une valeur maximale après 30 jours lorsque celle-ci est conservée à 4 °C dans une solution de tampon phosphate. Cette performance pourrait s’expliquer par la modification de la conformation des protéines à la surface du polypyrrole fonctionnalisé. Au-delà de 30 jours, une diminution de 50% est observée pour l’activité enzymatique des électrodes ayant un film fin de polymère, tandis que l’activité reste constante pour les films plus épais. D’autres études ont démontré que l’utilisation d’espaceurs carbonés à longue chaîne contribue à avoir de grandes densités de courant et présente moins de surtension qu’une chaîne carbonée courte. La flexibilité permettrait ainsi une grande mobilité de l’enzyme à la surface de l’électrode ce qui favorise la cinétique de réaction de réduction de l’oxygène moléculaire et d’obtenir une densité de puissance de 20 µW.cm-1 [85].. 25.

(33) I. 6 Réduction enzymatique d’O2 par la laccase La laccase (EC 1.10.3.2) est une enzyme extracellulaire appartenant à la famille de « multicopper oxidase » issue des plantes ou des champignons. Elle est capable d’oxyder des composés phénoliques en réduisant simultanément la molécule d’oxygène en eau [76, 106]. Contenant quatre atomes de cuivre notés T1, T2 et deux sites T3 comme précédemment décrit et selon le type de microorganismes dont elle est extraite, la laccase présente des valeurs de potentiels redox comprises entre 430 et 780 mV vs. ERH [107]. Cette différence s’explique par la séquence d’acides aminés autour de son site T1 [107, 108]. Pour ce qui est du mécanisme d’oxydation du substrat, il a été démontré que la réduction du site T1 se faisait avant celle du site T2, suivie d’un transfert intramoléculaire des électrons au site T3 [76, 106]. Le transfert d’électrons entre l’enzyme et l’électrode peut être réalisé de manière directe ou indirecte grâce à un médiateur redox.. I. 6. 1 Transfert direct d’électrons Le transfert direct d’électrons entre le site actif de l’enzyme et la surface d’électrode permet à celle-ci d’agir comme un substrat donneur d’électron. Les études menées par Yaropolov et col. [109] sur deux souches de laccase (Coriolus hirsutus, Rhus vernicifera) ont permis de mettre en évidence le transfert électronique au cours de la réduction de l’oxygène moléculaire. De plus de par leur origine différente, la souche Coriolus hirsutus présente un écart de potentiel pour le début de la réduction de 0,35 V par rapport à Rhus vernicifera, qui peut s’expliquer par la séquence d’acides aminés constituant les sites T1 de chacun [110]. Pour la laccase extraite de la souche Rhus vernicifera et celle de type T. Hirsuta, le potentiel de début de réduction a été observé respectivement à 600 mV vs. ESH à pH 7 et à 725 mV vs. ESH à pH 5 et les auteurs [111] proposent deux mécanismes différents de transfert de charge au cours de l’électroréduction de l’oxygène moléculaire pour cette laccase extraite de deux souches différentes. Lorsque la réduction se fait avec l’enzyme extraite de T. hirsuta quatre électrons sont échangés alors que pour celle extraite de Rhus Vernicifera, ce sont deux électrons échangés conduisant à la formation de peroxyde d’hydrogène. En travaillant sur divers types de laccase de la famille des basidiomycètes en milieu tampon citrate-phosphate à 26.

(34) pH 3, Shleev et col. [107] observent que lorsque l’électrode en graphite est modifiée par les différentes enzymes, ils enregistrent des variations de courant au cours de la réduction de l’oxygène moléculaire, avec des potentiels de début de réduction proches du site T1 de chaque enzyme. Le transfert électronique y est généralement difficile à cause de la structure complexe des centres redox de l’enzyme et des orientations défavorables avec l’électrode. Shleev et col. [112] ont étudié le mécanisme de transfert direct sur deux électrodes différentes (Carbone, Or). Sur l’électrode de carbone le transfert direct (DET) est observé entre la surface de l’électrode et le site T1, tandis que pour le cas de l’or le DET s’effectue entre le site T2 et l’électrode. Ceci a été confirmé par Pita et col. [113] lors de l’étude menée sur une électrode d’or fonctionnalisée par des liaisons thiol avec les enzymes d’origine des basidiomycètes. Ils ont obtenu comme produit de réduction du peroxyde d’hydrogène lorsque l’électrode d’or n’est pas fonctionnalisée. En présence de la laccase extraite de T. hirsuta immobilisée sur les électrodes d’or modifiées par des liaisons thiols, aucune trace de H2O2 n’a été détectée, le produit de la réduction est de l’eau. Pour optimiser le transfert direct, d’autres auteurs ont opté pour la fonctionnalisation de la surface d’électrode avant l’immobilisation de l’enzyme [114116]. Cela permet une meilleure orientation du site T1 de l’enzyme et du substrat.. I. 6. 2 Transfert indirect d’électrons Le transfert indirect (figure 7) peut être réalisé par l’utilisation de molécules organiques comme médiateur électrochimique parmi lesquelles figurent, l’acide 2,2-azinobis-3éthylbenzothiazoline-5-sulfonique (ABTS) [108, 117], le ferricyanure de potassium avec un potentiel redox de 119 mV vs. ECS ou le ferrocène présentant un potentiel redox de 405 mV vs. ECS [108]. Xu et col. [118] ont mis en évidence que le pH de fonctionnement optimal de l’enzyme dépend fortement de la nature du substrat utilisé. Ils ont révélé que pour les substrats phénoliques, cette valeur de pH est comprise entre 5 et 8, alors que pour les substrats non phénoliques elle est inférieure à 7. Quant au médiateur ABTS, la valeur du potentiel de demi-vague du système ABTS•-/ABTS2- augmente avec le pH : 440 mV vs. ECS à pH 4 en milieu citrate phosphate 0,2 mol.L-1 [108], 469 mV et 510 mV vs. Ag/AgCl respectivement à pH 5 et 6 [119-120]. En outre, les études menées par Solís-Oba et col. [119] ont montré que l’ABTS présente deux systèmes réversibles avec des potentiels de demi-vague de 469 et 870 mV vs. Ag/AgCl en milieu tampon acétate 0,1 mol.L-1 à pH 5 sur une électrode de carbone. 27.

(35) L’enzyme peut être également immobilisée sur un polymère rédox d’osmium [81, 82, 121], de molybdène [121], de ruthénium ou de complexe de fer [121]. De part la valeur de leur potentiel redox élevée ([Mo(CN)8]4-/3- 0,55 V vs Ag/AgCl, [Fe(2,2’-bipyridine)3]2+/3+ 0,86 V vs Ag/AgCl ou [Fe(1,10- phénantroline)3]2+/3+ 0,9 V vs Ag/AgCl) par rapport au site T1 de l’enzyme, les auteurs [121] concluent que ces médiateurs ne sont pas favorables à la réduction de O2 avec la laccase. En effet, pour avoir une meilleure performance, le potentiel T1 de l’enzyme doit être supérieur au potentiel redox du médiateur utilisé.. Enz Réd. MédOx. MédRéd. Enz Ox. O2. H2O. Electrode. Figure 7 : Réduction enzymatique indirecte de l’oxygène. I. 7 Réduction enzymatique d’O2 par la Bilirubine oxydase (BOD) La BOD comme la laccase est un « multi-copper oxidase » qui catalyse l’oxydation de la bilirubine en biliverdine [112, 122, 123] avec réduction simultanée du dioxygène en eau. Le site catalytique de la BOD est aussi constitué de trois sites, un site T1, un site T2 et deux sites T3 [76, 123]. Le site T1 est l’accepteur d’électrons provenant du substrat, avant de les transmettre aux sites T2 et T3 [76, 102]. Les BOD couramment utilisées proviennent de deux souches de champignons différentes : Myrothecium verrrucaria avec une masse moléculaire de 66 kDa [77, 110, 123] et Trachyderma tsunodea dont la masse moléculaire est de 64 kDa [78, 110]. Les potentiels redox du site T1 sont respectivement de 670 mV pour Myrothecium verrrucaria et supérieur à 650 mV vs. ENH pour Trachyderma tsunodea. Ces différences de potentiel sont caractérisées par les ligands autour du site T1 de chaque enzyme. Il est ainsi possible de classer la BOD extraite de Myrothecium verrrucaria dans le groupe des « multicopper oxidases » à bas potentiel redox et celle extraite de Trachyderma tsunodea dans le groupe de potentiel redox élevé [110]. En revanche, elles présentent le même potentiel redox au site T2 autour de 390 mV vs. ENH [110]. Les travaux effectués par Mano et col. [78, 28.