Génie génétique et amélioration du riz et du cotonnier

onnier

C. PANNETIER

CIRAD-CA/INRA, Centre de Versailles, 7 8 0 2 6 Versailles Cedex, France E, GUID ER DO NI CIRAD-CA/BIOTROP, BP 5 0 3 5 , 3 4 0 3 2 Montpellier Cedex 1, France B. HAU CIRAD-CA, BP 5 0 3 5 3 4 0 3 2 Montpellier Cedex 1, France

Les recherches sur la transformation

génétique du cotonnier pour la résistance aux insectes sont réalisées au laboratoire de biologie cellulaire de l'INRA, centre de Versailles, dirigé par Y. CHUPEAU. Les personnes suivantes ont participé ou participent au programme : J. TOURNEUR (chercheur CNRS),

P. COUZI (technicien INRA), M . MAZIER (thèse 1991-1994),

V. DUMANOIS-LE TAN (thèse 1 9 9 H 994), M . GIBAND (chercheur CIRAD),

P. M O N TO R O (post-doctorat CIRAD). Au laboratoire BIOTROP (CIRAD) à Montpellier, les personnes ci-après ont participé ou participent au programme de génie génétique du riz :

T. LEGAVRE (chercheur CIRADGERDAT), H. CHAIR (thèse 1991-1994), N. MEZENCEV (DEA Rennes, 1992), D. FERRAND (DESS Angers, 1993), F. GEORGET (DESS Angers, 1994), S, PICHOT (DEA, ENSAIA Nancy, 1994). CIRAD : Centre de coopération

internationale en recherche agronomique pour le développement, France CNRS : Centre national de la recherche scientifique, France

CSIRO : Commonwealth Scientific and Industrial Organization, Australie INRA : Institut national de la recherche agronomique, France

USDA : United States Department of agriculture, Etats-Unis

Les insectes causent sur certaines cultures des dégâts

considérables, obligeant à une utilisation massive

d'insecticides chimiques. Les conséquences

sur l'environnement et sur les équilibres écologiques

sont telles qu'elles rendent nécessaires une évolution

importante des approches de la protection phytosanitaire.

Le transfert de gènes codant pour des protéines

entomopathogènes permet la création de variétés de riz

et de cotonnier résistant à certains de ces ravageurs.

S

i la s é le c tio n c la s s iq u e a p e r­m i s d e s a m é l i o r a t i o n s tr è s s i g n i f i c a t i v e s d e s r i z e t d e s c o to n n ie rs en p a rtic u lie r p o u r le re n ­ d e m e n t e t la q u a l i t é des p r o d u i t s , c e r t a i n s p r o b l è m e s p o s é s p a r ces d e u x c u l t u r e s s o n t d i f f i c i l e m e n t accessibles a u x m éth o d e s classiques d 'a m é lio r a tio n variétale. C'est le cas de la résistance aux ravageurs et plus p a r t i c u l i è r e m e n t a u x in s e c t e s . Si a u c u n e m é t h o d e d e l u t t e n ' é t a i t a p p l i q u é e , 4 0 % d e la p r o d u c t i o n c o t o n n i è r e m o n d i a le se ra it p e rd u e . Les l é p i d o p t è r e s , p r i n c i p a l e m e n t

Helicoverpa armigera, Helicoverpa zea, H e lio t h is vire s c e n s et P e c tin o p h o ra g o s s y p ie lla , so n t à l 'o r i g in e de plus

de 70 % des pertes. Pour le riz , des insectes foreurs des tiges, é g a le m e n t d e l ' o r d r e des l é p i d o p t è r e s , o c c a ­ s i o n n e n t des p e rte s d e 10 à 3 0 % selon le degré d 'in te n s ific a tio n de la c u ltu re . D e plus, l 'o b j e c t if d 'a u g m e n ­

ta tio n de la p ro d u c tiv ité favorise une u t i l i s a t i o n d e p lu s en p lu s m a s s iv e d e p r o d u i t s c h i m i q u e s , t o u j o u r s p o llu a n te , et ne p e rm e t pas l'é ta b lis ­ s e m e n t d ' u n e a g r i c u l t u r e d u r a b l e (SAV A R Y et T EN G , 1994).

Les ins e c tic id e s c h im iq u e s o n t lo n g ­ te m p s été considérés c o m m e la seule m é th o d e de lutte . Néfastes p o u r les é q u i l i b r e s b i o l o g i q u e s , r a r e m e n t sélectifs, ces pesticides détru ise n t les in s e c t e s d é p r é d a t e u r s m a is a u s s i leurs e n n e m is n aturels. Leur e m p lo i in t e n s if a p r o v o q u é l 'a p p a r i t i o n de résistances c h e z les insectes c iblé s et a c o n d u it à une a u g m e n ta tio n co n s i­ d é r a b l e d e s d o s e s u t i l e s . Par e x e m p l e , près d e 3 0 % d u m a r c h é m o n d ia l des in s e c tic id e s c h im iq u e s sont c onsacrés à la p ro te c tio n de la c u ltu re c o to n n iè re .

D e p u i s q u e l q u e s a n n é e s , a f i n d e c o m b a t t r e les e ffe ts d e ces t r a i t e ­ m e n ts a b u s ifs , le c o n c e p t d e l u t te

La bactérie Bacillus thuringiensis

et la création de plantes transgéniques

résistant aux insectes

Découverte pour la première fois en 1902 au Japon dans un élevage de vers à soie, la bactérie B. t. fut isolée à nouveau et identifiée en Thuringe (Allemagne) par BERLINER, en 1911, à partir d'une population de teignes de la farine.

B. t. synthétise des toxines entomopathogènes

B. t. est une bactérie gram-positive, qui synthétise, lors du processus de sporulation,

des inclusions cristallines entomopathogènes. La structure cristalline de l'inclusion résulte de l'assemblage de sous-unités, les protoxines, également appelées 3-endo- toxines. La plupart des souches de B. t. produisent plusieurs protéines cristallines différentes. Les mêmes protéines cristallines peuvent être présentes dans des souches différentes. Les 9-endotoxines Cry sont très spécifiques.

Au moins 40 gènes codant pour des protoxines ont été isolés et séquencés à partir d'un grand nombre d'isolats de B. t. Une classification de ces gènes a été établie (HOFTE et WHITELEY, 1989). Elle est fondée sur les homologies de structure et sur la spécificité de la toxine protéique. Les gènes sont regroupés en quatre classes majeures : cryl,

cryll, c ry lll et crylV, elles-mêmes subdivisées en sous-classes. De nouvelles toxines

sont régulièrement identifiées.

Les 9-endotoxines sont dissoutes dans l'intestin de l'insecte (à cause du pH alcalin). Elles sont ensuite activées par des protéases intestinales qui clivent la protoxine pour donner un plus petit polypeptide, correspondant à la toxine elle-même. La toxine agit en se fixant à la surface des cellules de l'épithélium de l'intestin moyen, elle entraîne ensuite des lésions qui co n d u is e n t à la destru cio n des c e llu le s et à la m o rt de l'insecte.

Utilisation de B. t. pour la création de plantes résistant aux insectes

L'avantage majeur de cette utilisation est sa totale innocuité pour les êtres humains, les mammifères et la faune biologique non ciblée. L'emploi des souches de B. t. comme biopesticides en pulvérisation — réalisé depuis plus de 30 ans avec différentes formu­ lations de souches de B. t. — reste relativement réduit, essentiellement à cause de la faible rémanence au champ.

La stratégie des plantes transgéniques permet d'obtenir la production de la toxine par la plante elle-même. L'ensemble de la plante est protégé, en particulier contre des insectes, comme les foreurs, attaquant des parties difficilement accessibles par pulvé­ risation. L'insecte subit l'effet de la molécule dès les premiers stades larvaires. Le sys­ tème est inoffensif pour l'environnement, car le produit est maintenu dans les tissus de la plante.

Un certain nombre de toxines ont été testées sur les principaux ravageurs du cotonnier et du riz : il est donc possible de savoir quels sont les gènes à introduire dans le génome de ces deux espèces (tableau 1 ).

Tableau 1. Les toxines actives sur les principaux ravageurs du riz et du cotonnier. Insecte Type de ravageur Toxine active

Cotonnier Spodoptera littoralis Helicoverpa armigera Pectinophora gossypiella Cryptophlebia leucotreta Riz Chilo suppressalis lépidoptère phyllophage lépidoptère carpophage lépidoptère carpophage lépidoptère carpophage lépidoptère foreur CrylC CrylA(b), CrylA(c) CrylA(b), CrylA(c) CrylA(b), CrylA(c)

CrylA(a), CrylA(c), CrylB

i n t é g r é e , o u I n t e g r a t e d P e s t M a n a g e m e n t , a é té d é v e l o p p é . Il i m p l i q u e d e c o n j u g u e r t o u t e s les m é th o d e s s u s c e p tib le s de p ré se rve r les c u lt u r e s : les t e c h n i q u e s c u l t u ­ r a l e s , le c o n t r ô l e b i o l o g i q u e , l ' e x p l o i t a t i o n d e s c a r a c t é r is t iq u e s génétiques de la p la n te (la recherche de v a rié té s résistantes) et l ' a p p l i c a ­ t i o n d ' i n s e c t i c i d e s c h i m i q u e s . La m is e en p la c e d ' u n p r o g r a m m e de lutte intégrée est c o m p le x e et réclame u n e e x c e l l e n t e c o n n a i s s a n c e d e s m é th o d e s u tilis a b le s , des ra vageurs e t d u c o n te x t e a g r o é c o lo g iq u e . Les te c h n iq u e s de g é n ie g é n é tiq u e , q u i p e rm e tte n t le transfert et l'expression d e gènes c o d a n t p o u r des p ro té in e s e n to m o p a th o g è n e s , sont a u jo u r d 'h u i e x p lo ité e s p o u r la c ré a tio n de v a rié ­ tés résistant a u x insectes ravageurs. A v e c les te c h n o lo g ie s de tra n s fo rm a ­ tio n génétique, le c h e rch e u r m a n ip u le « d i r e c t e m e n t » le g é n o m e . A l o r s q u 'il ne p o uvait e xp lo ite r q u e la seule v a r i a b i l i t é e x is t a n t à l ' i n t é r i e u r d e l'e s p è c e v é gétale, ou — m o y e n n a n t la m i s e e n p l a c e d e t e c h n i q u e s sophistiquées — du genre b o ta n iq u e d e la p l a n t e q u ' i l t r a v a i l l a i t , il se t r o u v e d é s o r m a i s d o t é d ' u n o u t i l nouve a u q u i o ffre des possibilités très étendues. Pour o b te n ir une résistance aux insectes, le p re m ie r axe d é v e lo p ­ p é e s t l ' u t i l i s a t i o n d e s p r o p r i é t é s e n t o m o p a t h o g è n e s d e la b a c t é r i e B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s B e r l i n e r (appelée c o u ra m m e n t B. t.).

Des plantes

transgéniques

pour les régions

tropicales et

subtropicales

En 1 9 8 7 , les p r e m i e r s ré s u lta ts de t r a n s f e r t d e g è n e s d e B. t. d a n s le t a b a c e t d a n s la t o m a t e o n t é té p u b lié s . D e p u is , des gènes de B. t. o n t é té i n t r o d u i t s d a n s d if f é r e n t e s e s p è c e s : c o t o n n i e r , p e u p l i e r , p o m m e de terre, riz, maïs.

Spodoptera littoralis sur feuille de cotonnier.

Cliché CIRAD, UREA

Les cotonniers transgéniques

D e p u is les p re m iè re s o b te n t io n s de c o t o n n i e r s tr a n s g é n iq u e s en 1 9 8 7 ( F I R R O Z A B A D Y e t a l . , 1 9 8 7 ; U M B E C K e t al., 1 9 8 7 ), par tra n s fo r­ m a t io n v ia A g r o b a c t e r iu m tu m e fa ­

c ie n s et r é g é n é r a t io n des c e l l u l e s

t r a n s f o r m é e s p a r e m b r y o g e n è s e s o m a tiq u e , des firm e s p rivé e s n o rd - a m é r i c a i n e s ( A g r a c e t u s , C a l g e n e , M o n s a n to ) o n t d é p lo y é des m o y e n s im p o r ta n t s p o u r o b t e n i r des c o t o n ­ niers résistant à certains lépidoptères. L 'o b te n tio n de plantes présentant un bo n niveau de résistance à ces rava­ geurs a été ra p p o rté e p a r M o n s a n to (PERLAK e t al., 1990) ; il ne s'agissait alors q u e d'essais en lab o ra to ire . Plus tard, q u e lq u e s lignées o n t m o n tré au c h a m p des propriétés « insecticides » (JENKINS e t al., 1 9 9 3 ). Ces résultats o n t é té p o s s ib le s g râ c e à d ' i m p o r ­ tantes m o d ific a tio n s de la sé q u e n ce n u c lé o tid iq u e du gène de B. t. utilisé — en l'o c c u rr e n c e c ry lA (b ). En effet, les gè n e s d e B. t., d ' o r i g i n e b a c t é ­ rie n n e , s 'e x p r im e n t très f a i b le m e n t dans un c o n te x te végétal.

Des résultats très intéressants o n t été o b t e n u s p a r l ' é q u i p e d u D o c t e u r N. T R O L IN D E R (U S D A , Etats-Unis), c o n c e r n a n t la r é s is ta n c e au 2 , 4 - D (acide 2 ,4 d ic h lo ro p h é n o x y a c é tiq u e ) utilisé c o m m e h e rb ic id e , par transfert d ' u n g è n e p r o v e n a n t d e la b a c té r ie d u sol A lc a lig e n e s e u tr o p h u s . Ces t r a v a u x o n t é té r e p r i s au C S I R O (Australie) où des études sur la créa­ tio n de variétés résistant aux insectes s o n t é g a l e m e n t c o n d u i t e s d a n s le c a d r e d ' u n e c o l l a b o r a t i o n a v e c M o n s a n to .

Plant de cotonnier transformé.

Cliché C. Pannetier La mise sur le m a rc h é de c o to n n ie rs tra n s g é n iq u e s est a n n o n c é e c o m m e im m in e n te . C alg e n e et M o n s a n to — q u i a c o n c l u d e s a c c o r d s a v e c D e l t a p i n e , f i r m e s e m e n c iè r e n o r d - américaine — o n t déposé des dossiers d ' h o m o l o g a t i o n p o u r des v a r ié té s d e c o t o n n i e r s t r a n s g é n iq u e s ré s is ­ t a n t à u n d e s d e u x h e r b i c i d e s — le b ro m o x y n y l ou le glyp h o sa te — ou ré s is ta n t à c e rta in s lé p id o p tè r e s après le tra n s fe rt d ' u n g ène d e B. t. Les travaux du C IR A D sur le co to n n ie r o n t été lancés en 19 8 9 , dans le cadre

Agriculture et développement ■ n ° 6 - J u i n 1995

d ' u n e c o lla b o r a t io n avec l'IN R A . Ils s o n t r é a l i s é s a u l a b o r a t o i r e d e b io lo g ie c e llu la ire du centre IN R A de V ersailles (France).

Le tra n s fe rt d e gènes d 'in t é r ê t a g ro ­ n o m iq u e au g é n o m e du c o to n n ie r est e ffe c tu é par la m é th o d e de tra n s fo r­ m a t i o n v i a A . t u m e f a c i e n s . D e u x gènes de B. t. o n t été retenus. Le p re ­ m ie r, c ry lA (b ), c o d e p o u r une to x in e a c t i v e s u r H . a r m i g e r a e t C ry p to p h le b ia leucotreta. Le second, c r y l C , i s o l é e t c l o n é à l ' i n s t i t u t

Pasteur (SANC HIS e t al., 1989) c o d e p o u r u n e p r o t é i n e tr è s a c t i v e s u r

S p odoptera litto ra lis .

La régénération des cotonniers

et l'expression des gènes

transférés

Il s'agissait to u t d 'a b o r d de régénérer le c o to n n ie r in vitro. Reprenant p o u r une large part les résultats p u b lié s par T R O L IN D E R et G O O D I N (1 9 8 8 ), la ré g é n é ra tio n d e p la n te s de v a rié té s C o k e r ( C 3 1 0 , C 3 1 2 , C 2 0 1 ) a é té o b te n u e par un processus d 'e m b r y o ­ genèse s o m a tiq u e 1.

La p rio rité a été d o n n é e à la tra n sfo r­ m a tio n de ces variétés présentant de b o n n e s c a p a c it é s d e r é g é n é r a t io n , p l u t ô t q u ' à la m i s e au p o i n t d e l 'e m b r y o g e n è s e s o m a t iq u e et d e la t r a n s f o r m a t i o n des v a r ié té s c ré é e s p a r le C IR A D . D 'a p r è s les d o n n é e s de la litté ra tu re , très peu de variétés autres q u e les variétés C o k e r o n t été régénérées avec succès. Par ailleurs, les transgènes p e u v e n t être transférés d e la v a rié té C o k e r tra n s fo rm é e aux variétés com m erciales par la méthode classique des rétrocroisem ents. Les p r i n c i p a u x p a ra m è tre s i n t e r v e ­ n a n t d a n s la t r a n s f o r m a t i o n v i a A . tu m e fa c ie n s à p a rtir de fragments d 'h y p o c o ty le s o n t été définis.

(1). L'embryogenèse somatique : à partir d'un fragm ent d'organe (ici, un morceau d 'hyp o - cotyle) mis en c u ltu re sur un m ilie u n u tritif approprié, on obtient la formation d'un amas cellulaire inorganisé, appelé cal. Certaines des cellules du cal donnent ensuite naissance à un embryon somatique, en reproduisant de façon plus ou moins sim ilaire les étapes de la forma­ tion d'un embryon à partir du zygote issu de la fécondation.

génie génétique

La bactérie

Agrobacterium

tumefaciens

A. tumefaciens transfère une partie de son information génétique au génome de la plante

A la s u ite de b le ssu re s, la b a c té rie A tumefaciens provoque l'apparition de tumeurs au niveau du collet. Cette maladie a été appelée galle du co lle t ou « crown gall ». En 1974, une corrélation a été éta­ blie entre la manifestation de la maladie et la p ré s e n c e dans la b a c té r ie d 'u n plasm ide de haut poids m o lé c u la ire , le pla sm id e Ti, p o u r « tu m o r in d u c in g ». L 'A D N n u c lé a ire des tissus tu m o ra u x intègre un fragment d 'A D N du plasmide Ti, c'est l'A D N -T (p our A D N transféré) (figure 1). Le plasmide Ti porte des gènes responsables de la virulence de la bactérie (figure 2).

Une fois intégrés au génome végétal, les gènes portés par l'A D N -T s'expriment. Il s 'a g it, d 'u n e pa rt, des o n c o g è n e s q u i c o n trô le n t la synthèse d 'a u x in e s et de c y to k in in e s , qui in d u is e n t une p ro lifé ­ ration continue et incontrôlée des cellules végétales d'où la formation de tumeur. Il s'agit, d'autre part, des gènes de synthèse d'opines, qui sont utilisées par la bactérie comme substrat de croissance.

Les propriétés d'A. tumefaciens pour le transfert de gènes d'intérêt au génome de plantes cultivées

La bactérie A. tumefaciens réalise un pro­ cessus de transfert de gènes. L'idée s'est donc développée d'utiliser cette propriété pour transférer des gènes d'intérêt en les intégrant à l'A D N -T . Différents vecteurs ont été créés, en particulier des vecteurs fonctionnant en système binaire (figure 3). Le p la s m id e Ti est re m p la c é par deux plasmides. Le premier plasmide, souvent appelé vecteur autonome, porte un ADN-T réduit aux frontières, mais entre lesquelles ont été intégrés les gènes à transférer à la plante. Le second plasmide, dit « plasmide Ti désarmé » (l'A D N -T a été supprimé), p o rte les fo n c t io n s de v ir u le n c e q u i agissent en « trans » c'est-à-dire qu'elles p e rm e tte n t le tra n s fe rt de l'A D N - T du vecteur autonome.

Cellule végétale

Composés phénoliques

A. tumefaciens

Cellule végétale transformée

/

Plasmide Ti

(plusieurs copies) hormones

de croissance

F igurei. La bactérie Agrobacterium tumefaciens transfère une partie de son information génétique au génome de la plante.

FD

LADN-T (pour AD N transféré) porte les oncogènes (ONC), les gènes de synthèse des opines (OPS).

Il est limité par des « frontières » :

frontière droite (FD) et frontière gauche (FG), constituées d'une séquence de 25 nucléotides. C'est la région située entre ces frontières qui est transférée.

Sur le plasmide, on trouve également les gènes VIR, responsables du transfert de cet ADN-T, les gènes OPS contrôlant le catabolisme des opines. ORI est l'origine

de la réplication. Figure 2. Schéma du plasmide Ti.

FD

Figure 3. Schéma du système binaire.

Les deux plasmides portent une origine de réplication qui autorise leur multiplication dans A. tumefaciens mais aussi dans E. coli. Cette bactérie est utilisée pour la fabrication de la région à transférer au génome de la plante.

Anthonomus grandis

sur un bouton floral de cotonnier.

Cliché CIRAD, UREA

P our q u e le gène é tra n g e r (a p p e lé souvent transgène) s 'e x p rim e dans la plante, il a fa llu fa b riq u e r ce que l'o n appelle un gène chimérique (figure 4). Le promoteur peut être constitutif, c'est-à- dire ind u ire l'expression du gène dans toute la plante et à tout stade de dévelop­ pement, ou spécifique d 'un organe ou d 'un tissu, ou encore in d u c tib le par la blessure par exemple.

Ce gène chim érique est intégré dans un plasmide (ADN circulaire autonome) lui- m êm e i n t r o d u it dans la b a c té rie

Escherichia coli. Le vecteur de transfor­

mation, ainsi constitué, peut être m u lti­ plié par culture de la bactérie. Il peut être transféré dans la bactérie A. tumefaciens ou utilisé sous forme de plasmide pour les méthodes de transformation dites directes : é le c t r o p o r a t io n de p ro to p la s te s ou d'embryons, canon à particules.

(2) (1) (3)

Région Séquence Région

régulatrice codante terminatrice

AD N

Figure 4. Structure d'un gène chimérique.

D ans c e tte phase de m ise au p o in t, o n u tilis e un g ène ra p p o rte u r, d o n t l'expression dans le m a té rie l végétal e s t f a c i l e m e n t r e p é r a b l e p a r u n e m é th o d e h is t o c h im iq u e . Il s'agissait en l 'o c c u r r e n c e d u g è n e g u s (gène c o d a n t p o u r la B-glucuronidase) d o n t l'e x p re s s io n dans le tissu végétal est v i s u a l i s é e p a r la f o r m a t i o n d ' u n c o m p o s é de c o u le u r b le u in d ig o , en p ré s e n c e d ' u n s u b s tra t a d é q u a t. La m é th o d e de tra n s fo rm a tio n est m a in ­ te n a n t assez bien maîtrisée et d o n n e des résultats re p ro d u c tib le s . L'utilisa ­ tio n d 'u n e s o u ch e d ' tu m e fa c ie n s

porteuse d 'u n p la s m id e c o n te n a n t un gène sé le c tio n n a b le ainsi q u e le gène de B. t., crylA(b), a ctif sur H . armigera, r a v a g e u r m a j e u r d u c o t o n n i e r en A f r i q u e e t e n A s i e , a p e r m i s

Dans le v e c te u r de tra n s fo rm a tio n , le gène d'intérêt est, le plus souvent, associé à un ou à plusieurs gènes sélectionnâmes ou rapporteurs (également sous forme de gènes c h im é riqu e s). Ils perm e tte n t de s é le c tio n n e r ou de d é te c te r, par des moyens relativement simples, les cellules ou les tissus transformés. Les gènes sélec­ tionnâmes sont le plus fréquemment des gènes de résistance à des antibiotiques (ou à des herbicides). Parmi les gènes rapporteurs, on utilise couram m ent un gène d 'Escherichia c o li codant pour la B-glucuronidase (gène gus). Sa présence dans le génome végétal peut être facile­ ment mise en évidence par une technique histochim ique (en présence du substrat adéquat, le Xgluc, il y a form ation d'un précipité de couleur bleu indigo).

Le gène chimérique est constitué schématiquement de trois parties :

- une séquence codante qui correspond à la séquence d 'A D N , qui est transcrit en ARN messager lui-même traduit en protéine (1 ) ; - une région « promoteur », située en amont de la séquence codante, est constituée de plusieurs séquences, dont une est reconnue par l'ARN polymérase lui permettant de démarrer la transcription de l'AD N (2) ; - une séquence de terminaison (3).

l 'o b te n tio n de plantes transgéniques. Ces plantes o n t été a u tofécondées et o n t p r o d u it des graines (PANNETIER

e t al., 1994).

Pour assurer à la pla n te tra n sgénique un n iv e a u d e p r o t e c t i o n s u ffis a n t à l'é g a rd des insectes ravageurs, il est n é c e s s a ir e q u e les g è n e s d e B. t. transférés dans son g é n o m e s 'e x p r i­ m e n t à un b o n niveau. O r ces gènes, c o m m e o n l ' a d é j à s i g n a l é , s o n t d 'o r ig in e bacté rie n n e , et s 'e x p rim e n t tr è s f a i b l e m e n t d a n s u n c o n t e x t e végétal. D e u x stratégies o n t été rete­ nues p o u r a m é lio re r l'e xpression des gènes de B. t. : la m o d ific a tio n de la s é q u e n c e n u c l é o t i d i q u e , e t l 'i n s e r ­ tio n , en a m o n t du gène d 'in té rê t, de séquences e n tra în a n t u n e tra d u c tio n p lu s e ffic a c e (M A Z IE R e t al., 1 9 9 4 ). Des p la n te s d e c o t o n n i e r p o t e n t ie l ­ le m e n t transformées, et ayant intégré l ' A D N - T d ' u n v e c te u r se c a r a c t é r i ­ sant par la présence d 'u n e séquence (séquence « leader o m e g a » du virus de la m osaïque du tabac) susceptible d ' a m é li o r e r l'e f fic a c ité de la tr a d u c ­ tio n de gènes situés en aval, o n t été obtenues.

Des tra v a u x v is a n t à la m o d ific a tio n d e la s é q u e n c e n u c l é o t i d i q u e d u gène c o d a n t p o u r la to x in e a c tiv e sur

S. litto ra lis o n t été c o n d u its . Dans un

prem ier temps, c'est le tabac — plante m o d è le des la b o ra to ire s de b io lo g ie c e l l u l a i r e et m o l é c u la i r e — q u i est u tilis é p o u r tester l'e ffe t des m o d i f i ­ c a t i o n s a p p o r t é e s a u x g è n e s . Des gènes e n tiè re m e n t s y n th é tiq u e s — reconstruits à partir d 'u n e séquence en n u c lé o t id e s id é a le , m a is q u i ne c h a n g e pas la s é q u e n c e en a c id e s am inés — sont transférés au g é nom e du c o to n n ie r.

C ontourner les risques

d e résistance

Le transfert d 'u n gène de B. t. et son expression dans le g é n o m e de va rié ­ tés c o m m e r c i a l e s c o n s t i t u e n t u n e é ta p e p r i m o r d i a le p o u r l'u t il is a t io n fu tu re de ces variétés transgéniques. Les tra v a u x du C IR A D et de l'IN R A , o n t p o u r o b j e c t i f u n e p r o t e c t i o n d u ra b le des p lantes c o n tr e les rava­ g e u rs . Elle ne d o i t pas c o n d u i r e à

Construction d'un vecteur

d'expression végétale

génie génétique

Réalisation de

la transformation

via Agrobacterium

tumefaciens

Le processus de transformation

A titre d'exem ple, le cas du cotonnier sera décrit. Un fragment d'organe (pour le cotonnier, un fragment d'hypocotyle) est mis en c o n ta c t avec la b a c té rie

A. tum efaciens porteuse du système

bin a ire : c'est l'in o c u la tio n . Le tissu végétal est cultivé irt vitro (en condition aseptique sur un milieu nutritif adapté) p e n d a n t un c e rta in tem ps : c 'e s t la co c u ltu re . Puis, on in tro d u it dans le milieu de culture des antibiotiques : le premier a pour but de stopper la crois­ sance des b actéries a yant servi à la transformation, le second a pour objet de sélectionner les cellules végétales transformées. En effet, dans le plasmide porteur du gène d'intérêt, on a égale­ ment inséré un gène dit sélectionnable : en général ce gène confère la résistance à un a n tib io tiq u e . Seules les cellules ayant intégré le gène de résistance à l'a n tib io tiq u e seront capables de se diviser sur un milieu de culture conte­ nant l'agent sélectif (le plus souvent la kanamycine). Ces cellules auront égale­ ment intégré le gène d'intérêt.

L'embryogenèse des cotonniers transformés

En présence d'hormones végétales dans le milieu, les cellules transformées repi­ quées ré g u liè re m e n t sur un m ilie u contenant l'agent sélectif, vont donner naissance à un c a l. Dans ce rta in e s c o n d itio n s de m ilie u de c u lt u r e et d 'e n v ir o n n e m e n t (lu m iè re , te m p é ­ rature...), des plantes seront néoformées sur ce cal par les procédés classiques de régénération irt vitro. Pour le cotonnier, le cal va donner naissance à un tissu dit e m b ry o g è n e au sein d u q u e l des embryons somatiques se développent. Ces em bryons d o n n e n t ensuite nais­ sance à une jeune plante, qui sera trans­ férée en serre (voir planche couleur). Des analyses m oléculaires et b io c h i­ m iq u e s sont e n s u ite réalisées p o u r connaître le nombre de copies du gène qui ont été intégrées, ainsi que le taux d 'e x p r e s s io n de ce gène dans le génome végétal.

l 'a p p a r itio n d 'in s e c te s résistants à la p r o t é i n e s y n t h é t is é e p a r la p la n t e tr a n s g é n iq u e . D iffé re n te s stratégies o n t été proposées p o u r d im in u e r ces risq u e s. Elles so n t, p o u r la p lu p a r t, fondées sur la d im in u t io n de la pres­ s io n d e s é le c t io n en r é d u i s a n t les co n ta cts e n tre l'in s e c te et la to x in e : pla ntes refuges2, ro ta tio n de pla ntes tra n s g é n iq u e s et n o n tra n s g é n iq u e s , p la n t e e x p r i m a n t la t o x i n e u n i q u e ­ m e n t dans c e rta in s orga n e s... (M A C G A U G H E Y et W H A L O N , 1992). La stratégie re tenue co n siste à asso­ c i e r d e u x g è n e s c o d a n t p o u r des t o x i n e s a y a n t d e s m o d e s d ' a c t i o n d if fé r e n ts . D a n s c e cas, l'a v a n ta g e a d a p t a t if a c q u is p a r l'in s e c te a y a n t d é v e lo p p é une résistance à l'u n e des to x in e s sera r é d u it p u is q u e le ra v a ­ g e u r re s te ra s e n s ib le à la s e c o n d e to x in e .

D a n s c ette o p tiq u e , des tr a v a u x o n t été e n tr e p ris p o u r a n a ly s e r l 'i n t é r ê t d e l ' a s s o c i a t i o n d e g è n e s c o d a n t p o u r des to x in e s de B. t. et des gènes c o d a n t p o u r d e s i n h i b i t e u r s d e p r o t é a s e s . C es i n h i b i t e u r s d e p r o t é a s e s ( H I L D E R e t a l. , 1 9 8 7 ; R YA N , 1990) agissent en in h ib a n t les p ro té a s e s d ig e s tiv e s de l'in s e c t e et o n t d o n c u n e f f e t d é p r e s s i f s u r sa c r o is s a n c e , ils n 'a g is s e n t d o n c pas selon le m ê m e m o d e d 'a c tio n q u e les to x in e s de B. t. et présentent de plus u n s p e c tr e d ' h ô t e s b e a u c o u p p lu s large q u e ces dernières. Les bioessais s u r inse cte s, p a r i n c o r p o r a t i o n des i n h i b i t e u r s d e p r o t é a s e s d a n s un m i li e u n u tr it if , o n t m is en é v id e n c e des effets sur un lé p id o p tè r e c a r p o ­ p h a g e , H . a r m ig e r a , a in s i q u e s u r un c o lé o p tè re , A n th o n o m u s g ra n d is (LE T A N - D U M A N O I S , 1 9 9 4 ) . Ces tra v a u x o n t été réalisés au lab o ra to ire d 'e n t o m o lo g ie du C IR A D .

Plus de 100 lignées e m b ryo g è n e s de c o t o n n i e r a y a n t i n t é g r é u n g è n e d ' in h ib i t e u r de protéase o n t été o b te ­ nues ; plusieurs diza in e s de clones de pla ntes transform ées o n t été transfé­ rés en serre. L'analyse m o lé c u la ire et

(2). Plantes refuges : ce sont des plantes non transformées cultivées en mélange ou à proxi­ mité des plantes transgéniques (exprim ant la toxine entomopathogène).

b i o c h i m i q u e d e ces p la n t e s est en cours, ainsi q u e les prem iers tests sur les in s e c te s . Les p r e m ie r s ré s u lta ts in d iq u e n t q u e la p ro té in e est synthé­ tisée à un ta u x é le v é dans la p la n te aussi bien dans les fe u ille s q u e dans les capsules.

Les riz transgéniques

Les firm es privées de b io te c h n o lo g ie se s o n t r e l a t i v e m e n t p e u in v e s tie s d a n s le g é n i e g é n é t i q u e d u r i z , h o r m i s A g r a c e t u s a u x E t a t s - U n is , Japan T o b a c c o , M i t s u i T o a tsu et le Plantech Research Institute au Japon. Les ré s u lta ts q u i s u iv e n t s o n t d o n c issus de laboratoires p u b lic s financés en g r a n d e p a r t ie p a r un v a s te p r o ­ g ra m m e de la fo n d a t io n R o c k e fe lle r c o m m e n c é en 1985.

Les gènes d 'in t é r ê t tra n sfé ré s au riz c o n c e rn e n t à c o u rt te rm e la résistan­ ce aux insectes (gènes d 'e n d o t o x in e de B. t., in h ib ite u rs de protéases et de le c tin e s de p la n te s ), a u x v iru s , a u x b a c té rie s , a u x c h a m p i g n o n s e t a u x h erbicides. Des riz transgéniques o n t d é jà été p r o d u its a v e c l 'i n t é g r a t io n d 'u n gène s y n th é tiq u e C rylA (b), d 'u n gène de le c tin e de p e rc e -n e ig e , des gènes d 'in h ib ite u r s de protéase de la p o m m e d e t e r r e e t d u n i é b é , d e s g è n e s d e la p r o t é in e d e la c a p s id e virale des formes sphériques et b a c illi- form es du virus du turtgro et du virus d u stripe, des gènes de résistance à la p h o s p h i n o t h r i c i n e e t a u x s u l p h o - nylurées. C epe n d a n t, peu d'essais au c h a m p o n t e n co re été réalisés. Le système de transfert est o p é ra tio n ­ ne l s u r le r i z , a lo r s q u ' i l d e m e u r e e n c o re p r o b lé m a tiq u e c h e z les autres cé ré a le s — b ie n q u e ce tte s itu a tio n soit en cours d 'é v o lu tio n .

Les r e c h e r c h e s à m o y e n e t à lo n g te r m e v is e n t à tra n s fé re r au r iz des gènes a m é lio ra n t la q u a lité du grain, o u à a u g m e n t e r sa t o l é r a n c e à la sécheresse, à la salinité, à l'a n o x ie ou au fro id .

L'obtention des riz transgéniques

et les difficultés de la régénération

Les prem iers riz transgéniques o n t été o b te n u s par transfert d ir e c t de gènes sur des p ro to p la s te s de v a rié té s du

Préparation purifiée de protoplastes de riz, obtenue par traitement enzymatique de suspensions cellulaires, avant leur traitement au polyéthylène glycol.

Cliché E. Guiderdoni

g r o u p e j a p ó n i c a t e m p é r é e s ( T a i p e i 3 0 9 , N i p p o n b a r e , Y a m a h o u s h i ) e n 1 9 8 8 ( Z H A N G

e t al., 1988), soit plus de q u a tre ans

après les p re m ie rs résultats re la ta n t l 'o b t e n t i o n de d ic o t y lé d o n e s tr a n s ­ g é n iq u e s v ia /4. tu m e fa c ie n s ou par tr a n s fo rm a tio n de p rotoplastes. Cela est dû au fa it q u e la régénération de p la n te s à p a r t ir de p r o to p la s te s n 'a été maîtrisée q u 'e n 1 985 p o u r les riz du g r o u p e ja p ó n ic a . La te c h n iq u e a e n s u i t e é té a p p l i q u é e a u x r i z d u g ro u p e in d ic a (IR54, IR72), en géné­ ra l m o i n s a p te s à la r é g é n é r a t i o n (PENG e t al., 1992) ; mais l'e ffic a c ité d e la m é th o d e est d e m e u ré e lim ité e s u r c e s g é n o t y p e s . Les r i z t r a n s ­ g é n iq u e s régénérés p ré s e n te n t s o u ­ v e n t des p ro b lè m e s de sté rilité m âle et de niveau de p lo ïd ie . Dans la des­ c e n d a n c e , des v a ria tio n s ( m o d i f i c a ­ t i o n s m o r p h o l o g i q u e s ) s o n t o b s e r ­ v é e s , a c c e n t u é e s p a r r a p p o r t a u x plantes régénérées à p a rtir de p r o t o ­ plastes sans tra ite m e n t de tra n s fo rm a ­ t i o n . O n d o i t ra p p e le r q u e ces d e r ­ nières présentent déjà des différences

par ra p p o rt au té m o in issu de g e r m i­ n a tio n (D A VE Y e t al., 1991 ). M ê m e si les p u b lic a tio n s o n t été nombreuses, p e u d e l a b o r a t o i r e s o n t e n f a i t ré e lle m e n t maîtrisé, p a r ce p ro cé d é , un systè m e r o u t in i e r de p r o d u c t io n e n g r a n d s e f f e c t i f s d e r i z t r a n s ­ g éniques con fo rm e s.

Les méthodes d e transfert

utilisables pour le riz

En 1 9 9 1 , des r iz tra n s g é n iq u e s o n t é t é p r o d u i t s p a r la f i r m e p r i v é e A g r a c e t u s , p a r a c c é l é r a t i o n d e m i c r o p a r t i c u l e s s u r des e m b r y o n s im m a t u r e s d e v a rié té s des g ro u p e s ja p ó n ic a et in d ic a (C H R IS T O U e t al.,

1991). Des suspensions c e llu la ire s et des cals e m b ryo g è n e s o n t é g a le m e n t servi de s u p p o rt à une tra n s fo rm a tio n p a r c e t t e m é t h o d e d a n s d ' a u t r e s laboratoires. Cette te c h n iq u e a été un p e u a b u s i v e m e n t d é c l a r é e u n i ­ v e r s e l l e , c a r le s e m b r y o n s i m ­ matures de toutes les variétés de riz ne s o n t pas c a p a b le s de r é g é n é re r des plantes et, en tous cas, pas selon un p ro to c o le u n iq u e .

Les méthodes de transfert direct

L'électroporation

D 'a b o rd mise au p o in t sur les cellules animales et les bactéries, l'électropora­ tion a ensuite été appliquée aux cellules végétales, débarrassées de leur paroi pec- tocellulosique par un traitement enzyma­ tique, appelées protoplastes. L'absence de paroi était jugée nécessaire pour per­ m ettre le passage de l'A D N , mais les récents succès d 'o b te n tio n de plantes transgéniques

à

partir d'embryons zygo- tiques ou de fragments de cals, traités ou non p ré a la b le m e n t par une s o lu tio n enzym atique, semblent prouver que le transfert par électroporation peut se faire

à

travers une paroi intacte sous forts vol­ tages et capacités.

Dans la pratique, les protoplastes, mis en suspension dans une solution saline tam­ pon en présence d 'A D N p la sm idique, s o n t pla cé s dans une c u v e e n tre les bornes d'un électroporateur, qui délivre­ ra une décharge de capacité (exprimée en |jFarads) et de voltage (en Volts) défi­ nis durant un temps de l'ordre de la m illi­ seconde. Le champ électrique ainsi créé

p ro v o q u e une d é p o la r is a tio n des couches phospholipidiques de la mem­ brane plasmique du protoplaste aboutis­ sant

à

la création des pores transitoires permettant le passage de l'A D N .

Le traitement au polyéthylène glycol

Les protoplastes, en suspension dans une s o lu tio n s a lin e ta m p o n , sont m is en présence d'une solution de polyéthylène g ly c o l (co m p o s é

à

ha u t p o id s m o lé ­ culaire), de cations bivalents (Mg2+ ou Ca2+) et de l'A D N p la s m id iq u e . Les cations vont jouer le rôle de ponts entre l'A D N et la membrane plasmique, tous de u x chargés n é g a tive m e n t ; le p o ly ­ éthylène glycol a un rôle fusionnant et déstabilisateur du plasmalemme, permet­ tant l'entrée de l'A D N .

L'accélération de microparticules

L'ADN plasmidique, précipité autour de microparticules métalliques de tungstène ou d'or par l'action de l'alcool ou de sels, est déposé sur un m a c ro p ro je c tile (un disque de feuille d 'alum inium , voire un

tamis plastique) ou dans une gouttelette d'eau, suivant le type de canon

à

parti­ cules. Dans le cas du disque d 'a lu m i­ n iu m , la d é te n te d 'u n e e x p lo s io n de pou d re ou d 'u n gaz neutre c o m p rim é propulsera le m a c ro p ro je c tile qui sera stoppé dans sa course par une plaque d'arrêt, tandis que les m icro-projectiles poursuivront leur trajectoire vers la cible. Dans le cas du tamis plastique, c'est un flux d'hélium qui entraînera directement les microparticules vers la cible. Dans le cas de la gouttelette d'eau, un arc élec­ trique est créé entre les électrodes, où est déposée la gouttelette ; en entraînant sa vaporisation, le canon provoquera la pro­ pulsion des m icroparticules. La trajec­ toire des microparticules s'effectue dans une chambre, où est placée la cible et dans la q u e lle est créé un vide partiel pour ne pas ralentir leur course. La cible p e u t ê tre , dans le cas du riz , un é ta le m e n t de s u s p e n s io n c e llu la ir e em bryogène, des cals ou le scutellum d'embryons, voire des microspores.

génie génétique

Cals embryogènes présentant

des embryons somatiques de cotonnier en développement. Cliché C, Pannetier

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c Dégâts de Chilo suppressalis dans un champ de riz.

Cliché M . Betbeder

Cal transformé sur fragment d'hypocotyle de cotonnier, se développant sur un milieu sélectif.

Cliché C. Pannetier

Jeune plantule de cotonnier issue du développement d'un embryon somatique.

Cliché C. Pannetier

Section transversale de tige d'une jeune plante de riz transformée montrant une expression constitutive du gène gus dans les cellules des différentes feuilles enroulées.

Cliché E. Guiderdoni

Expression du gène gus dans les feuilles de ¡eunes plantes régénérées de riz.

Cliché E. Guiderdoni

Expression du gène gus dans les cellules du scutellum d'embryons immatures de riz ayant subi un bombardement de microparticules.

12 62 57 32 T-l p35SAc (4.02 Kb) s H " S i f s II S H "s H

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Exemples d'hybridation moléculaire de l'ADN de cinq plantes de riz. Elles sont transformées avec une sonde radioactive, constituée d'une séquence du gène transféré, prouvant l'intégration du transgène dans le génome du riz. s'agit du gène de résistance à l'herbicide glufosinate d'ammonium.

Cliché H. Chair

C e p e n d a n t , e l l e est très p r o b a b l e ­ m e n t la m é t h o d e d ' a v e n i r p o u r la tra n s fo rm a tio n du riz et des céréales en général. Elle est, de ce fait, utilisée p a r un n o m b r e c ro is s a n t d e la b o r a ­ to ire s , m ê m e si le p ro c é d é est c o u ­ v e r t p a r d e n o m b r e u x b r e v e t s . C o m p a r a t i v e m e n t à la m é t h o d e de t r a n s f o r m a t i o n à p a r t i r d e p r o t o ­ plastes, o n p e u t esp é re r u n e l i m i t a ­ t io n des v a ria tio n s é v o q u é e s p ré c é ­ d e m m e n t : les plantes sont en général f e r t i l e s e t m o r p h o l o g i q u e m e n t n o r m a l e s en p r e m i è r e g é n é r a t io n . En effet, en c u ltu re in v itro , les a n o ­ m a l ie s o b s e r v é e s d a n s les p la n t e s régénérées sont parfois dues à la lo n ­ g u e u r de la phase de r é g é n é ra tio n . C e l l e - c i e s t p l u s c o u r t e à p a r t i r d ' e m b r y o n s q u ' à p a r t i r d e p r o t o ­ plastes. Il est d if fic ile de c o n c lu r e sur la s u p é r i o r i t é d e l ' u n e d e c e s m éth o d e s, c a r elles n 'o n t ja m a is été c o m p a r é e s sur un m ê m e g é n o ty p e dans un m ê m e lab o ra to ire en termes d 'e ffic a c ité de p ro d u c tio n de plantes transgéniques con fo rm e s.

En 1 9 9 3 , u n e é q u i p e t a ï w a n a i s e ( C H A N e t a l., 1 9 9 3 ), p u is en 1 9 9 4 u n e é q u ip e ja p o n a i s e (H IE l) e t a l., 19 9 4 ) o n t p r o d u it les preuves m o l é ­ culaires que le riz peut être transformé par A. tu m e fa c ie n s a vec u n e e ff ic a ­ c ité liée à l'a p titu d e à la régénération d u gén o typ e .

Le transfert de résistance aux

foreurs sur les riz méditerranéens

En 1 9 9 0 , un p r o j e t d e tr a n s f e r t de gè n e s p o u r les v a r ié té s m é d i t e r r a ­ néennes et tro p ic a le s p lu v ia le s a été engagé par le C IR A D . L 'o b je c tif est la p ro d u c t io n de riz résistant au fo re u r des tiges asia tiq ue et e u ro p é e n C h ilo

s u p p re s s a lis , p y r a l e q u i c a u s e des

pertes de re n d e m e n t de l'o rd r e de 7 à 15 q u i n t a u x p a r h e c t a r e en C am a rg u e , ainsi q u 'a u x fo re u rs a fr i­ ca in s M a lia r p h a se p a ra te !la et C h ilo

z a c c o n iu s . Ces tra v a u x sont c o n d u its

d a n s l ' u n i t é B I O T R O P d u C I R A D (M o n tp e llie r). B ie n q u e des v a rié té s r e l a t i v e m e n t to lé ra n te s a u x fo re u rs e x is te n t n a tu ­ re lle m e n t, la n a tu re p o ly g é n iq u e du c o n t r ô l e d u c a r a c t è r e r e n d , d ' u n e part, le transfert d if fic ile par les voies c o n v e n tio n n e lle s , et, d 'a u tre part, la s t a b i l i t é d e la t o l é r a n c e n 'e s t pas assurée dès lors q u e la v ariété est lar­ g e m e n t d if f u s é e . P o u r des r a is o n s p ra tiq u e s , le p ro je t, q u i p o rte sur le tra n s fe rt d e gènes d 'e n d o t o x in e s de

B. t., a d 'a b o r d c o n c e n tr é ses efforts

s u r le r i z m é d i t e r r a n é e n e t s u r C. suppressalis. Les m é th o d e s mises au p o in t, aussi bien p o u r l 'id e n t if ic a ­ t io n des to x in e s a c tiv e s q u e p o u r la t r a n s f o r m a t i o n , p o u r r a i e n t ê t r e

Choix de la méthode de transformation

Pourquoi A. tumefaciens n'est-il pas utilisé sur le riz ?

Le riz com m e les autres céréales s'est montré réfractaire à une infection par les bactéries. L'absence de fo rm a tio n de tumeurs

à

partir des tissus différenciés de ces plantes ne serait pas cependant due

à

l'agrobactérie mais plutôt

à

l'incapacité de la plupart de leurs cellules

à

entrer en prolifération. Une expérience réalisée en 1986 par CRIMSLEY et ses collaborateurs a d é m o n tré que A. tu m e fa c ie n s é ta it capable de transférer son A DN -T dans le noyau de la cellule de céréale. L'absence de form a tio n de tumeurs

à

partir de la cellule de céréale serait due

à

la différen­ ce de réponse

à

la blessure existant entre la cellule de mono-cotylédone et celle de dicotylédone : la première réagit par une dégénérescence tandis que la seconde fo rm e un tissu c ic a tric ie l. C 'est do n c

l'absence des conditions favorables

à

la reprise des divisions dans la cellule, qui vient d'être infectée par l'agrobactérie, q ui serait responsable de l'in e ffic a c ité des transferts pour les graminées. Après les premiers travaux réalisés par une équipe taïwanaise, les chercheurs japonais de Japan Tobacco ont réussi, par la c o c u ltu re de prolifé ra tio n s em bryo- gènes de ces mêmes cellules avec des agrobactéries,

à

faire la démonstration irré fu ta b le de l'o b te n tio n d 'u n grand nombre des plantes transgéniques de riz.

Les méthodes de transfert direct appliquées au riz

Les méthodes ayant permis l'obtention de riz transgéniques, dès 1988, o n t to u t d'abord été le transfert d irect de gènes par traitement physique (électroporation) ou c h im iq u e (p o lyé th ylè n e g ly c o l) de

protoplastes. La maîtrise préalable du système de régénération est nécessaire. Ce système se révèle lourd

à

mettre en œuvre, applicable

à

un nombre limité de génotypes et, du fait des longues étapes de c u lt u r e in v itr o , p a ssant p a r un isolement total des cellules, potentiellement générateur de va ria tio n s indésirables. Afin d'essayer de réduire ces inconvé­ nients, des systèmes de transformation des suspensions cellulaires des cals et des s c u te llu m d 'e m b ry o n s o n t été mis au point. Ils ont conduit

à

l'obtention de riz transgéniques en 1991. Ces méthodes de transform ation deviennent la méthode préférentielle de production de riz trans­ géniques. D'autres méthodes telles que l'é le c t r o p o r a t io n de c e llu le s de l'e m b ry o n et l'u tilis a tio n d 'u n champ électrique puisé ont récemment donné de bons résultats sur cette plante.

génie génétique

Larve de Chilo suppressalis dans une talle de riz.

Cliché J. Escoute

r a p i d e m e n t e x t r a p o l a b l e s à d e s variétés de riz et à des ravageurs des régions tropicales.

Les t o x i n e s c o d é e s p a r les g è n e s

C r y lA ( c ) , C r y lA ( a ) et C r y lB o n t été

id e n t if ié e s c o m m e les p lu s a c tiv e s c o n tr e les larves de C. su p p re s s a lis , aussi bien par des tests d 'a ffin ité que p a r d e s te s ts d e t o x i c i t é ( F I U Z A , 1 9 9 5 ). Les gènes n a tifs d e ces tr o is to x in e s o n t été c lo n é s et des gènes s y n th é tiq u e s so n t en p ré p a ra tio n ou o b te n u s g râ c e à un a c c o r d a v e c le lab o ra to ire du professeur A L T O S A A R (université d 'O tt a w a , Canada). A u d é b u t de ce p rojet, p o u r la trans­ fo rm a tio n g é n é tiq u e de variétés élites m é d ite rra n é e n n e s , o n a p r iv ilé g ié la m é th o d e de transfert d ir e c t de gènes sur protoplastes. U n système de régé­ n é r a t i o n d e p la n t e s a é té é t a b l i à p a r t ir d e p ro to p la s te s p r o v e n a n t de suspensions c e llu la ire s e m b ryo g è n e s d e s v a r i é t é s A r i e t e , M i a r a e t T h a ï b o n n e t ( G U I D E R D O N I e t C H A IR , 1992). La v a ria tio n observée au c h a m p d a n s la d e s c e n d a n c e de ces plantes s'est m o n tré e d é p e n d a n te

du g é n o ty p e — sur le plan de sa fré­ q u e n c e , d e son a m p l i t u d e e t d e sa d i r e c t i o n — , m a is c o m p a t ib l e a v e c u n e u tilis a tio n dans des schém as de c ro is e m e n t (M EZENCEV et al., 1995). Parallèlem ent, une étu d e de la trans­ f o r m a tio n des p ro to p la s te s a p e rm is de d é t e r m in e r u n e m é t h o d e p e r f o r ­ m a n t e d e tr a n s fe r t d e g ènes. D e u x tra ite m e n ts p e rm e tte n t le transfert de gènes dans les protoplastes : un tr a i­ te m e n t c h im iq u e par le p o ly é th y lè n e g ly c o l ou un c h o c é le c triq u e (l'é le c - tro p o ra tio n ). A la suite d 'étu d e s c o m ­ p a ra tiv e s , le t r a it e m e n t c h i m i q u e a été retenu (C H A IR , 1 9 9 5 ). La s é le c ­ tio n des tissus tra n s fo rm é s est r é a li­ sée, n o n pas grâce à l'u tilis a tio n de la r é s is ta n c e à u n a n t i b i o t i q u e , m a is grâce à la résistance à la p h o s p h in o - tr ic in e (h e rb ic id e Basta) co n fé ré e par l'e x p re s s io n du g ène de la p h o s p h i- n o tr ic in e a cé tyl transférase (ou gène

b a r issu de la b a c té rie S tre p to m y c e s h y g r o s c o p i c u s ) . D e s p r o m o t e u r s c o n s t i t u t i f s p e r m e t t a n t u n e e x p r e s s io n fo r te p o u r le r iz o n t été identifiés. U n systèm e e ff ic a c e d ' o b t e n t i o n de p la n t e s t r a n s g é n iq u e s des v a r ié té s M i a r a , A r i e t e e t T h a ï b o n n e t , a v e c u n e f r é q u e n c e d e l ' o r d r e d e 0 ,5 à 1 p o u r 100 0 0 0 pro toplastes traités, a d o n c été créé. C e p e n d a n t, des d i f f i ­ cultés sont e n c o re fré q u e m m e n t ren­ c o n t r é e s d a n s la c o n f o r m i t é d e s p la n t e s , te ls q u e l ' a l b i n i s m e l ié à l 'u t il is a t io n de p ro to p la s te s issus de cals de microspores, ou un niveau de p lo ï d ie s u p é rie u r à la n o r m a le (2n). L 'u tilis a tio n de protoplastes d 'o r ig in e s o m a tiq u e o u d u c a n o n à p a rtic u le s sur des e m b ry o n s im m atures a d o n n é d e s r é s u l t a t s tr è s p r o m e t t e u r s , e t d e v r a i t r é s o u d r e c e s p r o b l è m e s (GEORGET, 1994).

Dans un fu tu r pro ch e , les effets, sur la résistance à la pyrale, de l'expression c o nstitutive d 'u n gène natif et de celle d ' u n g ène s y n th é tiq u e de B. t. dans u n e v a r ié t é s e n s ib le e t u n e v a r ié té to lé ra n te , s e ro n t c o m p a ré s . Ensuite, c o m m e p o u r le c o t o n n i e r , d e s c o n s t r u c t i o n s p lu s a v a n c é e s , c o m p r e n a n t u n e c o m b i n a i s o n d e d e u x gènes synthétiques différents ou d 'u n gène d 'e n d o t o x in e et d 'u n gène

d ' i n h i b i t e u r d e p r o t é a s e s s o u s le c o n t r ô l e d e p r o m o t e u r s à a c t i v i t é c o n s titu tiv e ou régulée, p o u rro n t être réalisées et transférées au riz.

Les perspectives

A v e c la tr a n s fo rm a tio n g é n é tiq u e , le s é l e c t i o n n e u r p e u t d é p a s s e r les l i m i t e s i m p o s é e s p a r la v a r i a b i l i t é de l'e s p è c e . La d é c o u v e r t e de ce tte p o s s ib ilité a suscité un gra n d e s p o ir au d é b u t des a n n é e s 8 0 , p r é d is a n t p o u r les années 90 une e x p lo s io n de n o u v e l l e s v a r i é t é s a u x c a r a c t é r i s ­ tiq u e s in té re s s a n te s . Les p re m iè re s r e c h e r c h e s se s o n t t o u r n é e s v e rs l 'i n t r o d u c t i o n de c a ra ctè re s à h a u te r e n t a b il it é c o m m e r c ia l e (ré s is tan c e a u x h e r b i c i d e s , r é s i s t a n c e a u x in s e c t e s ) . L ' a p p l i c a t i o n d u g é n i e g é n é t i q u e a é té m o i n s r a p i d e q u e p ré v u e , mais l'a rr iv é e sur le m a rc h é de variétés transgéniques est m a in te ­ n a n t i m m i n e n t e . C e p e n d a n t , p o u r plu sieurs d 'e n tre elles, en p a rtic u lie r les p la n te s résistant a u x h e rb ic id e s , certains p ro b lè m e s te c h n iq u e s posés p a r le u r e m p l o i s o n t a c t u e l l e m e n t débattus.

Dans le ca d re des pro g ra m m e s d é v e ­ loppés au C IR A D , la p re m iè re étape dans la c ré a tio n d e p la n te s tra n s g é ­ niques a été la mise au p o in t de te c h ­ n iq u e s fia b le s e t r e p r o d u c t ib l e s de transfert de gènes. Le p re m ie r o b je c t if d 'a m é lio r a tio n v a rié ta le retenu a été la résistance aux insectes. U n e v a lo r i­ s a tio n e f f ic a c e d e p la n t e s t r a n s g é ­ niques porteuses de ces gènes c o d a n t p o u r des p r o t é i n e s e n t o m o p a t h o - gènes sera le fr u it d 'u n e é troite c o lla ­ b o r a t i o n e n t r e les b i o l o g i s t e s , les e n to m o lo g is te s e t les séle ctio n n e u rs. D i v e r s e s s t r a t é g i e s d e v r o n t ê t r e d é f i n ie s p o u r c u l t i v e r ces v a r ié té s n o u v e l l e s a v a n t d e p r é t e n d r e les v u lg a r is e r , en p a r t i c u l i e r en te n a n t c o m p te de l'a p p a ritio n de résistance. La r e c h e r c h e p e r m a n e n t e d e n o u ­ velles sources de résistance représen­ te u n e c o n d it io n in d is p e n s a b le p o u r une lutte e fficace à lon g term e, grâce à des plantes transgéniques. L 'effic a ­ c ité de protéin es de diverses origines ( in h ib ite u rs de protéases, lectines...)

est déjà à l'é tud e . U n d o m a in e p o te n ­ tie lle m e n t intéressant est l'u t ilis a tio n de gènes de l'in s e c te q u i p o u rra ie n t e n tra în e r des p e rtu rb a tio n s dans son d é v e lo p p e m e n t (STEWART, 1991). Si la résistance a u x insectes ravageurs a c o n s titu é u n e p rio rité , les p o s s ib i­ lités o ffe rte s p a r le g é n ie g é n é tiq u e sont vastes et des recherches seront et s o n t m ê m e d é jà engagées dans des d o m a i n e s q u i c o n c e r n e n t to u s les aspects de la c u lt u r e . Il s 'a g it de la résistance a u x stress a b io tiq u e s (sali­ n ité , t e m p é r a tu r e .. .) , d e la c ré a t io n d 'h y b rid e s F1, de la q u a lité de la fibre p o u r le c o t o n n i e r , de la q u a l i t é du grain de riz... Dans le cas des variétés sauvages, un i m p o r ta n t ré s e rv o ir de gènes reste e n c o r e l a r g e m e n t in e x ­ p lo i t é . P o u r c e r ta in e s esp è ce s s a u ­ v a g e s d e c o t o n n i e r , d e n o m b r e u x caractères utiles existe n t : résistance à la b a c té rio s e , s té r ilité m â le , résis­ t a n c e à la s é c h e r e s s e , c a r a c t è r e s t e c h n o l o g i q u e s , r é s i s t a n c e a u x i n s e c t e s . T o u t e f o i s , p e u d e p r o ­ g r a m m e s d ' i n t r o d u c t i o n d e c e s caractères dans les espèces c u ltivé e s o n t c o n d u it à la c ré a tio n de variétés n o u v e lle s . Les b io te c h n o lo g ie s p e u ­ v e n t p e r m e t tr e u n e e x p l o i t a t i o n de cette im p o rta n te diversité génétique. L'accès à ces n o u v e lle s te c h n o lo g ie s représente, p o u r les pays du Sud, un e n je u de ta ille . B e a u c o u p des a p p li ­ c a tio n s p o te n tie lle s seront largem ent b é n é fiq u e s en p a rtic u lie r p o u r d é v e ­ l o p p e r d e s s y s tè m e s d e c u l t u r e à fa ib le s in tra n ts . La v u lg a r is a t io n de va rié té s tra n s g é n iq u e s d o i t être p ré ­ c é d é e d e l 'a n a l y s e d e l ' i m p a c t de l e u r u t i l i s a t i o n s u r le t e r r a i n ( p r a ­ tiq u e s c u ltu ra le s , c o n s é q u e n c e s sur l'e n v iro n n e m e n t...). Cette analyse est indispensable m ê m e si e lle d o it retar­ d er les bénéfices attendus. Il c o n v ie n t é g a le m e n t q u e les re c h e rc h e s e n g a ­ gées ré p o n d e n t aux besoins des pays d u S u d e t q u e d e s c o l l a b o r a t i o n s s o ie n t é t a b l ie s p o u r u n a c c è s n o n pas s e u le m e n t au m a t é r ie l v é g é ta l a m é lio r é m ais aussi a u x te c h n iq u e s elles-m êm es.

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