Faculté de Médecine
Laboratoire de Physiopathologie
Régulation
du canal sodium épithélial par les acides gras
polyinsaturés n-3
Frédérique Mies
Promoteur : Pr. S.Sohraby
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade académique
de Docteur en Sciences Biomédicales
2008
Remerciements
Une thèse est le fruit d’un long travail. Le moment est venu de remercier tous les acteurs ayant participé, de près ou de loin, à cette aventure. Toutes ces personnes sans lesquelles il serait difficile d’aboutir. Elles sont nombreuses, j’espère que je n’oublierai personne.
Je commencerai par remercier le Professeur Naeije, directeur du laboratoire de Physiopathologie.
Mon promoteur Sarah Sorhaby, qui remplit aujourd’hui d’autres fonctions au sein du NIH, sans qui je n’aurais pas entamé ce travail. Merci pour la confiance que tu m’as témoignée.
Merci à Magali Waelbroek pour les dosages d’activité de l’AC, Stéphane Swillens pour nos échanges sur l’AMPc, Renaud Beauwens pour sa lecture critique de mon manuscrit. A. Allaoui et A. Sener pour leurs critiques constructives.
Je remercie le laboratoire de Biophotonique de Lille, dirigé par le Pr Laurent Héliot, pour l’imagerie cellulaire, ainsi que l’équipe de Nutrisub pour les dosages des acides gras.
Je remercie Arnaud et Vadim, mes compagnons de route depuis quelques années déjà. Au-delà de nos discussions sur l’électrophysio, ils sont devenus des amis.
Je vous remercie Isa et Jason pour votre soutien, votre aide, nos discussions scientifiques (ou non !).
Merci à toutes ces personnes qui ont toujours répondu à mes appels à l’aide, Amira, Aziz, Issam, Laetitia, Laurence D., Laurence P., Pascale.
Merci à Michèle et Myrielle, qui ont toujours été là en cas de coup dur . A Vitalie, toujours de bonne humeur.
Et puis je ne voudrais pas oublier mes 3 enfants Martin, Juliette et Victor qui ont bien souvent dû attendre leur maman.
Merci à Luc pour sa patience et la correction de mes multiples fautes d’orthographe. Merci aussi pour les docus prises de tête .
Merci à Françoise et à Robert, mon oncle, qui m’ont soutenue maintes fois.
ABREVIATIONS
A : ampère
AA : acide arachidonique AC : adenylate cyclase ADH : antidiuretic hormone
AKAP : A-Kinase Anchoring Protein
AMPc : Adénosine MonoPhosphate cyclique ASDN : aldosterone-sensitive distal nephron ARNm : acide ribonucléique messager ATP : adénosine triphosphate
CAP-1 : channel-activating protease 1 CCD : cortical collecting tubule
CFTR : cystic fibrosis transmembrane conductance regulator COX : cyclo-oxygenase
CREB : cAMP responsive element-binding DAG : diacylglycerol
DHA : docosahexaenoic acid
DRM : detergent resistant membrane EPA : eicosapentaenoic acid
ETYA : 5,8,11,14-eicosatetraynoic acid EGF : epidermal growth factor
ENaC : Epithelial sodium Channel
ERK : extracellular signal-regulated kinase FRT : Fisher rat thyroid
GRE : glucocorticoid responsive element
GPI-AP : glycosylphosphatidylinositol anchoring protein GTP : guanosine triphosphate
IBMX : isobutyl-méthyl-xanthine IP3 : inositol 1,4,5 triphosphate JAM : junctional adherens molecule KDa : kilodalton
Ki : constante d’inhibition Km : constante d’affinité KΩ : kiloohm
Kv : le canal K
+voltage dépendant
ld : phase liquide désordonnée
LEC : liquide extracellulaire lo : phase liquide ordonnée LOX : lipo-oxygenase
MDCK : Madin-Darby Canine Kidney Cells MR : mineralocorticoid receptor
mV : milivolt
NaCl : Chlorure de sodium
Nedd : Neuronal precursor cell expressed, developmentally down-regulated protein NDRG 2 : N-myc downstream-regulated gene 2
PAH-1 : Pseudohypoaldostéronisme de type 1
PDK1 et 2 : 3-phosphoinositide-dependant protéine kinase-1 et 2 PDE : phosphodiestérase
PGE2 : prostaglandine E2 pH : potentiel hydrogène
PIP
2: phosphatidylinositol 4,5-biphosphate PIP
3: phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate PI3-K : phosphatidylinositol 3 kinase
PKA : protéine kinase A PKB : protéine kinase B PKC : protéine kinase C PKG : protéine kinase G PLA2 : phospholipase A2 PLC : phospholipase C Po : probabilité d’ouverture PP2A : phospholipase 2A pS : picosiemens
PUFA : polyunsatured fatty acid P2Y : récepteurs purinergiques SAH : S-adénosyl-L-homocystéine SAHHase : SAH hydrolase
Sgk : serum and glucocorticoid kinase
SNARE : soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment-protein receptor TNFα : tumor necrosis factor
WNK : with no lysine kinase
ZO : Zonula occludens
TABLE DES MATIERES
I. DESCRIPTION DU PROJET DE RECHERCHE... 07
II. INTRODUCTION... 09
II.1 GENERALITES... 09
II.2 LE CANAL SODIUM EPITHELIAL... 12
II.2.1 Propriétés et structure... 12
II.2.2 Transport transépithélial de sodium... 14
II.2.3 Régulation d’ENaC... 16
A. La protéine kinase induite par le sérum et les glucocorticoïdes... 17
• Régulation de Sgk1 par la phosphorylation... 18
• Régulation de Sgk1 par l’ubiquitinylation... 18
• Rôle de Sgk1 dans la réabsorption de sodium aldostérone-dépendante... 19
B. Neuronal precursor cell expressed, developmentally down-regulated protein (Nedd 4)... 21
• Régulation d’ENaC par la protéine Nedd4-2... 21
C. AMPc/PKA... 22
D. PIP
2/PIP
3/ PI3-K... 24
E. La méthylation... 25
F. Régulation non hormonale... 26
II.3 LES MICRODOMAINES MEMBRANAIRES... 27
II.3.1 Description et rôle... 27
II.3.2 Compartimentalisation d’ENaC dans les microdomaines... 28
II.4 LES ACIDES GRAS POLYINSATURES (PUFAs)... 30
II.4.1 Action des acides gras sur les canaux ioniques... 32
II.4.2 n-3 PUFAs et les microdomaines membranaires... 33
II.5 VOIES DE SIGNALISATION DE L’ADENOSINE MONOPHOSPHATE CYCLIQUE... 36
II.5.1 Les phospodiéstérases (PDE) des nucléotides cycliques... 37
A. Boucle de régulation courte de la PDE par la PKA... 39
B. Régulation de l’expression des PDE... 39
II.5.2 La protéine kinase A... 39
A. Mécanisme d’activation de la PKA... 40
• Liaison de l’AMPc... 40
• Association/dissociation des sous-unités des PKA... 41
II.6 ADRESSAGE DE LA PKA : LES AKAPS... 42
II.6.1 Rôle des AKAPs dans la signalisation cellulaire... 42
II.6.2 Types d’AKAPs... 44
II.6.3 Complexes associés aux AKAPS... 44
II.6.4 AKAP 18... 45
II.7 ENaC DANS LE POUMON... 48
III. METHODES... 51
III.I CULTURE CELLULAIRE... 51
III.2 METHODES ELECTROPHYSIOLOGIQUES... 51
III.2.1 Mesure du courant transépithélial... 51
III.2.2 Le patch-clamp... 53
III.2.3 Bicouche lipidique... 56
III.3 PROFIL DES LIPIDES... 58
III.4 ACTIVITE PKA... 58
III.5 MESURE DE L’ACTIVITE ADENYLATE CYCLASE... 58
III.6 MESURE DE L’ACCUMULATION D’AMPc... 59
III.7 MESURE DE L’ACTIVITE PHOSPHODIESTERASIQUE... 59
III.8 FRET-FLIM... 59
III.9 CONSTRUCTION DE PLASMIDES... 61
III.10 PLASMIDES Sgk ET PKA... 62
III.11 BIOTINYLATION DES MEMBRANES... 62
III.12 COLOCALISATION... 62
IV RESULTATS... 63
IV.1 LES MICRODOMAINES... 63
IV.1.1 Distribution des canaux sodiques dans la membrane apicale des cellules A6... 64
IV.1.2 Environnement lipidique... 65
IV.2 EFFET DES PUFAs SUR LE TRANSPORT TRANSEPITHELIAL DE SODIUM ET SUR L’ACTIVITE DES CANAUX SODIQUES... 66
IV.2.1 Stimulation du courant transépithélial (INa) par l’EPA... 66
IV.2.2 Mesures de l’activité des canaux sodiques... 67
IV.3 LES VOIES DE SIGNALISATION... 70
IV.3.1 Voie des leucotriènes et des prostaglandines... 70
IV.3.2 Voies de régulation du canal sodium... 71
A. La méthylation... 71
B. La PI3-K... 72
C. La PKA... 73
D. L’AMPc... 75
E. Les phosphodiestérases... 77
F. L’AKAP... 79
G. La Sgk1... 82
Articles ... 83
V. DISCUSSION... 105
VI. PERSPECTIVES... 115
VII. BIBLIOGRAPHIE... 117
I. DESCRIPTION DE PROJET DE RECHERCHE
Le canal sodium épithélial bloquable par l’amiloride (ENaC) est une protéine intégrale de la membrane apicale des épithéliums impliqués dans l’absorption du sodium. Deux fonctions majeures sont directement liées au fonctionnement d’ENaC.
D’une part, la régulation de la balance sodée par le rein et donc de la pression artérielle et d’autre part, la clairance du fluide alvéolaire pulmonaire.
Le transport vectoriel de sel et d’eau à travers ces épithéliums à jonctions serrées repose sur un transport actif de sodium entraînant un flux osmotique d’eau.
Ce transport de sodium s’effectue en deux étapes: l’entrée apicale, par diffusion, facilitée via ENaC, et la sortie basolatérale, active, par les pompes Na
+/K
+ATPases.
Ces dernières années, un intérêt grandissant est porté sur les acides gras polyinsaturés à longues chaînes de type oméga 3 (PUFAs) et leurs implications dans divers processus physiologiques. Entre autres effets, les PUFAs modulent différents types de canaux ioniques (canaux Na
+dépendant du voltage, Ca
++L-type, K
+).
Les études in vivo impliquant un effet à long terme des PUFAs décrivent des mécanismes inhibiteurs. Cependant, lors d’une étude précédente, axée sur la composition lipidique des membranes de cellules rénales en culture et l’influence de l’ajout d’acides gras saturés et insaturés sur le transport du sodium, nous avons constaté que les acides gras polyinsaturés à longues chaînes de type oméga 3 augmentaient la réabsorption du sodium. Ces résultats pourraient être intéressants, car les canaux sodiques de l’épithélium alvéolaire sont en contact direct avec le surfactant, dont la composition lipidique varie en fonction de l’apport alimentaire en PUFAs. Chez les prématurés humains, le syndrome de détresse respiratoire est une des causes les plus fréquentes de mortalité. Dans un certain nombre de cas, on peut restaurer une fonction pulmonaire satisfaisante par l’administration de surfactant.
Dans ce travail, nous avons opté pour une approche fondamentale des
mécanismes de régulation du canal sodium épithélial par l’acide eicosapentanoïque
(EPA, C 20:5, n-3). Des études électrophysiologiques, biochimiques et d’imagerie
cellulaire ont été réalisées sur la lignée cellulaire A6 de rein d’amphibien, qui sert
d’épithélium modèle pour l’étude d’ENaC depuis plus de 25 ans. Cette lignée
exprime des canaux sodiques très sélectifs et possède des propriétés
électrophysiologiques facilitant l’étude de leur régulation.
Ce travail nous a permis de mettre en évidence de nouveaux mécanismes fondamentaux dont la pertinence physiologique et /ou clinique ne pourra être établie qu’en transposant cette étude sur un modèle in vivo, comme nous le proposons dans les perspectives.
Dans le présent travail, nous avons étudié :
1. La distribution fonctionnelle d’ENaC dans la membrane apicale des cellules A6.
2. Les effets des acides gras polyinsaturés oméga-3 (n-3 PUFAs) sur le transport du sodium et les voies de signalisation impliquées dans ces effets.
Nous montrons que les canaux sodiques épithéliaux sont distribués de manière hétérogène dans la membrane apicale des cellules A6, les canaux actifs se localisant au niveau de microdomaines membranaires (Am. J. Renal Physiol. 2003). Nous montrons aussi que l’acide eicosapentanoïque (EPA, C20 :5) augmente la perméabilité au sodium de la membrane apicale des cellules A6. Cette stimulation est transitoire et réversible, et implique l’activation de la protéine kinase A (PKA) en aval d’une augmenation d’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) (Am. J. Renal Physiol. 2004).
L’EPA ne provoque ni la stimulation de l’adénylate cyclase, ni l’augmentation d’AMPc total, mais inhibe l’activité phosphodiestérasique membranaire. En l’absence d’une augmentation mesurable d’AMPc, nous avons testé l’hypothèse d’une compartimentalisation de la PKA à la membrane apicale, où une faible augmentation d’AMPc pourrait être suffisante pour son activation. Nous montrons qu’une telle compartimentalisation est rendue possible grâce à une A-Kinase Anchoring Protein (AKAP) qui ancre la PKA à la membrane apicale. L’inhibition de la liaison AKAP-PKA empêche la stimulation du courant sodium par l’EPA. La distribution d’ENaC dans les microdomaines membranaires insolubles aux détergents pourrait favoriser l’ancrage de l’AKAP et des protéines régulatrices à proximité du canal ( J. Biol. Chem, 2007).
Ce travail montre pour la première fois, un ancrage membranaire de la PKA par
une AKAP dans les cellules A6 et met ainsi en évidence un nouveau mécanisme de
régulation des canaux sodium épithéliaux.
II. INTRODUCTION II.1 GENERALITES
Une composition ionique et un volume constants du liquide extracellulaire sont indispensables pour un fonctionnement normal de l’organisme. Le volume et la concentration de ce liquide (aussi appelé «milieu intérieur») sont maintenus relativement constants grâce à des ajustements permanents sans lesquels des troubles graves des volumes et de la pression osmotique des cellules surviendraient. A la fin du XIXème siècle, Claude Bernard fut le premier à reconnaître la constance du milieu intérieur et lui donna le nom d’homéostasie. Les mécanismes complexes qui assurent cette homéostasie hydrominérale sont en grande partie assurés par les reins (fig. II.1), qui adaptent l’élimination urinaire de chaque ion à sa quantité ingérée. Ainsi, en modulant la réabsorption du sodium, les reins déterminent la quantité de sodium présente dans l’organisme, laquelle définit directement le volume du liquide extracellulaire et constitue un des principaux déterminant de la pression artérielle.
Figure II.1 Homéostasie hydrominérale. En réponse à des variations en eau et/ou en
sel, le rein module les quantités de sel et/ou d’eau réabsorbée afin de maintenir
l’équilibre hydrominéral (d’après 154).
Chaque rein est constitué d’environ un million de néphrons, ou unités fonctionnelles (fig. II.2). Chaque néphron transforme l’ultrafiltrat de plasma en urine primitive, puis en urine définitive, grâce à une série de mécanismes absorptifs et sécrétoires. Par ces processus de réabsorption et de sécrétion, le rein contrôle précisément le volume, l’osmolarité, la composition et le pH du liquide extracellulaire.
Figure II.2 Réabsorption rénale du sodium
La réabsorption de l’eau et du sodium représente une des fonctions majeures du néphron. Le transport d’autres solutés importants est lié, directement ou indirectement, à la réabsorption du sodium. La réabsorption du Na
+au niveau du néphron distal détermine la balance finale en sodium du liquide extracellulaire. Elle est assurée par le canal sodium épithélial (ENaC) situé à la membrane apicale de cellules principales des tubules distaux et collecteurs.
Le canal sodium épithélial (ENaC) est une protéine intégrale de la membrane apicale des épithéliums qui sont spécialisés dans la réabsorption du sodium et qui possédent des jonctions serrées leur conférant une haute résistance électrique. Dans le néphron distal, ENaC est responsable de la réabsorption du sodium, qui, couplée à la rétention isotonique d’eau, permet de maintenir constants le volume des liquides extracellulaires et la pression sanguine.
L’étude des mécanismes qui régulent ENaC est fondamentale dans
l’homéostasie sodique, comme en témoignent deux maladies rares mais exemplatives,
liées à une mutation de ce canal : la maladie de Liddle
1, liée à un gain de fonction des ENaCs, se caractérise par une rétention rénale excessive de sodium et une hypertension artérielle sévère, tandis que le pseudohypoaldostéronisme de type 1
2, lié à une perte de fonction des ENaCs, se caractérise par une diminution de la réabsorption du Na
+et une hypotension. Ces syndromes mettent en lumière l’importance d’une activité normale d’ENaC dans le maintien de l’homéostasie hydrominérale et de la tension artérielle.
Outre sa localisation principale dans le rein, ENaC est également présent dans le côlon, les glandes salivaires et sudoripares et les voies aériennes proximales et distales. Dans ces dernières, l’activité d’ENaC contrôle la composition ionique de l’interface air-liquide, et donc la clairance alvéolaire. En effet, des souris transgéniques déficientes en α ENaC meurent d’œdème pulmonaire dans les 40 heures après la naissance (76). Chez l’humain, une diminution anormale de l’activité d’ENaC dans le poumon peut conduire à une détresse respiratoire chez les nouveaux-nés prématurés et à l’œdème pulmonaire de haute altitude chez l’adulte (47, 54).
1 Le syndrome de Liddle est une maladie héréditaire autosomale dominante associant une réabsorption rénale excessive de Na+, une hypertension artérielle et une répression du système rénine-angiotensine- aldostérone. Cette maladie est associée à des mutations de laterminaison carboxy cytoplasmique de la sous-unité β ou γ ENaC (dans le domaine PY riche en proline (PPXY)) conduisant à une augmentation constitutive de l’activité du canal.
Dans des conditions physiologiques normales, le motif PPXY lie l’ubiquitine ligase Nedd 4-2 sur son domaine WW. La protéine Nedd 4-2 induit l’internalisation et la dégradation des molécules d’ENaC.
L’absence de ce répresseur d’activité conduit à une augmentation de l’expression d’ENaC à la surface cellulaire et explique la réabsorption excessive de sodium (5). La mutation de la sous-unité β augmenteégalement la probabilité d’ouverture (Po) du canal (51), et empêche la translocation cAMP dépendante des canaux Na+ à la surface cellulaire (158).
2 Le pseudohypoaldostéronisme de type 1 (PAH-1) est une maladie héréditaire caractérisée par une perte néonatale sévère en sel et une hypotension. Elle est associée à des mutations (par ex : mutation de la glycine en position 37) dans la partie N-terminale de la sous-unité β ENaC en une sérine. Ces mutations conduisent à une perte de fonction du canal. Gründer et Firsov suggèrent que la mutation d’un résidu glycine conservé dans le segment N-terminal des sous-unités ENaC change la cinétique d’ouverture d’ENaC, réduisant ainsi son activité (64). Bonny et Rossier ont récemment montré qu’un codon stop en position 492 sur la sous-unité α ENaC supprime la région formant le pore et la région carboxy terminale intracellulaire, et conduit à une diminution de l’activité du canal (24).
Enfin, des mutations inactivant le récepteur minéralocorticoïde sont responsables de la forme
II.2 LE CANAL SODIUM EPITHELIAL II.2.1 Propriétés et structure.
Le canal sodium épithélial se caractérise par une haute sélectivité pour le Na
+(P
Na/P
K> 20), une conductance de 4 à 5 pS, une cinétique d’ouverture et de fermeture de l’ordre de la seconde et est inhibé par l’amiloride, une drogue diurétique, avec un Ki de 0.1 µM.
Il fait partie de la famille des ENaC-Deg. Le nom de ENaC-Deg dérive des deux premiers membres de cette famille de canaux ioniques : le canal sodium épithélial (ENaC) et les dégénérines (Deg), appartenant au groupe des gènes de Caenorhabtidis elegans et impliquées dans la perception du toucher. Tous les membres de cette famille partagent une même structure protéique, mais diffèrent par leur sélectivité ionique, leur affinité pour l’amiloride et leurs mécanismes de régulation.
Ces canaux sont exprimés dans divers tissus d’organismes vertébrés et invertébrés où ils remplissent diverses fonctions allant de l’absorption de sodium au rôle de neurorécepteur dans le système nerveux.
ENaC est le canal le mieux caractérisé dans la famille ENaC-Deg. Sa caractérisation fonctionnelle a été réalisée grâce aux techniques de courant de court- circuit, d’analyse de bruit et de patch-clamp. La découverte de sa structure moléculaire est plus récente et a été élucidée par clonage d’expression dans l’oocyte de xénope en utilisant du mRNA de colon distal de rat (141).
Figure II.3 Structure d’ENaC et topologie membranaire. ENaC est composé de trois
sous-unités homologues α, β et γ qui sont insérées à la membrane avec une
stoechiométrie de 1α :1β: 1γ. Un faible courant sodium amiloride sensible peut être
produit par la sous-unité α seule, mais la co-expression avec les sous-unités β et γ
augmente le courant à un niveau similaire à celui du canal natif.
ENaC est une protéine hétérotrimérique composée de trois sous-unités clonées (α, β, γ ENaC) qui partagent 30 à 35% d’identité de séquence. La sous-unité α est capable à elle seule de générer un faible courant lorsqu’elle est exprimée dans l’oocyte de xénope (87, 127). Par contre, les sous-unités β et γ ne forment pas de canaux fonctionnels, qu’elles soient exprimées seules ou ensemble. Cependant, lorsque les sous-unités β et γ sont co-exprimées avec la sous-unité α, elles génèrent un large courant sodium, suggérant que les trois sous-unités sont requises pour une synthèse, un assemblage et un trafic efficaces du canal. Le canal fonctionnel ayant toutes les caractéristiques physiologiques et pharmacologiques du canal natif comporte les 3 sous-unités (fig. II.3). Les stoechiométries proposées étaient, soit de 2 sous-unités α, une β et une γ (5), soit une structure nonamérique composée de trois de chacune des sous-unités (48, 165). Cependant, un article très récent, propose une structure trimérique composée de chacune des 3 sous-unités
3L’ADN d’une quatrième sous-unité, δ ENaC a également été cloné. En association avec les sous-unités β et γ, elle forme des canaux fonctionnels.
Chez l’humain, cette sous-unité est essentiellement exprimée dans le cerveau, mais elle se retrouve aussi dans le cœur, le rein et le pancréas. Jusqu’à présent, aucun orthologue n’a été identifié chez le rat ou la souris. L’activité de la sous-unité δ ENaC est modulée par les protons et pourrait contribuer à la régulation du pH dans le cerveau humain (197, 198). Associée au complexe αβγ ENaC, la sous-unité δ modifierait les propriétés biophysiques du canal. Les caractéristiques biophysiques des canaux composés de αβγδ-ENaC offrent une explication aux variations observées dans les conductances Na
+des canaux natifs (82).
Les sous-unités d’ENaC sont des protéines de 650 à 700 acides aminés, donc de masse moléculaire estimée de 70 à 80 KDa. Des modifications post- transcriptionnelles augmentent cette masse (α, 92 KDa). Chaque sous-unité est caractérisée par deux domaines transmembranaires hydrophobes : M1 et M2, une large boucle hydrophile extracellulaire (50 KDa) et deux terminaisons cytoplasmiques amine (NH
2) et carboxyle (COOH) de 8 à 10 KDa. Selon l’analyse des séquences, les domaines M1 et M2 adopteraient une structure secondaire en hélice α. La boucle extracellulaire présente de nombreux sites de N-glycosylation (6 sur α, 9 sur β et 5 sur γ) et de phosphorylation par la Protéine Kinase C (2 sites sur β et 2 sur γ ). Les sous-unités β et γ contiennent un domaine de liaison Src C-terminal
3J. Jasti, H. Frukawa, EB. Gonzales and E. Gouaux. Nature, 449 :316-324, 2007
(Src homology 3 {SH3} binding domain). Ces sous-unités contribuent à la formation du pore et sont déterminantes pour le temps de demi-vie du canal ainsi que pour le nombre de canaux fonctionnels à la surface de la membrane.
Les 3 sous-unités comportent à leur extrémité intracellulaire C-terminal un motif PY, conservé entre les espèces (rat, xénope, humain) et qui consiste en une séquence d’acides aminés, Pro-Pro-Pro-Xaa-Tyr. Les résidus tyrosine présents dans les motifs riches en proline des sous-unités β et γ ENaC sont reconnus lors de l’endocytose des canaux (fig. II.4). Les motifs PY sont également des sites consensus pour des interactions protéine-protéine (62).
Figure II.4 Schéma d’une sous-unité ENaC.
II.2.2 Transport transépithélial de sodium.
Dans le rein, le canal sodium épithélial (ENaC) est présent dans la seconde partie du tubule contourné distal et dans le tubule collecteur cortical et médullaire. Il y permet le mouvement du sodium par diffusion à travers la membrane apicale des cellules épithéliales polarisées, le long d’un gradient électrochimique favorable.
L’entrée de sodium par les canaux ENaC est l’étape limitante de la
réabsorption. A la membrane basolatérale, le sodium est transporté activement hors
de la cellule, vers le sang, par les pompes Na
+/K
+-ATPases. Cette activité maintient
une concentration intracellulaire basse en sodium et fournit la force électrogénique
nécessaire à l’activité du canal (fig. II.5).
Figure II.5 Cellule du tubule collecteur. Les canaux sodiques, situés à la membrane apicale, réabsorbent le sodium qui est ensuite transporté vers le sang par les pompes Na
+/K
+ATPases situées à la membrane basolatérale.
Outre les tissus natifs déjà cités, ENaC est exprimé dans la lignée cellulaire A6, dérivée du rein de crapaud africain (Xenopus laevis). Ces cellules expriment des canaux sodiques à haute sélectivité à la membrane apicale et des pompes Na
+/K
+ATPases à la membrane basolatérale. Cultivées sur support perméable, elles forment un épithélium serré permettant des mesures électrophysiologiques, qui sont le reflet du transport transépithélial de Na
+. Les monocouches confluentes constituent un épithélium polarisé
4et développent une différence de potentiel transépithélial de 30 à 50 mV (pole apical négatif) et une résistance de 7 à 12 kΩ.cm².
4Les épithéliums sont constitués de cellules polarisées, avec une membrane apicale ou luminale (face à la lumière de l’organe) et une membrane basolatérale (côté séreux, le sang). Les jonctions serrées intercellulaires délimitent les domaines apicaux et basolatéraux. Les protéines membranaires, bien que pouvant diffuser dans les membranes, sont strictement restreintes à l’un de ces deux domaines. Les protéines de transport localisées à ces deux domaines sont différentes, et ceci paraît fondamental dans l’organisation en deux pôles d’un épithélium. On peut même dire qu’elle constitue le substratum biochimique du transport vectoriel que réalise un épithélium. On définit une absorption (ou ré- absorption) comme un mouvement vers le LEC, et une sécrétion comme mouvement inverse vers la lumière. Le domaine basolatéral contient presque toujours la Na-K-ATPase et divers récepteurs hormonaux ainsi que des intégrines spécifiques. C’est toujours la membrane apicalequi constitue la barrière limitant la perméabilité dans les épithéliums de type serré, lesquels peuvent générer des gradients ioniques importants. Les jonctions serrées jouent un rôle de barrière sélective qui détermine les propriétés de perméabilité de la voie paracellulaire, établissant une barrière physique. Les protéines des jonctions serrées incluent les molécules d’adhésion jonctionnelles (JAM), les claudines et l’occludine, qui interagissent avec des protéines cytoplasmiques telle que la famille des Zonula Occludens (ZO). Cette organisation est essentielle pour l’ancrage aux protéines du cytosquelette et à
Bien que cette lignée cellulaire soit issue du crapaud, et que l’homologie des séquences des ENaCs ne soit que de 60% entre les batraciens et les mammifères, cet épithélium polarisé répond aux principales hormones qui affectent la réabsorption de sodium chez les mammifères, à savoir l’aldostérone, la vasopressine et l’insuline (150).
Ce modèle cellulaire présente certains avantages par rapport à l’oocyte de xénope exprimant les 3 sous-unités du canal. La lignée cellulaire permet de travailler sur le canal natif, dans des cellules polarisées dont la fonction première est la réabsorption du sodium. Ce modèle nous garantit que toutes les protéines membranaires et/ou intracellulaires participant à la régulation du canal sont présentes, ce qui n’est pas le cas de l’oocyte. La limitation de ce modèle est la faible expression d’ENaC par les cellules A6 (145). Les systèmes d’expression par transfection dans des cellules COS ou FRT des différentes sous-unités offrent un plus grand nombre de canaux exprimés, mais ne possèdent pas nécessairement les voies de signalisation impliquées dans la régulation d’ENaC.
II.2.3 Régulation d’ENaC.
Le rôle central et prépondérant de la réabsorption du Na
+dans l’homéostasie hydrosodée explique probablement que l’activité d’ENaC soit contrôlée par de multiples facteurs.
In vivo, le transport de sodium via ENaC est régulé principalement par deux voies hormonales. Une déplétion volumique diminue la perfusion rénale et engendre la sécrétion de rénine par l’appareil juxtaglomérulaire. L’activation de la voie rénine- angiotensine-aldostérone qui y fait suite augmente l’activité d’ENaC.Une diminution du volume extracellulaire induit également la sécrétion d’ADH (hormone anti- diurétique ou vasopressine) par l’hypothalamus. La vasopressine, par liaison à son récepteur V2, augmente le transport de sodium via, entre autres, la voie AMPc dépendante. Cette voie est plus rapide que celle de l’aldostérone (minutes) car elle ne dépend pas d’une synthèse protéique.
Outre ces 2 hormones principales, l’insuline régule positivement l’activité des canaux sodiques dans le néphron distal (21, 25, 105, 139, 178). Ces hormones empruntent les différentes voies de signalisation décrites dans ce chapitre.
5La régulation d’ENaC est, entre autres, effectuée par des modifications posttraductionnelles, sous contrôle hormonal, principalement de l’aldostérone et de l’ADH. Ces modifications posttraductionnelles sont la phosphorylation, essentiellement par Sgk et PKA, la méthylation et l’ubiquitinylation par la protéine Nedd 4-2.
A. La protéine kinase induite par le sérum et les glucocorticoïdes (Sgk)
La Sgk1 joue un rôle important dans la régulation du transport ionique transépithélial. C’est une sérine/thréonine protéine kinase qui appartient à la famille des AGC kinases comprenant les protéines kinases A (PKA), G (PKG), C (PKC) et B/Akt (PKB/Akt). Sgk1 partage une forte homologie avec ces protéines kinases, essentiellement avec la protéine kinase B. Diverses molécules de signalisation modulent son niveau d’expression, son activité kinase intrinsèque et sa localisation subcellulaire. Ces propriétés lui permettent d’intégrer de nombreuses voies de signalisation et de réguler plusieurs transporteurs membranaires et certains canaux.
La Sgk1 est induite par un très large spectre de stimuli
6(dont des facteurs de croissance et hormones), souvent très spécifiques au type cellulaire. L’aldostérone induit rapidement (dans les 30 minutes) les taux d’ARNm et/ou de protéines de la Sgk1, uniquement dans les cellules dérivées des épithéliums répondant à l’aldostérone (20, 53, 111). Cette induction précède ou coïncide avec l’augmentation de la phosphorylation de Nedd4-2 et l’activation du transport transépithélial de Na
+dans les épithéliums rénaux (d’origine distale) (85, 160). Son activité est régulée par des
5D’autres hormones et facteurs de croissance sont impliqués dans la régulation du canal sodique, dont le peptide natriuértique auriculaire (16, 164), la progestérone (115, 153), l’EGF (epidermal growth factor) et le TNFα (tumor necrosis factor) (151), la bradykinine (15), la prostaglandine E2 (22, 88, 109, 185) et l’endothéline (60).
6Le gène de la Sgk1 contient plusieurs séquences consensus pour des facteurs de transcription. Son promoteur contient un élément de réponse aux glucocorticoïdes (GRE), un site de liaison pour la p53, un élément régulateur (SP-1) répondant à la stimulation par la FSH et la forskoline (dans les cellules ovariennes) et un cAMP-responsive element-binding (CREB). Enfin, un gène rapporteur en 5’ de la
phosphorylations réversibles. Cette kinase est une des cibles des trois principales hormones régulant le canal sodium épithélial (aldostérone, ADH et insuline) (8).
• Régulation de Sgk1 par la phosphorylation.
La protéine Sgk1 est régulée par une kinase en amont, qui dépend du système de la phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K). Le PIP
3produit par la PI3-K à partir du PIP
2active les 3-phosphoinositide-dependant protéine kinase-1 et 2 (PDK1 et 2). La PDK-2 induit la phosphorylation de la sérine 422, qui facilite la seconde phosphorylation par PDK-1 sur la thréonine 256 située dans le domaine catalytique.
Cette double phosphorylation la rend active (87, 97,127).
L’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) peut également activer Sgk1.
La séquence consensus pour la phosphorylation dépendant de la PKA se situe part et d’autre de la Thr369 (129).
Il semblerait que Sgk1 puisse également être contrôlée par WNK1 (with no lysine kinase), une kinase qui joue un rôle dans l’homéostasie du Na
+et dans le contrôle de la pression sanguine. Le mécanisme d’action n’est pas entièrement élucidé, mais il pourrait impliquer la phosphorylation de la Ser422 et de la Thr256 par les PDK1 et 2 (49). Il semblerait que l’activation de Sgk1 par WNK1 passerait par la voie de la PI 3-K (194, 195).
• Régulation de Sgk1 par l’ubiquitinylation.
Sgk1 est instable et a un turn-over rapide, avec un temps de demi-vie
avoisinant les 30 minutes. La dégradation rapide de Sgk1 implique son
ubiquitinylation suivie par une dégradation par les protéasomes. La protéine
ubiquitine ligase impliquée dans l’ubiquitinylation de Sgk1 n’est autre que Nedd4-2
(elle-même une cible de Sgk1). Son action dépend de la présence de la région N-
terminale décrite plus haut, et requiert que Nedd4-2 soit phosphorylé par Sgk1. Ceci
implique une régulation en « feedback ». En phosphorylant Nedd4-2, Sgk1 induit sa
propre dégradation. La phosphorylation de Nedd4-2 a des effets différentiels : à l’état
déphosphorylé, Nedd4-2 cible ENaC tandis qu’à l’état phosphorylé Nedd4-2 cible
Sgk (204).
• Rôle de Sgk1 dans la réabsorption de sodium aldostérone-dépendante.
L’effet à long terme de l’aldostérone implique la Sgk1 préalablement activée par PDK1 et 2 (122). L’effet stimulant de Sgk1 sur ENaC passe par, d’une part, l’augmentation de canaux à la membrane (41), et d’autre part, une activation des canaux déjà présents dans la membrane (43).
Le premier effet implique l’action de Nedd4-2. Sgk1 phosphoryle des résidus ser/thr sur des séquences type RXRXXS/T. Nedd4-2 contient plusieurs de ces motifs consensus de phosphorylation (2 à 3, en fonction du « splice variant »). Un motif P-Y sur Sgk1 pourrait servir de site de liaison pour Nedd4-2. Dans l’oocyte de xénope, Sgk1 induit la phosphorylation de Nedd4-2 sur deux de ses sites : la Ser444 et la Ser338, qui diminuent l’interaction de Nedd4-2 avec ENaC. Ceci conduit à une augmentation de l’expression et de l’activité d’ENaC à la surface cellulaire (85, 97, 161). L’effet inhibiteur de Sgk1 sur Nedd4-2 implique probablement les protéines 14- 3-3 qui se lient sélectivement Nedd4-2 lorsque celle-ci est phosphorylée (par la Sgk1).
La formation de ce complexe maintient l’ubiquitine ligase sous sa forme inactive (78, 121). Un mutant dominant négatif de la protéine 14-3-3 atténue fortement la stimulation d’ENaC par Sgk1, la surexpression de la protéine 14-3-3 altérant l’ubiquitinylation Nedd4-2 dépendante d’ ENaC (97).
En plus de cette action indirecte de Sgk1 sur l’abondance d’ENaC à la surface cellulaire, Sgk1 peut directement interagir avec ENaC (184) et augmenter l’activité du canal en phosphorylant les sous-unités α ENaC (43). Enfin, Sgk1 augmente la probabilité d’ouverture du canal (6). Ces interactions directes avec le canal ne font toutefois pas l’unanimité. Il semblerait également que Sgk-1 active la pompe Na
+/K
+ATPase. L’aldostérone augmente l’abondance de ces pompes tandis que la Sgk1 activerait les pompes préexistantes.
Enfin, NDRG 2 (N-myc downstream-regulated gene 2), qui est une protéine
induite par l’aldostérone dans l’ASDN (épithélium répondant à l’aldostérone,
aldosterone-sensitive distal nephron), est une autre cible de Sgk1. Toutefois son rôle
n’est pas encore connu. Cette protéine aurait une fonction dans la cascade de
signalisation dépendante de Sgk1 et en relation avec le transport de sodium (fig. II.6)
(19 ,119).
Figure II.6 Régulation du transport épithélial de sodium via la Sgk. L’aldostérone
induit l’expression de Sgk1. PDK2 induit la phosphorylation de Sgk1 sur la sérine
422 qui facilite la seconde phosphorylation sur la thréonine 256. Alternativement
Sgk1 est également activée par WNK1 (with no lysine kinase 1) via un mécanisme
inconnu. Une fois activée, Sgk1 phosphoryle Nedd4-2 (neuronal precursor cell
expressed developmentally downregulated 2) sur les sérine 444 et 338 qui permet la
liaison de la protéine 14-3-3 sur la sérine 444 de la Nedd4-2. Ce complexe empêche
l’interaction Nedd4-2/ENaC réduisant l’ubiquitylation d’ENaC et son retrait de la
membrane plasmique. Alternativement, Sgk1 phosphoryle et active ENaC
directement (97).
B. Neuronal precursor cell expressed, developmentally down-regulated protein (Nedd 4)
L’ubiquitinylation joue non seulement un rôle majeur dans l’internalisation des protéines membranaires, mais également durant le trafic intracellulaire des protéines. Elle consiste en une modification post-traductionnelle qui implique le transfert et la liaison covalente d’une ou de plusieurs copies d’ubiquitine sur les protéines cibles. L’ubiquitine est une protéine, hautement conservée, de 76 acides aminés. Elle contient un motif diglycine dans son domaine C-terminal qui interagit avec les résidus lysine des protéines cibles.
L’ubiquitinylation est un signal pour la dégradation protéique par les protéosomes. La liaison de l’ubiquitine peut également réguler la localisation des protéines et/ou l’activité, indépendamment de la protéolyse. Elle peut également contrôler l’activité des composants de la machinerie endocytique, l’activité des facteurs de transcription et l’activité de kinases.
Deux voies de dégradation peuvent être empruntées en fonction de l’ubiquitinylation. Les protéines polyubiquitinylées subissent une dégradation protéosomale, les protéines monoubiquitinylées sont dégradées par la voie lysosomiale.
• Régulation d’ENaC par la protéine Nedd4-2.
Le nombre des canaux à la membrane apicale dépend de la balance entre le taux d’insertion d’ENaC et le taux de retrait de la membrane.
La protéine ubiquitine ligase Nedd4-2 est caractérisée par la présence de deux à quatre domaines WW (interaction protéine-protéine) riches en résidus tryptophane (W), qui reconnaissent et se lient au motif PY (riche en proline) (fig. II.7). La liaison de Nedd4-2 aux motifs PY des domaines C terminaux (présents sur chacune des sous-unités du canal) conduit à l’ubiquitinylation et à la dégradation des sous-unités ENaC via la voie des protéasomes ubiquitine-26S (81). Cette voie de dégradation est valable pour les cellules exprimant ENaC de manière endogène (cellules A6) (167).
Par contre pour les cellules transfectées la dégradation d’ENaC se ferait par la voie lysosomiale (103, 104).
Récemment il a été établi que Sgk1 phosphoryle et inhibe Nedd4-2 (18). Sgk1
induit la phosphorylation de Nedd4-2 qui peut alors interagir avec les membres de la
famille des protéines 14-3-3. L’action concertée de Sgk1 et de 14-3-3 empêche l’ubiquitinylation d’ENaC par Nedd4-2 et son retrait de la membrane plasmique
7.
Figure II.7 Représentation schématique de l’ubiquitine ligase.
C. AMPc/PKA
L’augmentation de la concentration en AMPc intracellulaire, suivie de l’activation de la PKA, stimule rapidement le transport du sodium dans les épithéliums exprimant ENaC. Dans le cas de l’ADH, le mécanisme de transduction reste sujet à débats entre l’augmentation de la probabilité d’ouverture (Po) et l’augmentation du nombre de canaux à la membrane (N). Plusieurs études suggèrent que la réponse aiguë (minutes ou secondes) serait le résultat de l’insertion à la membrane apicale d’ENaCs contenus dans des vésicules intracellulaires (30).
7 Les protéines 14-3-3 furent initialement décrites dans le cerveau. Elles ont ensuite été identifiées dans tous les tissus. Elles sont impliquées dans plusieurs processus physiologiques et physiopathologiques. Elles agissent en se liant à des sites spécifiques, phosphorylés sur différentes protéines cibles, et induisent des changements conformationnels ou influencent les interactions entre leurs cibles et d’autres molécules. Ces modifications altèrent l’activité et/ou la localisation subcellulaire des protéines cibles. Nedd4-2 contient 3 motifs cibles pour Sgk1 (Ser 338, Thr 363, Ser 444), deux de ceux-ci (Ser 338 et Ser 444) ayant été montré comme étant des substrats de Sgk1. La sérine 444 semble être le principal médiateur de l’inhibition par Sgk1 et est conforme au motif consensus de liaison pour 14-3-3. Sgk1 phosphorylerait Nedd4-2 sur ce motif, induisant son inhibition via l’interaction avec la protéine 14-3-3. Il s’ensuit une augmentation du nombre de canaux à la
+