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Submitted on 1 Jan 1984
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ANALYSE HISTOLOGIQUE PAR MICROSPECTROMÉTRIE RAMAN
M. Truchet
To cite this version:
M. Truchet. ANALYSE HISTOLOGIQUE PAR MICROSPECTROMÉTRIE RAMAN. Journal de
Physique Colloques, 1984, 45 (C2), pp.C2-557-C2-560. �10.1051/jphyscol:19842127�. �jpa-00223796�
Colloque C2, suppliment au n02, Tome 45, fivrier 1984 page C2-557
ANALYSE H I S T O L O G I Q U E PAR MICROSPECTROMETRIE RAMAN
M. Truchet
Laboratoire dfHistophysioZogie Fondamentale e t ~ ~ ~ l i ~ u e ' e + , Universitd Pierre e t Marie Curie, 12, m e &vier, 75005 Paris, France
Re'swne'
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La microspectrome'trie Roman permet d r o b t e n i r des spectres de v i - bration mo Ze'cuZaire a' partir de prises d ' e s s a i s de 1 O - l l g , directement sous Ze microscope. Les structures draccwnuZation de composgs puriques, l e s pre'cipitations min6raZisBe.s natureZZes ou pathoZogiques peuvent a i n s i Ztre directement caractdris6es sur coupes histologiques. Duns Zre'tat actueZ de son instrumentation e t de sa me'thodotogie, Za microspectromgtrie Roman ne s'adresse qu'aux cas de bioaccumulations, mais des progrZs impor- t a n t s peuvent Ztre espdre's duns un proche avenir.Abstract
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Roman microspectrometry aZZows t o characterize d i r e c t l y i n t o m d t i s s u e s i n very ma22 samples (10-IIg) any kind o f metabolism products : purinic components, natural and pathoZogicaZ mineral precipi- t a t i o n s , secretion products. I n t h e present s t a t e of t h e a r t , only bio- accumuZations leads t o spectrum, but important progress are possible i n a near future.Pour dlterminer i n s i t u la composition chimique dldmentaire et moldculaire des structures cellulaires et tissulaires, l'histologiste n'a disposl longtemps que de mlthodes cytochimiques mettant en jeu des rlactifs en solution. I1 en est peu qui soient 1 la fois sensibles et spdcifiques, et, dans le domaine de l'analyse moldcu- laire, elles sont caractdristiques d'un radical, qui peut Ztre rencontrd dans des moldcules trEs diverses, Depuis longtemps, des tentatives ont dtd faites pour utili- ser des mlthodes basses sur des principes physiques ; la seule qui ait abouti 2 des rdsultats vraiment satisfaisants est la microspectromdtrie d'absorption dans le vi- sible et l'ultraviolet. Toutefois, ndcessitant un appareillage relativement complexe et des connaissances spticialisdes, elle s'est peu rdpandue (1).
Grzce au principe physique sur lequel elle repose, la spectromdtrie Raman offre b l'histologiste une mdthode d'identification des mollcules a p r i o r i universelle.
L'instrument crdl par Delhaye et Dhamelincourt (2) vient donc rdpondre 1 une demande potentielle trEs importante en histologic.
La microsonde Raman utilise un microscope optique ; son champ d'application est donc celui des coupes histologiques classiques ou des coupes semi-fines d'dchantil- lons prdpards pour l'examen en microscopic llectronique. Etalements, frottis, cellu- les en culture vivantes ou fixdes peuvent dgalement Ztre utilisds. Les coupes P la paraffine sont soigneusement dlparaffin6es.
Tous les procddds de pr6paration des dchantillons destinds 2 l'observation en mi- croscopie omptique peuvent Ztre employds, sous reserve qu'ils n'introduisent pas de fluorescence ; ainsib le baume de Canada, doit Ztre proscrit a p r i o r i . De mzme, on dvitera d'utiliser de l'eau ddmindralisGe par passage sur rdsine dchangeuse d'ions ou on lui fera subir ultlrieurement un traitement de purification, tel que le passa- ge sur charbon activl. Lors de l'analyse, la fluorescence diminue le plus souvent dans des proportions considdrables aprEs une longue illumination d'un mzme point.
Ce procddd permet d'obtenir des spectres, mais en dclairage ponctuel. L'dclairage global, par rotation du faisceau laser, excite la fluorescence au maximum : il n'est donc pas possible, actuellement, d'utiliser le mode image, qui serait pourtant d'un grand intdrst. Le plus petit diamEtre de la sonde est 1LgSrement infdrieur au micro- rnstre. La meilleure sensibilitti est obtenue avec le plus grand angle solide de
+ERA no 570 du CNRS
Article published online by EDP Sciences and available at http://dx.doi.org/10.1051/jphyscol:19842127
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collection possible : on utilisera de prdfdrence l'objectif 100 P sec, ou mieux en- core l'objectif 160. Les distances frontales trPs courtes interdisent l'emploi de lamelles ordinaires, et le mieux est d'analyser la coupe simplementsdchde. L'inter- prdtation des spectres est faite par comparaison avec celui d'un produit de rdfdren- ce, analysd dans les msmes conditions que la coupe ; ce standard correspond P la nature supposde de la structure analysde. Lorsque le spectre fourni par la coupe est complet, il n'y a aucune ambiguitd dans l'analyse qualitative. Mais, frdquemment, il ntappara4t qu'une seule raie, la plus intense, qui peut Ztre commune B divers corps ; la spdcificitd est alors moins satisfaisante.
En ddpit de la standardisation des conditions d'analyse entre l'dchantillon et les substances de rdfdrence, il n'est pas possible de quantifier les rdsultats. L'absorp- tion spdcifique, la fluorescence parasite, la gdomdtrie des microstructures illumi- ndes introduisent trop de variables. On peut ndanmoins estimer si le produit est pur, ou s'il est une partie d'un mdlange dont les autres composantes ne fournissent pas de raie caractdristique ; d'une structure B l'autre, l'abondance relative des phases du mdlange peut Qgalement Ztre dvalude.
La sensibilite est faible. Dans un cas trPs favorable de mdlange de phosphate de calcium et de calcite (la calcite diffuse intensdment), une proportion de calcite de quelques "pour millet' a pu Ztre caractdrisde (3). Mais, dans la plupart des cas, la concentration minimum ddtectable doit Ztre beaucoup plus forte (10 % ? ) . L'applica- tion de la microspectromdtrie Raman aux coupes histologiques a actuellement fourni les principaux rdsultats suivants :
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Caractdrisation de prdcipitds de guanine accumulds dans le tdgument de poisson et dans le tissu interstitiel d'araignde (4).Dans les deux cas, la nature du prdcipitd dtait connue par des travaux antd- rieurs et ce materiel a s e m i de modPle pour ddterminer les possibilitds analytiques rdelles de la microsonde. Les spectres obtenus sont tres semblables P ceux de la guanine pure ; dans les coupes d'araignde, la raie de vibration intermolCculaire B
145 cm-1 a m&e 6t6 observde. Aucune fluorescence n'est manifestde par la coupe de tdgument de poisson P 514.5 nm, tandis qu'il faut recourir B la raie rouge du laser P krypton pour diminuer la fluorescence importante dmise par la guanine d'araignde.
Les coupes Qtant prspardes de la mgme manisre, la fluorescence est donc intrinssque au tissu de l'araignde. Dans les deux cas, les concrdtions semblent faites de guani- ne presque pure ; il existe toutefois un composd d'accompagnement, dont la presence se traduit par une raie surnumdraire P 1315 cm-1. La nature de ce produit diffPre selon les animaux : chez le poisson, il s t y adjoint une autre raie vers 1420 cm-1.
L'analyse de frottis a montrd que le traitement histologique ne modifiait en rien la nature des concrdtions.
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CaractCrisation de ddchets puriques chez les insectes et un mollusque.L'accumulation des ddchets puriques se fait sous forme de volumineuses concrd- tions (I 1 25 pm) ou de nombreux microcristaux. Leur Ctude avait 6td rdalisde prdcd- dement par d'autres techniques : cytochimie, microsonde de Castaing, chromatogra- phie, diffraction des rayons X (5). L'apport de la microsonde Raman a dtd de confir- mer, par une seule mdthode, les hypothsses sur leur nature chimique. Les spectres de vibration moldculaire sont obtenus P partir de prises d'essais infinitdsimales
(I 0-1 lg) et directement in situ, ce qui n'est actuellement accessible B
aucun
autreinstrument, et permet d'analyser des concrdtions de trPs petite taille, trop peu nombreuses pour pouvoir Ztre extraites. En outre, la spectromgtrie Raman, contraire- ment B la diffraction des rayons X, ne requiert pas la cristallinitd du produit.
Ces spectres Raman ont permis d'identifier dans tous les cas un mdlange d'acide uri- que et d'urates. En effet, dans la rdgion de 1300 P 1800 cm-1, les spectres de l'aci- de urique, de l'urate de sodium et de l'urate de potassium different profonddment, et sont aisdment reconnaissables. L'examen des spectres fournis par les coupes mon- tre que les nombreuses raies sont dues 1 la superposition des trois spectres en un seul. Toutes les concrdtions d'un msme tissu montrent le mZme faciss spectral, quelle que soit la taille de la concrdtion ; en revanche, d'un tissu B l'autre, il est aisd de reconna'itre des diffdrences qui ddmontrent que les constituants du md- lange ne sont pas toujours dans les msmes proportions (4).
Dans certains cas, de la xanthine s'ajoute au mdlange.
de calcium et le carbonate, sous forme de calcite. En effet, ces deux espOces minb- rales diffsrent par leur raie de rdseau 1 280 et 206 cm-1, respectivement (7, 8).
Ces analyses ont montrd que les deux composds pouvaient coexister dans un mlme tissu d'un mlme animal, contrairement 1 une distinction classiquement admise. La composi- tion des prdcipitbs est parfois extrlmement pure, c o m e les microperles de calcite de VaZrata, ou, au contraire, trOs complexe c o m e les sphdrocristaux de Lymnaea.
Dans ce dernier cas, de nombreuses raies du spectre n'ont pu stre attribuges ; l'a- nalyse d'une grande varidtd de sels mindraux d'alcalino-terreux pris comme standards a seulement permis d'bcarter llhypothSse d'une phase mindrale associde au phosphate de calcium.
Dans d'autres prbcipitds de Lymnaea, les raies du graphite ont dtb identifibes. Les conditions analytiques n'dtant pas en cause, il faut admettre que ce graphite est accumuld in vivo ; toutefois, la signification physiologique de cette accumulation dchappe actuellement 1 toute interprdtation. Le seul cas analogue relate 1 ce jour est celui d'un poisson (9).
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Mise en dvidence de sulfure de cuivre dans des lysosomes (10, 11).Certains mollusques, dont le sang renferme de l'hdmocyanine et non de l'hdmo- globine, accumulent dans les lysosomes de cellules spdcialisdes, le cuivre provenant de la ddgradation du pigment respiratoire. En caractdrisant directement dans de vo- lumineux lysosomes le sulfure cuivrique par sa raie 1 4 7 4 cm-I, la microanalyse Raman, associde 1 la microscopic dlectronique 1 transmission et B la microanalyse par sonde dlectronique, a contribub 1 donner une explication de ce mbcanisme biochi- mique. Ces rbsultats invalident l'interprdtation selon laquelle la forte teneur en cuivre de ces mollusques serait la consdquence d'une pollution du milieu marin.
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Ddtermination de la nature des lithiases r6nales en cas d'intoxication par un m6- tal lourd (3, 12).En cas d'intoxication par le bichlorure de mercure ou le chlorure de cadmium, le rein des Vertdbrds est le siege d'une intense prdcipitation mindrale appelde ndphrocalcinose bien que la nature des prdcipitds n'ait jamais dtb ddterminbe avec certitude. Elle est accompagnde d'une ostdoporose et diffSre selon qu'il s'agit de mercure ou de cadmium : dans le premier cas, la prbcipitation est intracellulaire et aboutit 1 une vdritable mindralisation des tubules rbnaux ; dans le second, les concrdtions se forment dans la lumiSre.
Les spectres Raman ont montrd la grande similitude entre la composition des prdcipi- tds rdnaux et 1'0s d'animal sain ou intoxiqud. Tout se passe donc comme si la matis- re prdlevde dans 1'0s se reconstituait dans le rein. A cstd des raies caractbristi- ques du phosphate de calcium, on peut reconna4tre celles de l'oxalate et du
carbonate, ainsi qu'une composante organique plus ou moins importante. Le carbonate a parfois pu stre identifid 1 la calcite grsce 1 la raie 5 280 cm-I ; une dtude com-
~ a r d e effectube par diffraction des rayons X, a montrd que la calcite n'excddait pas 0,3 % de la matiSre analysde, fournissant ainsi la premiere, et actuellement unique, donnde chiffrbe sur la sensibilitd de la microsonde pour un composd minbral d'origi- ne biologique.
Dans tous les cas, ce sont donc des structures 06 la concentration est impor- tante dans le volume illumine qui fournissent un spectre Raman : prdcipitations mi- ndrales ou organiques, sphdrocristaux ou encore produits de sbcrdtion. Les consti- tuants ordinaires de la matiere vivante ne fournissent pas de spectres, lorsqu'ils ne sont pas accumulds localement.
Dans 1'6tat actuel de sa mbthodologie, la microsonde Raman s'adresse domc aux cas de bioaccumulations importantes, susceptibles de supporter une intensit6 d"il1umination assez forte, sans dmettre une trop grande fluorescence. Mais lorsque ces conditions sont safisfaites, il n'y a pas de substance qui ne puisse donner de spectres carac- tbristiques. L'dtude des composds moins concentrds ddpendra des progrss instrumen- taux et mdthodologiques, pour lesquels s'offrent dSs maintenant plusieurs possibili- tds.
L'extension du domaine spectral au proche ultraviolet, permet de se placer dans mes conditions de rbsonance ou de prdrcsonance ; un gain considdrable de luminosith Ra- man est obtenu, mais au prix d'une absorption qui peut ltre importante. Pour dviter la photoddgradation de la structure analysee, i1 faut diminuer la puissance d
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mination, ce qui revient P perdre d'un c6td ce qui dtait gagnd de l'autre : seule 11exp6rience dira si le bilan est positif, dSs que les instruments seront disponi- bles. Recemment, un microscope CARS a dt6 construit et applique avec succbs ii un dchantillon biologique (13) ; malheureusement les conditions du "phase matching" ne sont pas contrslables dans de tels dchantillons, ce qui fait peser une lourde hypothSse sur l'avenir de ce procddd en microscopic Raman. Bien que les puissances de crzte des lasers P impulsion soient encore trop fortes pour les structures cellu- laires, la spectromdtrie Raman resolue dans le temps para'it actuellement plus pro- metteuse, puisqu'elle ne recourt qu'8 des artifices instrumentaux pour le traitement du signal.
On peut donc raisonnablement espdrer, dans un prochain avenir, d'importants pro- grSs qui Llargiront le champ d'application de la microspectrometrie Raman 3 l'analy- se des structures cellulaires les plus varides.
1. LISON L., Gauthier-Villars, Ed., Paris (1960).
2. DELHAYE M. et DHAMELINCOURT P., J. Raman Spectrosc.,
3
(1975) 33-43.3. MARTOJA R., MELIERES F., RAYNAUD C. et TRUCHET M., C. R. Acad. Sc. Paris (D), 292 (1981) 857-862.
4. =LAN-DUFRANCAIS C., TRUCHET M. et DHAMELINCOURT P., Biol. Cell.,
2
(1 979) 51-58.5. BALLAN-DUFRANCAIS C. ThSse Doctorat dlEtat, Paris (1975).
6. MARTOJA M. et TRUCHET M., Malacologia,
3
(1983) 333-349.7. VENEC-PEYRE M.T. et JAESCHKE-BOYER H., C. R. Acad. Sc. Paris (D),
287
(1978) 607-6 10.8. LEFEVRE R., BARBILLAT J., CUIF J.P., DHAMELINCOURT P. et LAUREYNS J. C. R. Acad.
Sc. Paris (D),
288
(1979) 19-22.9. DELHAYE M., DHAMELINCOURT P. et WALLART F., Toxicol. Environ. Chem. Rev.,
3
(1 979) 73-87.
10.MARTOJA M., W THAN TUE et ELKAIM B., J. Exp. Mar. Biol. Ecol.,
fi
(1980) 251- 270.I I. TRUCHET M., MARTOJA M., MARTOJA R. et BALLAN-DUFRANCAIS C
. , Actual Chim. (4) (1980) 15-18.
12.MARTOJA R., TRUCHET M. et BOUQUEGNEAU J.M., C. R. Acad. Sc. Paris (III),
295
(1 982) 369-374.
I3.DUNCAN M.D., REINTJES J. and MANUCCIA T.J., Opt. Lett. (1982) 22-33
