Table des matières
Chapitre 1 - Introduction
A. L’ataxie de Friedreich ...3
1.1 Généralités ...3
1.1.1 Qu’est-ce que l’ataxie ? ...3
1.1.2 Historique ...3
1.2 Epidémiologie et tableau clinique ...3
1.2.1 Epidémiologie ...3
1.2.2 Premiers symptômes ...4
1.2.3 Progression de la maladie ...4
1.3 Une maladie neurodégénérative rare ...6
1.3.1 Le gène de l’AF (FXN) ...6
1.3.2 De l’expansion GAA à la diminution de l’expression de la frataxine. ...6
1.3.2.1 L’expansion GAA ...6
1.3.2.2 Extinction du gène FXN ...6
1.3.3 Autres mutations ...12
1.4 Physiopathologie ... 12
1.4.1 Symptômes neurologiques ... 12
1.4.1.1 Dégénérescence des neurones du DRG et neuropathie sensitive périphérique ...12
1.4.1.2 Dégénérescence de la moelle épinière ... 15
1.4.1.3 Dégénérescence des voies cérébelleuses efférentes ... 17
1.4.2 Cardiomyopathie hypertrophique ...17
1.4.3 Diabète ... ..19
1.5 La frataxine : une protéine mitochondriale ... ...21
1.5.1 Les mitochondries...21
1.5.2 Structure et localisation de la frataxine ...21
1.5.3 Fonctions ...23
1.5.3.1 Implication de la frataxine dans la biosynthèse et ou la régulation des centres [Fe-S] ...23
1.6 Physiopathologie moléculaire et cellulaire ...25
1.6.1 Atteinte des protéines [Fe-S] mitochondriales et stress oxydatif ...25
1.6.2 Autre voie de signalisation atteinte ...28
1.6.2.1 Régulation de mTOR ...28
1.6.2.2 Fonctions de mTOR ...28
1.6.2.3 Implication de mTOR dans l’AF ... 29
1.7 Modèles cellulaires et animaux ... ...31
1.7.1 Modèles murins ...31
1.7.1.1 Souris avec un déficit complet de la frataxine ... .31
1.7.1.2 Souris avec un déficit partiel de la frataxine ... 31
1.7.2 Modèles cellulaires ...32
1.7.3 Autres modèles ... ...33
1.8 Stratégies thérapeutiques... ...33
B. Les cellules souches pluripotentes induites ...35
2.1 Généralités ...35
2.1.1 Définitions ...35
2.1.2 Les différents type de cellules souches ... 35
2.1.3 Historique ...37
2.2.1 Principe ... 37
2.2.2 Les différentes méthodes de reprogrammation ... 38
2.3 Sélection et validation des iPSC ... 39
2.4 Variabilité du comportement des clones de iPSC ... 41
2.5 Utilisation des iPSC dans la modélisation de pathologies ... 41
2.5.1 Utilisation en recherche fondamentale ... 43
2.5.2 Utilisation en recherche appliquée ... 45
Chapitre 2 - Objectifs du projet...47
Chapitre 3 - Méthodologie expérimentale... 51
3.1 Cultures cellulaires ... 53
3.1.1 Culture des fibroblastes ... 53
3.1.2 Culture des iPSC ... 53
3.1.3 Différenciation en cellules corticales ... 53
3.1.3.1 Induction neurale ... 53
3.1.3.2 Différenciation neuronale ... 54
3.1.4 Différenciation en neurones sensoriels primaires ... 56
3.2 Modèles murins de l’AF ... 57
3.2.1 Les souris Knock-In homozygotes ... 57
3.2.2 Les souris BAC transgéniques ... 57
3.3 Traitements ... 58
3.3.1 Sur les cellules différenciées à partir des iPSC AF ... 58
3.3.1.1 Traitements 0 : par la forskolin ... 58
3.3.1.2 Traitements 1 : par des analogues des incrétines ([D-Ala2]-GIP et exendin-4) ...58
3.3.1.3 Traitements 2 : par un inhibiteur des histones désacétylases (iHDAC, 109) associé ou non à exendin-4 ... 58
3.3.1.4 Traitements 3 : par une nouvelle génération d’inhibiteurs des histones désacétylases (iHDAC, 69, 71, 89) ... 59
3.3.2 Sur les modèles murins AF : les souris BAC transgéniques et les souris KIKI ... 59
3.3.2.1 Traitements 3 : par les composés 69, 71, 89 ... 59
3.4 Techniques de biologie moléculaire et de biochimie ... 61
3.4.1 Western-Blot ... 61
3.4.1.1 Extraction et dosage protéique ... 61
3.4.1.2 Séparation des protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes ... 61
3.4.1.3 Transfert sur membrane de nitrocellulose ... 62
3.4.1.4 Blocage des sites non-spécifiques et incubation avec l’anticorps primaire et secondaire ... 62
3.4.1.5 Méthode d’analyse ... 62
3.4.1.6 Anticorps utilisés ... 62
3.4.2 Transcription inverse et réaction en chaine par polymérase (Reverse Transcription and Polymerase Chain Reaction, ou RT-PCR) ... 64
3.4.2.1 Extraction de l’acide ribonucléique (ARN) ... 64
3.4.2.2 La RT-PCR quantitative (qRT-PCR) ... 64
3.4.3 Réaction en chaine par polymérisation (Polymerase Chain Reaction, PCR) ... 65
3.4.3.1 Extraction de l’ADN ... 65
3.4.3.2 La PCR ... 65
3.4.3.3 Electrophorèse sur gel d’agarose et révélation ... 65
3.4.4 Immunocytochimie indirecte ... 67
3.4.4.1 Protocole ... 67
3.4.4.2 Anticorps utilisés ... 68
3.4.5 Activité de l'enzyme MnSOD ... 68
3.5.1 Dispositif expérimental... 69
3.5.2 Vérification de l’excitabilité cellulaire intrinsèque ... 69
3.6 Etude statistique ... 70
Chapitre 4 - Résultats ...71
A. Génération et caractérisation des modèles cellulaires de l’ataxie de Friedreich (AF) ... 73
4.1 Introduction ... 73
4.2 Caractérisation des iPSC ... 73
4.2.1 Marqueurs de pluripotence ... 73
4.3 Caractérisation des cellules corticales issues des iPSC ... 75
4.3.1 Présence de progéniteurs neuraux ... 75
4.3.2 Identité corticale ... 75
4.3.3 Stabilité de l’expansion GAA ... 75
4.3.4 Les neurones corticaux CT et AF présentent une excitabilité intrinsèque ...80
4.3.5 La diminution de l’expression de la frataxine induit une diminution de l’expression des protéines [Fe-S] au sein des cellules corticales AF... 80
4.3.6 La déficience en frataxine conduit à la perturbation du système antioxydant au sein des cellules corticales AF ...81
4.3.7 La Forskoline prévient l’activation de la voie intrinsèque de l’apoptose ... 85
4.3.8 Etude de l’implication potentielle de mTOR dans la physiopathologie de l’AF ... 85
4.3.8.1 Etude de TTP et PS6 ... 85
4.3.8.2 Etude des substrats directs de mTORC1 : P70 S6K1 et 4E-BP1 ... 86
4.3.8.3 Etude du gène MVK ... 86
4.4 Caractérisation des neurones sensoriels primaires issus des iPSC ... 89
4.4.1 Identité sensorielle primaire ... 89
4.4.2 La diminution de la frataxine conduit à la diminution de l’expression des protéines [Fe-S] au sein des PSN AF ... 89
4.4.3 La déficience en frataxine conduit à la perturbation du système antioxydant au sein des PSN AF ... 90
4.5 Conclusion ... 94
B. Thérapies potentielles ... 95
4.1 Introduction ... 95
4.1.1 Les inhibiteurs des HDAC ... 95
4.1.2 Les analogues des incrétines ... 96
4.2 Traitements par les analogues des incrétines associés ou non à un iHDAC (109)... 96
4.2.1 Premier traitement: Etude de l’effet de [D-Ala2]-GIP et d’exendin-4 ... 96
4.2.1.1 Augmentation de la frataxine par exendin-4 au sein des cellules corticales AF .... 97
4.2.2 Second traitement : Etude de l’effet de 109 et d’exendin-4 ... 97
4.2.2.1 Augmentation de la frataxine par exendin-4 et 109 au sein des cellules corticales AF ... 97
4.2.2.2 Augmentation de l’expression des protéines [Fe-S] par exendin-4 et 109 au sein des cellules corticales AF ... 98
4.2.2.3 Augmentation de l’expression de la frataxine après traitement par 109 au sein des PSN AF ... 98
4.2.3 Troisième traitement : Etude de l’effet des nouveaux iHDAC ... 103
4.2.3.1 Les traitements par 69, 71 ou 89, induisent une augmentation de la frataxine au sein des cellules corticales AF ... 103
4.2.3.2 Les traitements par 69, 71 ou 89, induisent une augmentation de l’expression des protéines [Fe-S] au sein des cellules corticales AF ... 103
4.2.3.3 Le traitement par 89, induit la restauration du système antioxydant au sein des cellules corticales AF ... 106
4.2.3.5 Etude de l’effet de 69, 71 ou 89 sur les souris KIKI et BAC transgéniques ... 109
4.3 Conclusion ... ... 113
Chapitre 5 - Conclusions et perspectives ...117
5.1 Caractérisation du phénotype AF au sein des cellules corticales et des neurones sensoriels primaires ... 118
5.1.1 Perturbation de l’homéostasie du fer et du métabolisme énergétique ... 119
5.1.2 Perturbation de la réponse antioxydante ... 121
5.1.3 Implication potentielle de la voie mTOR ... 123
5.2 Nouvelles thérapies potentielles dans l’AF ... 125
5.2.1 [D-Ala2]-GIP et exendin-4 : analogues des incrétines ... 125
5.2.2 Le composé 109 : un inhibiteur des HDAC de classe I ... 126
5.2.3 Les composés 69, 71, 89 : une nouvelle génération d’inhibiteurs des HDAC de classe I . 127 5.3 Conclusion ... 128
5.4 Perspectives générales ... 129
