Conception et synthèse d'inhibiteurs de l'Aminopeptidase membranaire N ([EC. 3.4.11.2], APN ou CD13)

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Conception et synthèse d’inhibiteurs de

l’Aminopeptidase membranaire N ([EC. 3.4.11.2], APN

ou CD13)

Lionel Roux

To cite this version:

1

Chapitre 1 : l’angiogénèse

1. L’angiogénèse et ses implications.

L’angiogénèse est le processus de formation de nouveaux capillaires sanguins par excroissance ou bourgeonnement de vaisseaux préexistants. C’est une phase essentielle de l’évolution d’un organisme vivant.

La formation des vaisseaux sanguins est un processus fondamental dans le développement précoce de l’embryon, la circulation sanguine est mise en place dès la formation des organes et les vaisseaux se multiplient et s’adaptent à la période de croissance. Dans l’organisme adulte, ce mécanisme généralement au repos peut être de nouveau stimulé en cas de blessures lors de la cicatrisation ou lors du cycle menstruel des femelles mammifères. Il est activé pour accompagner la régénération des tissus fonctionnels des organes.

L’angiogénèse est également une composante de nombreuses pathologies telles que la prolifération tumorale, certaines maladies inflammatoires chroniques1 comme la polyarthrite rhumatoïde ou le psoriasis ainsi que certaines maladies cardiaques (figure 1).

Figure 1 : Pathologies associées aux dérèglements de l’angiogénèse

D’autres affections dermatologiques comportent une importante composante angiogénique comme les hémangiomes et les ulcères. Ainsi le contrôle de l’angiogénèse constitue un axe de recherche important pour de nombreuses maladies. C’est dans un premier temps, l’angiogénèse tumorale qui a concentré nos efforts.

2

2. L’angiogénèse tumorale.

L’angiogénèse est un élément essentiel de la croissance et la progression tumorale ainsi que pour les métastases2. En effet le système vasculaire de la tumeur lui garantit l’apport en oxygène et en nutriments ainsi que l’évacuation de ses déchets.

Dans les années 70, Folkman est le premier à faire l’hypothèse que l’inhibition de la formation de ces vaisseaux sanguins peut stopper la croissance tumorale3. Le fondement de cette hypothèse est que la taille des tumeurs avasculaires ne peut pas excéder 1-2 mm3. Lors de la phase avasculaire, l’ensemble des nutriments peut être apporté par simple diffusion, mais lorsque la tumeur arrive à sa taille limite, la simple diffusion n’est plus suffisante pour assurer sa croissance. Cette hypoxie peut aboutir à une mutation4 de la tumeur qui lui permettra d’acquérir un caractère angiogénique comme l’illustre la figure 2. Cette modification peut prendre plusieurs années où la tumeur est dite dormante5.

Figure 2 : Influence de l’hypoxie sur la stimulation angiogénique de la tumeur4. a) Courbe représentant le pH et le taux d’oxygène

en fonction de la distance aux vaisseaux sanguins

3 Aujourd’hui, la théorie sur la stimulation de l’angiogénèse, contrôlé par la balance entre les molécules pro- et anti-angiogéniques dans l’environnement de la tumeur solide, est acceptée6 (figure 3). Quand les facteurs pro-angiogéniques surpassent les facteurs anti-angiogéniques, la tumeur acquiert un phénotype angiogénique, lui permettant d’être vascularisée.

Figure 3 : Représentation de la balance entre les facteurs pro et anti angiogéniques6

a. Les facteurs proangiogeniques

Comme expliqué précédemment, les cellules cancéreuses sont capables de stimuler l’angiogénèse en produisant des facteurs angiogéniques, incluant le vascular

endothelial-derived growth factor (VEGF), l’angiopoïétine, le basic fibroblast-like growth factor (bFGF),

l’epidermal growth factor (EGF), l’interleukine 8 (IL-8) et le transforming growth factor  (TGF-) ainsi que d’autres molécules (figure 3). En plus des cellules tumorales, les cellules endothéliales, les cellules tissulaires, les plaquettes et les macrophages sont aussi capables de sécréter d’autres facteurs de croissance7.

b. Les facteurs antiangiogéniques

Les facteurs proangiogéniques sont contre-balancés par les molécules antiangiogéniques dont les principaux sont la thrombospondine-1 (TSP-1), l’angiostatine et l’endostatine (figure 3).

c. Mécanisme de l’angiogénèse tumorale

4 facteur de croissance proche de l’insuline de type 1 (IGF-1), des cytokines comme les interleukines, le facteur de stimulation des granulocytes et des macrophages ou GM-CSF (figure 4).

Figure 4 : Les différentes étapes du processus d’angiogenèse10

5 Figure 5 : Schéma de la cascade angiogénique11,12,13.

3. la thérapie antiangiogenique

6 aboutissent à une normalisation du système sanguin. L’effet secondaire observé avec les antiangiogéniques est la formation accélérée de métastases18,19,20,21,22.

Nom Laboratoire Molécule Cibles Demie-vie Localisations

enregistrées

Bevacizumab

Avastin® Genentech

Anticorps

humanisé VEGF 17/31 jours

Côlon/rectum, Poumon Sorafenib

Nexavar® BAY 43-9006

Bayer TKI VEGFR (2 et 3)

PDGFR (ß) 25/48 h Rein Sunitinib Sutent® SU 11248 Pfizer TKI VRGFR (1 à 3) PDGFR (α et ß) cKIT FLT3 CSF-IR RET 40/60 h et 80/110 h pour le métabolite de la proline Rein, Tumeurs stromales, gastrointestinales

TKI : inhibiteur de la tyrosine kinase

Figure 6 : Antiangiogéniques possédant une autorisation de mise sur le marché

Les différents agents antiangiogéniques peuvent agir à différents niveaux du processus, et ainsi plusieurs familles d’inhibiteurs peuvent être distinguées.

a. Les inhibiteurs de facteurs de croissance angiogéniques

La figure 7 illustre les différentes étapes du processus d’angiogénèse où il semble possible d’intervenir. L’ensemble de ces inhibiteurs bloque la communication VEGF – cellules endothéliales durant l’angiogénèse, ce qui aboutit à l’inhibition de la prolifération, de la migration et de la survie de ces dernières. Parmi ces inhibiteurs, on trouve :

 Les anticorps monoclonaux contre les protéines de VEGF et leurs récepteurs. Par exemple, le Bevacizumab (Avastin®) est un anticorps humain du VEGF soluble23,24,25.

 Les récepteurs solubles du VEGF (VEGF-Trap) qui ont une très forte affinité avec le facteur de croissance tout en stoppant le message angiogénique26.

 Les inhibiteurs de la Tyrosine kinase et de mTOR qui stoppent la transmission du signal à l’intérieur de la cellule27

7 Figure 7 : Mode d’action des inhibiteurs de l’angiogénèse les plus étudiés8

Analyse fonctionnelle : Signalisation cellulaire impliquée

b. Les inhibiteurs de la prolifération des cellules endothéliales

Cette famille regroupe une grande variété d’inhibiteurs, agissant directement où indirectement sur les cellules endothéliales. Par exemple, l’endostatine, antiangiogénique naturel, bloque la croissance tumorale et la diffusion de métastases28. En la combinant avec l’angiostatine, elle permet une régression complète et définitive des tumeurs chez l’animal29

.

c. Les inhibiteurs de l’invasion, de la mobilité et de l’adhérence cellulaire

 Les inhibiteurs de métalloprotéases de la matrice (MMP)

8 développement de nombreuses tumeurs solides. Les inhibiteurs synthétiques des MMP sont donc des inhibiteurs potentiels de l’angiogenèse et de la croissance tumorale. Il a été démontré qu’ils bloquaient la prolifération et la migration des cellules endothéliales et tumorales30. De nombreux inhibiteurs sont à l’étude préclinique, comme par exemple les dérivés du flavan-4-ol qui inhibent les MMP-231,32.

 Les inhibiteurs des molécules d’adhésion

Les intégrines sont des récepteurs exprimés sélectivement à la surface des cellules endothéliales leur permettant de migrer en favorisant les contacts entre les cellules et la matrice. Elles constituent donc une cible de choix pour la thérapie antiangiogénique, basée sur l’utilisation d’anticorps spécifiques des intégrines33,34

. Depuis 2006, des essais cliniques de phase II, combinant la Cilengitide et la gemcitabine, sont cours d’étude.

Conclusion

9

Chapitre 2 : l’aminopeptidase membranaire N

([EC 3.4.11.2], APN ou CD13)

1. Importance biologique : Etat de l’art

L’APN ou CD13 est une enzyme protéolytique membranaire dont le rôle fonctionnel précis est peu connu. Il semble multiple et dépendant de sa localisation cellulaire35,36. Elle est exprimée sur les tissus rénaux et intestinaux, dans le système nerveux (membranes synaptiques), dans les fibroblastes. Son expression par les cellules endothéliales a aussi été reportée in vivo lors de l’angiogénèse37 et non sur les cellules quiescentes.

Figure 8 : Fonctions et mécanismes d’action du CD1337

10

a. Régulation de transmetteurs peptidiques (i).

Le premier est la fonction enzymatique, qui hydrolyse les liaisons amides en position N terminal, en effet l’APN est une aminopeptidase N-terminale spécifique aux acides aminés neutres, qui joue un rôle lors de:

 La régulation peptidique. Cette partie sera détaillée ultérieurement.

 L’invasion tumorale, en effet de nombreuses études ont montré une forte corrélation entre l’expression et l’activité enzymatique de l’APN avec le caractère invasif d’un certain nombre de tumeurs38.

 La différenciation, utilisée comme marqueur cellulaire39.

 La prolifération, l’apoptose, la motilité, la chimiotaxie, le marquage antigénique.

b. Endocytose (ii).

Le deuxième est le mécanisme de transport de molécules voire de particules vers l'intérieur de la cellule. En effet l’APN joue un rôle lors de :

 L’infection virale. L’APN est utilisé comme récepteur par le coronavirus humain 229E (HCoV-229E), quelques coronavirus animaux, le virus de la gastroentérite porcine transmissible à l’homme40_…

 L’absorption du cholestérol41.

c. La transduction de signaux (iii).

L’APN semble jouer un rôle lors de :

 L’adhésion. Des études ont montré que l’APN est exprimé lors de la croissance cellulaire dans les zones de contact cellule-cellule42.

 La phagocytose43.

11 Deux exemples illustrent cette dernière implication de l’APN et ce sont les données de la littérature qui nous ont incités à démarrer nos travaux sur l’APN:

 Dans une expérience de vascularisation de la rétine provoquée par une hypo-oxygénation (figure 9a), le nombre de vaisseaux sanguins formés est quantifié chez les souris traitées ou non par des inhibiteurs d’APN. L’activité inhibitrice de la Bestatine (200 µg/sourris) est tout à fait intéressante et similaire à celle obtenue avec les meilleurs anticorps (250 µg/sourris). Comme la bestatine n’est pas sélective, ces résultats n’ont de sens que parce que les anticorps monoclonaux bloquent le site actif de notre enzyme.

 Dans le modèle d’angiogenèse illustré figure 9b, la vascularisation, en présence d’un facteur de croissance, le bFGF d’un tissu greffé sur la membrane chorioallantique d’embryons de poulet*, est observée et quantifiée. Ces différentes greffes sont suivies en absence ou en présence des inhibiteurs indiqués. Il est observé une nette diminution de la vascularisation des tissus en présence de Bestatine et d’anticorps monoclonaux spécifiques de l’APN (*membrane extra-embryonnaire hautement vascularisée, servant de modèle pour étudier l’angiogénèse et la transplantation de tissu.)

Figure 9 : Effet anti-angiogénique d’inhibiteurs synthétiques de l’APN 45.

12 Figure 10 : Effet antitumoral de la Bestatine et d’un anticorps monoclonal

dirigé contre le site actif de l’APN45.

Ces différentes expériences décrites dans la littérature indiquent clairement l’importance de l’APN dans le processus d’angiogénèse. Ces travaux ont été reproduits par d’autres groupes avec d’autres types d’inhibiteurs de cette aminopeptidase comme la Psammaplin A45

.

2. Mécanisme enzymatique de l’aminopeptidase N

Ces aminopeptidases sont des exopeptidases ubiquitaires chez les mammifères. Elles sont présentes sous forme soluble ou associées aux membranes. Elles catalysent la réaction d’hydrolyse de l’acide aminé en position amino-terminale d’un peptide ou d’une protéine. Il en existe donc une très grande variété spécifique au groupement R1 (figure 11). La fonction amine libre est essentielle à la reconnaissance d’un substrat par cette famille d’enzymes protéolytiques46.

Figure 11 : Exemple d’aminopeptidase en fonction de l’acide aminé N terminal.

Le nombre de ces aminopeptidases soulève une des premières difficultés liées à la conception d’inhibiteurs spécifiques à l’APN. De plus, pour la plupart, l’activité catalytique dépend de la présence d’ions métalliques tels Zn2+

13 Certaines enzymes fonctionnent avec un seul ion zinc (famille M1), ce qui est le cas de l’APN et l’activité aminopeptidasique de la Leukotriène A4 hydrolase (LTA4H)*, alors que d’autres en possèdent deux, organisés en « unité co-catalytique » (famille M7), comme la Leucine Aminopeptidase cytosolique (LAPc)47 ou de l’Aminopeptidase d’Aeromonas proteolytica (APaero)48. La figure 12 donne une vue représentative de ces enzymes. (*La fonction précise de cette activité aminopeptidasique n’est pas connue mais son activité époxyde hydrolase catalyse l’étape finale de la biosynthèse du leukotriène B4.)

L’analyse de ces structures, nous permet de constater que le repliement des aminopeptidases à « un ion Zn » est différent de celles à deux ions Zn. Elles ne semblent avoir aucun lien d’un point de vue évolutif. En effet le site actif des aminopeptidases à deux ions Zn se situe à la surface de l’enzyme sur des feuillets  tandis que pour celles à un ion Zn, le site actif est en profondeur dans un domaine constitué d’hélice 

Figure 12 : Vue schématique de :

14 Comme énoncé précédemment, l’APN présente une spécificité de substrat très large puisqu’elle reconnaît des acides aminés hydrophobes comme la leucine, la valine, la phénylalanine en position N-terminale. Le mécanisme auquel nous nous référons est celui de la thermolysine (figure 13), endopeptidase qui comme l’APN contient un seul ion zinc dans le site catalytique49 dont la structure est connue. Depuis d’autres structures d’aminopeptidases à un zinc ont été résolues comme l’APN d’E. Coli50 et l’APN Meningitis51 (code : 2GTQ) bien que les homologies de séquence avec l’APN humaine ne dépassent pas 30%.

Figure 13 : Mécanisme catalytique proposé pour l’aminopeptidase à un zinc

L’ion zinc est tetracoordiné (His 297, His 301, Glu 320, H2O) dans le site actif de l’enzyme native. Dans ce modèle, le peptide qui se lie déplace la molécule d’eau liée au zinc vers le résidu Glu 298. L’atome de zinc forme ainsi un complexe pentacoordinné (a). La molécule d’eau, activée à la fois par l’influence du métal et du résidu Glu 298 (HO

15

3. Structure et caractéristique de l’APN

L’APN est une protéine membranaire homodimérique fortement glycosylée, d’un poids moléculaire d’environ 280 kDa52_{. Bien que la structure de l’APN humaine ne soit pas connue} à ce jour, un modèle basé sur l’analyse des structures secondaires53

, peut être proposé. Elle comporterait trois parties distinctes (figure 14): la partie (I) est un court domaine cytoplasmique N-terminal, la deuxième (II) est constituée d’une hélice hydrophobe par monomère cette fois-ci implantée dans la membrane plasmique, et enfin la dernière (III, IV, V, VI et VII) correspond au domaine extracellulaire C-terminal où se situe le site actif.

Figure 14 : Représentation basée sur les structures secondaires de l’APN humain a) monomères APN : le site actif est situé entre le domaine V et VI,

la dimérisation s’établissant au niveau du domaine VII. b) 37

4. Les inhibiteurs de l’APN

16

a. Inhibiteurs issus de produits naturels

Quelques inhibiteurs de l’APN issus de produits naturels54 sont représentés figure 15. La bestatine et l’amastatine ont toutes les deux été isolées de Streptomyces olivoreticuli par Umezawa en 1976 et en 197855,56,57.

Figure 15 : Constantes d’inhibition pour l’APN

La grande majorité de ces inhibiteurs naturels sont des dérivés de la statine ou comportent une fonction acide hydroxamique. Les dérivés de la statine possèdent un amino-acide particulier, qui mime partiellement l’intermédiaire tétraédrique formé au cours de la catalyse enzymatique grâce à l’hydroxyle C-OH sp3

17 hydroxamique ne font intervenir que ce dernier lors de la chélatation du zinc ce qui les rend très peu sélectifs.

Figure 16 : Mode de liaison des dérivés de la statine avec les enzymes à un zinc (a) avec les enzymes à deux zincs (b) et des acides hydroxamiques (c).

La plupart de ces molécules sont des inhibiteurs peu puissants et peu sélectifs de l’APN, puisqu’ils sont plus actif sur les familles des enzymes à deux zincs comme la LAPc avec une chélation deux fois plus importante.

b. Inhibiteurs synthétiques

La plupart des inhibiteurs connus de l’APN sont des analogues de peptides capables de mimer l’intermédiaire tétraédrique ou des composés non-peptidiques (figure 17). Ils incluent des agents chélatants du zinc tels que :

 Des aminocétones58.

 Des dérivés de la cystéine59.

 Des dérivés d’acide aminophosphoniques60,61,62,63,64 .

18 Figure 17 : Inhibiteurs les plus actifs de l’APN.

Peu de données existent concernant la sélectivité de ces inhibiteurs vis-à-vis d’autres aminopeptidases.

c. Inhibiteurs synthétisés au laboratoire

Bien que de nombreux inhibiteurs soient disponibles, la plupart d’entre eux sont peu spécifiques de l’APN. Cependant des structures non-peptidiques dérivées de la 3-amino-2-tétralone synthétisées et étudiées par le Dr Huques D’Orchymont79

19 Figure 18 : Inhibition de l’APN par les composés synthétisés au laboratoire,

20 Malgré son caractère spécifique, la 3-amino-2-tétralone souffre d’un problème de stabilité, dans les conditions de pH physiologique. On suppose qu’une aromatisation de notre composé peut se faire à la suite de l’équilibre céto-énolique. Pour résoudre ce défaut, diverses modifications de la tétralone ont été effectuées, notamment sur les fonctions impliquées dans la chélation du zinc à savoir la cétone et l’amine80 ainsi que leurs localisations sur la molécule. Comme malheureusement aucun de ces inhibiteurs n’a rempli l’ensemble des 3 critères d’activité, de sélectivité et de stabilité en dehors de la 3-amino-2-tétralone, il a été décidé de passer en série benzocycloheptènes81. Dans cette série, la 7-amino-5,7,8,9-tétrahydro-benzocycloheptèn-6-one résout l’ensemble des problèmes de la série tétralone.

Seule la fonctionnalisation en position 1 & 4 de ce composé permet d’augmenter l’activité (la fonctionnalisation en position 5 peut aussi augmenter l’activité dans certains cas). En effet l’ajout d’un brome en position 1 ou d’un phényle en position 4 permet d’améliorer l’activité d’un facteur 100. On remarque qu’une synergie entre les deux groupements sur l’aromatique est obtenue et que l’ajout du bon groupement en position 1 et 4 permet un gain d’activité d’un facteur 100.

21 Figure 19 : Modes de chélation de la bestatine a) avec l’APN de E. coli ([EC.3.4.11.2], code

PDB : 2DQM)

Figure 20 : Mode de chélatation de la

22

d. Evaluation in vivo de nos inhibiteurs

Lors d’études in vivo, les biologistes du laboratoire (la doctorante Céline Schmitt et la société de prestation Onco Design) tentent de corroborer les précédents résultats en montrant que sur la sourie « nude », les effets de ces inhibiteurs sont toujours notables. Dans un certains nombres d’études pilotes, nos meilleurs inhibiteurs induisent un ralentissement de la croissance tumorale similaire au meilleur antiangiogénique (Avastin). Les tumeurs étudiées sont le Mélanome humain A-375-SM84, le Cancer du sein MDA-MB-23185 et le cancer du Rhabdomyosarcome humain A-67386 (cancer des tissus mous).

Dans le cas du Rhabdomyosarcome humain A-673 (modèle qui a donné les meilleurs résultats), le nombre de vaisseaux sanguins montre au bout de 26 jours que la vascularisation de ces tumeurs diminue d’environ 10% dans le cas du composé 12b (40 mg/kg/administration, 1 injection toutes les 3 jours), 50% dans le cas du composé 38 (30 mg/kg/administration, 1 injection toutes les 3 jours), 70% dans le cas de l’Avastin (5 mg/kg/administration, 2 injections par semaine) (figure 21). Dans cette étude, le composé 38 a des effets antiangiogéniques assez proches de l’Avastin87. D’autres tests ont été effectués en combinaison avec d’autres médicaments connus (Collaboration avec le Dr D. Guenot, Strasbourg) et montrent à ce jour des résultats assez prometteurs.

Figure 21: A- Croissance tumorale individuelle à 26 jours

Conclusion :

In Vitro, nous avons montré que nos composés ont une très forte sélectivité vis-à-vis de

l’APN. In Vivo, l’activité antitumorale observée lors de nos études pilotes est significative. Mon travail dans un premier temps a été de compléter l’étude des relations structures activités de cette famille de composés aux positions 1 et 4. Nous aborderons ensuite le développement

D26

25

Chapitre 3 : Synthèse de dérivés de la

7-amino-5,7,8,9-tétrahydro-benzocycloheptèn-6-one

substitués en position 1 et/ou 4

Dans un premier temps, nous avons synthétisé différents analogues d’aminobenzosubérone substitués en positions 1 et/ou 4, afin de compléter de précédentes études du laboratoire faites par le Dr Carmen Maiereanu. Nous avons tout d’abord débuté par la synthèse des 1 et 4-bromo-7-tert-butoxycarbonylamino-5,7,8,9-tétrahydro-benzocycloheptèn-6-ones (figure 22). Dans l’espoir d’accroitre l’affinité avec l’enzyme en tenant compte des résultats de la figure 18, il a été décidé de faire des substitutions par divers groupements aromatiques.

Figure 22 : Dérivés de la

7-amino-5,7,8,9-tétrahydro-benzocycloheptèn-6-one substitués en position 1 et 4

1. Synthèse de dérivés de la

7-amino-5,7,8,9-tétrahydro-benzocycloheptèn-6-one monosubstitués en position 1 ou en position 4

Selon le schéma rétrosynthétique suivant (figure 23), les deux squelettes moléculaires monobromés sont nécessaires pour obtenir des composés monosubstitués en position 1 ou en position 4 via des couplages pallado-catalysé. Pour obtenir ces composés, on part du

bromo-ortho-xylène commercial. Après cyclisation, la cétone formée est fonctionnalisée via des

26 Figure 23 : Rétrosynthèse de dérivés de la

7-amino-5,7,8,9-tétrahydro-benzocycloheptèn-6-one substitués en position 1 ou 4

a. Synthèse des 1- et 4-bromo-7-tert-butoxycarbonylamino-5,7,8,9-tétrahydro-benzocycloheptèn-6-ones.

La première étape repose sur une bromation radicalaire par irradiation UV-visible du 2,3-dibromobenzène dans le tétrachlorométhane et en présence de NBS ; elle conduit quantitativement au 1-bromo-2,3-dibromométhylbenzène 188 (figure 24). Le bis-ester 2 est préparé par double condensation de l’ester du 1,3-acétone dicarboxylate de méthyle sur le précédent synthon 1 en milieu basique avec un rendement de 92%89. La décarboxylation du composé 2 en milieu acide90 conduit à la cétone 3 avec un rendement de 62%. Cette dernière est transformée en l’éther d’énol silylé 4 en suivant un procédé développé par Simchen et Kober qui utilise le triflate de triméthylsilyle (CF3SO3Si(CH3)3) en présence de triéthylamine91.

27 L’éther d’énol 4 est ensuite oxydé par le mCPBA à 0°C en utilisant la méthode de Rubottom92,93 (figure 26). Cette réaction procède via l’intermédiaire d’un époxyde silyloxylé qui se réarrange très facilement en milieu acide en un ion oxocarbénium par migration du reste silylé en les α-silyloxy-cétone isomères 5a,b (figure 25).

Figure 25 : Schéma général d’oxydation de Rubottom

L’amination réductrice de la fonction cétone est faite par la méthode de Bhattacharyya94 en amino-alcool par action de l’ammoniac saturée dans l’éthanol en présence d’isopropoxyde de titane (IV), suivie d’une réduction in situ au NaBH4. Cet amino-alcool est N-protégé par action de Boc2O95 pour fournir le mélange de régioisomères et d’isomères cis et trans d’amino-alcools N-protégés 6a-d (figure 26). Les deux couples de régioisomères sont alors séparés par HPLC semi-préparative.

Figure 26 : Synthèses des 7-tert-butoxycarbonylamino-1- et 4-bromo-5,6,8,9-tétrahydrobenzocycloheptèn-6-ols 6a-d.

28 Figure 27 : Synthèse des 7-tert-butoxycarbonylamino-1 ou

4-bromo-5,6,8,9-tétrahydrobenzocycloheptèn-6-one 7a et 7b.

Figure 28 : Mécanisme simplifié de l’oxydation de Dess-Martin99

b1. Synthèse de dérivés de la 7-amino-5,7,8,9-tétrahydro-benzocycloheptèn-6-one substitués en 1.

29 Figure 29 : Cycle catalytique de la réaction de Suzuki101

Dans un premier temps, on effectue à l’aided’un four micro-ondes une réaction de couplage de Suzuki sur la molécule 7a avec différents acides boroniques, en présence de carbonate de potassium et de tétrakis (triphénylphosphine) palladium comme catalyseur. Les divers composés 9a-c sont déprotégés en présence de HCl 2N dans l’éther diéthylique à température ambiante, pendant une nuit pour donner les amines 10a-c sous forme de chlorhydrates (figure 30).

Figure 30 : Synthèse de dérivés de la 7-amino-5,7,8,9-tétrahydro-benzocycloheptèn-6-one substitués en position 1

30 Figure 31 : Valeurs des constantes d’inhibition des composés 8a et 10a-c

Ce tableau montre qu’un substituant en position 1 apporte un gain d’activité. La taille du groupement est très importante. On remarque que si l’on augmente la taille de ce groupement, de l’hydrogène au brome 8a en passant par le chlore, on améliore l’affinité. Par contre en passant à des fonctions plus encombrantes, comme dans le cas des aromatiques

10a-c, on perd en activité. Il y a peut être aussi un effet électronique. La taille d’un atome de

brome en cette position semble pour l’instant être la taille optimale.

31 faible absorption ou une forte perméabilité. Des travaux ont montré que pour pouvoir être utilisés raisonnablement, les composés ne devraient pas posséder des clogP supérieurs à 5.0102. Comme on peut le voir dans le tableau, l’ensemble des inhibiteurs reste dans cette zone d’absorption.

b2. Synthèse de dérivés de la 7-amino-5,7,8,9-tétrahydro-benzocycloheptèn-6-one substitués en 4.

La position 4 a été également fonctionnalisée de manière analogue. Comme précédemment à partir du squelette bromé 7b, un certain nombre de nouveaux inhibiteurs peuvent être synthétisés via la réaction de couplage de Suzuki avec différents acides boroniques, en présence de carbonate de potassium et de tetrakis(triphénylphosphine) palladium comme catalyseur sous micro-ondes (figure 32). Les divers composés 11a-m sont déprotégés dans les mêmes conditions que précédemment pour conduire aux amines 12a-m sous forme de chlorhydrate.

Figure 32 : Synthèse de dérivés de la 7-amino-5,7,8,9-tétrahydro-benzocycloheptèn-6-one substitués en 4

Ces nouveaux composés ont été évalués en utilisant les mêmes tests enzymatiques que précédemment. Les 2 tableaux ci-dessous résument l’essentiel des résultats obtenus (figures 33 et 34). Il ressort de ces tableaux les faits suivants :

 Les composés les plus actifs sont ceux possédant un groupement aromatique comme

12b.

 Les hétéroaromatiques 12a, 12l et 12m sont moins actifs que le composé 12b possédant un phényle.

 Le motif benzylique est substitué en ortho, meta et para par un groupement méthoxy. La fonctionnalisation en ortho et para aboutit à une très forte diminution de l’activité comme dans le cas des molécules 12c, 12d, 12f et 12k.

32 Vu les couplages effectués en position 1 et 4 de façon indépendante, il est intéressant de savoir si des composés homosubstitués en ces positions peuvent avoir de bonnes affinités avec l’enzyme. Comme précédemment, les clogP de nos inhibiteurs restent inférieurs à 5.0, ce qui nous laisse supposer qu’ils sont absorbables dans l’organisme.

34

2. Synthèse de dérivés de la

7-amino-5,7,8,9-tétrahydro-benzocycloheptèn-6-one homodisubstitués en positions 1 et 4

Selon le schéma rétrosynthétique indiqué figure 35, l’obtention de ces composés homodisubstitués nécessite la synthèse de la 1,4-dibromo-7-tert-butoxycarbonylamino-5,6,8,9-tétrahydrobenzocycloheptèn-6-one 21. On part de la 2,3-diméthyl-aniline commerciale que l’on fonctionnalise d’une façon assez proche de celle utilisée pour l’obtention du composé monobromé.

Figure 35 : Rétrosynthèse de dérivés de la 7-amino-5,7,8,9-tétrahydro-benzocycloheptèn-6-one

homodisubstitués en positions 1 et 4

a. Synthèse de la 1,4-dibromo-7-tert-butoxycarbonylamino-5,6,8,9-tétrahydrobenzo cycloheptèn-6-one 21.

35 Figure 36 : Synthèse du 1,4-dibromo-2,3-dibromométhylbenzène 15

A ce stade, la synthèse est identique à celle des composés monobromés précédents : la formation du bis-ester 16 est obtenue par double condensation du 1,3-acétone dicarboxylate de diméthyle sur 15. Une saponification, suivie d’une décarboxylation, conduisent alors à la dibromocétone 17108 avec un rendement moyen. Celle-ci est transformée comme

précédemment en l’éther d’énol silylé 18 en utilisant le triflate de triméthylsilyle (CF3SO3Si(CH3)) et la triéthylamine, puis oxydé par le mCPBA pour donner l’α-silyloxy-cétone 19 (figure 37). Les amino-alcools 20a,b obtenus par amination réductrice et protection de l’amine par Boc2O sont oxydés par le DMP en cétone 21.

Figure 37 : Synthèse de la 1,4-dibromo-7-tert-butoxycarbonylamino-5,7,8,9-tétrahydro-benzocycloheptèn-6-one 21

b. Synthèse de dérivés de la 7-amino-5,7,8,9-tétrahydro-benzocycloheptèn-6-one homodisubstitués en 1&4.

36 Figure 38 : Synthèse de 7-amino-5,7,8,9-tétrahydro-benzocycloheptèn-6-ones

homodisubstituées en 1 et 4 23a-i

37 Figure 39 : Valeurs des constantes d’inhibition des composés 23a-i

38 départ 21. Pour résoudre ce problème et synthétiser des composés pyrroliniques, des couplages de Suzuki113,114 ont été tentés en vain avec l’acide pyrrole-2-boronique présenté ci-dessous. Cet échec est vraisemblablement imputable à l’encombrement de la fonction Boc et de l’instabilité du composé final 23k.

Figure 40 : Composés pyrroliniques 23j-k

3. Conclusion

39

Chapitre 4 : Synthèse de la 1-bromo-4-phényl-7-amino-5,7,8,9-

tetrahydro-6H-benzocycloheptèn-6-one

Compte tenu des résultats obtenus dans le chapitre précédents, la synthèse de la 1-bromo-4-phényl-7-amino-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzocycloheptèn-6-one semble être une voie intéressante. Précédemment au laboratoire, différents chercheurs ont travaillé sur l’élaboration d’une première synthèse de ce dérivé reprenant les étapes-clés des composés monosubstitués (figure 41). Dans un premier temps, cette synthèse débute par une fonctionnalisation de la 2,3-diméthylaniline ; la cycloheptanone est ensuite formée comme précédemment. Au moment de la formation de l’éther d’énol silylé dans les mêmes conditions qu’au chapitre 3, on obtient un régioisomère de façon majoritaire. Cette excès régiosélectif peut s’expliquer par l’encombrement plus important du groupement phényle par rapport au brome lors de la déprotonation de l’hydrogène en  de la cétone. Part la suite, les deux éthers d’énol silylé sont fonctionnalisés pour donner les deux amino-alcools protégés.

Figure 41: Synthèse de la 1-bromo-4-phényl-7-amino-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzocycloheptèn-6-one par voie HPLC

40 Figure 42 : Interprétation de l’excès régiosélectif observé

lors de la formation de l’éther d’énol silylé

D’un point de vue rétrosynthétique, le synthon de départ est la bromo-aniline 13. Après formation du cycle aliphatique, l’éther d’énol silylé 28a est obtenu dans ce cas de façon majoritaire. Pour finir, le cycle aromatique est fonctionnalisé via des réactions de Sandmeyer et de Suzuki. Une déprotection finale conduit à l’amino-cétone 38 désirée.

41

1.

Synthèse

des

1-tert-butoxycarbonylamino-4-bromo-7-benzoxyloxycarbonylamino-5,6-dihydro-benzocycloheptène

et

1-tert-

butoxycarbonylamino-4-bromo-7-benzoxyloxycarbonylamino-8,9-dihydro-7H-benzocycloheptène.

a. Etapes de préfonctionnalisation de l’aromatique et d’énolisation.

La synthèse démarre avec la protection par un groupement Boc115 de la 4-bromo-2,3-diméthyl-aniline 13 synthétisée précédemment (figure 44). La benzocycloheptanone 27 est ensuite formée en trois étapes. La première est la photobromation radicalaire en présence de NBS, suivie d’une cyclisation avec la 1,3-acétone dicarboxylate de diméthyle en milieu basique et pour conclure d’une décarboxylation, ici, en milieu basique à cause du groupement protecteur.

Figure 44 : Synthèse de l’éther d’énol silylé 28a,b

A partir de la cétone 27, les isomères 28a,b sont formés avec un meilleur excès régiosélectif (70 /30) en présence de TBDMSCl qu’en présence de TMSOTf 116.

b. Etapes de formation de l’énone 30a,b.

Des travaux précédents réalisés dans notre laboratoire ont montré que le réarrangement de Rubottom ne donne rien en présence du groupement TBDMS. A partir du couple d’éthers

28a,b, une bromation en  de la cétone en présence de NBS a ainsi été effectuée pour donner les bromocétones correspondantes 29a,b117. Une élimination par le DBU donne alors les

42 Figure 45 : Synthèse de l’énone 30a,b

c. Etapes d’amination réductrice et de séparation des deux régioisomères 31a et 31b.

Le couple de régioisomères d’énones 30a,b (figure 46) est réduit par la méthode de Bhattacharyya en amine par action de l’ammoniac dans l’éthanol en présence d’isopropoxyde de titane (IV), suivie par une réduction in situ à NaBH4. Cette amine est ici protégée en dérivé carbamate de benzyle par action du chloroformiate de benzyle119. Il est à noter qu’a ce stade les deux régioisomères 31a et 31b ont été séparés par une simple chromatographie sur colonne. Les rendements pour la réaction d’amination sont bien meilleurs que par la voie précédemment décrite pour les dérivés bromés.

43

2.

Synthèse

de

la

1-bromo-4-phényl-7-amino-5,7,8,9-tétrahydro-6H-benzocycloheptèn-6-one 37 à partir du composé majoritaire 31a.

a. Obtention de la cétone 33.

A ce stade, le but est de transformer l’alcène majoritaire 31a en cétone 33. Plusieurs méthodes ont été utilisées (figure 47). La première est le réarrangement d’époxyde via des acides de Lewis. L’étape initiale est dans ce cas une époxidation en présence de mCPBA conduisant à 32(+/-).

Figure 47 : Réarrangement d’époxyde

Ce dernier subit un réarrangement en présence de divers acides de Lewis mais pour chacun d’entre eux le succès ne fut pas au rendez-vous :

 BF3 dans l’éther donne uniquement une déprotection du groupement Boc120.

 Pd(OAc)2 / PPh3 donne une absence de conversion121.

 MgBr2 - Zn(OTf)2122 - SnCl2123 ont aboutit soit à une absence de conversion ou bien à une dégradation du produit.

L’ensemble de ces échecs peut s’expliquer en partie par la présence de 2 groupements carbamates qui chélatent les acides de Lewis, empêchant ainsi toutes réactions ou en hydrolysant ces derniers. La seconde idée pour obtenir une cétone depuis l’alcène 31a est d’effectuer des hydroborations suivies de 2 oxydations (figure 48). Le premier borane utilisé est le BH3124 dans l’éther qui malheureusement n’est pas assez régiosélectif et ne conduit qu’à un rendement d’environ 20%. Le second borane, le 9-BBN125

, ne donne malheureusement qu’une conversion nulle.

44 Devant ces échecs, une autre voie de synthèse a été mise en place à partir de l’époxyde cis

32, qui démarre par une étape de réduction par le Dibal-H126 (figure 49). Ce dernier attaque le carbone le plus électrophile (en  de l’aromatique) pour donner l’alcool cis 34(+/-). La stéréosélectivité cis de l’époxyde 32 et de l’alcool 34 sera discutée au chapitre 8. La molécule

34 est ensuite oxydée par le périodinane de Dess Martin en cétone 33.

Figure 49 : Synthèse de la cétone 33

b. 1-Bromo-4-phényl-7-amino-5,7,8,9-tétrahydro-6H-benzocycloheptèn-6-one 38.

Après la fonctionnalisation du cycle aliphatique, la cétone 33 est engagée dans une réaction de Suzuki avec l’acide phénylboronique en présence de tétrakis(triphénylphosphine) palladium. Le carbamate 35 obtenu est déprotégé par l’acide trifluoroacétique127, et l’aniline nouvellement obtenue 36 est engagée dans une réaction de Sandmeyer en présence de bromure cuivrique pour conduire au dérivé bromé 37.

Figure 50 : Synthèse de l’amino-cétone protégée 37

45 Figure 51 : Synthèse de la

1-bromo-4-phényl-7-amino-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzocycloheptèn-6-one 38

3.

Synthèse

de

la

1-bromo-4-phényl-7-amino-5,7,8,9-tétrahydro-6H-benzocycloheptèn-6-one à partir du composé minoritaire 31b.

A ce stade, le but est de transformer l’alcène minoritaire 31b en cétone correspondante (figure 52). La même stratégie de synthèse que précédemment a été appliquée. Malheureusement la première étape d’époxidation par mCPBA donne une conversion nulle quelle que soit la température ou la concentration en réactif employé. Ceci peut s’expliquer par l’encombrement stérique apporté par le groupement NHBoc.

Figure 52 : Epoxydation du composé 31b

Comme la fonctionnalisation du cycle aliphatique ne peut se faire à ce stade, il est préférable d’effectuer celle du cycle aromatique en premier (figure 53). Comme précédemment la fonction carbamate a été déprotégée en aniline 39 par action de l’acide trifluoroacétique, puis engagée dans une réaction de Sandmeyer dans le but d’obtenir dans ce cas le composé iodé

46 Figure 53 : Fonctionnalisation de l’aromatique

Pour compléter la fonctionnalisation de la partie aromatique, un couplage de Suzuki est fait sur la partie iodé du dérivé 40 de façon préférentielle par rapport au bromé131 (figure 54). A ce stade, l’époxidation de l’alcène est réalisée sans problème à 40°C. La gène stérique du groupement phényle est donc moins importante que celle du groupe carbamate de tert-butyle.

Figure 54 : Réaction de Suzuki et époxidation

L’époxyde 42(+/-) est réduit en présence de Dibal-H pour conduire à l’alcool 43(+/-). Ce dernier est oxydé par le periodinane de Dess Martin en cétone 37 (figure 55).

Figure 55 : Etape de réduction et d’oxydation de l’époxyde 42(+/-)

47

Chapitre 5 : L’agrandissement de cycle, une

idée intéressante pour obtenir des dérivés de la

7-amino-5,7,8,9-tétrahydro-6H-benzocycloheptèn-6-one

Les travaux précédents ont mis en évidence que des dérivés de la

7-amino-5,7,8,9-tétrahydro-6H-benzocycloheptèn-6-one avait une valeur de Ki allant du nanomolaire au picomolaire. Le

résultat de cette recherche a établi qu’il serait intéressant de synthétiser des dérivés de cette cétone hétérodisubstitués en position 1 et 4. Deux synthèses de ces composés ont déjà été élaborés : la première est une synthèse non régiosélective et la deuxième est régiosélective (chapitre 4).

En complément des précédents travaux, nous décrivons ici une nouvelle voie de synthèse qui permet de passer d’un cycle à 6 à un cycle à 7 via une réaction d’agrandissement de cycle dénommée : Le « réarrangement de Koser »132,133,134.

1. Rétrosynthèse et mécanisme du réactif de Koser

Pour pouvoir faire cette transformation, nous partons du composé de type 54 possédant un alcène exocyclique en position  du noyau aromatique (figure 56).

Figure 56 : Rétrosynthèse du composé 38 via le réarrangement de Koser

48 Figure 57 : Mécanisme du réarrangement de Koser

2. Synthèse de la tétralone 51

a. Fonctionnalisation de la chaîne aliphatique.

La première étape est une estérification du L-tryptophane faite dans le méthanol en présence de SOCl2137 (figure 58). Le groupement NH2 de l’ester méthylique 44 est alors protégé sous forme de carbamate d’éthyle 45 en milieu légèrement basique par action de chloroformiate d’éthyle138

.

Figure 58 : Double protections du tryptophane

49 Figure 59 : Ozonolyse du tryptophane 45

L’ester est alors saponifié par l’hydroxyde de lithium en acide 48 (figure 60). La fonction aniline de ce dernier est protégée par l’anhydride trifluoroacétique140. Après cinq étapes, l’amide 49 est obtenue avec un rendement de 62%.

Figure 60 : Saponification et protection du composé 46

b. Réduction du groupement carbonyle et cyclisation par la réaction de Friedel et Crafts.

50 Figure 61 : Hydrogénolyse et réaction de Friedel et Craft

Les sept premières étapes qui mènent à la formation de la cétone cyclique 51 ont pour objectif d’obtenir un cycle à six chaînons qui par la suite sera transformé en un cycle à sept centres via un réarrangement de Koser. Mais pour cela, il est tout d’abord nécessaire d’avoir un alcène exocyclique en α de l’aromatique 54.

3. Oléfination et réarrangement de Koser

Cette étape est mise en place pour transformer la cétone conjuguée au cycle benzénique en un alcène primaire. Des travaux d’optimisation ont permis de mettre en évidence que l’emploi de méthodes habituelles comme une réaction de type Wittig144 ou utilisant le réactif de Tebbe145 ne fonctionne pas (conversion trop faible, voire nulle) sur la cétone 51. De ce fait, une autre stratégie de synthèse a été mise en place qui consiste à transformer tout d’abord la cétone en alcool tertiaire 53 par action d’un organomagnésien. Celui-ci est ensuite transformé en un groupement mésylate qui est éliminé en présence de triéthylamine146,147,148,149,150. L‘alcène 54 est ainsi formé avec un rendement de 55% (figure 62).

51

b. Réarrangement de Koser.

L’alcène 54 est soumis à l’action du réactif de Koser (HTIB), afin d’effectuer l’agrandissement de cycle désiré (figure 63) du cycle à six chaînons comprenant l’alcène en un cycle à sept chaînons 7 selon le mécanisme décrit précédemment. Le réarrangement de Koser est un élément-clé dans cette voie de synthèse car il permet d’obtenir le squelette carboné correspondant à celui des inhibiteurs d’APN que l’on souhaite synthétiser avec un bon rendement. Il donne une certaine originalité à ce schéma synthétique dont les 10 premières étapes sont vouées à la construction de ce cycle à sept chaînons avec une cétone en position 6.

Figure 63: Réarrangement de Koser

4. Changement de groupement protecteur

Pour pouvoir effectuer la fonctionnalisation en position 1 et 4 de la molécule, il est nécessaire de transformer les deux groupements protecteurs en deux autres groupements beaucoup plus faciles à cliver par la suite (figure 64). Les protections trifluoroacétate et éthyle carbamate ont été choisies parce qu’elles résistaient aux conditions acides utilisées lors de l’étape d’ozonolyse, d’hydrogénolyse et de Friedel et Crafts. Le remplacement de la protection trifluoroacétique du compose 55 en Boc est facilement accompli en utilisant au départ des conditions basiques afin de rendre l’aniline libre151,152,153,154,155. Malheureusement à ce stade, le centre asymétrique en position 7 est totalement racémisé dû à l’équilibre céto-énolique de la fonction carbonyle en 6. L’aniline racémique 56 est ensuite reprotégée par un groupement Boc.

Figure 64 : Changement de protection de l’aniline.

52 basiques se sont toutes soldées soit par une destruction du composé dans les deux premiers cas ou bien par une absence de conversion tel que:

 HBr ou HCl dans l’acide acétique au reflux156.

 L’utilisation du TMSI et de BBr3157,158,159 .

 Le chauffage à reflux du méthanol en présence de sel de Ba(OH)2160.

En revanche, si l’on réduit la fonction carbonyle par le Dibal-H, la déprotection du carbamate devient alors possible161,162,163 (figure 65). En effet l’alcool racémique 58(+/-) est déprotonné en présence de base. L’alcoolate formé va attaquer le carbamate d’éthyle afin de donner un carbamate cyclique 59(+/-), moins résistant aux conditions basiques. L’implication d’une telle voie est appuyée par le fait que le composé 59(+/-) peut être isolé si l’on ne laisse pas la réaction se compléter. Ce composé est ensuite N-protégé en carbamate de benzyle 61(+/-).

Figure 65 : Changement de protection de l’amine en position 7.

La fonction alcool est ensuite oxydée par le réactif de Dess-Martin en cétone 62, pour retrouver le squelette de nos inhibiteurs. Afin d’obtenir des composés hétérodisubstitués en position 1 et 4, il est nécessaire d’avoir un groupement en position 4 du composé 62. Pour cela une bromation en para du groupement NHBoc est effectuée par la N-bromosuccinimide pour donner le composé 33 désiré. A ce stade, la synthèse du composé final 38 rejoint celle décrite dans le chapitre 4164.

53

5. Conclusion

En conclusion, nous avons synthétisé un composé qui en quelques étapes peut être transformé en de puissants inhibiteurs nanomolaires à picomolaires de l’APN. Les trois principaux points de cette synthèse sont les suivants:

 Le réarrangement de Koser fonctionne dans ces conditions et rend cette voie de synthèse viable165.

 Le carbone 7 est épimérisé au cours de la synthèse. Bien que cela soit regrettable, il est à noter que :

_ L’ensemble des précédents inhibiteurs a été donné en série racémique.

_Si le composé se racémise durant la synthèse, il y a de très forte chance que celui-ci se racémise dans les conditions de pH physiologique.

_ L’APN ne semble pas faire de discrimination entre les énantiomères du carbone en  de l’amine terminal, par exemple la bestatine a une configuration d’un acide aminé D alors que les substrats de type peptidique ont une configuration L166.

55

Chapitre 6 : Utilisation du réarrangement de Koser pour la synthèse de

dérivés de la 3-amino-2,3-dihydrobenzo[b]oxépin-4(5H)-one

Comme nous l’avons détaillé dans le chapitre 5, la synthèse du dérivé 33 à partir du L-tryptophane est très longue. Pour résoudre ce problème, l’introduction d’un hétéroatome en position 9 a été envisagée. (figure 67).

Figure 67 : Nouvelles molécules-cibles.

Nous avons retenu pour cela une suite réactionnelle de 3 étapes-clés: Mitsunobu, Heck et Koser (figure 68). Pour débuter cette synthèse, il est nécessaire de préparer le 2-benzyloxycarbonylamino-but-3-èn-1-ol 68.

Figure 68 : Voie rétrosynthétique générale.

1. Synthèse du 2-benzyloxycarbonylamino-but-3-èn-1-ol 68

La synthèse débute avec une réaction de protection de la fonction amine du chlorhydrate de l’ester méthylique de la DL-sérine avec du chloroformiate de benzyle.La fonction alcool du produit ainsi obtenu 63 est alors protégée par le tert-butylchlorodiméthylsilane en présence d’imidazole dans le dichlorométhane167. Au bout d’une nuit à 50°C, la molécule O,N-protégée 64 est obtenue avec un bon rendement (figure 69).

56 La molécule 64 est réduite par le Dibal-H. Malheureusement la réduction directe en aldéhyde n’a pas donnée les résultats souhaités : seul un mélange d’aldéhyde, d’ester et d’alcool a pu être obtenu. Après réduction complète, cet alcool 65 conduit à l’aldéhyde 66 en présence de réactif de Dess-Martin dans le dichlorométhane avec un bon rendement (figure 70).

Figure 70 : Réduction de l’ester.

Une réaction de Wittig a été effectuée pour transformer l’aldéhyde 66 en alcène 67 en présence de bromure de méthyl-triphénylphosphonium et de KHDMS168,169. L’alcène 67 est

O-déprotégé en présence de fluorure de tétrabutylammonium pour conduire au synthon

désiré 68170 (figure 71).

Figure 71 : Oléfination et déprotection.

2. Synthèse de la 3-amino-2-hydro-5H-benzo[b]oxépin-4-one 72

57 Figure 72 : Réactions de Mitsunobu et de Heck.

Le cycle catalytique de ce couplage débute par une addition oxydante du palladium dans la liaison carbone-halogène (figure 73). La double-liaison, une fois chelatée au palladium, est insérée entre la liaison carbone métal. Un seul régioisomère est alors obtenu, il s’agit du plus stable et du moins encombré stériquement. L’alcène 70 est ensuite formé après une  -élimination. Le complexe palladié formé subit une élimination réductrice pour régénérer l’espèce catalytique Pd(0)173

.

Figure 73 : Mécanisme simplifié de la réaction de Heck.

b. 3-amino-2-hydro-5H-benzo[b]oxépin-4-one 72

58 Figure 74 : Réarrangement de Koser et étape de déprotection finale.

Les résultats d’activité du composé 72 sont identiques au composé de référence ne comportant pas d’hétéroatome dans le cycle aliphatique (figure 75). En plus le composé 72 a été obtenu en un nombre plus limité d’étapes. Comme l’idée d’introduire un hétéroatome a été validée, la synthèse de composés hétérodisubstitués dans la série oxa peut débuter. De plus, les clogP de ce dernier inhibiteur est très inférieur à 5.0, ce qui est mieux que précédemment.

Figure 75 : Constantes d’inhibition.

3.

6-Benzyloxycarbonylamino-4-hydroxy-4-méthoxy-6-(2,2,2-trifluoro

acétamido)-2,3,4,5-tétrahydrobenzo[b]oxépine 78

a. 3-Benzyloxycarbonylamino-4-méthylène-5-trifluoroacétamide-chromane 77

59 Figure 76 : Réactions de Sandemeyer et de Mitsunobu.

Une réaction de couplage de type Heck a été réalisée conduisant à la molécule 75 avec un rendement 68%30. A ce stade, la réaction Koser comme réalisée dans la première voie de synthèse n’a pas pu être effectuée avec succès. La présence du groupement nitro sur le cycle aromatique explique probablement cet échec. Pour surmonter cette difficulté, nous avons envisagé de remplacer la fonction nitro par une fonction amine protégée. La réduction du groupement nitro se fait aisément par la poudre de fer dans l’acide acétique174,175. L’aniline

76 obtenue est protégée avec l’anhydride trifluoroacétique. La molécule protégée 77 est alors

obtenue avec un rendement de 95% (figure 77).

Figure 77 : Heck, réduction et protection.

b. Réaction de Koser et perspective de synthèse

60 Figure 78 : Réarrangement de Koser.

A ce jour, la voie de synthèse n’est pas pu être achevée mais au vue de la longueur de la synthèse, cette dernière répond à nos attentes, à savoir l’obtention d’une synthèse rapide de composés hétérodisubstitués qui sont les meilleurs inhibiteurs de l’APN. Nous proposons figure 79 une voie de synthèse possible pour l’obtention de ces composés. Les réactions utilisées sont assez similaires à celle décrites précédemment, ce qui nous donne de bonnes raisons de croire que cette synthèse est viable.

Figure 79: Voie possible pour la fin de la synthèse.

4. Séries azotée et soufrée

En parallèle de la série oxygénée, des essais en séries azotée et soufrée ont été effectués.

a. Tentative de synthèse en série azotée

61 (figure 80). Malheureusement à ce stade, la réaction de Koser ne marche pas, ne donnant que des produits de dégradation. D’autres tests de synthèse avec un autre groupement que la fonction mésylate sont encore à l’étude.

Figure 80 : Série azotée.

La synthèse de composés en série azotée permettrait de synthétiser des composés possédant une chaine latérale sur l’azote.

b. Tentative de synthèse en série soufrée

La série soufrée a également été abordée. Mais malheureusement, l’ensemble des tests pour la réaction de Mitsunobu s’est soldé par un échec avec une absence de couplage177 (figure 81). Ces différents revers et le fait que la fonctio thiol risquait de s’oxyder au cours de la synthèse lors du réarrangement de koser, nous ont poussés à abandonner cette voie.

Figure 81 : Série soufrée.

5. Conclusion

En conclusion, une synthèse a été mise en place pour les composés comportant un oxygène dans le cycle aliphatique. Les principaux points de cette synthèse sont :

 Le réarrangement de Koser fonctionne encore dans ces conditions rendant cette voie de synthèse viable.

 La synthèse semble moins longue pour obtenir un analogue du composé 38 par cette voie.

63

Chapitre 7 : Synthèse d’inhibiteur utilisant

la thérapie de capture de neutron par le bore

(« Boron Neutron Capture Therapy » : BNCT)

Comme expliqué dans le chapitre 2, l’APN est aussi surexprimée sur certaines tumeurs en plus des cellules endothéliales. Mon travail dans cette partie a consisté à introduire un groupement cytotoxique sur nos inhibiteurs afin de pouvoir détruire la cellule cancéreuse « de l’intérieur ». Les groupements cytotoxiques employés sont des dérivés du type « cages de bore » classiquement employés lors de l’utilisation de la BNCT. Dans ce chapitre, le principe de cette technologie sera vu, un petit historique des molécules utilisant ce procédé sera abordé, une étude méthodologique de greffage sera effectuée et enfin l’application à notre composé sera faite.

1. La BNCT appliquée au cancer

La BNCT est basée sur une réaction nucléaire se produisant quand l’isotope stable 10B est irradié sous une faible énergie (0.025 eV) par un neutron ‘thermique’. Le 11B excité obtenu se décompose en noyau d’hélium (appelé aussi particule ), en noyau de lithium et en une particule figure 82)178

Figure 82 : Mode de décomposition du 11B excité172.

Les particules  ont la capacité de dégrader l’ensemble des molécules organiques comme l’ADN, l’APN et les protéines179

64 Ceci signifie que l’effet des radiations ne se ressentira que sur les cellules ayant une forte concentration en 10B, c'est-à-dire essentiellement les cellules tumorales sans provoquer de réels dommages aux tissus sains (figure 83)180.



Figure 83: BNCT appliqué au cancer174.

Le potentiel thérapeutique de cette réaction a été reconnu par Locher en 1936181, mais Sweet fut le premier à suggérer que la BNCT pourrait être utile pour le traitement des tumeurs cérébrales182,183. Après des essais peu convaincants dans les années 60, les études cliniques de l’équipe d’Hatanaka pour le traitement des gliomes malins184

et de l’équipe de Mishima pour le traitement du mélanome ont stimulé l’intérêt pour la BNCT185.

b. Section efficace de capture de neutron (cross-section) et cage de bore

Un certain nombre de noyaux ont de bonnes propriétés pour l’absorption provenant en particulier de ‘neutrons thermiques’ de faible énergie. Ce potentiel se nomme la section efficace de capture de neutron () : elle est mesurée en barn (1b = 10-24cm2) (figure 84)186.

65 Le bore est le plus attractif des noyaux ayant une grande section efficace pour plusieurs raisons :

 les particules émisses par cette capture de neutrons [10B(n,Li] ont une haute énergie de transfert.

 l’effet des radiations de ces particules est approximativement du diamètre d’une cellule (10-14 m). Ceci signifie que l’effet des radiations ne se ressentira que sur les cellules ayant une forte concentration en 10B.

 De tous les noyaux ayant une forte activité, le bore est celui dont la chimie est la plus élaborée ce qui lui permettra d’être intégré dans un très grand nombre de structures chimiques187.

Bien que la valeur de soit très faible pour les éléments des tissus sains (figure 85), deux d’entre eux, l’hydrogène et l’azote sont présents en très forte concentration ce qui peuvent les faire participer à la capture des neutrons. Pour éviter les réactions avec l’azote [14N(n,p), 14C] et l’hydrogène [1

H(n,), 2H], il est essentiel que les cellules cancéreuses soient forcément enrichies en 10B.

Figure 85 : La section efficace de capture de neutron thermique des principaux noyaux se trouvant dans l’organisme180

.

66 Figure 86 : Diverses cages de Bore

2. Exemples de molécules utilisant la BNCT

67 Depuis les années 60 et les premières études cliniques, un nombre important de composés utilisant cette technologie a été synthétisé avec des modes d’action à peu près similaires (figure 87). Malheureusement à l’heure actuelle et à notre connaissance, il n’existe aucun traitement médical sur le marché utilisant ce procédé.

3. Etude méthodologique de greffage et application à nos inhibiteurs

Comme énoncé précédemment, le volume des cages de bore est sensiblement équivalent au volume d’un phényle en rotation. Après les études de structure activité faites dans les chapitres 3 et 4, la substitution du phényle en position 4 par l’orthocarborane semble ainsi être une voie intéressante. A l’heure actuelle, seules 2 réactions existent pour obtenir des composés possédant une liaison entre l’aromatique et le carborane. La première est une réaction proche de la boration (dont le mécanisme n’est pas connu) entre le décaborane et un alcyne (figure 88)195. La seconde est un couplage d’Ullmann entre un dérivé iodé et l’orthocarborane196_{. Chacun des deux composés peut être obtenu à partir d’intermédiaires} déjà synthétisés au laboratoire.

Figure 88 : Rétrosynthèses envisageables pour l’obtention de nos composés portant des cages de bore

a. Boration

Optimisation :

68 les conditions standards. Pour résoudre ce problème, deux optimisations sont effectuées (figure 89).

Figure 89 : Synthèse utilisée pour les études méthodologiques

Le cycle catalytique de ce couplage débute par une insertion oxydante du Pd(0) dans la liaison carbone-halogène (figure 90). L’alcyne est déprotoné par la base, puis transformé en cuprate en présence du sel de cuivre (I). Une transmétallation entre le Pd(II) et le complexe au cuivre se produit. Après isomérisation, l’intermédiaire formé subit une élimination réductrice pour former une nouvelle liaison C-C et ainsi régénérer l’espèce catalytique Pd(0)197.

69 Dans cette étude d’optimisation de la réaction de Sonogashira, les conditions expérimentales classiques198 (2) n’ont pas donné de bonne conversion (figure 91). En utilisant la tri-tert-butylphosphine199, meilleur ligand que la triphénylphosphine200 mais plus sensible à l’oxydation, et le sel de BF4(Ht

PBu3)201, plus stable que la tri-tert-butylphosphine, les conversions sont presque doublées mais restent insuffisantes. Une étude similaire a été effectuée avec un autre catalyseur tout aussi classique pour cette réaction (5 et 6), qui malheureusement ne donna pas les résultats escomptés202. L’utilisation du micro-onde semble résoudre une bonne partie des problèmes avec 45% de conversion dans le meilleur des cas203. En répétant 3 fois la réaction, on arrive à obtenir une conversion de 70% et un rendement de 65%. Par la suite, ces conditions (10) seront utilisées pour la réaction de Sonogashira.

70 L’alcyne 83 est déprotégé pour donner l’alcyne vrai 84 en milieu basique dans le méthanol204,205. A partir de ce dernier composé, une série de tests est effectuée pour obtenir le composé 86 (figure 92). Les deux premières méthodes (1206 et 2207,208) sont les méthodes les plus classiques de la littérature. Certains exemples montrent que lors de cette réaction, il est possible de conserver la cétone209, malheureusement dans notre cas seul le produit de réduction 87 a été obtenu. Les méthodes 3210 et 4211,212 ne dérogent pas à cette règle et conduisent aussi à l’alcool 87, dans le premier cas avec 20%, du composé 85, et uniquement à ce dernier dans le second cas. Par la suite, les conditions (4) seront utilisées pour la réaction de boration.

Figure 92 : Optimisation de la réaction de boration Application :

71 Figure 93 : Première tentative d’application de boration à nos inhibiteurs

La fixation de la cage de bore en fin de synthèse semble impossible. Mais elle fonctionne cependant à partir du composé 85, nous avons opté pour une synthèse à partir de ce dernier composé en utilisant les outils précédemment utilisés (figure 94). L’alcool 85 oxydé par le periodinane de Dess-Martin donne la cétone 86 stable. Cette dernière est transformée en éther d’énol silylé 89 en utilisant le triflate de triméthylsilyle (CF3SO3Si(CH3)) et la triéthylamine. Du fait de l’important encombrement stérique de l’orthocarborane, un seul régioisomère est obtenu.

Figure 94 : Oxydation et énolisation.

A partir de l’éther 89, une bromation en position  de la fonction cétone par le NBS, suivi d’une réaction d’élimination par le DBU conduisent à l’énone 90 (figure 95). Cette dernière est transformée par la méthode de Bhattacharyya en amine, puis protégée avec du CbzCl.

72 A ce stade, les trois étapes développées au chapitre 4 sont employés :

 l’époxydation de l’alcène 91 par le mCPBA.

 La réaction de l’époxyde avec le Dibal-H.

 L’oxydation par le periodinane de Dess-Martin de l’alcool donnant la cétone 92 (figure 96).

La synthèse se termine avec une déprotection en milieu acide donnant le bromhydrate 93.

Figure 96 : Passage de l’alcène à la cétone et déprotection