Partie 2: Expression génétique

Laboratoire de Microbiologie et Biologie Moléculaire ---

Université Mohamed V - Agdal• Faculté des Sciences B.P. 1014 - Rabat - MAROC

Filière SVI – S4

Module de Biochimie et Biologie Moléculaire

Elément 2: Biologie Moléculaire – Pr. Bouchra BELKADI

Partie 2:

Expression génétique

Faculté des Sciences - Rabat

belkadibouchra@yahoo.fr  

Année  universitaire  2010-­‐2011  

Expression d ʼ un gène

Processus entier qui décode lʼinformation portée par un gène donné et la traduit en protéines

ARN

Acide RiboNucléique =

Ø  Comment se fait le choix des types de protéines exprimées par les cellules?

Ø  Qui détermine le taux dʼexpression de ces protéines?

Ø  Comment un organisme unicellulaire sʼadapte aux différents milieux?

Facteurs déterminants

-  Concentration en ARMm propre à chaque protéine qui dépend de la nature du gène transcrit et de la vitesse de transcription -  Fréquence à laquelle il est transcrit

Cʼest donc principalement la transcription différentielle des gènes dans une cellule qui détermine ses caractéristiques (propriété et fonction)

Introduction

Les ARN, les ARN polymérases et généralité sur la transcription

I- Transcription chez les bactéries

1– Lʼorganisation dʼun gène bactérien

2 – Le Promoteur et lʼinitiation de la transcription 3 – Lʼélongation de la transcription

4 – La terminaison de la transcription

5 – Les inhibiteurs spécifiques de la transcription

B- Transcription

II- Transcription chez les Eucaryotes

Introduction : particularités du génome eucaryote 1 – Lʼinitiation de la transcription

2 – La régulation post-transcriptionnelle

q  Les ARN:

Introduction :

•  Polyribonucléotides avec Uracyl (U) à la place de Thymine (T)

•  chaînes monocaténaires qui peuvent former des structures secondaires en se repliant (épingle à cheveux)

•  Molécules plus courtes et plus instables que lʼADN

Certains segments de lʼARN peuvent sʼapparier sʼils sont

complémentaires

•  Produits de la transcription de l ʼ ADN par l ʼ ARN polymérase ADN dépendante

•  Rôle génétique (messager) ou fonctionnel (transfert d ʼ a.a)

•  ARN m est transcrit à un taux plus élevé que l ʼ ARNt et l ʼ ARNr

Types d ʼ ARN:

ARN ribosomiques (18 S- 5,8S-

28S  - 5S) 83%

ARNt 15%

ARNm 2%

Assurée par lʼARN polymérase

•  Nécessite ADN double brin (matrice), des précurseurs (ribonucléosides triphosphates: ATP, GTP, UTP et CTP) et pas dʼamorce

•  Formation des liaisons phosphodiester entre les ribonucléotides dans la direction 5ʼ – 3ʼ

•  Un seul brin servira à la synthèse dʼARN

1

étape de synthèse d ʼ une protéine = copie du gène (ADN) en une molécule d'ARN

En trois étapes:

Initiation, élongation, terminaison

•  LʼARNm se détache et la molécule dʼADN se referme

q  Généralités/Transcription

Brin sens et anti-sens

•  La séquence de lʼARN synthétisé est identique à celle du brin sens, avec U à la place de T et orientée dans le même sens.

•  Elle se construit de 5' vers 3' en complémentarité de celle qui est « lue » sur le brin antisens.

Brin sens

Brin anti-sens

q  Les ARN polymérases

• La sous unité β assure la liaison à lʼADN.

• La sous unité βʼ possède le site actif de la polymérase

• Les 2 sous unité α permettent

lʼassemblage des autres sous unités

•  La sous unité ϖ rétablit la fonctionnalité de lʼARNp dénaturée in vitro

• Intervention du facteur σ pour la reconnaissance du site dʼinitiation.

Chez les procaryotes: une seule ARN polymérase

Le core de lʼenzyme est un complexe protéique multimérique: 4 sous- unités α₂, β, βʼ et ϖ (α₂ββʼϖ).

Lʼassociation de σ au core = holoenzyme (α₂ββʼϖσ)

ü  RNA-polymérase I qui synthétise les RNA cytoplasmiques : RNA ribosomiques (18 S- 5,8 S- 28 S)

ü  RNA-polymérase II qui synthétise les RNA messagers certains des snRNA

ü  RNA-polymérase III qui synthétise les petits RNA (tRNA, rRNA 5 S, snRNA, 7SL-RNA).

ü  RNA-polymérase IV spécialisé dans la transcription de lʼADN mitochondrial et la synthèse de lʼhétérochromatine chez les plantes

Chez les eucaryotes: trois types d ʼ ARN polymérase

q  Les ARN polymérases

promoteur Région transcrite terminateur

Site dʼinitiation

de la transcription Matrice de

synthèse de lʼARN Séquence signal pour la libération de lʼARN pol

1- Organisation d ʼ un gène bactérien

I- Transcription chez les bactéries

ARN polymérase se fixe à l’ADN au niveau d’une courte séquence d'ADN placée juste avant le début du gène

= promoteur reconnu par le facteur σ

TTGACA   TATAAT  

promoteur région transcrite terminateur

-­‐35Pb   -­‐10  Pb  

10Pb   -­‐50  Pb  

5ʼ   3ʼ  

3ʼ   5ʼ  

1^er site de

fixation Boite Pribnow

1Pb  

Début de la transcription

Sens de la transcription Formation du complexe ARNpol/ADN

ouverture de la double hélice Brin  sens  

2- Promoteur et initiation de la transcription

Initiation de la polymérisation et facteur sigma :

q  Assure la reconnaissance des séquences clé du promoteur

q  Positionne lʼARNp sur le promoteur qui lʼoriente dans une direction q  Facilite lʼouverture de la double hélice

q  Association de 7 ou 8 ribonucléotides sous forme d'un polymère hybridé au brin matrice ADN

q  Forte affinité de lʼARNp avec lʼhybride ADN/ARN dʼoù décrochage du facteur sigma et liaison de la protéine NusA permettant la stabilisation de lʼenzyme

complexe fermé

complexe ouvert

formation du Primer

Dissociation du facteur σ

Initiation de la transcription

Liaison de la protéine NusA

Chez E.coli, 7 facteurs sigma qui reconnaissent des séquences différentes -  Sigma de la famille 70: σ⁷⁰ standards (reconnaît différentes séquences de promoteurs)

-  Sigma de la famille 32: σ³² spécifique à la réponse au choc thermique -  Sigma de la famille 54: σ⁵⁴ spécifique à lʼassimilation de lʼazote

Structure des promoteurs et diversité des facteurs sigma

3- Élongation de la chaîne d ʼ ARN:

Topoisomérase s  

•  assurée par le core de la polymérase à une vitesse dʼenviron 30nucl/sec.

• Topoisomérases précèdent et suivent la polymérase

• Souvent plusieurs transcrits de la même matrice

•   Unité de transcription polycistronique

Un ité d e tr an scr ipti on

Cas des ARNs polycistroniques et notion d ʼ opéron

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Opéron: Unité d ʼ expression de gènes, codant plusieurs enzymes apparentées ou des ARNr, sous le contrôle d'un même promoteur: co-transcrits générant un long ARNm

> séquences codant plusieurs protéines en même temps

> séquences codant des ARNr (16S, 23S, 5S) et des ARNt

ADN

ARN

ARN mature

Promoteur

Gène codant ARN16S

Gène codant ARNt

Gène codant ARNr 23S

Gène codant

ARNr 5S Terminateur de transcription

ARN16S

ARNt

ARNr 23S ARNr 5S Transformation

5ʼ 3ʼ

Unité bactérienne de transcription ribosomique de l ʼ ARNr

(opéron ARNr) et sa transformation

Propriétés% Procaryote Eucaryote Taille globale

70S 80S

Petite sous-unité

Taille dʼARN 30S

16S (1500pb)

40S

18S (2300pb)

Grande sous-unité Taille dʼARN

50S

23S (2900pb) 5S (120pb)

60S

28S (4200pb) 5,8S (160pb)

5S (120pb)

% ARN

% Protéines

63 37

50 50

Comparaison des ribosomes procaryotes et eucaryotes

Unité Svedberg: unité du coefficient de sédimentation lors dʼune force centrifuge

Introduction

Les ARN, les ARN polymérases et généralité sur la transcription

I- Transcription chez les bactéries

1– Lʼorganisation dʼun gène bactérien

2 – Le Promoteur et lʼinitiation de la transcription 3 – Lʼélongation de la transcription

4 – La régulation de la transcription 5- La terminaison de la transcription

6– Les inhibiteurs spécifiques de la transcription

B- Transcription

II- Transcription chez les Eucaryotes

Introduction : particularités du génome eucaryote 1 – Lʼinitiation de la transcription

2 – Les modifications post-transcriptionnelles

Unité de transcription

zone où la transcription s = ʼ initie et se termine

un seul gène 2 ou plusieurs

gènes co-transcrits

Une seule molécule d ʼ ARNm

Unité de transcription polycistronique

Codant plusieurs = protéines

Résumons

Promoteur Opérateur Gène A Gène B Gène C

ARNp Sens de la transcription

Protéines spécifiques - Répresseur

-  Activateur

4- Régulation de la transcription:

protéines allostériques se liant à l ʼ ADN

Transcription de lʼARNm dʼun opéron peut être sous le contrôle dʼun opérateur qui régule le processus transcriptionnel par liaison avec

dʼautres protéines spécifiques

Opéron

Corégulateurs ou effecteurs - Inducteur

- Corépresseur

Promoteur

lʼarginine Opérateur

arg argC argB argH

ARNp Transcription se déroule Répresseur

inactif Promoteur

lʼarginine Opérateur

arg argC argB argH

ARNp Transcription ne se déroule pas Répresseur actif

Corépresseur : Arginine

A- Régulation négative de la transcription

1- Fixation d ʼ un répresseur en aval du promoteur

En se liant à son effecteur (corépresseur), la protéine répresseur est active et se fixe à lʼopérateur Ex: lʼopéron arginine

En absence de son inducteur, la protéine répresseur bloque la transcription Ex: lʼopéron lactose

A- Régulation négative

2- Fixation d ʼ un inducteur sur le répresseur

Promoteur

lac Opérateur

lac lacZ lacY lacA

ARNp Transcription est bloquée Répresseur

Promoteur

lac Opérateur lac

ARNp Transcription se déroule Répresseur

Inducteur

lacZ lacY lacA

Site de fixation

de lʼactivateur Promoteur

mal malE malF malG

activatrice Pr ARNp

Inducteur = maltose

Transcription se déroule

Promoteur possède des séquences différentes de la séquence

consensus, dʼoù besoin dʼun activateur et dʼun inducteur pour que lʼARNp reconnaisse le site de fixation malgré le bon facteur sigma Ex: catabolisme du maltose

Site de fixation

de lʼactivateur Promoteur

mal malE malF malG

activatrice Pr ARNp Transcription ne se déroule pas

B- Régulation positive

Gènes codant enzymes de catabolisme

5- Terminaison de la transcription

Processus conduisant à la dissociation des sous unités de l ʼ ARNp après la rencontre des signaux de terminaison

Deux mécanismes:

v 

Terminaison « rhô-indépendante »: terminateurs intrinsèques

v 

Terminaison « rhô-dépendante »: dépend de la

présence d ʼ une protéine rho

Terminaison rho-indépendante:

3 ʼ    TAATTTCCGAGGAAAACCTCGGAAAAAAAA    5 ʼ     5 ʼ    ATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTT    3 ʼ  

Dernière base transcrite

Sens de la transcription

Terminateur intrinsèque

Région riche en AT

•  deux séquences répétées inversées particulièrement riches en G et C, séparées par un court segment

•  cette région palindromique est terminée par un segment de bases répétées

•  Une série de 6 à 8 bases A sur le brin matrice codant pour un poly-U (région de faible énergie)

Sites spécifiques de terminaison: constitué de 3 segments caractéristiques

Brin sens Brin matrice

C  G   C  G   U  A   C  G   G  C   G  C   A  U   A  U   A  U   U  

U   U  

U  

AUU  

5’   UUUUUOH  3’  

5ʼ  AUUAAAGGCUCCUUUUGGAGCCUUUUUUUU  3ʼ  

Structure en tige boucle

ARNm

• Structure en tige-boucle ou en épingle à cheveux, déstabilise le complexe

• Séquence ARN se termine par un poly-U (région de faible énergie)

Détachement de lʼARNp

Après transcription de la région de terminaison

3 ʼ    TAATTTCCGAGGAAAACCTCGGAAAAAAAA    5 ʼ     5 ʼ    ATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTT    3 ʼ  

Dernière base transcrite

Sens de la transcription

Brin sens

Région riche en AT

Terminaison rho-dépendante:

•  Hélicase ATP dépendante

•  Fixation à lʼextrémité 5ʼ de lʼARNm, migration le long de lʼARN, localise le complexe pol-ARN et le déroule

Libération de lʼARN

nouvellement synthétisé

5ʼ  

5ʼ  

Facteur Rho:

Terminaison rho-dépendante:

6- Les inhibiteurs spécifiques de la transcription

- Groupe Rifamycines: ( Rifampicine, rifamycine et

rifabutine). Inhibiteur de l ʼ ARNp en se fixant sur la sous unité β

- Streptomycines: Inhibiteur de l ʼ ARNp en se fixant sur la sous unité β (site différent des rifamycines)

- Actinomycines: inhibition de l ʼ élongation en se fixant

à l ʼ ARN sur les paires de bases GC

Introduction : Particularités du génome eucaryote 1 – L ʼ initiation et la terminaison de la transcription 2 – Les modifications post-transcriptionnelles

II- Transcription chez les Eucaryotes

•   Diploïde

•   Éclaté ou en mosaïque: introns et exons

•   Expression compartimentée

•   Unité de transcription est monocystronique

Particularités du génome des eucaryotes

Introduction:

Génome en mosaïque

Hybridation ARNm épissé avec le gène correspondant d'ADN

Introns: A, B, C, D, E, F, G

ü  RNA-polymérase I: Transcription des RNA ribosomiques (18 S- 5,8 S- 28 S)

ü  RNA-polymérase II: Transcription des RNA messagers et certains des snRNA

ü  RNA-polymérase III: Transcription des tRNA, rRNA 5S

ü  RNA-polymérase IV spécialisé dans la transcription de lʼADN mitochondrial et la synthèse de lʼhétérochromatine chez les plantes

Chez les eucaryotes: quatre types d ʼ ARN polymérase

Les ARN polymérases: Rappel

L ʼ ARN polymérases II

v  Dans le nucléoplasme

v  Plusieurs sous unités polypeptides (10 chez la levure, RPB1 à RPB10)

v  Nécessite 7 facteurs de

transcription: A, B, D, E, F, H et séq TATA

Fixation spécifique sur le promoteur

Chez les Eucaryotes, le mécanisme de base de la transcription est identique à celui des Procaryotes

ü  Structure des promoteurs

ü  Modifications post-transcriptionnelles des ARN Différences

•  ARNr (sauf le 5S): méthylation, bases modifiées et épissage

•  ARNt : méthylation, épissage et bases modifiées (U-->ΨU)

•  ARNr 5S : pas de modification

•  ARNm : coiffés, épissés et polyadénylés. Certaines adénines peuvent également être méthylées

E1 E2 E3 E4

CAAT TATAA

70p bb 30 pb

I1 I2 I3

100 pb

GT AG GT AG GT AG

TTATTT

1- Initiation de la transcription et terminaison

Signaux moléculaires nécessaires à lʼinitiation:

v  30 PB: Boite TATA (équivalente de la Pribnow des procaryotes)

v  70 PB: CAAT ou Enhancer (virus): stabilisation du complexe ADN-ARNp Signal de terminaison:

v  Séquence de 6 pb à la fin du gène reconnue par ARN-endonucléase

>>> Extrémité 3ʼ formée est polyadénylée dans le nucléoplasme ADN génomique

2- Modification post-transcriptionnelle:

•  Polyadénylation

•  Capping

•  Epissage

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a- Coiffe ou capping

Guanosine méthylée sur lʼazote 7 fixée à lʼextrémité 5ʼ par une liaison

pyrophasphate 5ʼ-5ʼ à la première base de lʼARN (A ou G)

Dernière base du messager inaccessible

aux ribonucléases

Augmente lʼefficacité

de la

traduction signal de

reconnaissance pour les ribosomes

b- Polyadénylation

PAP

l'ARNm est clivée au niveau d'une séquence conservée hexamérique (AAUAAA) à lʼextrémité 3ʼ

Une extrémité poly A est

rajoutée par PAP

Fin de transcription

v  La longueur de la queue poly A varie de 100 à 200 nuc.

v  Absente chez les ARNt, les ARNr et les ARNm codant pour les protéines histones

v La queue polyA sera raccourcie dans le cytoplasme

Rôles du polyA

v  Attachement du

messager à la membrane de RE

v  Transfert du

messager au cytoplasme

v  Stabilisation du

messager (demi vie ARN diminue en son absence)

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c- Splicing ou épissage:

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Ribonucléo-protéiques snRNP (U1 à U6)

U1 reconnaît le site 5' d'épissage U2 reconnaît le site de branchement

U4/U5/U6 se lie et U5

reconnaît le site 5' d'épissage U1 se dissocie suivi de U4 et U5 se déplace de l'exon à l'intron U6 catalyse la trans-

esterification et le site 5'

d'épissage est coupé et le lasso est formé.

Le site 3' d'épissage est coupé et les deux exons ligaturés.

L'ARN épissé est libéré.

U2

E1 E2 E3 E4

CAAT TATAA

70 PB 30 PB

I1 I2 I3

100 PB

GU AG GU AG GU AG

E1 E2 E3 E4

CAAT TATAA

70 PB 30 PB

I1 I2 I3

100 PB

GT AG GT AG GT AG

TTATTT

E1 E2 E3 E4

CAP Codon initiateur traduction AUG

(UGA, UAA ou UAG) Codon stop traduction

ARN transcrit primaire

ARN messager

Signal de polyadénylation

(AAA)n CAP

ADN génomique

AAUAAA

Extrémité 3ʼ Extrémité 5ʼ

Récapitulatif

GU: site 5ʼ dʼépissage AG: site 3ʼ dʼépissage

ü  Les introns: séquences d’ADNs non codantes situées à l’intérieur des gènes qui peuvent être:

Pseudogènes

Transposons

Rétrotransposons Microsatellites

Minisatellites Satellites

ü  Chez les eucaryotes, seulement 3% de l'ADN code pour des

protéines ou des ARNr ou ARNt, 97% non codant (entre les gènes et à l’intérieur des gènes)

ü  Dans certains cas, un même gène peut être épissé de différentes façons pour donner différentes protéines.

ü  Une protéine peut aussi être découpée, après sa synthèse, de différentes façons pour donner différentes protéines.

Combien de gènes ?

Selon les équipes qui ont séquencé l'ensemble du génome humain il y aurait entre 30 000 et 60 000 gènes dans le génome humain mais plus de 100 000 protéines différentes.

•  Arabidopsis thaliana (une petite plante) contient 25 000 gènes

•  C. elegans (un nématode) en contient 19 000

•  Drosophile: 13 600

C. elegans

Arabidopsis thaliana