pH dependence of propeptide inhibition
37 INTRODUCTION DU CHAPITRE 3
Une forme recombinante active de l’allergène Der p 1 et correctement reconnue par les IgE, en lieu et place de l’allergène naturel, pourrait être très utile dans le diagnostic et l’immunothérapie spécifique de l’allergie aux acariens. Plusieurs études montrent que la levure Pichia pastoris est un hôte de choix pour la production de Der p 1 recombinante car, dans cet organisme, l’allergène produit est correctement replié et sécrété en grande quantité dans le milieu de culture. Cependant, la présence du propeptide semble être essentielle pour obtenir cette expression conduisant à la production de l’allergène sous une forme inactive nécessitant une activation ultérieure. De plus, ces différentes études montrent que le zymogène produit par Pichia pastoris est hyperglycosylé et que son activation en protéase mature, par un traitement à pH acide ou par une déglycoslylation enzymatique, n’est pas maîtrisée et est difficilement reproductible.
Dans cette première étude, la présence de glycosylation sur les deux sites potentiels de N-glycoslation du zymogène et son impact sur le processus d’activation seront analysés grâce à la construction et à l’expression, en Pichia pastoris, de mutants du zymogène dans lesquels un ou les deux sites de N- glycosylation sont supprimés par remplacement de l’asparagine du site NxS/T par une glutamine.
L’activation de ces différents zymogènes, à pH acide, sera analysée au cours du temps afin de pouvoir étudier l’impact des différents sites de N-glycosylation et mettre en évidence la présence d’éventuels intermédiaires au cours du processus d’activation.
L’expression indépendante du propeptide de Der p 1 en E. coli sera envisagée afin de pouvoir caractériser son potentiel inhibiteur envers la protéase Der p 1 mature et de pouvoir déterminer comment ce potentiel évolue en fonction du pH. Cette approche nous permettra de mieux comprendre comment et dans quelles conditions il est possible d’activer le zymogène proDer p 1. Dans cette étude, nous envisagerons et validerons l’utilisation de la technologie RPS (BIAcore) comme une nouvelle approche pour caractériser l’interaction entre un propeptide et une protéase. Enfin, nous étudierons la présence de structures secondaires et tertiaires dans le propeptide, ainsi que leur évolution en fonction du pH afin de pouvoir relier un possible changement du potentiel inhibiteur du propeptide à pH acide à un éventuel changement de la structure tertiaire et/ou secondaire du propeptide.
pH dependence of propeptide inhibition
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