Analyse des plantes de melon (Cucumis melo L) issues de croisements avec du pollen irradie a differentes doses

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Analyse des plantes de melon (Cucumis melo L) issues

de croisements avec du pollen irradie a differentes doses

F. Cuny, Robert Dumas de Vaulx, B. Longhi, R. Siadous

To cite this version:

F. Cuny, Robert Dumas de Vaulx, B. Longhi, R. Siadous. Analyse des plantes de melon (Cucumis

melo L) issues de croisements avec du pollen irradie a differentes doses. Agronomie, EDP Sciences,

1992, 12 (8), pp.623-630. �hal-02713735�

Amélioration

des

_plantes

Analyse

des

_plantes

de melon

_(Cucumis

melo

_L)

issues

de

croisements

avec

du

pollen

irradié

à différentes

doses

F Cuny

R Dumas de Vaulx

B

_Longhi

R

Siadous

1 _Université

d’Avignon, Laboratoire de _{cytologie et pathologie végétales,} 33, rue Louis-Pasteur, F-8400 Avignon;

2_{INRA, station d’amélioration des}

plantes maraîchères,

domaine Saint-Maurice, F-84143 Montfavet Cedex;

3

Institut _{montpelliérain d’imagerie médico-biologique,} service de cytométrie en flux, mini-parc, bâtiment 2,

rue de la Croix-verte, F-34090 Montpellier;

4_{Commissariat à}

l’énergie atomique, département de _biologie, service de _{radioagronomie,} CEN de Cadarache,

F-13108 Saint-Paul-Lez-Durance Cedex, France

(Reçu le 13 février 1992; accepté le 18 juin 1992)

Résumé — Chez le melon, les

_{conséquences}

de l’irradiation _{y du}

_pollen

du

_génotype

Védrantais sur le rendement en

embryons et en _{plantules haploïdes} sont évaluées _{après autopollinisation} et

_après

_hybridation avec le

_{génotype F}

₁

_G

_I

_.

L’utilisation de marqueurs

génétiques

nucléaires _permet de confirmer

_{l’origine parthénogénétique}

des _embryons

obte-nus. La _{perturbation du processus} de double fécondation semble mieux

_acceptée

par le

_génotype

_F

₁

_G

_I

_(3,4

d’em-bryons

pour 100

graines)

que par Védrantais

(2 d’embryons

pour 100

_graines).

Quelles que soient les doses

d’irradia-tion

_comprises

entre 0,15 et 2,5

kGy,

la

_{réponse parthénogénétique}

est

_{toujours présente.}

Pour le

_génotype

Védrantais testé, l’induction _d’embryons est _plus élevée en été _qu’en automne. Au maximum 70% de ces _embryons

placés

sur un milieu de culture

_spécifique

ont évolué en

_plantes

_haploïdes. Le niveau de _ploïdie des _plantules a été déterminé en

_cytométrie

en flux à

_partir

de feuilles. Actuellement, l’utilisation en routine de cette _{technique permet} un

tri

_précoce

des

_plants

in vitro et l’élimination

_rapide

des

_diploïdes

issus de fécondations accidentelles. Aucun

aneu-ploïde n’est détecté. Toutes les _plantes obtenues

_présentent

les

_phénotypes

normaux attendus.

cytométrie

en flux

_{/ parthénogénèse}

_{/ embryon} / niveau de _ploïdie

Summary —

Analysis of musk melon _{plants (Cucumis} melo

_L)

obtained after _pollination

_{with γ-}

irradiated

pol-len: effect of different doses. In musk melon, the effects of

_{γ-irradiation}

_applied to

_pollen,

on

_{haploid embryos}

and

plantlet

production have been evaluated after _{autopollinization} or

_{hybridization.}

The use of nuclear _genetic markers

con-firmed the _{parthenogenetic origin} of these _embryos. The _disruption of the double fertilization _{process seemed} to be bet-ter _{accepted by} the _genotype

_F

₁

_.G

_I

_(3.4%

of _embryos) than _by Védrantais

_(2%

of _embryos). Whatever the irradiation dose between 0.15 and 2.5

_kGy,

the

_{parthenogenetical}

response was

_always

_present. For the Védrantais _genotype,

em-bryo induction was _{higher during} summer than in autumn. A maximum of 70% of those _{embryos placed} on a

_specific

cul-ture medium _developed into _{haploid plants.} Plantlet ploidy was determined from leaves _using flow _cytometry. Routine

use of this method allows an _early screened _{of plantlets} and efficient elimination of _diploids obtained from accidental

fer-tilization. No

_aneuploid

was detected. All the

_plants

obtained showed the normal _{expected phenotypes.} flow _{cytometry / parthenogenesis} / _embryo

_{/ ploidy}

level

INTRODUCTION

Chez le melon

_(2n

= 2x =

24),

l’irradiation du

pol-len à _0,3

_kGy

a

_permis

_{d’obtenir pour la} pre-mière fois des

_haploïdes,

avec un rendement

in-téressant : 2%

_{d’embryons haploïdes (Sauton}

et

Dumas de

Vaulx,

1987).

L’utilisation de mar-queurs

génétiques

nucléaires confirme leur

ori-gine parthénogénétique.

Mais il

_n’y

a _{que la} combinaison de la

_{pollinisation}

avec du

_pollen

inactivé par irradiation et de la culture

d’em-bryons

immatures

_qui

_permette

l’obtention de

plantes haploïdes

par

parthénogenèse

in situ.

Jusqu’à présent,

cette

_{haplométhode}

n’a été

tes-tée que chez très peu

d’espèces végétales,

et seul un

_petit

nombre a

_réagi

_positivement

(Iva-nov, 1938: Brewbaker et

_Emery,

_1962).

Il a

sou-vent _{été constaté que la dose d’irradiation}

appli-quée

au

_{pollen joue}

un rôle essentiel dans l’efficacité de la

_technique.

_Ainsi,

_{généralement,}

des

_hybrides

de

_phénotypes

souvent anormaux et

Eng-vild,

1985; Sari Gorla et _al,

_1987),

résultant

vrai-semblablement d’un état

_{d’aneuploïdie}

de leur

contenu

_{chromosomique}

nucléaire

_(Snape

et

_al,

1983),

sont obtenus à faibles doses.

_Lorsque

la dose d’irradiation

_augmente,

ces

_hybrides

dispa-raissent

_{progressivement}

au

_profit

des

_haploïdes

(Pandey

et

_Phung,

_1982;

_Raquin,

_1985;

_Zhang

et

Lespinasse,

1991).

À

fortes doses

_{d’irradiation,}

la

production d’haploïdes

est

_quasiment

_nulle,

alors que l’obtention de fruits

_{parthénocarpiques}

_peut

exister

_(Zamir,

_1983; Sanford

_{et al,}

_1984;

_Zhang

et

_{Lespinasse, 1991).}

Afin

_{d’optimiser}

l’induction

d’haploïdes

chez le _melon, l’étude des effets des

doses d’irradiation

_appliquées

au

_pollen

a été

en-visagée.

Généralement,

le niveau de

_ploïdie

d’une

plante

est _{déterminé par dénombrement} des

chromosomes dans les

_figures

_mitotiques

des

cellules

_{méristématiques.}

Les cellules en mitose sont

fixées

au stade

_métaphase

et l’ADN est co-loré par la méthode de

_Feulgen.

Cette

_technique

bien _{que très fiable} est

_fastidieuse,

et de ce fait ne

peut

être utilisée en routine. D’autres

_techniques

dites indirectes

permettent

de

_connaître,

_par

ex-trapolation,

le niveau de

_ploïdie

du matériel

végé-tal testé. Il

_s’agit

_par

_exemple,

de dénombrer les

chloroplastes

dans les cellules de

_garde

des sto-mates ou encore _{les pores}

_germinatifs

des

_grains

de

_pollen.

Les

_haploïdes

sont

_{généralement}

révé-lés par leur stérilité.

_Cependant,

cette dernière observation nécessite l’attente de la floraison de

la

_plante

et la

_technique

de détection

_{d’haploïdes}

s’avère ainsi lourde et coûteuse.

Récemment,

la détermination du niveau de

_ploïdie

basée sur la mesure de la teneur en ADN _{des noyaux} en

inter-phase

par

cytométrie

en

_flux,

a été

_appliquée

aux

végétaux

(De

Laat et

_al,

_1987; Brown

et al,

1991).

Notre

_objectif

a été d’utiliser cette

_technique

cyto-logique

pour le

melon,

afin de détecter de

_façon

fiable et routinière les

_haploïdes

parthénogénéti-ques induits par irradiation du

pollen,

à différentes doses. Nous déterminons dans

_quelle

mesure d’éventuels

_aneuploïdes

_peuvent

être détectés par cette méthode.

MATÉRIEL

ET

MÉTHODES

Matériel

_végétal

et conditions de culture

des

_plantes

mères

La variété _Védrantais,

_lignée

_pure

_{andromonoïque}

du

type

Cantaloup

Charentais

_(obtention

_Vilmorin), est

utilisée à la fois comme _{parent pollinisateur} et comme

parent femelle. Une seconde _{variété, PI124111} x

_gl/

yg/nsv, notée

_F

₁

_G

_I

est

_également

utilisée comme

pa-rent femelle. _Celle-ci, de

_phénotype

_monoïque, pos-sède les allèles récessifs

_glabre

et _yellow-green

(cou-leur du

_feuillage)

à l’état

_{hétérozygote.}

L’expérimentation

a été réalisée _pendant 2 années successives à la station d’amélioration des _plantes de l’INRA de _Montfavet, afin de détecter un éventuel effet saison sur l’obtention _d’embryons

_haploïdes.

Les

plantes mères ont été cultivées :

-

durant les mois de _septembre et d’octobre 1989 dans une serre _{cooling system vitrée;}

- durant les mois de mai et

juin 1990 dans un tunnel

plastique.

Irradiation du

_pollen

Les fleurs mâles sont

_prélevées

le matin de l’anthèse

et irradiées aux _{rayons gamma le jour} même. Les irra-diations

_{y émises}

_par une source au cobalt 60 _(1,184 x

10

5_Bq) sont effectuées au centre d’étude nucléaire de

Cadarache

_{(ionisateur Cigal,}

_France). Le débit utilisé

est de 79

_Gy/min.

Des doses de 0,15; 0,5; 1,6; 2,5; 3,6 ou 4

_kGy

ont été

_appliquées

aux fleurs mâles.

Réalisation des

_{pollinisations}

manuelles

Les fleurs _{hermaphrodites} de la variété Védrantais

sont castrées _puis ensachées 24 h avant l’ouverture des

_pétales

et l’anthèse. Les fleurs femelles de

_F

₁

_G

_I

sont fermées la veille de l’anthèse avec une _paire de

pinces. Le _jour de _{l’anthèse, chaque} fleur est

pollini-sée par le pollen irradié de 4 fleurs. Les _stigmates

sont _toujours saturés en

_pollen.

Enfin, les fleurs sont

ensachées ou fermées à nouveau, selon le cas.

Sauvetage

des

_embryons

immatures

Les fruits sont récoltés _{20 j}

_après

la _{pollinisation,} c’est-à-dire avant la maturité totale du fruit

_qui

se situe

envi-ron _{15 j plus} tard. Les

_{graines prélevées}

dans les

fruits, préalablement désinfectées par

flambage,

sont ouvertes _{aseptiquement} au

_scalpel,

sous _loupe bino-culaire. Les _embryons en sont extraits et sont

_placés

en conditions _aseptiques sur le milieu de culture

spéci-fique

des _embryons de melon

_(Sauton

et Dumas de

Vaulx,

1987).

La mise en oeuvre de la culture in vitro

est

_{indispensable}

à la

_poursuite

du

_{développement}

des

_embryons

immatures.

Repiquage

et

_clonage

des

_plantules

Les

_{embryons placés}

sur le milieu de culture se

15 j plus tard en tube à essai sur le même milieu de cul-ture.

_Quelques

gouttes d’une solution 10-5 M de

gibbé-relline GA3 sont _déposées sur les apex caulinaires non

développés.

Les

_{plantules âgées}

d’environ 1 mois sont

clonées par

bouturage

des nœuds sur le même milieu.

Les cultures en boîtes de Pétri ou en tube à essai sont

placées en chambre climatisée en

_{photopériode}

de 12 h

et à une

_température

constante de 25 °C.

_{Quinze j}

après

chaque bouturage, les _plantes au stade «3 à 4 feuilles» _peuvent être transférées en _{pots individuels,} sous serre. _Cependant, une _partie du matériel

_végétal

est conservée in vitro _par

_bouturages

successifs en vue

des

_analyses

ultérieures.

Tri des

_plantes

Analyses

des

_{caractéristiques génétiques}

des

_plantules

issues de la

_F

₁

_G

_I

Le

_{phénotype correspondant}

à l’allèle

_glabre

est

détec-té _précocement sur les _plants in vitro. Par contre, l’al-lèle

_{yellow-green,}

_responsable de la couleur _vert-jaune des feuilles, est détecté

_plus

tardivement sur les

plan-tules transférées en terre.

Observations

_{morphologiques}

Les _{plantes haploïdes}

_présentent

des fleurs de

_petites

tailles et les anthères contiennent des _grains de _pollen stériles.

Observations

_cytologiques

Le dénombrement _{chromosomique} est _{effectué par la}

méthode de

_Feulgen,

sur des

_pointes

racinaires de

plantes en croissance active

_après

leur transfert en

terre. Les

_pointes

racinaires

_prélevées

en fin de

mati-née sont traitées selon la _technique décrite _{par Dumas}

de Vaulx (1970).

Analyse

du niveau de

_ploïdie

des feuilles par

cytométrie

en flux

La détermination du niveau de _ploïdie a été réalisée

au service de

_cytométrie

en flux de l’Institut

montpellié-rain _d’imagerie

_{médico-biologique.}

Le _cytomètre utilisé

est un ACR 1400

_{(Bruker) équipé}

d’une

_lampe

à

va-peur de mercure Ushio-102DH-100 W et de 4 tubes

photomultiplicateurs (PMT) (longueur

d’onde d’excita-tion : 490 nm ± 10 nm; fluorescence de l’iodure de

pro-pidium : 640 nm ± 80

nm).

Une feuille est hachée _rapidement à la lame de

ra-soir dans 0,5 ml de _tampon

_phosphate

_pH 7,10

conte-nant

_KNO

₃

20 mM,

_NH

₄

_NO

₃

20 mM,

_CaCl

₂

3 mM,

MgSO

4

1,5 mM,

KH

2

PO

4

1,2 mM, sorbitol 50 mM et

thioglycolate

de Na 50 mM. La _suspension est ensuite

filtrée sur toile à bluter en _nylon d’une ouverture de

maille de _{50 μm.} On

_ajoute

ensuite l’iodure de

propi-dium _{(concentration} finale : 50 _μg/ml) ainsi que du Tri-ton X-100

_{(concentration}

finale : 0,1%

v/v).

L’échan-tillon est mis à colorer

_pendant

15 min à 4 °C et à

l’obscurité. La coloration des acides _nucléiques double-brin est _{obtenue par l’iodure de propidium}

(fluorochrome

intercalant

_spécifique

des acides

nu-cléiques

double-brin ADN et

_ARN).

L’intensité de

fluo-rescence _rouge de l’iodure de

_propidium

mesurée est

proportionnelle

à la

_quantité

d’ADN _présente dans les

noyaux

(l’iodure

de _propidium se fixe sur l’ADN de manière

_{stoechiométrique).}

Pour améliorer la

_précision

et la

_{répétabilité}

des

mesures, nous utilisons une référence interne dans

chaque échantillon: 1 000 _{à 10 000 noyaux} en

sus-pension d’une _graminée

_(ray-grass)

sont

_ajoutés

à l’échantillon avant coloration de l’ADN. Les _noyaux de la

_graminée

sont isolés dans les mêmes conditions que ceux de l’échantillon. Le _{pic supplémentaire}

obte-nu est utilisé comme référence

(étalon).

RÉSULTATS

ET DISCUSSION

Nouaison des fruits et rendement

en

_embryons

en fonction

de la dose d’irradiation

_appliquée

au

_pollen

Les fruits se sont

_développés

dans tous les

cas, hormis ceux issus de fleurs non

pollini-sées,

dont l’ovaire a

_séché,

ou

_pollinisées

avec du

_pollen

irradié à _3,6 et 4

_kGy.

La dose létale pour le

pollen

de melon est de 4

_{kGy (Cuny}

et

Roudot,

1991).

Pour des doses d’irradiation

in-férieures à _1,6

_kGy,

le taux de nouaison n’est pas affecté par l’irradiation du

pollen. Lorsque

le

_pollen

est traité aux _{rayons gamma,} 97% des

graines

des fruits obtenus ne sont pas

em-bryonnées.

Deux

_types

_d’embryons

sont

obser-vés : des

_{embryons bloqués}

au stade

globu-laire et des

_embryons

_{cotylédonnaires}

(embryons

en forme de

_cœur).

Ces derniers ne

remplissent

que la moitié de la

graine.

Leurs

cotylédons

sont étalés et

_plus

ou moins

dissy-métriques.

Des irradiations du

_pollen

_comprises

entre _0,15 et _2,5

_kGy

donnent des rendements en

_{embryons pratiquement identiques.}

Cepen-dant 3 faits

_marquants

_peuvent

être

_{soulignés :}

1)

les rendements en

_embryons

sont

_plus

éle-vés pour le

génotype

femelle

_F

₁

_G

_I

que pour

Vé-drantais;

en

effet,

le

_{pourcentage d’embryons}

cotylédonnaires

est de l’ordre de

2,4%

par fruit pour le

génotype F

1

G

I

(tableau I)

et de

_1,4%

seulement _{pour Védrantais}

_{(tableau II);}

cet effet du

_génotype

du

_parent

femelle sur le

melon

_{(Brun, 1990);}

on notera _{que le meilleur}

rendement en

_embryons

_{par fleur}

_pollinisée

est

obtenu pour le

_génotype

_F

₁

_G

_I

_,

_après

irradiation

du

_pollen

à la dose de _1,6

_{kGy; 2)}

_pour les deux

génotypes,

les rendements en

_embryons

globu-laires sont

_toujours

2 à 3 fois

_plus

_{faibles que} ceux en

_{embryons cotylédonnaires; 3)}

_{pour le}

génotype

Védrantais,

le seul

testé,

on constate

un effet très net de la saison sur le rendement en

_embryons

en fonction de la dose d’irradiation

appliquée

au

_pollen;

en

_effet,

lors de

l’expéri-mentation de

_juin-juillet

1990

_{(tableau II),}

les

rendements les

_plus

élevés sont obtenus aux fortes doses d’irradiation

_(0,5

et

_1,6

_kGy);

à

l’op-posé,

lors de

_{l’expérimentation}

d’automne 1989

(tableau III)

l’irradiation à faible dose

_{(0,15 kGy)}

fournit les meilleurs rendements. De toute

façon,

les rendements les

_plus

élevés sont

tou-jours

obtenus en début d’été.

Chez les autres

_{espèces végétales,}

où des croisements intra- et

_{interspécifiques}

ont été ré-alisés avec du

_pollen

_irradié,

la

_production

d’em-bryons après

irradiation à forte dose n’a

_jamais

été

_signalée

à notre connaissance. Les

rende-ments en

_{embryons haploïdes}

parthénogénéti-ques, cités dans la

bibliographie,

sont

générale-ment très faibles et

_{n’atteignent}

_{que très} rarement les _3,4% obtenus chez le melon

_(Doré,

1989;

Raquin,

1985; Rode et Dumas de Vaulx,

1987).

Le melon

_présente

donc un

comporte-ment relativement

_original

vis-à-vis de l’irradia-tion du

_pollen;

cela

_pourrait

être la

_conséquence

d’une radiorésistance

_pollinique

élevée,

_DL

₅₀

=

3

_{kGy (Cuny}

et

Roudot,

1991).

Rendement de

_{l’haplométhode}

mesurée en nombre de

_plants

in vitro viables

Généralement,

le taux de

_reprise

de croissance des

_{embryons globulaires}

est très faible : dans

le meilleur des cas, 29% des

embryons

évoluent en

_plantules.

Par contre, la

_reprise

de crois-sance des

_embryons

_{cotylédonnaires,}

est nette-ment

_plus

élevée : 70% des

_embryons

cotylé-donnaires du

_génotype

_F

₁

_G

_I

_(tableau

_I)

et 55%

de Védrantais

_{(tableau III)}

donnent des

plan-tules. Pour ce

_dernier,

les conditions automnales de

_{l’expérimentation}

_peuvent

être la cause de la

_reprise

de croissance

_plus

faible des

em-bryons.

De nombreux

_plants

in vitro sont anor-maux. Ils sont _{caractérisés par} une absence

de système

caulinaire alors _que le

_système

racinaire ainsi que

l’hypocotyle

se

_développent

normalement.

_Après

environ 3 mois de culture

in vitro, la

_majorité

de ces

_plantules

anormales

dégénèrent,

ce

_qui

conduit à une

_perte

impor-tante de matériel. Parfois la stimulation de

_l’apex

caulinaire par des

gibbérellines

permet

le

déve-loppement

d’une

_plantule

tout à fait normale.

Après

6 mois de culture in

vitro,

seules les

plan-tules

_présentant

un

_{développement}

normal sont

conservées

_(tableaux

I et

_III).

Les avortements, les

_problèmes

de

germina-tion des

_embryons

et de croissance des

plan-tules

_peuvent

résulter de la

_présence

de

_gènes

récessifs délétères

_{qui s’expriment}

du fait de

Contrairement à notre attente, les

_plus

faibles rendements en

_plants

sont obtenus à faible dose d’irradiation

_(tableaux

I et

_III).

_{Cette situation} pa-radoxale et inattendue a

_déjà

été

_évoquée

chez

de nombreuses autres

_{espèces végétales.}

Par

exemple,

chez le

_pommier,

les

_haploïdes

parthé-nogénétiques

obtenus

_après

irradiation du

_pollen

à _0,125

_kGy

ne sont _pas

_viables,

alors

_qu’ils

le

sont aux doses

_plus

élevées,

0,5

kGy

(Zhang

et

Lespinasse, 1991).

De

même,

chez le

maïs,

les effets de l’irradiation du

_{pollen (stérilité,}

nombre de

_grains

_par

_épis...)

_{apparaissent plus}

pronon-cés à _0,1

_{kGy qu’à}

_0,2

_{kGy (Sari}

Gorla et

_al,

1987). Pandey

et

_{Phung (1982) expliquent}

ces résultats par le fait que vraisemblablement les faibles doses d’irradiation n’altèrent que très peu le

_système

nucléaire du

_{pollen, qui}

conserve ainsi certaines

_{potentialités}

fécondantes. Il en ré-sulte la formation

_{d’hybrides plus}

ou moins

sté-riles,

d’aneuploïdes

et

_{d’haploïdes.}

_{L’apparition}

des

_phénotypes

anormaux et les stérilités sont

principalement

la

_conséquence

de l’état

aneu-ploïde

instauré et des

_{réarrangements}

chromo-somiques qui

en résultent

_(Snape

et

_al,

_1983).

Les fortes doses

d’irradiation,

beaucoup plus

drastiques,

altèrent fortement le

_système

nu-cléaire

_pollinique

et conduisent à la formation d’un seul

_type

de

_pollen

non fécondant mais in-ducteur

_{d’haploïdes}

ou de

_diploïdes,

_par

parthé-nogenèse

in situ.

Niveau de

_ploïdie

des

_plantes

L’examen

_cytologique

réalisé sur les

_pointes

de racines

_après

_{coloration par la}

_technique

de

Feulgen

révèle la

_présence

de nombreuses ra-cines

_{mixoploïdes (n,}

_2n,

_4n).

Du fait de la diffi-culté à dénombrer les cellules

_haploïdes

par

rap-port

aux autres cellules sur les

_{préparations}

racinaires,

nous n’avons souvent _{pas pu}

conclure en ce

_qui

concerne le niveau de

_ploïdie

de certains clones.

L’analyse

en

_cytométrie

en flux des feuilles des

_plants

in

_{vitro, permet}

la détermination

ra-pide

et

_précise

du niveau de

_ploïdie

du clone

testé. Cette

_technique

est basée sur la mesure de la teneur en ADN des _noyaux

_{interphasiques.}

Du fait de la forte corrélation

_qui

existe entre le

niveau de

_ploïdie

_{déterminé par} la

_cytométrie

en flux et le nombre

_{chromosomique,}

les

_haploïdes

peuvent

être facilement détectés

_(Fahleson

et

al,

1988).

En calibrant l’échelle de fluorescence rouge au _moyen d’échantillons de niveaux de

ploïdie

connus

_{(plantules diploïdes),}

le niveau de

ploïdie

des échantillons

_peut

être _{déterminé par}

comparaison.

La

_présence

simultanée de

_pics

2C, 4C,

8C sur un même

_histogramme

obtenu à

_partir

d’une même feuille révèle l’état

_mixoploïde

stable du melon

_(fig

_1a).

Pour la détermination du niveau de

_ploïdie,

seul le

_{premier pic}

est retenu, et cela

quelle

que soit son

_amplitude.

_{On pose}

l’hypo-thèse que le

_{premier pic}

reflète le niveau de

ploï-die

_germinale.

La

_présence

de

_mixoploïdie

exclut la

_possibilité

de déterminer les

_proportions

exactes de cellules dans

_chaque

niveau de

ploï-die,

pour deux raisons :

- le second

pic

contient à la fois les cellules

ha-ploïdes

en

_phase

_G

₂

_/M

c’est-à-dire en division et

les cellules

_diploïdes

en

_phase

_G

₀

_/G

₁

_;

-

le second

_pic

_peut

contenir de 0 à 3% de dou-blés de cellules en

_G

₀

_/G

₁

et ainsi de suite

_(en

pro-portions

respectives)

pour les zones

4C,

8C... Chez le

_{génotype F}

₁

_G

_I

_,

toutes les

_plantes

ob-tenues à

_partir

de

_pollen

irradié aussi bien à faible dose

_{(0,15 kGy) qu’à}

fortes doses

_(0,5,

1,6

et _2,5

_{kGy) présentent}

un

_spectre

de

_type

ha-ploïde

(fig 1b).

Ce résultat est confirmé par la

présence

de fleurs de

_petite

taille et stériles. La

disjonction

des

_gènes

_marqueurs

_(tableau

_IV)

est

conforme à celle attendue

_{(proportions 1:1).}

Chez

_{Védrantais, quatre}

_plantules

étaient

di-ploïdes.

Trois

_{plantules correspondaient}

à la dose de 0,15

kGy

et une à la dose de

0,5

kGy.

Du fait de l’absence de _marqueurs

_{génétiques,}

il est

_impossible

de conclure

_quant

à leur

_origine.

Quatre

_hypothèses

peuvent

être émises :

₁₎

la dose de _0,15

_kGy

est _{insuffisante pour éliminer}

totalement le

_pouvoir

fécondant du

_{pollen; 2)}

des contaminations _{par du}

_pollen

non irradié ont lieu

durant la castration des

fleurs;

3)

il existe des doublements

_spontanés

du stock chromosomi-que

haploïde

chez certains

_{génotypes (Zhang}

et

Lespinasse, 1991);

chez le kiwi, par

exemple

(Pandey

et

_al,

_1990),

la

_capacité

de

_production

d’embryons

diploïdes

parthénogénétiques

est

très variables en fonction à la fois du

_génotype

paternel

et du

_génotype

_maternel;

₄₎

des

gaméto-phytes diploïdes

issus de cellules mères non ré-duites à la méïose

_peuvent

être

_présents.

Sur l’ensemble des

_{plantes analysées (150),}

aucun

_aneuploïde

n’a été détecté dans nos conditions

_{expérimentales.}

Nous avons considé-ré

_{qu’une plantule}

est

_aneuploïde

_lorsque

la

posi-tion du

_pic

de fluorescence

_{correspondant}

à la

quantité

2C d’ADN est

_éloignée

_par

_plus

de 3 ca-naux du

_{pic diploïde}

témoin. Cet intervalle de confiance a été défini en déterminant les dévia-tions de 3

_plantes

témoins

_{diploïdes, après}

nor-malisation des fluorescences au _moyen de l’éta-lon interne. Le

_logiciel

de

_cytométrie

en flux

(Flower

version

_3.41)

convertit sur une échelle li-néaire

₍₀

à 255

_canaux)

la

_position

de

_{chaque pic}

de fluorescence et fournit le numéro du canal

correspondant

au maximum d’événements. Avec

3 canaux

_{correspondant}

à _1,3 déviations

stan-dard,

cet intervalle de confiance

_équivaut

à 8%

du

_génome

2C

_(2n

= 2x=

24).

Des anomalies à ±

2 chromosomes

_peuvent

être ainsi mises en

évi-dence chez le melon. Le coefficient de variation

des

_pics

_G

₀

_/G

₁

est de 1. De nombreux auteurs constatent la

_{présence d’aneuploïdes}

à la suite de croisements avec du

_pollen

irradié

_(Ivanov,

1938; Brewbaker et

_Emery,

1962;

Snape

et _al,

1983;

Shintaku et

_al,

_{1988). Pandey}

et

_Phung

(1982),

par

exemple,

ont obtenu des

aneu-ploïdes

de Nicotiana

_comportant

24 + 1 à 24 +

11 chromosomes.

Chez les

_plantes

en culture in

vitro,

le niveau de

_ploïdie

est stable au cours du

_temps.

Les

analyses

ont été effectuées sur une

_période

d’une année avec 2 à 4

_{répétitions}

échelonnées au cours du

_temps.

Quatorze

_plantes

ont été

_analysées

_après

leur

transfert en terre. On constate que seules les

jeunes

feuilles

_présentent

des

_histogrammes

avec un

_{pic haploïde important}

_(fig

_1c),

compa-rable à celui obtenu à

_partir

d’un

_plant

in vitro

_(fig

1b).

Dans le cas des feuilles _adultes, on obtient

des

_histogrammes

avec un

_{pic haploïde}

nette-ment minoritaire

_(fig

_1d).

Il semblerait

_qu’au

cours du vieillissement de la

_feuille,

la

_majorité

des cellules doublent

_{spontanément}

leur stock

chromosomique. Cependant,

les cellules

germi-nales conservent

_toujours

leur état

_haploïde

et

les fleurs formées sont

_toujours

stériles. Il convient donc d’être relativement

_prudent

_quant

au choix du _{matériel utilisé pour}

_l’analyse

en cy-tométrie en flux. Les

_plantes

in vitro ou les

jeunes

feuilles de

_{jeunes plantes}

cultivées en

pots

semblent constituer le matériel le mieux

ap-proprié

pour une étude du niveau de

_ploïdie

en

cytométrie

en flux. Cette

_technique

_permet

ainsi un tri

_précoce

des

_plantules.

CONCLUSION

Chez le

melon,

l’irradiation du

_{pollen (1,6}

_kGy)

permet la

_{production d’embryons}

parthénogéné-tiques

(3,4%)

et de

_plantes

_{haploïdes (2,4%)}

avec des rendements

_{particulièrement}

élevés.

À

partir

de _0,15

_kGy,

le

_{développement}

parthéno-carpique

des fruits est observé. Mais,

contraire-ment à ce

_qui

est

_fréquemment

constaté chez la

majorité

des

_{espèces végétales,}

l’irradiation du

pollen

de melon ne _{semble pas induire}

l’appari-tion

_d’hybrides

à

_phénotypes

anormaux ou sté-riles

_{(mutation, aneuploïdie).}

La

_réponse

à

l’irra-diation est relativement

_semblable,

_quelle

_que

soit la dose

_appliquée

au

_{pollen (entre}

0,15 et

2,5

kGy).

Seules les fortes doses

_{(supérieures}

à

1,6

kGy)

semblent affecter la nouaison des fleurs

_pollinisées

avec du

_pollen

irradié. Le

ni-veau de

_ploïdie

des

_plantules

est déterminé à

partir

d’une

_part

de l’observation de la

stérilité-fertilité des

_plantes,

et d’autre

_part

des résultats de la

_cytométrie

en _{flux. Vu que, dès} la mise en

terre de

_plants,

le niveau de

_ploïdie

du

_système

foliaire évolue

_rapidement,

toute

_analyse

en cy-tométrie en flux nécessite un choix

_judicieux

et

réfléchi de

_{l’organe végétal}

à

_{analyser :}

de

préfé-rence une très

_jeune

feuille.

REMERCIEMENT

Les auteurs remercient M Grotte de son aide pour

l’analyse des résultats.

RÉFÉRENCES

Brewbaker JL, Emery GC

₍₁₉₆₂₎

Pollen _radiobotany.

Radiat Bot 1, 101-154

Brown _SC, Devaux P, Marie D, Bergounioux C, Petit PX

_{(1991) Analyse}

de la

_ploïdie

_par

_cytométrie

en

flux. Biofutur 105, 5-16

Brun P ₍₁₉₉₀₎

Étude

de l’effet

_génotype

sur l’obtention

d’haploïdes

par

parthénogenèse

induite _par du pol-len irradié chez le melon Cucumis melo L et

re-cherche _{préliminaire} d’une alternative à l’irradiation. Mémoire DEA _Nancy, 29 _p

Cuny

F, Roudot AC

₍₁₉₉₁₎

Germination et croissance

pollinique in vitro du

_pollen

de melon

_(Cucumis

melo

_{L) après}

_{irradiations gamma.} Environ

_Exp

Bot

31, 277-283

Daskalov S

₍₁₉₈₄₎

Pollen irradiation and _gene transfer in

_Capsicum.

Theor

_Appl

Genet 68, 135-138 Dumas de Vaulx R

₍₁₉₇₀₎

Mise au _point d’une

mé-thode de dénombrement des chromosomes chez le

melon

_(Cucumis

melo

_L).

Ann Amélior Plant 20,

375-378

De Laat AMM, Göhde W, Vogelzang MJDC ₍₁₉₈₇₎ De-termination of _ploidy of

_{single plants}

and

_plant

popu-lations _by flow _cytometry. Plant _{Breed 99,} 303-307 Doré C

₍₁₉₈₉₎

Obtention de _plantes

_haploïdes

de

chou cabus

_(Brassica

_{oleracea L ssp capitata)}

après culture in vitro d’ovules _{pollinisés par du} pol-len irradié. C R Acad Sci Paris 309, 729-734

Engvild KC ₍₁₉₈₅₎ Pollen irradiation and _possible gene transfer in Nicotiana _species. Theor _Appl

Genet 69, 457-461

Fahleson J, Dixelius J, Sundberg E, Glimelius K

(1988) Correlation between flow _cytometric determi-nation of nuclear DNA content and chromosome

number in somatic

_hybrids

within Brassicaceae. Plant Cell _Rep 7, 74-77

Ivanov MA

₍₁₉₃₈₎

_Experimental

_production

of _haploids in Nicotiana rustica L. Genetica 20, 295-386

Pandey KK, Phung M _{(1982) "Hertwig} effect" in _plants: induced

_{parthenogenesis}

_through the use of irradia-ted _pollen.

_{Theor Appl}

Genet 62, 295-300

Pandey KK, Przywara L, Sanders PM

₍₁₉₉₀₎

Induced

parthenogenesis in kiwi fruit _{(Actinidia deliciosa)}

through the use of _lethally irradiated _pollen.

Euphy-tica 51, 1-9

Powell W, Caligari PDS, Hayter AM ₍₁₉₈₃₎ The use of

pollen irradiation in _{barley breeding.} Theor _Appl Genet 65, 73-76

Raquin C

_{(1985) Étude}

des conditions d’obtention de

pétunias haploïdes gynogénétiques

par culture in

vitro d’ovaires de _plantes

_pollinisées

par du pollen

irradié. In: Nuclear _techniques and in vitro culture for _{plant improvement.} IAEA, Vienne _(IAEA-SM

282/13),

207-211

Rode JC, Dumas de Vaulx R

₍₁₉₈₇₎

Obtention de

plantes haploïdes de carotte _(Daucus carota _L)

is-sues de

_{parthénogénèse}

induite in situ par du

pol-len irradié et culture in vitro de _graines immatures. C R Acad Sci Paris 305, 225-229

Sanford _{JC, Chyi YS,} Reisch B _{(1984) Attempted "egg}

transformation" in Zea mays L,

using

irradiated

pol-len. Theor _Appl Genet 68, 269-275

Sari Gorla M, Villa M, Ottaviano E ₍₁₉₈₇₎ Pollen

irradia-tion and gene transfer in maize.

_Maydica

32, 239-248 Sauton A, Dumas de Vaulx R ₍₁₉₈₇₎ Obtention de

plantes haploïdes chez le melon _(Cucumis melo _L) par

gynogénèse

induite par pollen irradié.

Agrono-mie 7, 141-148

Shintaku _Y, Yamamoto K,

Nakajima

T

₍₁₉₈₈₎

Interspe-cific _{hybridization} between Nicotiana _repanda Willd and N tabacum L _through the _pollen irradiation

technique

and the egg cell irradiation

_technique.

Theor Appl

Genet _76, 293-298

Snape JW, Parker BB, Simpson E, Ainsworth CC, Law CN ₍₁₉₈₃₎ The use of irradiated _pollen for differen-tial gene transfer in wheat

(Triticum aestivum).

Theor _Appl Genet 65, 103-111

Zamir D

₍₁₉₈₃₎

Pollen irradiation in tomato: minor ef-fects on _{enzymic gene transfer. Theor Appl} Genet

66, 147-151

Zhang YX, Lespinasse Y ₍₁₉₉₁₎ Pollination with

gamma-irradiated pollen and _development of fruits,

seeds and

_{parthenogenetic}

_plants in _apple.