Caractérisation par diffusion de second harmonique de nanocristaux pour l'imagerie biomédicale

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Submitted on 30 Aug 2013

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nanocristaux pour l’imagerie biomédicale

Cécile Joulaud

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Cécile Joulaud. Caractérisation par diffusion de second harmonique de nanocristaux pour l’imagerie biomédicale. Autre. Université de Grenoble, 2013. Français. �NNT : 2013GRENA008�. �tel-00856045�

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DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE GRENOBLE

Spécialité :Sciences pour l’ingénieur

Arrêté ministériel : 7 août 2006

Présentée par

Cécile JOULAUD

Thèse dirigée parRonan Le Dantec, Jean-Pierre Wolf et codirigée parYannick Mugnier

préparée au sein du Laboratoire SYMME : Systèmes et Matériaux pour la MEcatronique

et del’École Doctorale SISEO

Caractérisation par diffusion de se- cond harmonique de nanocristaux pour l’imagerie biomédicale

Thèse soutenue publiquement le29 mai 2013, devant le jury composé de :

Patrice Baldeck

Directeur de recherche, CNRS/Université Joseph Fourier Grenoble, Président

Sophie Brasselet

Directrice de recherche, CNRS/Université Aix-Marseille, Rapporteur

Ronan Le Dantec

Professeur, Université de Savoie, Directeur de thèse

Yannick Mugnier

Maître de conférences, Université de Savoie, Co-Directeur de thèse

Vincent Rodriguez

Professeur, Université de Bordeaux, Rapporteur

A l’heure de clôturer cette thèse, je souhaite remercier toutes les personnes qui ont contribué à sa réalisation et m’ont apporté conseils, soutien et enthousiasme.

Tout d’abord, je souhaite adresser mes sincères remerciements à mon directeur de thèse Ronan Le Dantec et mon co-directeur Yannick Mugnier au laboratoire SYMME pour leur accueil et leur intégration au sein de l’équipe des (nano-)matériaux. Je tiens à leur exprimer ma gratitude pour leur soutien pendant ces trois années et la confiance qu’ils m’ont accordée tout au long de ce travail, particulièrement pendant les périodes les plus difficiles. Je les remercie autant pour leur apport scientifique et leurs conseils avisés que pour leurs qualités humaines, leur disponibilité et leurs encouragements. Merci pour ces discussions stimulantes lors de réunions relativement régulières malgré des emplois du temps souvent incompatibles.

Merci également pour l’aide précieuse notamment en instrumentation (et autres débogages sur le pro- gramme labVIEW) et pour avoir fait régulièrement le lien entre mon travail et les avancées réalisées parallèlement en salle de chimie. Je n’oublie pas non plus les discussions lors de trajets réguliers pour les réunions de projet à Genève, ou de manière plus exceptionnelle devant une Guiness à Dublin.

Une petite partie de ce travail s’est déroulée au GAP-biophotonics de l’université de Genève où j’ai été accueillie par Jean-Pierre Wolf que je remercie pour cette opportunité. Cette collaboration m’a apporté une ouverture précieuse grâce à l’aide de Luigi Bonacina, à ses réponses dans le domaine de l’optique toujours envoyées avec réactivité, à ses conseils avertis lors de la rédaction d’articles et à sa remarquable gestion du projet de recherche au sein duquel s’est déroulée cette thèse. Que ce soit à Genève ou à Carouge, j’ai toujours apprécié l’accueil chaleureux des membres de ce laboratoire (et le traditionnel café proposé avant toute autre chose).

Je tiens à remercier les membres de mon jury de thèse, Sophie Brasselet et Vincent Rodriguez en tant que rapporteurs de ce travail pour leurs remarques constructives et pour avoir partagé leur expertise sur ce sujet ainsi que Patrice Baldeck pour avoir accepté d’être président de mon jury et pour la discussion très intéressante qu’il a engagée.

Il est important pour moi de replacer ce travail dans le contexte des projets Naomi et Namdiatream qui ont permis de donner du sens à mon activité mais également de m’ouvrir sur de nouveaux horizons dans des domaines tels que la biologie, la microscopie ou la synthèse de cristaux. Je tiens à ce titre à remercier tous les membres de ces projets pour leurs échanges enrichissants. En particulier, les conseils fournis par Davide Staedler (EPFL) et Daniel Ciepelwski (Nikon) m’ont été très utiles lors de la rédaction de ce manuscrit. J’ai également eu l’opportunité de travailler avec Thibaud Magouroux, Jérôme Extermann et Denis Kiselev du GAP-biophotonics sur des plateformes optiques autrement plus impressionnantes que la

mienne et j’ai eu le plaisir de travailler conjointement avec Sebastian Schwung (FEE) lors de son séjour à Annecy.

Certaines personnes ont apporté une contribution toute particulière à la réalisation de ce travail. Je pense à Djanta Gnon qui m’a initié à l’emploi de suspensions de nanoparticules tout en supportant nos froids polaires, avec qui j’ai passé de nombreux moments sur des mesures à 135° (sans compter les heures, même le jour de son anniversaire) et qui a pris le temps de m’expliquer toute la théorie attenante. Une partie de ce travail n’aurait pas vu le jour sans Moustafa El Kass avec qui la réalisation d’expériences s’est toujours déroulée dans la bonne humeur et qui a fait preuve de disponibilité pour répondre à mes questions, même longtemps après son départ du laboratoire. Je me rappelle également les conversations très variées que nous avons pu avoir et bien évidemment les petits gâteaux libanais. Je remercie également Marc Dubled pour son aide précieuse concernant la préparation de suspensions, les nombreuses heures passées devant le MEB pour traquer des nanocristaux variés, des aiguilles d’iodate de fer entre autres, les diverses discussions "nanoparticulaires" et un bonus pour avoir supporté en tant que voisin de bureau mes divagations et mes goûts musicaux plus que douteux dans les moments de stress (je n’oublierai pas les malabars dûment gagnés pendant ma rédaction).

Je suis particulièrement reconnaissante envers Jean-Christophe Marty pour sa disponibilité sans faille toujours dans la bonne humeur ainsi que pour son assistance très appréciée sur la technique de diffraction de rayons X ou lorsqu’il s’agit de trouver quelque matériel en salle de chimie. Je tiens aussi à remercier Blaise Girard pour son aide précieuse concernant l’amélioration du banc expérimental, son enthousiasme et ses nombreuses idées toujours fructueuses. Merci également à Jérôme Anglade pour la mise en place de matériel informatique son assistance précieuse lors de problèmes techniques.

Deux personnes importantes au laboratoire ont également favorisé le très bon déroulement de cette thèse, Christelle Davanzo et Nassika Laouici, toujours prêtes à rendre service avec le sourire depuis les tout premiers contacts à mon arrivée en 2010 et jusqu’à la préparationin extremis de mon pot de thèse.

Merci également à Agnès Tremolada pour sa disponibilité et sa bonne humeur.

Je souhaite remercier toute l’équipe des (nano-)matériaux fonctionnels (maintes fois rebaptisée) pour m’avoir intégrée et pour les quelques séminaires très intéressants auxquels j’ai pu assister. Je pense en particulier à Christine Galez, sa gentillesse et son accessibilité, ses nombreux conseils à tous points de vue et son écoute précieuse. Je remercie Christiane Durand pour son rôle concernant l’hygiène et la sécurité des salles de manipulation. Je suis également reconnaissante envers Philippe Galez pour m’avoir formée à l’utilisation de la diffraction de rayons X. Je n’oublie pas non plus toutes les personnes qui se sont investies dans le déménagement du laboratoire et des salles de manip alors que j’étais particulièrement occupée par ailleurs (d’autant plus qu’ils ont dû faire les cartons deux fois ...).

J’ai également eu l’opportunité durant cette thèse de découvrir et apprécier l’enseignement au sein du département Mesures Physiques à l’IUT d’Annecy, et ce notamment grâce à l’accueil chaleureux de toute l’équipe et aux conseils reçus de la part de différents enseignants. J’ai une pensée particulière pour Sandrine Beauquis qui m’a encadrée en tant que monitrice et a toujours été disponible pour répondre à mes questions. Je remercie également Marc Lomello pour les quelques discussions pédagogiques que nous avons pu avoir et pour ses conseils avisés, Yves Zolnierowski pour sa disponibilité et son aide dans le domaine de la thermodynamique et Guillaume Poulet pour ses réponses toujours réactives.

Ces 3 années de thèse ont également été inspirées par un petit air celtique grâce à mes voisins de bureau irlandais. Merci à Gareth pour nos premières discussions en salle de chimie en début de thèse, les diverses conversations scientifiques toujours enrichissantes et une visite guidée de Dublin sous le soleil.

Merci également à Derek pour son aide lors de la réalisation d’expériences et à James pour sa sympathie et la patience dont il a fait preuve pendant la période de rédaction.

Je n’oublie pas non plus mes collègues doctorants en matériaux expatriés, Rachid et Mehdi et les conversations échangées lors de leurs visites occasionnelles à Annecy.

Un grand merci aux collègues du laboratoire, aux inconditionnels de la pause café de 10h, à ceux avec qui j’ai partagé de nombreux repas de midi en salle des personnels et aux personnes parfois moins présentes mais qui m’ont apporté des conseils divers et variés ou avec lesquels j’ai tout simplement pu avoir des conversations extra-professionnelles qui m’ont changé les idées de temps à autre. Je pense aussi à tous les collègues doctorants (ou déjà docteurs) sans lesquels ces trois ans auraient été bien différents, il n’y aurait pas eu les mêmes pauses café devant la cafet de Polytech, ni de quizz à l’amnésie, de concerts au bistro des Tilleuls ou autres soirées crêpes. Merci à Emmanuelle, Ronan, Mathieu, Gaëtan, Rémi, Hugues, Boukar, Nathalie, Tobias ... et mon premier voisin de bureau Ciprian pour m’avoir dit qu’"à la fin, ça s’est bien passé".

Merci également à mes colocs, en particulier Guillaume pour les bons moments et les soirées avec les physiciens du Lapp.

J’ai une pensée spéciale pour les amis qui m’ont soutenue pendant ces trois années et qui savent à quel point cela a été important pour moi. Lili (qui m’a rappelé que j’envisageais déjà de faire une thèse dès le premier jour de mes études), Perrine, Mathilde M., Mathilde B., Camille, Marie F., Marie G., Lucie, JM, Simon, Emile, Martin et Elisabeth.

Une dernière pensée à ma famille qui a été avec moi, cousins et oncles et tantes, en particulier Paul- Xavier et Maryse pour leur accueil bienveillant dans les périodes de doute.

Et enfin, merci à mes parents pour leur très précieux soutien et à mes frères François et Olivier qui ont toujours cru en moi et n’ont jamais cessé de m’encourager.

Introduction 1

1 Génération de Second Harmonique de nanoparticules et applications en imagerie bio-

médicale 5

I Optique Non Linéaire et Génération de Second Harmonique . . . 5

I.1 Introduction à l’optique non linéaire . . . 6

I.2 Propriétés ONL de second ordre . . . 8

I.2.a Susceptibilité non linéaire d’ordre 2 . . . 8

I.2.b Symétrie cristalline . . . 10

I.3 Moment dipolaire induit et polarisabilité moléculaire . . . 11

II Applications en biologie : marquage et imagerie . . . 12

II.1 Microscopie multiphotonique . . . 12

II.1.a Principe et enjeux en imagerie biomédicale . . . 12

II.1.b Exemples d’applications . . . 15

II.1.c Marqueurs optiques luminescents. . . 15

II.2 Marqueurs GSH : état de l’art . . . 17

II.2.a Intérêts des marqueurs GSH pour l’imagerie biomédicale . . . 19

II.2.b Microscopie de GSH : technologie . . . 22

II.2.c Marqueurs : synthèse et fonctionnalisation . . . 23

II.2.d Applications des marqueurs GSH pour l’imagerie biologique. . . 27

II.3 Alternatives . . . 33

II.3.a Nanodiamants fluorescents . . . 34

II.3.b Upconversion . . . 34

III Conclusion . . . 35

2 Diffusion Hyper-Rayleigh ou de second harmonique : principe et configuration expé- rimentale 37 Introduction. . . 37

I Principe de la technique de diffusion Hyper-Rayleigh . . . 38

I.1 Généralités . . . 38

I.2 Détermination théorique du signal de diffusion . . . 39

I.3 Mesures résolues en polarisation . . . 43

I.4 Méthodes de caractérisation des coefficients ONL . . . 43

I.4.a Détermination des coefficients moyens< β > . . . 43

I.4.b Détermination des coefficients indépendants β_ij . . . 45

I.5 Conclusion . . . 46

II Mesures HRS sur des nanocristaux . . . 46

II.1 Application de la théorie HRS aux nanocristaux . . . 46

II.1.a Caractérisation HRS de nanocristaux dans la littérature. . . 46

II.1.b Notion d’hyperpolarisabilité effective d’un nanocristal . . . 47

II.2 Coefficients moyens <β> et <d> : méthode par référence externe appliquée aux particules . . . 48

II.3 Coefficients indépendantsdij . . . 50

II.3.a Méthode du rapport de dépolarisation . . . 50

III Système expérimental . . . 51

III.1 Description du banc d’optique . . . 52

III.2 Système de détection et d’acquisition. . . 52

III.3 Limite expérimentale de détection . . . 54

III.3.a Optique et détection. . . 54

III.3.b Signal HRS de référence. . . 54

III.3.c Zone sondée par le laser . . . 55

III.3.d Estimation de la limite de détection pour des suspensions . . . 56

IV Préparation et caractérisation de suspensions de nanocristaux . . . 57

IV.1 Préparation de suspensions colloïdales . . . 57

IV.2 Caractérisations des suspensions . . . 58

IV.2.a Taille des nanoparticules . . . 58

IV.2.b Diffraction des Rayons X (DRX) . . . 59

IV.2.c Forme et aspect des nanoparticules . . . 59

IV.2.d Concentration des suspensions . . . 59

IV.2.e Stabilité des suspensions . . . 60

IV.3 Préparation d’une solution de para-nitroaniline . . . 60

V Conclusion . . . 61

3 Efficacités optiques moyennes des nanocristaux 63 I Présentation des différentes particules . . . 63

I.1 BaTiO3 . . . 63

I.2 KNbO3 . . . 64

I.3 KTP. . . 65

I.4 LiNbO3 . . . 65

I.5 ZnO . . . 67

II Exemple détaillé des nanocristaux de KNbO3 . . . 67

II.1 Préparation des échantillons et mesure de taille . . . 68

II.2 Détermination de la concentration . . . 68

II.3 Mesure du signal HRS . . . 69

II.4 Calcul des coefficients moyens. . . 69

III Validité du protocole . . . 70

III.1 Signal HRS . . . 70

III.1.a Optique . . . 70

III.1.b Luminescence et signaux parasites . . . 72

III.1.c Stabilité des échantillons de référence . . . 72

III.1.d Stabilité des suspensions . . . 73

III.1.e Agrégation . . . 74

III.1.f Régime de Rayleigh . . . 74

III.1.g Absorption et diffusion . . . 76

III.2 Mesures de taille des nanoparticules . . . 77

III.2.a Effet de la polydispersité . . . 77

III.2.b Agrégats . . . 80

III.2.c Forme des particules. . . 81

III.3 Mesure de concentration des particules. . . 81

III.3.a Concentration massique . . . 81

III.3.b Concentration N . . . 82

III.4 Influence de la distribution en taille sur l’intensité HRS . . . 83

IV Résultats : coefficients moyens <d> et <β>. . . 85

V Conclusion . . . 87

4 Détermination des coefficients indépendants d_ij 89 I Mesures HRS résolues en polarisation . . . 89

I.1 Validité du protocole . . . 89

I.1.a Reproductibilité expérimentale . . . 90

I.1.b Agrégation . . . 90

I.1.c Taille et polydispersité . . . 91

I.1.d Effets de la concentration . . . 92

I.2 Rapport de dépolarisation des différentes nanoparticules . . . 93

I.2.a Tenseur "simple". . . 93

I.2.b Tenseur "complexe" . . . 94

II Effets de forme des particules : croissance d’aiguilles d’iodate de fer. . . 95

II.1 Croissance d’aiguilles d’iodate de fer . . . 96

II.1.a Synthèse de nanoparticules en microémulsion . . . 96

II.1.b Suiviin situ de la cinétique de croissance en HRS . . . 96

II.1.c Mécanisme de croissance des aiguilles d’iodate de fer. . . 96

II.2 Évolution du rapport de dépolarisation pendant la croissance d’aiguilles . . . 98

II.2.a Méthodes . . . 98

II.2.b Mesures optiques. . . 98

II.3 Modélisation de la GSH dans une particule longiligne . . . 99

II.3.a Hypothèses . . . 99

II.3.b Formalisme . . . 100

II.3.c Application aux aiguilles d’iodate de fer . . . 101

III Conclusion . . . 102

5 Caractérisation ONL du BiFeO3 105 I Introduction. . . 105

I.1 Particularités et intérêts du BiFeO3 . . . 105

I.2 Propriétés physiques générales . . . 105

I.3 Propriétés optiques non linéaires . . . 107

II Caractérisations optiques non linéaires . . . 107

II.1 Mesures HRS sur différents échantillons . . . 108

II.1.a Premières mesures . . . 108

II.1.b Deuxième série de mesures : estimations plus précises . . . 109

II.1.c Conclusion et particularités des caractérisations HRS du BFO . . . 110

II.2 Coefficients moyens du BFO. . . 111

III Conclusion . . . 113

Conclusion et perspectives 115

Bibliographie 119

Table des Figures 131

Liste des Tableaux 135

A Volume de solution excité par le laser au point focal 137 B Détermination du coefficient moyen de référence du pNA 139 C Mesure de <d> dans différentes configurations expérimentales 141

D Approximation statistique des distributions en taille 143

E Mesures optiques et DLS 147

F Détermination des coefficients moyens <d> à partir des valeurs de la littérature 151

Depuis plusieurs années, les avancées médicales et technologiques réalisées dans le cadre de la recherche contre le cancer ont nettement augmenté les chances de survie et de guérison face à cette maladie.

Cependant, elle reste l’une des premières causes de mortalité en Europe avec environ 1,7 millions de décès chaque année¹et des progrès restent à accomplir en termes de prévention, de diagnostic précoce et de prise en charge. Dans ce contexte, les avancées récentes en synthèse, stabilisation et fonctionnalisation de nanomatériaux ont permis de développer des marqueurs de taille nanométrique compatibles avec les milieux biologiques, permettant ainsi d’envisager des avancées majeures pour le diagnostic précoce et le suivi du traitement de telles maladies.

Par ailleurs, les récents progrès dans le domaine de l’imagerie optique sont importants et ouvrent de nombreuses possibilités en termes d’applications pour la biologie et la médecine. En effet, la large diffusion de techniques telles que la microscopie confocale et la microscopie multiphotonique couplée au développement de marqueurs fluorescents est à l’origine de progrès significatifs en imagerie biomédicale.

Cependant, l’utilisation de ces techniques basées principalement sur la fluorescence présente certaines li- mitations. L’autofluorescence des tissus a tendance à réduire le contraste optique, le temps d’observation est souvent restreint à des durées de l’ordre de quelques dizaines de minutes en raison du photoblanchi- ment des marqueurs organiques et des inconvénients tels que le clignotement de la fluorescence peuvent apparaître avec l’utilisation de nanocristaux semi-conducteurs, appelésQuantum Dots (ou boîtes quan- tiques). Ces derniers présentent également une toxicité élevée qui peut les exclure de certaines applications biologiques, en particulierin vivo. Enfin, pour les marqueurs organiques, la toxicité générée par des effets de photodégradation chimique peut être également problématique .

Face à ces limitations, une nouvelle génération de sondes optiques à propriétés optiques non linéaires est en cours de développement. Il s’agit de nanocristaux de structure cristalline non-centrosymétrique qui ont la particularité de générer un rayonnement à la fréquence double lorsqu’ils sont soumis à un flux incident intense. En microscopie multiphotonique, l’exploitation de ce processus, appelé génération de second harmonique (GSH), offre de nouvelles possibilités en termes de suivi sur de longues durées et de profondeur de pénétration dans les tissus biologiques²³⁴. En effet, la génération de second harmonique est un phénomène non résonant, limitant ainsi la photodégradation des marqueurs et permettant leur suivi sur de longues durées. De plus, ce processus optique est relativement indépendant de la longueur d’onde d’excitation, ce qui permet de travailler dans le proche infrarouge. Dans cette gamme spectrale les tissus biologiques absorbent peu. On augmente ainsi la profondeur d’imagerie tout en diminuant l’énergie lumineuse déposée dans l’échantillon.

1. Portail de la commission européenne pour la santé publique,http://ec.europa.eu/health-eu/index_en.htm 2. B. E. Cohen, Biological imaging : Beyond fluorescence, Nature. 467, 407-408 (2010)

3. W. Dempsey, S. Fraser, P. Pantazis, SHG nanoprobes : Advancing harmonic imaging in biology BioEssays, 34, 351-360 (2012)

4. L. Bonacina, Nonlinear Nanomedecine : Harmonic Nanoparticles toward Targeted Diagnosis and Therapy. Molecular Pharmaceutics, 10 (3), 783-792, 2012

Au laboratoire SYMME, Les projets de recherche collaboratifs Naomi⁵(Nano-sOndes Multifonction- nelles pour l’Imagerie) et Namdiatream⁶(NAnotechnological toolkits for Multi-modal disease DIAgnostics and TREAtment Monitoring) ont ainsi pour objectif le développement de nano-sondes performantes pour l’imagerie biomédicale et le diagnostic précoce de cellules tumorales.

L’utilisation de tels marqueurs pour ces applications nécessite de regrouper des compétences multidisci- plinaires allant de la synthèse des nanocristaux à leur manipulation en milieu biologique, en passant par la maîtrise des techniques de microscopie. Ces différents thèmes de recherche sont étudiés par différents partenaires impliqués selon leur domaine de compétences. La société de cristallogenèse FEE ⁷ travaille sur la synthèse des nanocristaux ainsi que le laboratoire SYMME⁸, qui a aussi pour rôle de quantifier les propriétés de GSH des particules obtenues et de les stabiliser en milieu aqueux par une modification de leur chimie de surface. La synthèse et l’encapsulation des nanocristaux est également développée au la- boratoire LAGEP⁹. La fonctionnalisation des particules pour un marquage spécifique est développée par le laboratoire de chimie LSPN¹⁰en coopération avec une équipe de recherche en chimie biomédicale du CHUV¹¹. Cette même équipe est également responsable de la manipulation des milieux biologiques, des études de toxicité et des observations in vitro de marquage sur différentes lignées cellulaires. L’imagerie biphotonique est réalisée au sein du laboratoire GAP-biophotonics¹² sur une plateforme développée par Nikon. L’entreprise AAA¹³, qui développe des marqueurs radioactifs pour la tomographie à émission de positons, est également impliquée dans ce projet de recherche dans l’optique de développer des sondes mul- tifonctionnelles. Par ailleurs, une équipe de biologie du laboratoire CARRTEL¹⁴s’intéresse au marquage spécifique de bactéries en milieux biologiques lacustres pour les aspects biodiversité et pollution. L’entre- prise Epithelix¹⁵ est concernée quant à elle par des applications de vectorisation de médicaments pour les troubles respiratoires et par un marquage permettant d’observer l’efficacité des traitements utilisés.

Une dernière équipe partenaire, issue du CHU de Genève¹⁶, a pour thématique principale de recherche la différenciation de cellules souches en cellules cardiaques et ce pour des applications thérapeutiques.

Mon travail de thèse s’inscrit dans cette démarche générale et porte plus particulièrement sur la carac- térisation des propriétés de GSH des nanocristaux. Ces propriétés optiques, communément caractérisées

5. NAOMI : projet interreg France Suisse

6. Namdiatream : projet Européen FP7 (http://www.namdiatream.eu/)

7. FEE GmbH (Forschungsinstitut für mineralische und metallische Werkstoffe - Edelsteine/Edelmetalle), Idar-Oberstein, Allemagne

8. SYstèmes et Matériaux pour la Mécatronique, Université de Savoie, Annecy-le-Vieux, France 9. Laboratoire d’Automatique et de Génies de Procédés, Lyon, France

10. Laboratory of Synthesis and Natural Products , Institut des Sciences et Ingénierie Chimiques, EPFL, Lausanne, Suisse 11. Centre Hospitalier Universitaire Vaudois, Institut universitaire de pathologie de Lausanne, Suisse

12. Group of Applied Physics, Université de Genève, Suisse 13. Advanced Accelerator Applications, Saint-Genis Pouilly, France

14. Centre Alpin de Recherche sur les Réseaux Trophiques des Ecosystèmes Limniques, Université de Savoie, Le Bourget- du-Lac, France

15. Entreprise de biotechnologie spécialisée en ingénierie tissulaire, Genève, Suisse 16. Department of Pathology and Immunology, Faculty of Medicine, Université de Genève

de caractérisation. La microscopie de GSH permet dans une certaine mesure d’accéder à des informations pertinentes sur les propriétés optiques non linéaires des nanoparticules mais son utilisation est limitée d’un point de vue quantitatif. Dans ce travail, nous mettons en application une technique basée sur des mesures d’ensemble pour déterminer les efficacités de GSH de nanocristaux. A l’origine, la technique de diffusion Hyper-Rayleigh a été développée afin de caractériser les propriétés optiques non linéaires de molécules. Par la suite, son application a été étendue à des objets de plus grande taille tels que des assemblages moléculaires ou des nanoparticules centrosymétriques et métalliques. La caractérisation de nanocristaux non-centrosymétriques est relativement nouvelle et seules quelques études font actuelle- ment part de l’utilisation, présentée dans ce travail, de la technique de diffusion Hyper-Rayleigh pour cet objectif.

Ce mémoire est divisé en cinq chapitres. Dans le chapitre 1, nous introduisons les notions d’optique non linéaire nécessaires à la compréhension de ce travail. Elles permettront de mieux appréhender les intérêts des nanocristaux GSH qui sont ensuite détaillés pour l’imagerie. Le principe et les avantages de la microscopie multiphotonique sont également présentés puis nous donnons un état de l’art sur l’utilisation des marqueurs GSH pour des applications en imagerie biomédicale.

Le chapitre 2 porte sur la technique de diffusion Hyper-Rayleigh que nous avons utilisée pour la caractérisation optique des marqueurs. Après en avoir présenté le principe et le formalisme général, nous présentons les particularités liées à l’application de cette technique à des suspensions de nanocristaux. Les protocoles de mesures optiques, le montage expérimental utilisé ainsi que les techniques de caractérisations complémentaires sont aussi exposés.

Dans le chapitre 3, nous présentons les résultats des mesures de l’efficacité de GSH des marqueurs étudiés : BaTiO3, KNbO3, KTP, LiNbO3 et ZnO. Nous commençons par une description générale des caractéristiques de ces différents types de nanomatériaux. Nous décrivons ensuite la démarche globale de mesure et nous nous intéressons tout particulièrement à sa validité, en identifiant les paramètres à prendre en compte pour une détermination fiable des coefficients optiques non linéaires moyens des nanocristaux.

Les résultats obtenus par cette approche, qui essaie de quantifier l’influence de la taille et de la forme des nanocristaux, sont ensuite présentés et discutés.

Le chapitre 4 décrit les mesures aboutissant à l’identification des composantes indépendantes du tenseur optique non linéaire de second ordre des nanocristaux. Des mesures résolues en polarisation ont ainsi été effectuées. Leur analyse est présentée et discutée dans cette section. Par ailleurs, nous montrons dans une seconde partie l’influence de la forme des nanocristaux, à travers une étude de la réponse en polarisation réalisée sur des aiguilles d’iodate de fer en formation.

Le chapitre5 porte sur la caractérisation de nanocristaux de ferrite de bismuth (BFO), un matériau multiferroïque dont l’utilisation est envisagée dans le cadre du projet pour la fabrication de sondes multifonctionnelles couplant, par exemple, les propriétés magnétiques et optiques non linéaires de ce matériau. Ces dernières sont très peu connues mais présentent a priori un fort potentiel pour le marquage optique. La caractérisation par diffusion Hyper-Rayleigh est ici appliquée à des nanocristaux de BFO afin d’obtenir une estimation de l’efficacité de GSH de ces marqueurs potentiels.

1

Génération de Second Harmonique de nanoparticules et applications en imagerie bio-médicale

Introduction

Le développement de l’imagerie biomédicale est un enjeu actuel majeur en biologie et en médecine.

On peut citer par exemple la lutte contre le cancer qui nécessite des méthodes de diagnostic toujours plus performantes. De manière générale, l’amélioration des techniques d’imagerie, et en particulier l’imagerie optique, représente aussi un atout non négligeable pour l’étude et la compréhension du monde du vivant et des maladies.

La génération de second harmonique, appelée également doublage de fréquence, est un phénomène optique non linéaire qui présente un fort potentiel pour le développement de l’imagerie biomédicale. On envisage ainsi depuis peu de réaliser du marquage biologique grâce à des nanoparticules, dont la taille favorise une bonne interaction avec les milieux biologiques et pour lesquelles les propriétés de doublage de fréquence permettent une détection aisée en microscopie.

L’objectif de ce premier chapitre est donc de présenter les propriétés de génération de second har- monique des nanoparticules considérées et de démontrer leur intérêt pour des applications en imagerie biologique. Dans une première partie, nous introduirons les fondamentaux de l’optique non linéaire ainsi que les formalismes qui seront utilisés dans la suite de ce manuscrit. Une seconde partie décrira briève- ment les dernières avancées en microscopie optique pour des applications biologiques avant de présenter un état de l’art sur l’utilisation de nano-marqueurs à doublage de fréquence pour l’imagerie biomédicale, en considérant les avantages intrinsèques à l’optique non linéaire.

I Optique Non Linéaire et Génération de Second Harmonique

L’Optique Non Linéaire (ONL) correspond à l’étude de la réponse optique des matériaux lorsqu’ils sont soumis à une lumière très intense. L’ONL est un domaine qui est apparu peu après l’invention du laser et la première observation de Génération de Second Harmonique (GSH) par Franken et al. date de 1961 [Franken 61].

Dans un premier temps, nous présenterons une courte description des phénomènes ONL, nous permet- tant d’introduire les formalismes que nous utiliserons par la suite. Ensuite, nous décrirons de manière plus précise les propriétés ONL de second ordre, qui sont à l’origine de la Génération de Second Harmonique.

Enfin, nous nous intéresserons en particulier à la GSH au niveau microscopique, ce qui permettra de mieux saisir les enjeux des études propres aux nanocristaux.

I.1 Introduction à l’optique non linéaire

Interaction lumière-matière

Les phénomènes optiques non linéaires sont dus aux interactions lumière-matière lorsque le champ élec- tromagnétique incident est intense. Un matériau soumis à une onde lumineuse correspond à un ensemble de charges qui oscillent sous l’effet d’un champ incident. Ce champ va entraîner l’apparition de dipôles électriques, créant ainsi une polarisation macroscopique dans le matériau. Chacun de ces dipôles en vi- bration émet à son tour un rayonnement. A l’échelle macroscopique, la somme de ces rayonnements est à l’origine d’une nouvelle onde électromagnétique qui s’ajoute à l’onde incidente.

De l’optique linéaire à l’optique non linéaire

En optique linéaire, la polarisation macroscopique P du matériau générée par un champE est propor- tionnelle à ce champ.

P =ε0χE (1.1)

avec

χla susceptibilité électrique du matériau, ε₀ la permittivité du vide.

Dans ce cas, la fréquence de l’onde émise par rayonnement est la même que celle de l’onde incidente.

Lorsque l’intensité du champ incident est élevée, on observe des effets non linéaires : le matériau ne répond pas de manière proportionnelle à l’excitation. La polarisation macroscopique comprend alors des composantes non-linéaires qui s’ajoutent à la composante linéaire initiale telles que :

P=ε0(χE+χ⁽²⁾E²+χ⁽³⁾E³+...) (1.2) que l’on peut également écrire :

P =P⁽¹⁾+P⁽²⁾+P⁽³⁾+...

avec







χ⁽²⁾, χ⁽³⁾ les susceptibilités électriques non linéaires d’ordre 2 et 3 respectivement, P⁽¹⁾ la polarisation linéaire,

P⁽²⁾,P⁽³⁾ les polarisations non linéaires d’ordre 2 et 3 respectivement.

Dans ce cas, l’onde électromagnétique émise par rayonnement dipolaire peut avoir une fréquence différente de l’onde incidente.

Phénomène du doublage de fréquence

La génération de second harmonique (GSH) est un phénomène optique non linéaire d’ordre 2, c’est-à-dire qui est issu de la polarisation d’ordre 2, P⁽²⁾. Pour une onde incidente de fréquence ω₁ dont le champ physique réel est défini par :

E(ω1) =E1(ω1) +E₁^∗(ω1) =E1e^−i(ω1t)+E1e^i(ω1t) On a :

E²(ω1) =E₁²(2 +e^−i(2ω1t)+e^i(2ω1t)) = 2E₁²+E(2ω1) Cela implique une polarisation du second ordre telle que :

P⁽²⁾=ε0χ⁽²⁾(2E₁²+E(2ω1))

Le terme 2E₁² décrit une polarisation constante du matériau n’entraînant pas de rayonnement. On appelle ce phénomène la Rectification Optique.

Le second termeE(2ω1)correspond à la polarisation qui est à l’origine du rayonnement à la fréquence double, autrement dit la GSH. La polarisation étant proportionnelle au carré du champ incident, cela implique que l’intensité de GSH émise est proportionnelle au carré de l’intensité incidente.

La GSH peut également être représentée par l’interaction de deux photons de même fréquence ω1

avec le matériau, entraînant la génération d’un troisième photon de fréquence double, comme le montre la figure1.1.

Figure 1.1 – Représentation de la Génération de Second Harmonique

Notion d’accord de phase

Dans un matériau, nous avons vu que la GSH est émise de manière cohérente par des dipôles sous l’effet d’une onde excitatrice. Cette onde incidente n’excite pas tous les dipôles en même temps mais au fur et à mesure qu’elle se propage à travers le matériau. Cela signifie que chaque dipôle génère une onde à la fréquence double en phase avec l’onde excitatrice lors de son passage et l’onde GSH globale générée par le matériau est la somme de chacune de ces ondes. Or, la vitesse de propagation de l’onde à la fréquence double n’est pas la même que celle de l’onde incidente. Cette différence de phase est à l’origine d’interférences constructives ou destructives des ondelettes GSH générées par tous les dipôles. L’onde GSH globale va ainsi voir son intensité varier en fonction de la longueur traversée du matériau.

L’intensité de second harmonique générée à une longueurzdu matériau s’écrit : I2ω(z)∝χ⁽²⁾I_ω²z²sinc²

∆kz 2

avec:

I_ω intensité de l’onde excitatrice

∆k=k2ω−2kω la différence de phase.

Dans le cas particulier de l’accord de phase, correspondant à ∆k = 0, toutes les ondelettes GSH s’additionnent constructivement et l’intensité de GSH augmente quadratiquement avec la longueur du matériau, soitI²∝z². En général, il n’y a pas accord de phase et cette propriété n’est pas respectée. On définit alors la longueur de cohérencelc pour laquelle l’intensité de GSH est maximale :

lc= π

∆k = λω

4(n_2ω−n_ω)

Le tableau1.1 présente les longueurs de cohérence de certains matériaux étudiés dans la cadre de ce travail. On constate que l’ordre de grandeur est leµm, ce qui signifie qu’en dessous de cette taille, toutes les ondelettes GSH s’additionnent de manière constructive.

Tableau 1.1 – Indices de réfraction de matériaux optiques non linéaires aux longueurs d’onde de 532 et 1064 nmextraits de [Bass 09] et longueurs de cohérence associées.

n532 n1064 ∆k [nm⁻¹] lc [µm]

BaTiO3 2,47 2,38 1,06.10⁻³ 2,96 KNbO3 2,2 2,12 9,45.10⁻⁴ 3,33 KTP 1,78 1,74 4,72.10⁻⁴ 6,65 LiNbO3 2,32 2,23 1,06.10⁻³ 2,96 ZnO 2,03 1,94 1,06.10⁻³ 2,96 SiC-3C 2,67 2,59 9,45.10⁻⁴ 3,33

Ainsi, lorsque l’on travaille avec des nanoparticules, leur taille est nettement inférieure à cette longueur de cohérence. Le phénomène d’accord de phase n’entre donc pas en compte dans l’observation de la GSH pour notre étude.

Conventions, notations, unités

Nous introduisons ici une autre notation caractérisant les propriétés ONL de second ordre, qui sera utilisée préférentiellement dans ce manuscrit : le coefficient non linéairedou sa notation tensorielledijk. Celle-ci est généralement utilisée dans les conditions de Kleinman et est reliée au tenseurχ⁽²⁾ par un facteur qui varie selon la convention. Les conventions utilisées dans la littérature pour décrire les processus optiques non linéaires peuvent varier d’un groupe à l’autre. Afin d’éviter les confusions, une comparaison de ces conventions est présentée par [Kuzyk 98]. Ici, nous choisissons la convention I, pour laquelle on a pour un phénomène de GSH :

P =1

2ε₀χ⁽²⁾E²=ε₀d E² (1.3)

avec l’équivalence en notation matricielle :

dijk =1

2χ⁽²⁾_ijk (1.4)

Par ailleurs, dans la suite de ce manuscrit, nous simplifierons l’écriture de la polarisation en omettant volontairement le facteur ε0. La permittivité du vide devra cependant être prise en compte dans les calculs. On rappelle queε0= 8,854.10⁻¹²F.m⁻¹.

Le système d’unité choisi ici est le système d’unités international. Dans la littérature, les valeurs des coefficients optiques non linéaires sont parfois données dans le système CGS en [esu]. Dans ce système, la permittivité du vide n’entre pas dans l’expression de la polarisation. Pour effectuer la conversion, il est nécessaire de changer d’unités et d’inclure la permittivité du vide [Kuzyk 98]. La conversion pour une hyperpolarisabilité de second ordre, grandeur que l’on définira par la suite, est telle que :

1 esu(CGS)=3,7088.10⁻²¹Cm³V⁻² 8,854.10⁻¹²F.m⁻¹ (SI)

= 4,189.10⁻¹⁰m⁴V⁻¹_(SI,I)

I.2 Propriétés ONL de second ordre

I.2.a Susceptibilité non linéaire d’ordre 2

Dans le cas général d’une interaction non linéaire d’ordre 2, deux ondes de fréquences ωn et ωm

provoquent la génération d’une troisième onde de fréquence ωn+ωm =ωn+m, comme schématisé dans la figure1.2.

Figure 1.2 – Phénomène optique non linéaire d’ordre 2.

Dans la convention I (définie par l’eqn. 1.3), la polarisation non linéaire à cette fréquence somme est notée [Boyd 92] :

Pi(ωn+m) =X

jk

X

(nm)

dijk(ωn+m;ωn, ωm)Ej(ωn)Ek(ωm) (1.5) Les indicesijkcorrespondent aux composantesx,youzd’un repère cartésien dans lequel sont définis les champs.

La susceptibilité non linéairedijk(ωn+m;ωn, ωm)est un tenseur de rang 3 possédant 27 éléments. On peut également écrire l’équation précédente comme suit :

P_i(ω_n+m) =DX

jk

d_ijk(ω_n+m;ω_n, ω_m)E_j(ω_n)E_k(ω_m) (1.6) Le facteurD, qui correspond àP

(nm), est égal au nombre de permutations distinctes sur les fréquences.

Par exemple, pour un processus de sommation de fréquence oùω₁ etω₂provoquent la génération d’une troisième onde de fréquence ω₃, on a D = 2. Pour un processus de génération de second harmonique, ω_n=ω_m=ω et D= 1.

La polarisation non linéaire peut aussi s’écrire sous forme matricielle, à l’aide de la notation matricielle du tenseur de susceptibilité non linéairedijk donnée dans le repère (x, y, z)où les champs sont définis.

Les indicesijk du tenseur sont notés dans ce repère par1 =x,2 =y, 3 =z.



 Px

Py

Pz





ωn+m

=D





d111 d112 d113 d121 d122 d123 d131 d132 d133

d211 d212 d213 d221 d222 d223 d231 d232 d233

d311 d312 d313 d321 d322 d323 d331 d332 d333





ωn+m





























Ex(ωn)Ex(ωm) Ex(ωn)Ey(ωm) Ex(ωn)Ez(ωm) Ey(ωn)Ex(ωm) Ey(ωn)Ey(ωm) Ey(ωn)Ez(ωm) E_z(ω_n)E_x(ω_m) E_z(ω_n)E_y(ω_m) E_z(ω_n)E_z(ω_m)





























Il y a permutation sur les indicesjetkpuisque la polarisation non linéaire issue du produitE_j(ω_n)E_k(ω_m) est équivalente à celle issue deE_k(ω_m)E_j(ω_n), c’est-à-dire que d_ijk = d_ikj. Chaque ligne du tenseur ne comporte plus que 6 éléments indépendants soit 18 éléments indépendants au total.



 Px

Py

Pz





ωn+m

=D





d111 d122 d133 d123 d113 d112

d211 d222 d233 d223 d213 d212

d311 d322 d333 d323 d313 d312





ωn+m

















Ex(ωn)Ex(ωm) Ey(ωn)Ey(ωm) Ez(ωn)Ez(ωm)

Ey(ωn)Ez(ωm) +Ez(ωn)Ey(ωm) Ex(ωn)Ez(ωm) +Ez(ωn)Ex(ωm) Ex(ωn)Ey(ωm) +Ey(ωn)Ex(ωm)

















Notation contractée

La notation est alors simplifiée grâce à la contractiond_ijk=d_il avec les correspondances suivantes :

jk 11 22 33 23=32 31=13 12=21

l 1 2 3 4 5 6

Le tenseur de susceptibilité non linéaire peut donc être représenté de la manière suivante :

d_il=





d₁₁ d₁₂ d₁₃ d₁₄ d₁₅ d₁₆ d₂₁ d₂₂ d₂₃ d₂₄ d₂₅ d₂₆ d₃₁ d₃₂ d₃₃ d₃₄ d₃₅ d₃₆





Hypothèse de Kleinman

L’hypothèse de Kleinman correspond au cas où les fréquences optiques sont très inférieures aux fréquences de résonance du matériau. Cela implique une interaction lumière-matière sans perte et instantanée. Dans ces conditions, la permutation est possible sur tous les indices :

dijk=djki=dkij=dikj =djik=dkji (1.7)

Le tenseurdijk ne comporte alors plus que 10 éléments indépendants.

dijk =





d111 d122 d133 d123 d113 d112

d112 d222 d233 d223 d123 d122

d113 d223 d333 d233 d133 d123





Avec

avec



























d₂₁₁=d₁₁₂ d₂₁₃=d₁₂₃ d212=d122

d311=d113

d322=d223

d323=d233

d313=d133

d312=d123

équivalent à



























d₂₁=d₁₆ d₂₅=d₁₄ d26=d12

d31=d15

d32=d24

d34=d23

d35=d13

d36=d14

en notation contractée.

Génération de Second Harmonique

Dans le cas particulier de la génération de second harmonique, avec pour fréquence incidenteωet fréquence généréeω₂= 2ω, l’équation (1.5) devient :

P_i(2ω) =X

jk

d_ijk(2ω;ω, ω)E_j(ω)E_k(ω) (1.8)

La notation matricielle de la polarisation non linéaire dans les conditions de Kleinman donne :



 Px

P_y P_z





2ω

=





d11 d12 d13 d14 d15 d16

d₁₆ d₂₂ d₂₃ d₂₄ d₁₄ d₁₂ d₁₅ d₂₄ d₃₃ d₂₃ d₁₃ d₁₄





2ω

















E²_x(ω) E²_y(ω) E²_z(ω) 2Ey(ω)Ez(ω) 2Ex(ω)Ez(ω) 2E_x(ω)E_y(ω)

















(1.9)

I.2.b Symétrie cristalline

Le tenseur de susceptibilité non linéaire est lié à la symétrie de la structure cristalline du matériau.

Par simplicité, le tenseur est défini dans le repère du cristal. Cela signifie par exemple que si le cristal possède un axe de symétrie d’ordre 4 autour de son axe z, c’est-à-dire que la structure cristalline est la même selon les axes x et y, les propriétés optiques non linéaires vont également posséder cette symétrie.

On a alors, dans ce repère, l’équivalence d_zxx =d_zyy. A chaque classe cristalline ou groupe ponctuel de symétrie correspond donc une forme de tenseur particulière dont certains coefficientsd_ilsont égaux entre eux et d’autres s’annulent.

Les structures cristallines qui comprennent un centre de symétrie n’ont pas de propriétés ONL de second ordre, autrement dit, le tenseur d_il correspondant est nul [Boyd 92]. En effet, pour un matériau centrosymétrique, si un champ électrique E génère une polarisation P, le champ de signe opposé -E génère une polarisation égale et opposée à la première, -P. Par exemple, pour un processus de GSH :

−P =χ⁽²⁾[−E]²=χ⁽²⁾E²=P La seule solution de cette équation estχ⁽²⁾= 0, soit un tenseur nul.

Certains matériaux ne possèdent pas de centre de symétrie, ils sont appelés non-centrosymétriques.

C’est cette particularité qui leur procure les propriétés ONL de second ordre et en particulier celle de GSH qui nous intéresse ici.

Les tenseurs des principaux matériaux étudiés ensuite sont répertoriés dans le tableau (1.2).

Tableau 1.2 – Tenseur de susceptibilité d’ordre 2 pour quelques classes cristallines, et équivalences dans les conditions de Kleinman.Extrait de [Boyd 92].

Classe cristalline Tenseur(dil)sous forme matricielle conditions de Kleinman Matériaux

6mm, 4mm





0 0 0 0 d15 0

0 0 0 d15 0 0

d31 d31 d33 0 0 0



 d15=d31 ZnO, BaTiO3

6





0 0 0 d14 d15 0 0 0 0 d15 d14 0 d31 d31 d33 0 0 0





d14= 0

d15=d31 Fe(IO3)3

mm2





0 0 0 0 d₁₅ 0

0 0 0 d₂₄ 0 0

d₃₁ d₃₂ d₃₃ 0 0 0





d₁₅=d₃₁

d₂₄=d₃₂ KNbO3, KTP

3m





0 0 0 0 d15 −d22

−d22 d22 0 d15 0 0

d31 d31 d33 0 0 0



 d₁₅=d₃₁ LiNbO3, BiFeO3

43m





0 0 0 d14 0 0 0 0 0 0 d14 0 0 0 0 0 0 d14



 3c-SiC, Bi25FeO40

I.3 Moment dipolaire induit et polarisabilité moléculaire

Lorsqu’une molécule est excitée par un champ électrique localEloc, le moment dipolaire moléculaire induitpest défini par la relation :

p=αEloc+βE_loc² +γE³_loc+... (1.10) Cette relation est l’équivalence à l’échelle microscopique de la relation (1.2) avec αla polarisabilité électronique linéaire de la molécule,β etγ les hyperpolarisabilités de premier et de second ordre respec- tivement de cette molécule. Rappelons ici que l’on se place dans la convention I (cf. §I.1). Le moment dipolaire moléculaire de second ordre pour un phénomène de second harmonique (SH) s’écrit alors :

p^(2ω)=βE²_loc (1.11)

Facteur de champ local et relation de Lorentz-Lorenz

Une molécule soumise à un champ est rarement isolée dans l’air. Son milieu environnant modifie les propriétés du champ incident du fait de l’interaction lumière-matière et des effets de polarisation et de champs de réaction qui en résultent [Kuzyk 98]. Le champ effectifE_locvu par la molécule diffère du champ incidentE par un facteur de champ localfω tel que Eloc=fωE, qui dépend des propriétés diélectriques du milieu environnant. La relation de Lorentz-Lorenz relie les champs macroscopique et microscopique dans un liquide homogène non dipolaire d’indice de réfractionn:

E_loc= n²(ω) + 2

3 E

L’hyperpolarisabilité moléculaire βmol est reliée au coefficient macroscopique d par ces facteurs de champ local. Elle est définie pour un phénomène de second ordre par [Zyss 82] :

d=Nmolf_ω²f2ωβmol (1.12)

avecNmol le nombre de molécules par unité de volume émettant de manière cohérente. Le coefficient d représente donc les propriétés ONL pour une unité de volume du système.

Nous utiliserons également la notation F_l pour exprimer le facteur de champ local dans le cas de la génération de second harmonique.

F_l=f_ω²f_2ω (1.13)

Conclusion

Dans cette première partie, nous avons décrit les propriétés optiques non linéaires et plus particulière- ment la GSH. Nous avons pu voir que ce phénomène entraîne l’émission d’une onde à la fréquence double sous illumination intense et pour laquelle l’intensité émise est proportionnelle au carré de l’intensité inci- dente. Ce processus optique est caractérisé par une grandeur appelée susceptibilité non linéaire d’ordre 2 ou encore, au niveau moléculaire, hyperpolarisabilité. De nature tensorielle, cette caractéristique dépend de la structure cristalline du matériau. On peut aussi signaler que ce phénomène est inhérent à toute non-centrosymétrie et en particulier celle propre aux cristaux non-centrosymétriques. Nous verrons par la suite en quoi ces propriétés optiques sont intéressantes pour des applications en imagerie biomédicale.

II Applications en biologie : marquage et imagerie

Introduction

La seconde partie de ce chapitre est destinée à présenter l’intérêt et les enjeux de l’utilisation de nanoparticules GSH en imagerie biomédicale, afin de mieux appréhender les motivations de ce travail de recherche. Nous nous intéresserons dans un premier temps à la microscopie multiphotonique qui est une technique novatrice pour imager les milieux biologiques. Après en avoir exposé le principe et les enjeux, quelques exemples d’applications seront présentés de manière à illustrer la portée de cette technique, puis l’utilisation de marqueurs pour l’imagerie optique sera abordée. La seconde partie portera sur le marquage biologique par des nanoparticules GSH en faisant état des avantages de ces marqueurs dans ce contexte, des technologies utilisées, des types de nanoparticules et enfin des résultats obtenus à ce jour.

Nous terminerons par une présentation succincte d’autres types de marqueurs qui, bien que non étudiés dans le cadre de ce travail, nous semblent pertinents pour le développement de l’imagerie biomédicale.

II.1 Microscopie multiphotonique

II.1.a Principe et enjeux en imagerie biomédicale

En biologie, la microscopie optique classique est habituellement confrontée à des difficultés telles que l’endommagement des échantillons par photo-dégradation, la difficulté à imager en profondeur ou encore la résolution spatiale. La microscopie confocale [Shotton 89] a permis de contourner certains obstacles.

En particulier, la résolution spatiale est améliorée au moyen de trous confocaux, dont l’un permet de limiter l’angle d’excitation et l’autre, utilisé pour la détection, laisse passer uniquement la lumière issue d’un point précis de l’échantillon. Couplée à un système de balayage, la microscopie confocale permet alors de reconstruire une image de l’échantillon en trois dimensions avec une résolution élevée.

Plus récemment, une nouvelle technique de microscopie est apparue suite aux travaux de [Denk 90] : la microscopie multiphotonique. Cette technique offre de nouvelles possibilités en terme d’imagerie, grâce notamment à l’utilisation de différents processus optiques tels que la fluorescence à deux-photons (2PF, pour "2-Photon Fluorescence") et à 3 photons (3PF), les phénomènes optiques non linéaires comme la GSH, la génération de troisième harmonique (GTH) ou le mélange quatre ondes (FWM, pour "four wave mixing"), et la diffusion Raman, qu’elle soit cohérente (CARS, pour "Coherent Anti-Stokes Raman Scattering") ou stimulée (SRS, pour "Stimulated Raman Scattering") [Zipfel 03]. Comme décrit ci-après, la microscopie multiphotonique est très prometteuse dans le domaine des applications biomédicales.

Principe

Une manière assez simple de décrire le principe de la microscopie multi-photonique consiste à se baser sur la comparaison des phénomènes de fluorescence et de fluorescence à deux-photons.

La fluorescence est un phénomène optique de type luminescent. Elle est émise par des matériaux ou molécules dans lesquelles certaines transitions entre deux états électroniques peuvent s’effectuer par absorption ou émission de photons. La figure 1.3 (a) décrit ces interactions. Dans un premier temps, l’absorption d’un photon entraîne la transition de l’état électronique fondamental ou initial à l’état excité.

Un phénomène de relaxation vibrationnelle, de type non radiatif, peut se produire de manière à atteindre le niveau le plus bas de l’état électronique excité. Enfin, une dernière transition est nécessaire pour retrouver l’état de plus faible énergie. Lorsque cette désexcitation s’effectue par l’émission d’un photon, c’est ce que l’on appelle l’émission de fluorescence. L’énergie de ce photon est prédéfinie puisqu’elle est déterminée par la transition énergétique entre les deux états mis en jeu.

Cette émission de fluorescence est produite par l’excitation d’un photon, d’énergie égale ou supérieure à la bande d’absorption de la transition correspondante. Or il est possible d’exciter ce même échantillon par l’absorption simultanée de deux photons de plus faible énergie, mais dont la somme permet effectivement l’excitation, comme le montre la figure1.3(b). Ce type de fluorescence, appelé fluorescence à 2 photons se produit à condition que les deux photons arrivent au même endroit en même temps. L’émission de fluorescence, qu’elle soit excitée à 1 ou 2 photons, aura dans les deux cas la même énergie.

Figure 1.3 – Fluorescence excitée (a) à un photon, (b) à deux photons.Extrait de [Bonacina 12].

Il est ainsi possible d’exciter un échantillon avec une énergie lumineuse inférieure à son énergie d’ac- tivation intrinsèque, c’est-à-dire en utilisant une longueur d’onde supérieure. C’est en exploitant cette propriété que la microscopie biphotonique permet de contourner de nombreux inconvénients de la micro- scopie classique. Ce phénomène d’absorption simultanée de deux photons a donné son nom à la micro- scopie biphotonique, mais il peut également se manifester avec trois photons ou plus et l’on parle alors de microscopie multiphotonique.

Enjeux

Les enjeux en imagerie biomédicale sont nombreux puisque les avantages de la microscopie biphotonique permettent de repousser les limites actuelles de la microscopie classique. Dans cette partie, nous détaillons ces avantages.

On peut citer tout d’abord l’amélioration de la résolution spatiale. En effet, les conditions selon lesquelles deux photons de même énergie doivent arriver en même temps impliquent une plus faible probabilité d’excitation. Cette faible probabilité doit être compensée par une intensité d’excitation élevée, ce qui est fait au moyen d’un faisceau laser focalisé. Le processus optique est alors limité spatialement par l’intensité d’excitation : il reste confiné au point focal. Cette région étant inférieure à la limite de diffraction, la résolution spatiale ainsi obtenue est meilleure que celle obtenue en microscopie confocale.

Un système de balayage complémentaire permet, comme en microscopie confocale, d’obtenir une image complète d’un échantillon avec une résolution spatiale très élevée.

Figure 1.4 – Microscopie classique (à gauche) et microscopie biphotonique (à droite) avec amélioration de la résolution spatiale. Le couplage à un système de balayage permet d’imager en 3 dimensions.

En microscopie à un photon, la résolution spatiale vautr_1p = ^0,6λ_ON, ON étant l’ouverture numérique du système, tandis que la résolution latérale à deux photons est plus fine et vautr2p= ^0,5λ_ON. Concernant la profondeur de champ (Depth Of Field, DOF), elle est deDOF1p=_ON^4λ2 à un photon et est restreinte à seulementDOF_2p= ^1,3nλ_ON2 à deux photons, ce qui améliore considérablement la résolution selon l’axe z.

Par ailleurs, cette technique permet d’augmenter la profondeur de pénétration dans les tissus. La possibilité d’exciter des échantillons à des longueurs d’onde supérieures à celles habituellement utilisées permet de travailler dans des zones où l’absorption des tissus n’est pas aussi importante que dans le visible. La fenêtre spectrale dite de transition biologique se situe dans le proche infra-rouge, entre 700 nm et 1000 nm, comme illustré sur la figure 1.5. En travaillant dans cette zone, le signal optique sera peu absorbé par l’échantillon biologique et pourra ainsi pénétrer plus profondément dans les tissus. Il est intéressant d’ajouter ici que la diffusion de la lumière joue un rôle important dans la profondeur de détection en microscopie biphotonique. Lorsque l’on prend en compte cet effet, on constate qu’il est souvent avantageux d’augmenter la longueur d’onde au-delà de cette fenêtre afin de travailler dans le domaine Infra-Rouge (IR) où les tissus diffusent beaucoup moins la lumière, même si l’eau absorbe plus.

Figure 1.5 – Spectres d’absorption des principaux constituants des milieux biologiques.Extrait du Bio- medical Photonics Handbook [Vo-Dinh 04].

Enfin, la photo-dégradation des échantillons peut être restreinte. D’une part en raison de l’absorption moindre des tissus dans la zone de longueur d’onde utilisée, et d’autre part par la très faible zone spatiale d’excitation limitée au point focal. Il semble important d’ajouter que si les intensités laser employées doivent être élevées, les puissances moyennes peuvent être relativement faibles grâce à des lasers pulsés ultra-rapides, dont la durée de pulsation est de l’ordre de la femto-seconde.