RESULTATS 1. Recherche de gènes suppresseurs de tumeurs dans les QTLs

RESULTATS

1. Recherche de gènes suppresseurs de tumeurs dans les QTLs

Il est fort possible que certains des QTLs qui ont été détectés au laboratoire contiennent des gènes suppresseurs de tumeurs (TS) (Quan et al., 2006). Dans le modèle à deux évènements utilisé pour décrire l’inactivation d’un gène TS, le premier évènement est une mutation germinale dans un des allèles du gène (gènes à l’état hétérozygote) et le second est la perte (somatique) de l’allèle fonctionnel restant, celle-ci pouvant affecter une partie ou l’ensemble du chromosome (Knudson, 1971). Au niveau du génotype, le résultat du second évènement est une perte d’hétérozygotie. Il faut toutefois noter que l’on peut aussi observer l’inactivation de l’allèle fonctionnel sans perte physique par une mutation additionnelle.

Il est donc concevable que chez des animaux hétérozygotes, des tumeurs mammaires

soient caractérisées par une perte d’allèle dans une région contenant un QTL de sensibilité au

cancer mammaire. En criblant des paires d’échantillons de tissus normaux et de tissus

tumoraux au niveau de marqueurs polymorphes le long des régions d’intérêt (QTLs), il est

possible de mettre en évidence des marqueurs présentant des pertes d’hétérozygotie

récurrentes et ainsi de repérer des régions contenant potentiellement des gènes suppresseurs

de tumeurs. Dans cette optique nous avons caractérisé des tumeurs d’animaux F1, issus du

croisement (SPRD-Cu3 X WKY/E56), pour des éventuelles pertes d’hétérozygotie au niveau

des 7 QTLs identifiés au laboratoire. En cas de perte d’hétérozygotie, l’étude de plusieurs

tumeurs peut permettre de définir la plus petite région de perte commune, ce qui conduit à

limiter la zone à explorer pour y trouver le gène responsable. Nous avons donc testé l’ADN de

21 femelles F1 ayant généré, après un traitement au DMBA à l’âge de 55 jours, 39 tumeurs au

total. Nous avons comparé les échantillons d’ADN extraits de tissu sain (foie) aux

échantillons d’ADN extraits de tissu tumoral au niveau de 54 marqueurs microsatellites

polymorphes recouvrant les 7 QTLs identifiés (la liste des marqueurs étudiés est reprise dans

la Table 15 de l’Annexe 6 : Matériel et Méthodes). Ce travail a été effectué grâce à l’utilisation

du séquenceur automatique à capillaire 3100 Genetic Analyser (Applied Biosystems) qui

permet la séparation et la détection de produits PCR fluorochromés. Nous avons ensuite traité

les données issues de ces analyses grâce au programme de génotypage Genotyper (Applied

Biosystems) et ainsi pu comparer les rapports allèliques dans le tissu sain et dans la tumeur

pour chaque marqueur dans toutes les paires d’échantillons. La Figure 7.A illustre un exemple

de résultats obtenus après le traitement des données issues du séquenceur à capillaire par le

programme Genotyper. Les rapports d’intensité des marqueurs repérés dans les tumeurs ont

été normalisés par rapport aux rapports observés dans le tissu sain (foie). Le rapport (T1/T2) /

(N1/N2) a donc été calculé pour chaque marqueur dans toutes les paires d’échantillons. T1 et N1 sont les valeurs des aires de pics d’un allèle et T2 et N2 sont les valeurs des aires de pics de l’autre allèle pour l’échantillon de tumeur (T) et de foie (N) respectivement. Lorsque le résultat du rapport allèlique (Tumeur / Foie) était supérieur à 1.0, le rapport inverse a été utilisé afin d’obtenir une valeur entre 0 et 1. Nous avons considéré les pertes allèliques comme significatives lorsque le résultat du rapport allèlique (Tumeur / Foie) était inférieur à 0.6. Il est à noter que la perte totale d’un allèle est rarement observée étant donné que les tumeurs ne sont pas constituées à 100% de cellules tumorales. Les analyses ont été répétées deux ou trois fois. La Figure 7.B détaille le calcul de perte d’hétérozygotie pour l’exemple de résultats obtenus lors de l’analyse des données issues du séquenceur automatique par le programme Genotyper (Applied Biosystems) (Figure 7.A).

Les premiers résultats ont permis de mettre en évidence deux marqueurs présentant potentiellement des pertes d’hétérozygotie, l’un situé dans le locus localisé sur le petit bras du chromosome 1 et l’autre dans le locus Mcstm1 (chromosome 5). Nous avons observé que environ 60% des échantillons tumoraux présentaient des pertes partielles d’hétérozygotie au niveau du marqueur microsatellite D1Rat1 (10.6 Mb) et que environ 90% des échantillons tumoraux présentaient des pertes partielles d’hétérozygotie au niveau du marqueur D5Rat190 (25.0 Mb) (Table 5). De manière remarquable nous n’avons observé aucune perte allèlique dans les échantillons tumoraux au niveau des marqueurs (disponibles à l’époque) jouxtant les marqueurs D1Rat1 (dont les marqueurs polymorphes les plus proches sont D1Rat327 à 8.2 Mb et D1Rat4 à 11.9 Mb) et D5Rat190 (dont les marqueurs polymorphes les plus proches sont D5Rat209 à 23.2 Mb et D5Rat130 à 32.7 Mb). De plus, lors de l’analyse du marqueur D5Rat190 nous avons noté que dans tous les cas, l’allèle qui faisait l’objet d’une perte de signal était l’allèle SPRD-Cu3. Dans ce cas ce serait donc l’allèle de sensibilité qui ferait l’objet d’une délétion et non l’allèle de résistance. La même observation a été faite dans le cas de l’analyse du marqueur D1Rat1 mais ceci ne nous a pas paru étonnant puisque celui-ci est situé dans un QTL qui a été décrit comme cryptique (allèle de résistance issu du parent sensible). Il était intriguant que dans les deux cas un seul marqueur soit affecté par une perte d’hétérozygotie (ce qui suggérait des pertes sur des distances anormalement courtes). Les données complètes de cette première analyse sont reprises dans l’Annexe 2.

Compte tenu de ces observations nous avons voulu réévaluer ces premiers résultats par

d’autres analyses. Pour cela nous avons appliqué la technique de pyroséquençage au niveau

des régions contenant les marqueurs microsatellites D1Rat1 et D5rat190 (avec l’aide de

l’équipe de P. Hilbert de l’Institut de Pathologie et de Génétique). Cette technique de

séquençage de courtes régions d’ADN permet de quantifier l’incorporation de nucléotides

spécifiques. Cette méthode a nécessité au préalable la localisation de polymorphismes

nucléotidiques de type « SNP » (Single Nucleotide Polymorphism) dans les zones flanquant les marqueurs microsatellites étudiés D1Rat1 et D5Rat190. Pour ce faire nous avons séquencé deux régions de environ 2000 paires de bases et de environ 3000 paires de bases, contenant respectivement les marqueurs microsatellites D1Rat1 et D5Rat190. Les séquences ont été effectuées en duplicat en orientation sens et antisens dans les lignées parentales SPRD-Cu3 et WKY. Pour chacune des deux régions, une séquence consensus a été obtenue grâce à l’utilisation du logiciel Contig Express. La comparaison des séquences consensus SPRD-Cu3 et WKY, réalisée grâce à l’utilisation de la fonction « Align » du logiciel Vector NTI, nous a permis de mettre en évidence un polymorphisme de séquence entre les lignées parentales SPRD-Cu3 et WKY dans la région du marqueur D1Rat1 et cinq polymorphismes de séquence entre les deux lignées dans la région du marqueur D5Rat190. La comparaison des séquences consensus est reprise dans l’Annexe3.A pour la région du marqueur D1Rat1 et dans l’Annexe3.B pour la région du marqueur D5Rat190. Nous avons réalisé les analyses de perte d’hétérozygotie par pyroséquençage au niveau de deux SNPs identifiés dans les deux régions d’intérêt et quantifié les allèles dans des échantillons de foie et de tumeurs. Le détail des résultats est repris dans l’Annexe4. Les résultats de cette analyse n’ont pas confirmé les pertes allèliques observées précédemment. Les premières conclusions sur les deux marqueurs microsatellites étaient sans doute erronées et dues à un biais technique inexpliqué. Nous en concluons qu’aucune perte d’hétérozygotie n’a pu être mise en évidence dans les sept QTLs identifiés statistiquement. Nous n’avons donc pas pu mettre en évidence des indices de présence de gènes suppresseurs de tumeurs dans les QTLs.

2. Réalisation et étude des lignées congéniques

La deuxième approche a consisté dans un premier temps à réaliser et étudier des lignées congéniques SPRD-Cu3.WKY/E56 pour plusieurs des sept locus identifiés statistiquement (Quan et al., 2006), ceci dans le but de tester physiquement l'existence des QTLs et de mesurer l'implication individuelle de chacun d'entre eux dans le contrôle de la sensibilité au cancer mammaire. Dans un deuxième temps, nous avons voulu créer et analyser une lignée dite multicongénique afin d’évaluer les effets d’une combinaison génétique et donc les relations d'épistasie éventuelles entre deux QTLs.

2.1 Les lignées congéniques simples 2.1.1 Génération des lignées congéniques

Au cours de ce travail nous avons généré des lignées congéniques pour six des sept

locus identifiés. Ce travail a été réalisé en collaboration avec D. Stieber. La génération de lignées congéniques a consisté, par une succession de 9 croisements en retour, à introgresser indépendamment et isolément, chaque région contenant un QTL issu de la lignée résistante WKY/E56 dans le génome de la lignée sensible SPRD-Cu3. A partir du premier croisement en retour, les animaux ont été génotypés pour des marqueurs microsatellites polymorphes contenus dans la région d’intérêt. La liste des marqueurs microsatellites qui ont été utilisés est reprise dans la table 2 du chapitre « Matériel et Méthodes ». (Il est à noter que pour éviter une éventuelle perte de gènes critiques, nous avons sélectionné, d’une manière générale, les animaux présentant une région différentielle plus large que celle décrite initialement par les analyses de liaisons). Seuls les animaux possédant les marqueurs microsatellites du locus d’intérêt à l’état hétérozygote SPRD-Cu3 / WKYE/56 ont été retenus pour parents de la génération suivante. Après 9 croisements en retour, on estime que les animaux sont homozygotes SPRD-Cu3 pour l’ensemble du génome à l’exception de la région d’intérêt qui a été sélectionnée tout au long de l’expérience à l’état hétérozygote. Ensuite, en croisant des animaux de la génération N9 entre eux (croisement frère-sœur) et en sélectionnant cette fois-ci les animaux présentant les marqueurs du locus différentiel à l’état homozygote WKY/E56, nous avons généré des individus congéniques pour le locus d’intérêt.

2.1.2 Caractérisation des lignées congéniques pour la sensibilité au cancer mammaire induit au DMBA

Lorsque les lignées congéniques ont été établies, chacune d’elle a été caractérisée pour les trois phénotypes tumoraux à savoir, la multiplicité tumorale (le nombre de tumeurs formées par animal à la 19

semaine après le traitement), la latence tumorale (le temps écoulé entre le traitement et l’apparition de la première tumeur) et la vitesse de croissance tumorale (l’agressivité tumorale). Une collection de femelles âgées de 55 jours a été traitée par une seule dose intragastrique de DMBA. Chaque femelle a été palpée de manière hebdomadaire à partir de la troisième semaine après traitement au DMBA. L’expérience a été menée sur 19 semaines. Lors de chaque contrôle hebdomadaire nous avons relevé le nombre de tumeurs formées par animal et estimé le diamètre de chacune d’elle et ainsi pu déterminer les valeurs phénotypiques pour la multiplicité, la latence et la vitesse de croissance tumorale pour chacune des lignées. Celles-ci sont exprimées en terme de moyenne ± l’erreur standard (SE).

En raison de la quantité de travail et du grand nombre de rats nécessaires à

l’aboutissement de cette étude, nous avons scindé ce travail en deux parties. La première a

consisté en l’étude phénotypique des lignées congéniques pour les locus situés aux

chromosomes 5, 9 et 18. Cette première partie a été réalisée en collaboration avec D. Stieber.

La deuxième partie a consisté en l’étude phénotypique des trois lignées congéniques pour les deux locus situés sur le chromosome 1 (deux lignées congéniques) et pour le QTL situé sur le chromosome 10. Chacune des deux séries d’analyse a été menée en parallèle avec l’étude d’une collection de femelles de souche sensible SPRD-Cu3. Ces deux populations, nommées SPRD-Cu3.I et SPRD-Cu3.II, ont fourni des données phénotypiques qui ont constitué la référence pour la comparaison des autres lignées. Les comparaisons des données entre les lignées ont été effectuées en utilisant la fonction « Pairwise Comparison » du logiciel SigmaStat. Dans le cas de populations de données présentant une distribution normale, ce logiciel effectue un test t et dans le cas contraire, il effectue un test de la somme des rangs de Mann-Whitney. A l’issue de ces tests une valeur de p est produite, celle-ci traduit la force statistique de la différence entre les deux groupes étudiés. Les données phénotypiques des lignées congéniques pour les locus situés aux chromosomes 5, 9 et 18 ont été comparées aux données de la population parentale SPRD-Cu3.I et les données phénotypiques des lignées congéniques pour les locus situés aux chromosomes 1 et 10 ont été comparées aux données de la population parentale SPRD-Cu3.II. Notons que les données de ces deux populations parentales ne sont pas statistiquement différentes (Table 6).

Les résultats de ces études sont présentés suivant la position chromosomique des locus caractérisant les lignées congéniques.

Table 6 : Données phénotypiques de deux populations de femelles de lignée sensible SPRD-Cu3 (SPRD-Cu3.I et SPRD- Cu3.II).

Phénotype

Multiplicité Latence Agressivité

Nom de la

lignée N Nombre de

tumeurs

p-value vs.

SPRD- Cu3.I

N Jours

p-value vs.

SPRD- Cu3.I

N Vitesse de croissance (cm/sem)

p-value vs.

SPRD- Cu3.I SPRD-Cu3.I 4

8 11.23 ± 0.51 59 43.86 ± 0.95 59 0.71 ± 0.03

SPRD-Cu3.II 1

7 10.88 ± 0.43 0.699 25 43.21 ± 1.71 0.752 25 0.72 ± 0.04 0.594 Ces données ont constitué la référence pour la comparaison des autres lignées. N représente le nombre d’animaux dans la population. Les valeurs phénotypiques sont présentées sous forme de moyenne ± SE. p-value vs. SPRD-Cu3.I est la valeur p associée à la comparaison des deux populations.

2.1.2.1 Lignée congénique du chromosome 1p.tel

Nous avons généré une lignée congénique de rat SPRD-Cu3.WKY-

D1Rat246/D1Rat260, qui se caractérise par un segment WKY situé sur le petit bras du

chromosome 1 de rat (RNO1) de environ 75.7 Mb (Figure 8). Ce segment couvre l’entièreté

de l’intervalle de confiance du QTL identifié statistiquement sur le petit bras du chromosome 1 qui a été associé au phénotype de multiplicité tumorale. (Cet intervalle de confiance a été défini comme le plus petit segment contigu de chromosome qui contient 95% de 1000 échantillons de « boostrap » dans l’analyse de liaison génétique) (Quan et al., 2006). Il est à noter que lors des analyses de liaisons ce QTL a été décrit comme un QTL cryptique. Dans un premier temps nous avons appelé cette lignée, Congénique 1p.tel. L’homozygotie SPRD-Cu3 des marqueurs anonymes situés dans les autres QTLs identifiés statistiquement a été vérifiée (QTLs sur les chromosomes 1, 2, 5, 9, 10 et 18), (la liste des marqueurs testés est reprise dans la Table 17 de l’Annexe 6). Nous avons caractérisé cette lignée pour les trois phénotypes tumoraux à la génération N9F5. Le détail des données phénotypiques est repris dans la Table 7.

Table 7 : Données phénotypiques de la lignée congénique C1p.Mcstm3 et de la population de référence SPRD- Cu3.II.

Phénotype

Multiplicité Latence Agressivité

Nom de la

lignée N Nombre de

tumeurs

p-value vs.

SPRD- Cu3.II

N Jours

p-value vs.

SPRD- Cu3.II

N Vitesse de croissance (cm/sem)

p-value vs.

SPRD- Cu3.II SPRD-Cu3.II 1

7 10.88 ± 0.43 25 43.21 ± 1.71 25 0.72 ± 0.04

C1p.Mcstm3 5 10.80 ± 2.31 0.784 12 41.33 ± 1.75 0.920 12 0.60 ± 0.05 0.102 N représente le nombre d’animaux dans la population. Les valeurs phénotypiques sont présentées sous forme de moyenne ± SE. p-value vs. SPRD-Cu3. II est la valeur p associée à la comparaison des deux populations.

L’analyse des données a révélé une augmentation du caractère de sensibilité chez les Congénic1p.tel par rapport à la lignée parentale SPRD-Cu3 (panel II), bien que cette différence soit un peu subtile (non visible dans l’analyse des résultats tels que analysés après 19 semaines, soit à la fin de l’expérience). En effet, nous avons noté que 50% des animaux testés n’ont pas survécu au delà de la quinzième semaine d’expérience en comparaison avec un taux de mortalité de 28% chez les parents SPRD-Cu3.II. Les animaux congéniques pour lesquels l’expérience n’a pas abouti sont morts naturellement ou ont été sacrifiés en raison de leur état de faiblesse trop avancé (en raison de la charge tumorale) pour que l’on continue leur caractérisation. Le sacrifice des animaux très affaiblis en cours d’analyse revient à exercer un biais sur le caractère de multiplicité tumorale à 19 semaines en défaveur d’une sensibilité élevée. Lors de l’analyse des données de multiplicité tumorale, les animaux pris en compte au terme de l’expérience représentent une population dont le degré de sensibilité au cancer mammaire est compatible avec une durée de vie de 19 semaines après traitement au DMBA.

Les animaux présentant une grande multiplicité (ou agressivité) tumorale sont donc exclus de

l’analyse. La Figure 9 illustre cette observation. La région du chromosome 1 bordée par les marqueurs D1Rat246 (2.4 Mb) et D1Rat260 (78.1 Mb) contiendrait donc bien un locus de sensibilité au cancer mammaire et nous l’avons appelé Mcstm3 (Mammary cancer susceptibility, tumor multiplicity 3). Dès lors, sur base des règles de la nomenclature des lignées congéniques chez le rat nous avons appelé cette lignée congénique ; SPRD- Cu3.WKY-Mcstm3. (http://www.informatics.jax.org/mgihome/nomen/gene.shtml#nsqtl). Afin de faciliter la lecture, nous utiliserons l’annotation suivante : C1p.Mcstm3.

2.1.2.2 Lignée congénique du chromosome 1q.tel

Nous avons construit une lignée congénique de rat SPRD-Cu3.WKY- D1Rat324/D1Rat88. Le segment différentiel de celle-ci a une taille d’environ 36.3 Mb et est situé sur le grand bras du chromosome 1 de rat (RNO1). Ce segment couvre l’entièreté de l’intervalle de confiance du QTL identifié statistiquement sur le grand bras du chromosome 1 de rat qui a été associé au phénotype de multiplicité tumorale. (Figure 8). Nous avons établi l’homozygotie SPRD-Cu3 des animaux pour l’ensemble des marqueurs anonymes situés dans les autres QTLs identifiés. Nous avons appelé cette lignée Congénique 1q.tel et l’avons caractérisée pour les trois phénotypes tumoraux à la génération N9F5. Le détail des données phénotypiques est repris dans la Table 8.

Table 8 : Données phénotypiques de la lignée congénique C1q.tel et de la population de référence SPRD-Cu3.II.

Phénotype

Multiplicité Latence Agressivité

Nom de la

lignée N Nombre de

tumeurs

p-value vs.

SPRD- Cu3.II

N Jours

p-value vs.

SPRD- Cu3.II

N Vitesse de croissance (cm/sem)

p-value vs.

SPRD- Cu3.II SPRD-Cu3.II 1

7 10.88 ± 0.43 25 43.21 ± 1.71 25 0.72 ± 0.04

C1q.tel 2

0 9.95 ± 0.75 0.308 33 46.42 ± 1.25 0.126 31 0.57 ± 0.04 0.010 Power of test to

low N représente le nombre d’animaux dans la population. Les valeurs phénotypiques sont présentées sous forme de moyenne

± SE. p-value vs. SPRD-Cu3.II est la valeur p associée à la comparaison des deux populations. « Power of the test to low » signifie que la puissance du test statistique effectué est inférieure à la puissance désirée (0.8), la différence entre les populations étudiées ne peut donc pas être considérée comme significative

Les données phénotypiques de multiplicité, de latence et d’agressivité ont été

comparées à celles de la population contrôle SPRD-Cu3.II et aucune différence

statistiquement significative n’a été observée entre les deux lignées (Table 8). En effet, en

terme de multiplicité tumorale, les animaux congéniques (N=20) ont développé 9.95 ± 0.745

tumeurs par animal 19 semaines après traitement au DMBA, laquelle n’est pas statistiquement différente de celle des animaux contrôles SPRD-Cu3.II (10.882 ± 0.43 tumeurs par animal) (N=17). Nous n’avons donc pas été en mesure de confirmer les résultats des analyses de liaisons qui prédisaient que la région du chromosome 1 bordée par les marqueurs D1Rat324 (229.5 Mb) et D1Rat88 (265.8 Mb) contenait un locus impliqué dans la détermination de la multiplicité tumorale.

2.1.2.3 Lignée congénique du chromosome 5

Nous avons généré une lignée congénique de rat SPRD-Cu3.WKY-D5Rat124/Pla2g2a, qui se caractérise par un segment WKY du chromosome 5 de rat de environ 138,4 Mb (RNO5). Ce segment couvre l’entièreté de l’intervalle de confiance du QTL identifié statistiquement sur le chromosome 5 qui a été associé au phénotype de multiplicité tumorale (Quan et al., 2006) (Figure 10). Dans un premier temps nous avons appelé cette lignée, Congénique 5. L’homozygotie SPRD-Cu3 des marqueurs anonymes situés dans les autres QTLs identifiés statistiquement a été vérifiée. Cette lignée a été caractérisée pour les trois phénotypes tumoraux à la génération N9F2 (Table 9).

Table 9 : Données phénotypiques de la lignée congénique C5.Mcstm1 et de la population de référence SPRD-Cu3.I.

Phénotype

Multiplicité Latence Agressivité

Nom de la

lignée N Nombre de

tumeurs

p-value vs.

SPRD- Cu3.I

N Jours

p-value vs.

SPRD- Cu3.I

N Vitesse de croissance (cm/sem)

p-value vs.

SPRD- Cu3.I SPRD-Cu3.I 4

8 11.23 ± 0.51 59 43.86 ± 0.95 59 0.71 ± 0.03

C5.Mcstm1 1

4 3.93 ± 0.64 ≤ 0.001 16 53.38 ± 2.45 ≤ 0.001 16 0.65 ± 0.08 0.250 N représente le nombre d’animaux dans la population. Les valeurs phénotypiques sont présentées sous forme de moyenne

± SE. p-value vs. SPRD-Cu3.II est la valeur p associée à la comparaison des deux populations.

La population contrôle SPRD-Cu3.I (N=46) a développé en moyenne 11.23 ± 0.51

tumeurs par animal 19 semaines après traitement au DMBA, alors que les animaux de la

lignée Congénique 5 (N=14) ont développé en moyenne 3.93 ± 0.64 tumeurs par animal. Les

rats de la lignée Congénique 5 présentaient donc une réduction du nombre de tumeurs formées

par animal de 65% par rapport à la lignée parentale sensible. Un test de la somme des rangs de

Mann-Whitney a permis de mettre en évidence que la différence entre les deux populations est

statistiquement significative (p≤0.001). Ces résultats permettent de confirmer physiquement

que le QTL détecté par les analyses de liaisons sur le chromosome 5 de rat, contient au moins

un allèle de résistance WKY impliqué dans la détermination de la multiplicité tumorale (Stieber et al., 2007). Ce QTL est situé dans la région bordée par le marqueur D5Rat124 (19.2 Mb) et le gène Pla2g2a (157.6 Mb) et nous l’avons appelé Mcstm1 (Mammary cancer susceptibility, tumor multiplicity 1). Dès lors, sur base des règles de nomenclature des lignées congéniques chez le rat, la lignée congénique dérivée a été appelée : SPRD-Cu3.WKY- Mcstm1. Afin de faciliter la lecture, nous utiliserons l’annotation suivante : C5.Mcstm1.

L’analyse des données phénotypiques a également permis de mettre en évidence une différence statistiquement significative entre les deux populations en terme de latence. Les rats de la lignée congénique présentaient une latence plus élevée que les rats contrôles SPRD- CU3.I (N=59). En effet, nous avons observé une latence moyenne de 53.38 ± 2.45 jours pour les animaux congéniques (N=16) en comparaison à une latence moyenne de 43.86 ± 0.95 jours pour les rats contrôles et la valeur de p obtenue lors de la comparaison des deux populations était de p≤0.001 (test des rangs de Mann-Whitney). Le QTL Mcstm1 est donc également impliqué dans la détermination de la latence tumorale, l’allèle WKY conférant une certaine résistance (augmentation du temps moyen d’apparition de la première tumeur).

2.1.2.3.1 Lignées sous-congéniques du chromosome 5

Le locus différentiel qui définit la lignée congénique C5.Mcstm1 a une taille de 138.4

Mb et couvre environ 80% du chromosome 5. Afin de réduire la région à explorer, nous avons

généré deux lignées sous-congéniques de C5.Mcstm1. La première est caractérisée par un

segment proximal WKY du chromosome 5 de rat de environ 28.3 Mb et la deuxième par un

segment distal WKY du chromosome 5 de rat de environ 70.2 Mb. Ces deux régions sont

respectivement bordées par les marqueurs D5Mgh2 (17.5 Mb) et D5Rat82 (45.8 Mb) et les

marqueurs D5Rat230 (82.8 Mb) et D5rat39 (153 Mb) (Figure 10). Pour générer ces lignées,

nous avons sélectionné à partir de la génération N7 de la construction de la lignée

C5.Mcstm1, des animaux possédant l’hétérozygotie uniquement au niveau des marqueurs

d’une des deux sous-régions du QTL Mcstm1. Ceci revient à sélectionner parmi les

descendants, les rats présentant des recombinaisons de la région d’intérêt. Chacune des

lignées sous-congéniques a ensuite été obtenue par croisement des animaux de la génération

N9 entre eux et sélection des animaux possédant l’homozygotie WKY/E56 dans la région

d’intérêt. Nous avons donc construit deux lignées sous-congéniques du chromosome 5

(RNO5), la première : SPRD-Cu3.WKY-D5Mgh2/D5Rat82 et la seconde : SPRD-Cu3.WKY-

D5Rat230/D5Rat39. Ces deux lignées ont été appelées C5.A et C5.B. Ce travail s’est achevé

en toute fin de thèse et ces lignées n’ont pas encore été phénotypées.

2.1.2.4 Lignée congénique du chromosome 9

Nous avons généré une lignée congénique de rat SPRD-Cu3.WKY- D9Rat139/D9Rat158. Cette lignée est caractérisée par un segment d’environ 21.7 Mb d’origine WKY sur le chromosome 9 de rat (RNO9). Ce segment couvre et borde l’intervalle de confiance du QTL identifié statistiquement sur le chromosome 9 qui a été associé au phénotype de latence tumorale (Figure 11). Dans un premier temps nous avons appelé cette lignée, Congénique 9. Nous avons établi l’homozygotie SPRD-Cu3 des animaux pour l’ensemble des marqueurs anonymes situés dans les autres QTLs identifiés avant de la caractériser pour les trois phénotypes tumoraux. Le détail des données phénotypiques est repris dans la Table 10.

Table 10 : Données phénotypiques des lignées congéniques C9.Mcstl1 (WKY / WKY), C9.Mcstl1 (SPRD-Cu3 / WKY) et de la population de référence SPRD-Cu3.I.

Phénotype

Multiplicité Latence Agressivité

Nom de la

lignée N Nombre de

tumeurs

p-value vs.

SPRD- Cu3.I

N Jours

p-value vs.

SPRD- Cu3.I

N Vitesse de croissance (cm/sem)

p-value vs.

SPRD- Cu3.I SPRD-Cu3.I 4

8 11.23 ± 0.51 59 43.86 ± 0.95 59 0.71 ± 0.03

C9.Mcstl1 (WKY / WKY) 2

0 9.45 ± 0.57 0.045 Power of test to low

25 51.00 ± 1.97 ≤ 0.001 25 0.72 ± 0.04 0.725

C9.Mcstl1 (SPRD-Cu3 /

WKY)

2

3 9.35 ± 0.51 0.024 Power of test to low

25 48.96 ± 1.86 0.012 25 0.64 ± 0.04 0.207

N représente le nombre d’animaux dans la population. Les valeurs phénotypiques sont présentées sous forme de moyenne

± SE. p-value vs. SPRD-Cu3.II est la valeur p associée à la comparaison des deux populations. « Power of the test to low » signifie que la puissance du test statistique effectué est inférieure à la puissance désirée (0.8), la différence entre les populations étudiées ne peut donc pas être considérée comme significative.

Les données phénotypiques de la Congénique 9 ont été comparées à la celles de la

population contrôle SPRD-Cu3.I et en ce qui concerne les phénotypes de multiplicité et

d’agressivité aucune différence significative n’a été observée entre les deux lignées. Par

contre, lors de l’étude du phénotype de latence nous avons noté une différence entre les deux

lignées (Table 10). En effet, il a été établi que les animaux homozygotes WKY au locus

d’intérêt (N=25) présentaient une latence moyenne de 51.0 ± 1.97 jours à comparer à la

latence moyenne de la population SPRD-Cu3.I (43.86 ± 0.95 jours), (N=59). Les tests

statistiques ont permis d’établir que cette différence est statistiquement significative

(p≤0.001). Nous avons également caractérisé un panel d’animaux hétérozygotes SPRD-Cu3 /

WKY au locus différentiel (N=25). L’analyse de ces données a permis de mettre en évidence que ces animaux présentaient une latence moyenne intermédiaire (48.96 ± 1.86 jours) entre les animaux de la Congénique 9 homozygotes et la lignée parentale sensible (la valeur de p pour la comparaison de la population hétérozygote et de la population SPRD-Cu3.I était de 0.012).

Le phénotype de latence est donc dans ce cas-ci soumis à un « effet de dose » des allèles. Ces résultats démontrent qu’il existe au moins un allèle de résistance WKY impliqué dans la détermination de la latence tumorale situé dans la région bordée par les marqueurs D9Rat139 (2.17 Mb) et D9Rat158 (23.88 Mb). Le QTL a été nommé Mcstl1 (Mammary cancer susceptibility, tumor latency 1) et sur base des règles de nomenclature des lignées congéniques chez le rat, la lignée congénique dérivée a été appelée : SPRD-Cu3.WKY-Mcstl1 ou C9.Mcstl1. Il faut toutefois remarquer que le locus Mcstl1 avait été initialement décrit comme cryptique, autrement dit les analyses de liaisons prédisaient l’effet inverse de celui observé lors de la caractérisation phénotypique. Dans ce dernier cas c’est l’allèle WKY qui augmente le temps de latence et confère la résistance.

2.1.2.5 Lignée congénique du chromosome 10

Nous avons construit une lignée congénique de rat SPRD-Cu3.WKY-D10Rat 91/D10Rat135. La taille du segment différentiel de celle-ci est d’environ 98.9 Mb, il comprend donc la quasi totalité du chromosome 10 de rat (RNO10 a un taille d’environ 110.7 Mb) et couvre largement l’intervalle de confiance du QTL identifié statistiquement sur le chromosome 10, lequel a été associé au phénotype de vitesse de croissance tumorale (agressivité tumorale) (Figure 12). Dans un premier temps nous avons appelé cette lignée, Congénique 10. L’homozygotie SPRD-Cu3 de l’ensemble des marqueurs anonymes situés dans les autres QTLs identifiés a été établie. La caractérisation phénotypique de cette lignée a été réalisée à la génération N9F4 (Table 11).

Table 11 : Données phénotypiques de la lignée congénique C10.Mcsta1 et de la population de référence SPRD-Cu3.II.

Phénotype

Multiplicité Latence Agressivité

Nom de la

lignée N Nombre de

tumeurs

p-value vs.

SPRD- Cu3.II

N Jours

p-value vs.

SPRD- Cu3.II

N Vitesse de croissance (cm/sem)

p-value vs.

SPRD- Cu3.II SPRD-Cu3.II 1

7 10.88 ± 0.43 25 43.21 ± 1.71 25 0.72 ± 0.04

C10.Mcsta1 2

5 9.24 ± 0.65 0.003 34 38.56 ± 1.18 0.005 33 0.53 ± 0.02 ≤ 0.001 N représente le nombre d’animaux dans la population. Les valeurs phénotypiques sont présentées sous forme de moyenne

± SE. p-value vs. SPRD-Cu3.II est la valeur p associée à la comparaison des deux populations.

L’analyse des données phénotypiques a permis de mettre en évidence une différence modeste mais significative en terme de multiplicité tumorale entre les animaux de la lignée Congénique 10 (N=25) et les animaux de la lignée parentale sensible (panel II) (N=17) (Table 11). En effet la Congénique 10 présentait un multiplicité tumorale moyenne de 9.24 ± 0.65 tumeurs par animal, tandis que la multiplicité tumorale moyenne de la lignée contrôle SPRD- Cu3.II était de 10.88 ± 0.43 tumeurs par animal. Nous avons donc observé une réduction de la charge tumorale des animaux Congéniques 10 de 18% par rapport aux animaux contrôles. Les tests statistiques ont permis d’établir que cette différence est statistiquement significative (p=0.003). Il est à noter que ce trait n’avait pas été observé lors de l’analyse de liaisons. En ce qui concerne le phénotype d’agressivité, l’analyse de données nous a permis de mettre en évidence une réduction du taux moyen de croissance de la tumeur la plus rapide chez les animaux Congéniques 10 (N=33) par rapport à celui de la lignée parentale (N=25). Chez les Congéniques 10, les tumeurs les plus agressives ont montré en moyenne une vitesse de croissance de 0.53 ± 0.02 cm par semaine à comparer avec une moyenne de 0.72 ± 0.04 cm par semaine pour les tumeurs les plus agressives développées par les animaux de la lignée parentale SPRD-Cu3. La valeur de p obtenue lors de la comparaison des deux populations était de p≤0.001 (test des rangs de Mann-Whitney), ce qui nous a permis de dire que la réduction (26%) de la vitesse de croissance des tumeurs les plus agressives développées par les Congéniques 10 par rapport à celle de la lignée parentale est statistiquement significative.

La Figure 13 illustre cette observation. Les tumeurs les plus rapides chez les Congéniques 10 ont montré une vitesse de croissance intermédiaire entre celle des tumeurs les plus rapides et celle des tumeurs les plus lentes développées par les animaux SPRD-Cu3. Ces résultats confirment et complètent les analyses statistiques préalables : ils démontrent physiquement que la région bordée par les marqueurs D10Rat91 (9.8 Mb) et D10Rat135 (108.7 Mb) contient au moins un locus de sensibilité au cancer mammaire impliqué dans la détermination de la vitesse de croissance tumorale. Le QTL a été nommé Mcsta1 (Mammary cancer susceptibility, tumor aggressiveness 1) et sur base des règles de nomenclature des lignées congéniques chez le rat, la lignée congénique dérivée a été appelée ; SPRD-Cu3.WKY- Mcsta1 ou C10.Mcsta1.

Cette région est également impliquée dans le contrôle de la multiplicité tumorale mais elle a un effet modeste sur celle-ci.

L’analyse des données phénotypiques a également permis de mettre en évidence une

différence statistiquement significative entre les deux populations en terme de latence

tumorale. De manière surprenante les rats de la lignée congénique présentaient une latence

moins élevée que les rats contrôles SPRD-Cu3.II. Nous avons observé une latence moyenne

de 38.56 ± 1.18 jours pour les animaux congéniques (N=34) en comparaison à une latence

moyenne de 43.21 ± 1.71 jours pour les rats contrôles et la valeur p obtenue lors de la comparaison des deux populations était de 0.005. Le QTL Mcsta1 est donc également impliqué dans la détermination de la latence tumorale, mais pour ce trait, l’allèle WKY confère une certaine sensibilité au cancer mammaire (diminution du temps moyen d’apparition de la première tumeur).

2.1.2.6 Lignée congénique du chromosome 18

Nous avons construit une lignée congénique de rat SPRD-Cu3.WKY- D18Wox8/D18Rat44, celle-ci se caractérise par un segment WKY du chromosome 18 de rat de environ 54.4 Mb (RNO18). Ce segment couvre majoritairement l’intervalle de confiance du QTL identifié statistiquement sur le chromosome 18 qui a été associé au phénotype de vitesse de croissance tumorale (agressivité tumorale) (Figure 14). Dans un premier temps nous avons appelé cette lignée, Congénique 18. Il a été vérifié que les animaux étaient homozygotes SPRD-Cu3 pour l’ensemble des marqueurs anonymes situés dans les autres QTLs identifiés. Nous avons caractérisé cette lignée pour les trois phénotypes tumoraux à la génération N9F2 (Table 12).

Table 12 : Données phénotypiques des lignées congéniques C18.Mcstm2 (WKY / WKY), C18.Mcstm2 (SPRD-Cu3 / WKY) et de la population de référence SPRD-Cu3.I.

Phénotype

Multiplicité Latence Agressivité

Nom de la lignée N Nombre de tumeurs

p-value vs.

SPRD- Cu3.I

N Jours

p-value vs.

SPRD- Cu3.I

N Vitesse de croissance (cm/sem)

p-value vs.

SPRD- Cu3.I

SPRD-Cu3.I 4

8 11.23 ± 0.51 59 43.86 ± 0.95 59 0.71 ± 0.03

C18.Mcstm2

(WKY / WKY) 4

6 7.61 ± 0.45 ≤ 0.001 54 45.91 ± 1.27 0.220 52 0.73 ± 0.03 0.531 C18.Mcstm2

(SPRD-Cu3 / WKY) 8 10.13 ± 0.61 0,039 Power of test to low

14 47.21 ± 1.62 0.061 14 0.64 ± 0.04 0.396

N représente le nombre d’animaux dans la population. Les valeurs phénotypiques sont présentées sous forme de moyenne ± SE. p-value vs. SPRD-Cu3.II est la valeur p associée à la comparaison des deux populations. « Power of the test to low » signifie que la puissance du test statistique effectué est inférieure à la puissance désirée (0.8), la différence entre les populations étudiées ne peut donc pas être considérée comme significative.

L’analyse de données concernant le phénotype d’agressivité tumorale n’a pas révélé de

différence significative entre les animaux de la Congénique 18 (N=58) et ceux de la lignée

parentale SPRD-Cu3 (panel I) (N=59). En effet, la lignée Congénique 18 présentait une

vitesse de croissance moyenne des tumeurs les plus agressives pendant les premières semaines

de leur développement de 0.73 ± 0.03 cm par semaine, ce qui n’est pas statistiquement différent de celle de la lignée parentale sensible (0.7 ± 0.03 cm par semaine), (p=0.53). Ces deux populations ne sont donc pas distinctes en ce qui concerne le phénotype d’agressivité tumorale. Par contre, et de manière inattendue, nous avons noté une différence entre les deux lignées en terme de multiplicité tumorale. En effet, les individus de la Congénique 18 (N=46) ont développé en moyenne 7.61 ± 0.45 tumeurs par animal alors que la multiplicité moyenne des individus de la lignée parentale SPRD-Cu3 (panel I.) (N= 48) était de 11.23 ± 0.51 tumeurs par animal. Les animaux de la Congénique 18 présentent donc une réduction du nombre de tumeurs formées par animal d’environ 32% par rapport à la lignée parentale. Un test de la somme des rangs de Mann-Whitney a permis de mettre en évidence que la différence entre les deux populations est statistiquement significative (p≤0.001). Ces résultats démontrent que la région bordée par les marqueurs D18Wox8 (32.5 Mb) et D18Rat44 (86.9 Mb) contient au moins un locus impliqué dans la détermination de la multiplicité tumorale, nous l’avons appelé Mcstm2 (Mammary cancer susceptibility, tumor multiplicity 2) (Stieber et al., 2007). Sur base des règles de nomenclature des lignées congéniques chez le rat, la lignée congénique dérivée a été appelée ; SPRD-Cu3.WKY-Mcstm2. Afin de faciliter la lecture, nous utiliserons l’annotation suivante : C18.Mcstm2. L’observation d’un phénotype de multiplicité dans cette lignée congénique intégrant une région initialement associée au phénotype d’agressivité, peut s’expliquer par le fait que l’effet de cette région sur la multiplicité se situe à un niveau statistiquement faible et qui avait en conséquence été ignoré en première analyse (Quan et al., 2006).

2.2 La lignée double congénique des chromosomes 5 et 18

Les résultats concernant le phénotype de multiplicité montrent que l’effet de résistance cumulé des lignées C5.Mcstm1 et C18.Mcstm2 rend presque totalement compte de la différence entre les deux lignées parentales. En effet, le pourcentage de réduction de multiplicité tumorale dû aux allèles WKY de Mcstm1 (RNO5) et de Mcstm2 (RNO18) sont respectivement de 65% et 33%. En additionnant ceux-ci on peut faire l’hypothèse d’une réduction de 98% dans une lignée double congénique Mcstm1 + Mcstm2. Compte tenu de ceci, nous avons créé et analysé une lignée dite double congénique afin de déterminer si les QTLs Mcstm1 et Mcstm2 affectent le phénotype de multiplicité tumorale de manière additive.

Etant donné que le QTL localisé sur chromosome 18 avait été décrit par les analyses de liaison

comme étant lié au phénotype de vitesse de croissance tumorale, nous avons naturellement

aussi analysé le phénotype de la double congénique pour ce trait afin de tester la possibilité

que l’effet du QTL, apparemment perdu dans la lignée C18.Mcstm2, pourrait dépendre de la

présence des déterminant génétiques présents dans le QTL du chromosome 5.

2.2.1 Génération de la lignée double congénique

La première étape de la génération de la lignée double-congénique a consisté à croiser des rats de la lignée C5.Mcstm1 avec des rats de la lignée C18.Mcstm2 (production de la génération F1). Ensuite, les animaux F1 ont été croisés entre eux pour produire la génération F2 à partir de laquelle nous avons sélectionné après génotypage, les animaux présentant le plus grand nombre de marqueurs des deux régions d’intérêt à l’état homozygote WKY. Les animaux double congéniques homozygotes pour tous les marqueurs définissant les QTLs Mcstm1 et Mcstm2 ont été obtenus à la génération N9F4. Nous avons donc généré une lignée double congénique de rat SPRD-Cu3.WKY-D5Rat124/ Pla2g2a.D18Wox8/D18Rat44. Celle- ci est caractérisée par deux segments WKY, l’un situé sur le chromosome 5 (bordé par les marqueurs D5Rat124 (19.2 Mb) et Pla2g2a (157.6 Mb)) et l’autre situé sur le chromosome 18 de rat (bordé par les marqueurs D18Wox8 (32.5 Mb) et D18Rat44 (86.9 Mb)). L’homozygotie SPRD-Cu3 des marqueurs anonymes situés dans les autres QTLs identifiés a été vérifiée.

2.2.2 Caractérisation de la lignée double congénique pour la sensibilité au cancer mammaire induit au DMBA

Nous avons phénotypé la lignée double-congénique SPRD-Cu3.WKY-D5Rat124/

Pla2g2a.D18Wox8/D18Rat44 pour la sensibilité au cancer mammaire induit au DMBA à la génération N9F5 (Table 13).

Table 13 : Données phénotypiques de la lignée double congénique DC5.18. Mcstm1 & Mcstm2/Mcsta2, des lignées congéniques C5.Mcstm1 et C18.Mcstm2 /Mcsta2 et des populations de référence SPRD-Cu3.I et SPRD-Cu3.II.

Phénotype

Multiplicité Latence Agressivité

Nom de la

lignée N Nombre de

tumeurs

p-value vs. SPRD-

Cu3 N Jours p-value

vs. SPRD-

Cu3 N Vitesse de

croissance (cm/sem)

p-value vs. SPRD-

Cu3 SPRD-Cu3.I 4

8 11.23 ± 0.51 59 43.86 ± 0.95 59 0.71 ± 0.03

SPRD-Cu3.II 1

7 10.88 ± 0.43 25 43.21 ± 1.71 25 0.72 ± 0.04

C5.Mcstm1 1

4 3.93 ± 0.64 ≤ 0.001¹ 16 53.38 ± 2.45 ≤ 0.001 16 0.65 ± 0.08 0.250 C18.Mcstm2 /

Mcsta2 4

6 7.61 ± 0.45 ≤ 0.001 54 45.91 ± 1.27 0.220 52 0.73 ± 0.03 0.531 DC5.18.

Mcstm1 &

Mcstm2/Mcsta2 3

3 5.00 ± 0.44 ≤ 0.001¹ ² 36 55.61 ± 2.27 ≤ 0.001¹ ³ 36 0.37 ± 0.03 ≤ 0.001¹

¹ p (vs.C18. Mcstm2/Mcsta2) ≤ 0.001. ² p (vs. C5. Mcstm1) = 0.184.

³ p (vs. C5. Mcstm1) = 0.692.

p (vs. C5. Mcstm1) = 0.002.

Les lignées congéniques simples ont été comparées à la population SPRD-Cu3.I et la lignée double congénique a été comparée à la population SPRD-Cu3.II. N représente le nombre d’animaux dans la population. Les valeurs phénotypiques sont présentées sous forme de moyenne ± SE. p-value vs. SPRD-Cu3 est la valeur p associée à la comparaison de la population de la lignée étudiée par rapport à la population de la lignée de référence.

Les animaux de la double-congénique ont montré une multiplicité tumorale équivalente à celle des animaux de la lignée congénique C5.Mcstm1 (Table 13). En effet, les animaux double-congéniques (N=33) ont développé en fin d’expérience en moyenne 5.0 ± 0.44 tumeurs par animal, ce qui n’est pas statistiquement différent des valeurs de multiplicité des animaux C5.Mcstm1 (3.93 ± 0.64 tumeurs par animal) (p=0.184). Les deux QTLs de multiplicité détectés sur les chromosomes 5 (Mcstm1) et 18 (Mcstm2) n’ont donc pas d’effet additif.

En ce qui concerne le phénotype de vitesse de croissance tumorale, la situation est

toute différente. L’analyse des données phénotypiques nous a permis de mettre en évidence

une réduction de 49% du taux moyen de croissance de la tumeur la plus rapide chez les

animaux double congéniques (N=36) par rapport à celui de la lignée parentale SPRD-Cu3

(N=25) (panel II). En effet, les animaux double congéniques présentaient une vitesse de

croissance moyenne des tumeurs les plus agressives qui était de 0.37 ± 0.03 cm par semaine à

comparer à celle de la lignée parentale sensible (0.72 ± 0.04 cm par semaine). Un test de la

somme des rangs de Mann-Whitney a permis de mettre en évidence que la différence entre les

deux populations est statistiquement significative (p≤0.001). Rappelons qu’aucune des deux

lignées congéniques simples ne présentait de réduction de la vitesse de croissance tumorale

par rapport à la lignée sensible SPRD-Cu3. La Figure 15 illustre ces observations. Les

tumeurs qui se développent le plus rapidement chez les animaux double congéniques ont une

vitesse de croissance équivalente à celle des tumeurs qui se développent le moins rapidement

chez les animaux contrôle SPRD-Cu3, alors que les tumeurs les plus rapides développées par

les simples congéniques des chromosomes 5 et 18 ont une vitesse de croissance équivalente à

celle des tumeurs les plus rapides développées par les animaux sensible SPRD-Cu3. Ces

résultats démontrent que les QTLs situés sur les chromosomes 5 et 18 interagissent de

manière synergique pour moduler la vitesse de croissance tumorale. Ils constituent également

une confirmation physique du fait que le QTL détecté sur le chromosome 18 par les analyses

de liaisons est impliqué dans la vitesse de croissance tumorale, bien que son effet ne puisse

être détecté dans la congénique simple du chromosome 18. La région du chromosome 18

contenant le QTL Mcstm2 contrôle donc à la fois la multiplicité tumorale et la vitesse de

croissance tumorale. Cependant les deux traits sont indépendamment modulés par la région du

chromosome 5 contenant le QTL Mcstm1, étant donné que l’allèle WKY du QTL Mcstm2 n’a

pas d’effet sur la multiplicité tumorale en présence de l’allèle WKY du QTL Mcstm1 alors que ces deux régions agissent de manière synergique sur la vitesse de croissance tumorale. Les phénotypes de multiplicité tumorale et de croissance tumorale sont au moins en partie indépendants, il est donc justifié de considérer que la région du chromosome 18 bordée par les marqueurs D18Wox8 (32.5 Mb) et D18Rat44 (86.9 Mb) contient deux QTLs et d’utiliser une dénomination distincte pour chacun d’eux. Nous avons dès lors appelé le QTL lié au phénotype de vitesse de croissance tumorale (agressivité tumorale) Mcsta2 (Mammary cancer susceptibility, tumor aggressiveness 2) et renommé la lignée congénique dérivée : SPRD- Cu3.WKY- Mcstm2/Mcsta2 ou C18. Mcstm2/Mcsta2. La lignée double congénique a été nommée SPRD-Cu3.WKY-Mcstm1.Mcstm2/Mcsta2 ou DC5.18. Mcstm1 & Mcstm2/Mcsta2.

Pour finir, les données phénotypiques ont également été analysées pour le phénotype de latence tumorale. Rappelons que lors de l’analyse des lignées congéniques simples C5.Mcstm1 et C18.Mcstm2, seule la lignée C5.Mcstm1 avait révélé une différence en terme de latence en comparaison avec la lignée parentale SPRD-Cu3 et que le locus Mcstm2 n’a pas été décrit comme étant lié au trait. C’est donc sans surprise que l’analyse des données phénotypiques de la double congénique nous a permis de mettre en évidence une augmentation statistiquement significative du temps moyen d’apparition de la première tumeur dans la double congénique en comparaison à celui de la lignée parentale SPRD-Cu3 (panel II), cette augmentation n’étant pas différente de celle observée dans la lignée congénique C5.Mcstm1 (Table 12). En effet, nous avons observé une latence moyenne de 55.61 ± 2.27 jours pour les rats de la lignée double congénique (N=36) à comparer à une latence moyenne de 53.38 ± 2.45 jours pour les rats C5.Mcstm1 (N=16) et une latence moyenne de 43.21 ± 1.71 jours pour les rats contrôles (N=25). La valeur de p obtenue lors de la comparaison des populations DC5.18. Mcstm1 & Mcstm2/Mcsta2 et SPRD-Cu3.II était de p≤0.001. Le QTL situé sur le chromosome 18 n’a donc pas d’effet sur le QTL de latence tumorale situé sur le chromosome 5 qui, à l’état WKY, confère une certaine résistance au cancer mammaire.

3. Application de la méthode du gène candidat

La taille des QTLs identifiés étant trop élevée pour que l’on puisse appliquer la

méthode classique du gène candidat de manière raisonnable à notre modèle, D. Stieber a

réalisé une comparaison des profils d’expression génique des lignées parentales sensible

SPRD-Cu3 et résistante WKY (Stieber, 2005). Lors de cette étude préalable, le profil

d’expression des gènes a été comparé au niveau des ARNm de glandes mammaires dans les

deux lignées parentales SPRD-Cu3 et WKY chez des femelles âgées de 55 jours non traitées au carcinogène DMBA. Il est à noter qu’il a été montré que la différence de sensibilité entre les deux lignées est spécifique du tissu, il était donc légitime d’étudier le tissu mammaire.

(Gould, 1986). L’analyse a été réalisée grâce à l’utilisation de puce à ADN « génome entier » (Gene Chip® d’Affymetrix, Rat Expression Set 230, puce RAE320A). A l’issue de cette étude, une liste de 288 gènes candidats, dont 150 sont surexprimés et 138 sont sous exprimés dans la lignée sensible par rapport à la lignée résistante, a été établie. Parmi ces 288 transcrits, 40 (hors EST) sont localisés dans l’un des QTLs identifiés statistiquement au laboratoire (Quan et al., 2006) et constituent par conséquent des candidats de choix. L’Annexe 5 reprend les résultats d’analyse pour ces 40 transcrits.

La troisième approche du présent travail a donc consisté à appliquer la méthode du gène candidat à notre modèle avec toutes les réserves liées au fait que les régions définies couvrent de grands segments génétiques. Pour ce faire nous avons déterminé les taux d’expression relatifs de gènes candidats dans les différentes lignées congéniques étudiées préalablement en appliquant la méthode de RT-PCR quantitative (qRT-PCR). Le choix des gènes à tester a été fait sur la base de la liste des 40 gènes différentiellement exprimés entre les lignées parentales SPRD-Cu3 et WKY et localisés dans les QTLs identifiés statistiquement, établie par D. Stieber. Dans un premier temps, nous avons sélectionné parmi cette liste de candidats, les transcrits dont les gènes sont localisés dans l’un des QTLs dont nous avons confirmé l’effet de sensibilité sur le phénotype dans une lignée congénique, à savoir les QTLs Mcstm1 (RNO5), Mcstl1 (RNO9), Mcsta1 (RNO10) et Mcstm2/Mcsta2 (RNO18). Cette sélection a abouti en une liste de 27 gènes dont 12 gènes sont localisés dans le QTL Mcstm1, 12 sont situés dans le QTL Mcsta1 et 3 le sont dans le QTL Mcstm2/Mcsta2.

Il est à noter qu’aucun gène exprimé de façon divergente n’a été localisé dans le locus Mcstl1

(RNO9). Ensuite, étant donné le coût engendré par l’application de la méthode de qRT-PCR,

nous avons encore réduit la liste des candidats à tester en nous basant sur leur fonction connue

et leur possible implication dans la détermination de la sensibilité au cancer mammaire. De

cette manière nous avons obtenu une liste de 5 gènes candidats. Notre choix s’est porté sur les

gènes Fabp3 (RNO5) (AOD : Rn00577366_m1), Pla2g2a (RNO5) (AOD :

Rn00580999_m1), Ccl2 (RNO10) (AOD : Rn00580555_m1), IL17b (RNO18) (AOD :

Rn01501362_m1) et Acaa2 (RNO18) (AOD : Rn00590503_m1). Nous avons également testé

la candidature de deux gènes ne figurant pas dans cette liste : TP53 (RNO10) (AOD TP53 :

Rn00755717_m1) et Pfn1 (RNO10) (AOD : Rn00821096_g1).

3.1 Analyse des taux d’expression de gènes candidats

Nous avons comparé les taux d’expression des sept gènes choisis dans le tissu mammaire d’animaux femelles issus de chacune des quatre lignées congéniques, C5.Mcstm1, C10.Mcsta1, C18.Mcstm2/Mcsta2 et DC5&18.Mcstm1&2/Mcsta2 et des deux lignées parentales SPRD-Cu3 et WKY. Les animaux étudiés étaient âgés de 55 jours et n’ont pas été traités au carcinogène DMBA. Les taux d’expression de ces gènes a été évalué par RT-PCR quantitative (qRT-PCR) en utilisant la méthode 5’nucléase (Taqman®). Nous avons normalisé le taux d’expression des gènes par rapport au gène de la β2-microglobuline (β2-M) (AOD : Rn00560865_m) qui a constitué le gène de référence et servi de contrôle endogène. Pour chaque transcrit étudié nous avons aussi déterminé le taux d’expression relatif du transcrit étudié dans un échantillon d’ARN de rat total commercial : toutes les valeurs obtenues lors de l’analyse des différentes lignées ont alors pu être calibrées par rapport à celui-ci. Enfin, pour chacune des lignées étudiées, au moins trois analyses d’échantillons indépendants (3 animaux) ont été effectuées et chacune d’elle a été réalisée en triple. Les résultats obtenus sont exprimés en terme de taux relatif d’expression (RE) ± l’erreur standard (SE). Un test de la somme des rangs de Mann-Whitney a été effectué grâce à l’utilisation du logiciel SigmaStat. Ceci nous a permis de comparer les données des lignées entre elles. Les résultats sont illustrés dans la Table 14.

Les variations observées pour 5 des 6 transcrits représentés sur la puce à ADN confirment les résultats obtenus lors de l’analyse des profils d’expression génique des deux lignées parentales. Rappelons que Pfn1 n’est pas représenté sur la puce à ADN utilisée. La seule exception concerne Fabp3 (« fatty acid binding protein 3 » RNO5 : 149.34 Mb) pour lequel nous avons noté une différence du taux d’expression entre les lignées parentales mais qui n’est pas statistiquement significative. Les résultats sont présentés dans la Table 14 et la Figure 17.

3.1.1 Gènes candidats localisés sur le chromosome 5

La comparaison des taux d’expression du gène Pla2g2a (« phospholipase A2, group IIA » RNO5 : 157.65 Mb) dans les différentes lignées nous a permis de mettre en évidence un effet en cis de la présence de l’allèle WKY du QTL Mcstm1 sur le taux d’expression du gène.

En effet, nous avons pu noter une sous-expression du gène (par rapport à la lignée SPRD-

Cu3) uniquement dans les lignées WKY, C5.Mcstm1 et DC5&18.Mcstm1&2/Mcsta2, c'est-à-

dire dans les lignées possédant le locus Mcstm1 à l’état WKY, en comparaison au taux

d’expression observé dans les lignées SPRD-Cu3 au locus (Table 14 et Figure 17). Les

différences observées entre les lignées WKY, C5.Mcstm1 et DC5&18.Mcstm1&2/Mcsta2 et

la lignée SPRD-Cu3 étaient statistiquement significatives (les valeurs de p sont reprises dans la Table 14).

3.1.2 Gènes candidats localisés sur le chromosome 10

De manière remarquable, aucune différence d’expression du gène TP53 (RNO10 : 56.4 Mb) n’avait été observée entre les lignées parentales SPRD-Cu3 et WKY lors de la comparaison des profils d’expression génique réalisée par D.Stieber (Stieber, 2005).

Cependant étant donné sa localisation au centre du segment différentiel définissant la congénique C10.Mcsta1 et son importance dans le processus de cancérisation, nous avons voulu assurer ces données en appliquant la méthode de qRT-PCR. Lors de la comparaison des taux d’expression relatif du gène TP53 entre les lignées parentales, nous n’avons pas mis en évidence de différence statistiquement significative du taux d’expression du gène entre les lignées parentales (Table 14).

Nous avons également testé la candidature du gène Pfn1 (« profiline 1 » RNO10 : 57.53 Mb). Le gène Pfn1 n’est pas représenté sur la puce RAE230A et compte tenu de sa localisation (Pfn1 est localisé au centre du segment différentiel définissant la congénique C10.Mcsta1) et du fait sa potentielle implication dans le processus de cancérisation (Janke et al., 2000), nous avons déterminé le taux d’expression du gène dans les différentes lignées d’intérêt. Les analyses ont révélé un effet en cis de la présence de l’allèle WKY du QTL Mcsta1 sur le taux d’expression du gène (Table 14 et Figure 17). En effet le taux d’expression relatif du gène Pfn1 dans la lignée congénique C10.Mcsta1 était intermédiaire à celui observé dans les lignées parentales. Les différences observées entre les trois lignées SPRD-Cu3, WKY et C10.Mcsta1 étaient statistiquement significatives (les valeurs de p sont reprises dans la Table 14). Par contre les taux d’expression relatifs du gène Pfn1 dans les autres lignées congéniques ne sont pas différents du taux observé dans la lignée parentale sensible SPRD- Cu3.

D’autre part, lors de l’analyse du gène Ccl2 (« chemokine (C-C motif) ligand 2 »

RNO10 : 70.25 Mb) nous avons confirmé la différence du taux d’expression du gène Ccl2

entre les lignées parentales, le gène étant largement sous exprimé dans la lignée résistante

WKY. Les analyses des lignées congéniques ont révélé un effet général de la présence de

l’allèle WKY de chaque QTL sur le taux d’expression relatif du gène. En effet, à l’instar de la

situation dans la lignée résistante, le gène Ccl2 est sous-exprimé dans chacune des 4 lignées

congéniques en comparaison au taux d’expression dans la lignée parentale sensible (Figure

17). Les différences observées étaient statistiquement significatives (les valeurs p sont reprises

dans la Table 14). La sous-expresssion de Ccl2 pourrait donc être associée à la résistance au

cancer mammaire.

3.1.3 Gènes candidats localisés sur le chromosome 18

Le premier gène localisé sur le chromosome 18 dont nous avons testé la candidature est IL17b (« interleukin 17b » RNO18 : 57.53Mb). Nous avons noté une différence statistiquement significative du taux d’expression du gène entre les lignées parentales, mais les taux relatifs d’expression du gène dans les lignées congéniques n’étaient pas différents de celui observé dans la lignée parentale sensible. La présence des allèles WKY aux trois locus ne semble donc pas avoir d’effet sur l’expression de ce gène (Table 14).

Par contre, les analyses des lignées congéniques ont révélé un effet général de la

présence de l’allèle WKY de chaque QTL sur le taux d’expression du gène Acaa2 (« acetyl-

Coenzyme A acyltransferase 2 » RNO18 : 71.59Mb). En effet, à l’instar de la situation dans la

lignée résistante, le gène Acaa2 est surexprimé dans chacune des 4 lignées congéniques en

comparaison au taux d’expression dans la lignée parentale sensible SPRD-Cu3. Les

différences observées étaient statistiquement significatives (les valeurs p sont reprises dans la

Table 14). Cette situation ressemble à celle du gène Ccl2.