doi:10.1684/abc.2020.1585
Pour citer cet article : Veauville A, Acquaviva-Bourdain C, Nowoczyn M, Read MH, Corne C, Dessein AF, Van Noolen L, Garnotel R, Minet-Quinard R. Recommandations
Recommandations concernant l’analyse de la chromatographie des acides aminés
Recommendations for aminoacids chromatography analysis
Alice Veauville1
Cécile Acquaviva-Bourdain1 Marie Nowoczyn2
Marie-Hélène Read2 Christelle Corne3
Anne-Frédérique Dessein4 Laetitia Van Noolen3 Roselyne Garnotel5 Régine Minet-Quinard6
Groupe des biologistes de la Société franc¸aise pour l’étude des erreurs innées du métabolisme (SFEIM)
1Service de biochimie et biologie moléculaire Grand Est – UM Pathologies métaboliques, érythrocytaires et dépistage périnatal, Centre de biologie Est, Hospices civils de Lyon, Bron, France
2Laboratoire de biochimie, CHU Caen, Caen, France
3Laboratoire des maladies héréditaires du métabolisme, Service de biochimie, biologie moléculaire et toxicologie environnementale, CHU Grenoble-Alpes, Grenoble, France
4UF Métabolisme général et maladies rares, Centre de biologie pathologie génétique, CHU Lille, Lille, France
5Laboratoire de
biochimie-pharmacologie-toxicologie, Pôle de biologie territoriale, CHU Reims, Reims, France
6Service de biochimie et génétique moléculaire, CHU Clermont-Ferrand, Clermont-Ferrand, France
Article rec¸u le 26 juin 2020, accept ´e le 04 ao ˆut 2020
Résumé. Le diagnostic biochimique des maladies héréditaires du métabolisme nécessite la détection et l’identification simultanées d’un grand nombre de composés, d’où l’intérêt des profils métaboliques. La chromatographie des acides aminés permet l’identification et la quantification de plus de quarante composés. Dans le cadre du processus d’accréditation des examens de biolo- gie médicale selon la norme NF EN ISO 15189, le groupe issu de la Société franc¸aise pour l’étude des erreurs innées du métabolisme (SFEIM) recom- mande une démarche pour accréditer la chromatographie des acides aminés.
Les paramètres de validation et des recommandations sont discutés dans ce cadre spécifique.
Mots clés : chromatographie des acides aminés, accréditation, norme, ISO 15189
Abstract. Biochemical diagnosis of hereditary metabolic diseases requires the detection and simultaneous identification of a large number of compounds, hence the interest in metabolic profiles. Amino acid chromatography allows the identification and quantification of more than forty compounds. As part of the accreditation process for medical biology examinations according to standard NF EN ISO 15189, the group from SFEIM recommends an approach to accredit amino acid chromatography. Validation parameters and recommendations are discussed in this specific framework.
Key words: aminoacids chromatography, accreditation , ISO standard, ISO 15189
Le dosage des acides aminés (AA) est une analyse quantitative réalisable dans le sang, les urines, le liquide céphalorachidien (LCR) et le liquide amniotique (LA).
Elle participe à l’évaluation du bilan nutritionnel mais son principal intérêt réside dans le diagnostic et le suivi des ami- noacidopathies qui constitue un sous-groupe des maladies
héréditaires du métabolisme (MHM) pouvant se révéler à tous les âges.
La méthode historiquement utilisée pour le dosage des AA est la chromatographie échangeuse d’ions (CEI) avec détec- tion photométrique après dérivatisation post-colonne par la ninhydrine. Elle tend à être remplacée par la chromatogra- phie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) ou à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS).
Il en a découlé une certaine hétérogénéité de techniques qui ne sont pas l’objet de cette étude.
Correspondance :R. Minet-Quinard
Encadré 1
Recommandations pré-analytiques
Sang Urines LCR
Prélèvement / recueil
Phase aiguë À défaut, à jeun
Nourrisson : avant le biberon Enfant/adulte :≥6h jeûne
Première miction après un épisode aigu Première miction du matin préférentiellement, sur présentation chronique Ne pas faire sur recueil de 24 heures
Prélèvement sanguin simultané pour réalisation d’une chromatographie des AA plasmatiques
Prélèvement sanguin simultané indispensable pour réalisation d’une chromatographie des AA plasmatiques (délai max. entre les deux : 2 heures)
Contenant Tube avec héparinate de lithium (avec ou sans gel)
Buvard : séchage : 2 heures température ambiante, abri de l’humidité
Contenant plastique sans conservateur ni acide
Tube sec sans conservateur
Aucun contenant n’est proscrit si le prélèvement est«précieux» Volume minimum 50-200L
de plasma/500L sang
2 spots 500L 150-300L
(10 gouttes) Acheminement Réfrigéré, 3 heures
Laboratoire extérieur : -20◦C (plasma)
7 jours température ambiante
Réfrigéré, 3 heures Laboratoire extérieur : -20◦C
Réfrigéré, 3 heures Laboratoire extérieur : -20◦C
Centrifugation +4◦C / +4◦C +4◦C
Conservation -20◦C +4◦C ou -20◦C -20◦C -20◦C
Liquide amniotique : recommandations similaires à celles des urines ; AA : acides aminés.
Étape pré-analytique (Encadré 1)
Indications et modalités de prélèvement
Le dosage des AA plasmatiques est indiqué pour explorer le métabolisme intermédiaire. Les contextes clinico-biologiques sont variés, citons par exemple l’hyperammoniémie, les encéphalopathies épileptiques, les atteintes hépatiques, les troubles de l’humeur ou du comportement. . .
Le milieu biologique de choix est le plus souvent le sang (plasma ou sang séché). Les urines, sont surtout utiles pour rechercher une anomalie de transport des AA. L’analyse du LCR, présente un intérêt dans certaines atteintes neurolo- giques.
Le dosage des AA peut également être réalisé dans le surnageant de LA pour certains diagnostics prénataux.
Le sang séché sur buvard est actuellement plutôt utilisé pour le suivi des aminoacidopathies (phénylcétonurie, leucinose. . .), et dans ce cas concerne le dosage d’un AA isolé ou d’un petit nombre d’AA.
Dans le cadre de la juste prescription et pour une inter- prétation pertinente du profil des AA, toute demande doit être accompagnée de renseignements cliniques, diététiques
et thérapeutiques (formulaire disponible sur le site internet www.sfeim.org).
Les prélèvements doivent être réalisés prioritairement en période aiguë de décompensation ou, au décours d’un jeûne qui doit être au minimum de 6 heures. Chez le nouveau-né, les prélèvements doivent être réalisés juste avant un biberon.
Pour les urines, en raison de la stabilité des AA, un recueil des urines de 24 heures n’est pas recommandé, un recueil de la miction au décours d’un épisode aigu ou de la première miction matinale en cas de présentation chronique est à privilégier.
Les prélèvements sanguin, urinaire et du LCR (s’ils se jus- tifient) doivent être réalisés si possible simultanément, un écart maximal de deux heures est acceptable [1].
Nature de l’échantillon et conditions de prélèvement
Plasma
Le plasma hépariné est le milieu biologique de première intention. Pour la CEI, l’EDTA [2] et l’héparine injectable si elle contient du métabisulfite [3] sont à proscrire car à l’origine d’interférences. L’EDTA est également décon-
Tableau 1. Conservation des échantillons.
Nature de l’échantillon/recueil Sang Urines LCR
Sang total Plasma Plasma déprotéinisé
Buvard
Température Ambiante 1h 1h 5h 2 semaines 6h 5h
+4◦C 3h 3h 48h 5 mois 24h 24h
-20◦C / 1 an*/** 1 an** 1 an (+ dessicant) 1 an*/** 6 mois
-80◦C / 1 an 2 ans / 1 an 2 ans
Synthèse des données bibliographiques [3, 5, 6] et des journées qualité de la SFEIM. *<1 semaine pour les acides aminés soufrés ; **<6 mois pour glutamate et glutamine, au-delà de 6 mois interpréter la somme de ces deux acides aminés.
seillé pour les techniques par spectrométrie de masse en raison d’un risque d’extinction du signal variable selon les méthodes [4]. La présence de gel séparateur est sans impact sur le profil des AA [4]. Le volume minimal requis est de 500L pour le sang et de 50 à 200L pour le plasma.
Sang séché sur buvard
Le sang capillaire ou le sang veineux doit être déposé immé- diatement et en une seule fois sur une seule face d’un papier-filtre marqué CE (Whatman 903 ou Ahlstrom grade 226). Après avoir déposé une goutte de sang par cercle sur le buvard, celui-ci doit sécher 2 heures à température ambiante et à l’abri de l’humidité. La quantité minimale est de deux spots correctement remplis, les tâches devant être symétriques au recto et au verso. L’acheminement au labo- ratoire se fait dans une enveloppe, ne pas mettre le buvard directement dans un sachet plastique.
Urines et LA
Ces recueils doivent être réalisés dans un contenant plas- tique sans conservateur ni acide. Un volume minimum de 1 mL est requis.
LCR
Le LCR doit être prélevé dans un tube sec sans conservateur.
Un volume minimal de 150 à 300L (environ 10 gouttes) est requis.
Acheminement – Délai – Prise en charge au laboratoire
Sang total/plasma/urines/liquide amniotique/LCR Des études de stabilité des AA en fonction de la tempé- rature (ambiante, +4 ◦C, -20 ◦C) et de la matrice (sang total, plasma, plasma déprotéinisé, urines) ont été réalisées par le groupe de travail [4], les résultats sont décrits dans le tableau 1. Dans le LCR et le LA, les stabilités sont compara- bles à celles observées dans les urines [1]. En conséquence nous recommandons que l’acheminement des échantillons sang, urine, LCR et LA se fasse à une température réfrigérée et dans les 3 heures qui suivent le prélèvement. Une centrifu-
gation à +4◦C est recommandée mais reste possible jusqu’à +16◦C [4]. Après décantation, les échantillons conservés à +4◦C s’ils ne sont pas analysés directement doivent être congelés à -20◦C (ou à une température inférieure) dans les 3 heures suivantes.
Concernant les urines, il est nécessaire de procéder à un dosage de créatinine pour calculer les rapports AA/créatinine. Il est recommandé de réaliser une bandelette urinaire (au minimum pH, nitrites, corps cétoniques) afin d’adapter l’interprétation en fonction de certaines contami- nations [1].
La présence d’un ictère ou d’une lactescence ne doit pas induire un rejet de l’échantillon car ils ne sont pas source d’interférences analytiques. Une hémolyse macroscopique doit être signalée dans la mesure où des variations signifi- catives peuvent être observées : libération par les cellules d’AA (taurine, aspartate, glutamate) et d’enzymes impli- quées dans le métabolisme des AA (arginase) [2] ; pour les LCR hémorragiques le résultat est souvent ininterprétable compte tenu de la différence importante de concentration en certains AA entre le sang et le LCR.
Sang séché sur buvard
Compte tenu des conditions de conservation (tableau 1), il est recommandé de transporter le buvard sec à tempé- rature ambiante, dans une enveloppe et de l’analyser dans les 15 jours suivant le prélèvement. Il convient d’éviter une humidité excessive qui pourrait entraîner une dilution des taches de sang [7, 8]. Les buvards qui ne sont pas analysés directement doivent être conservés à +4◦C (tableau 1).
Les recommandations concernant les critères d’acceptation des buvards (rejeter les tâches superposées, quantité insuffi- sante, imprégnation incomplète du buvard) et la localisation du poinc¸onnage (préférentiellement à la périphérie de la tâche [9] sont celles émises dans le cadre du dépistage néonatal [10].
Pour les échantillons dits « précieux » (prélèvements lors d’un épisode critique ou chez un nourrisson par exemple), quelle que soit la matrice, le profil des AA doit être ana-
lysé, y compris s’ils font l’objet d’une non-conformité pré-analytique. Les résultats pourront être rendus avec une dérogation du biologiste responsable. Pour l’interprétation de la chromatographie, le biologiste pourra alors s’aider des variations observées en cas de non-respect des conditions de conservation, accessibles sur le site de la SFEIM [1].
Conservation à long terme – Ré-analyse Plasma/urines/LCR/LA
Les modalités et les durées de conservation à long terme sont décrites dans le tableau 1. Le plasma congelé à - 20 ◦C peut être conservé pendant 1 an mais dans ce cas l’interprétation de glutamate et glutamine portera sur la somme de ces 2 AA et la cystine ne pourra être exploitée.
Sang séché sur buvard
Les buvards peuvent être analysés après une conservation longue (1 an), s’ils ont été stockés à -20 ◦C avec un dessicant [5].
Étape analytique
Actuellement, trois méthodologies sont classiquement utili- sées pour le dosage quantitatif des AA : la CEI, la LC-MS et la LC-MS/MS. Concernant les techniques par spectrométrie de masse, elles peuvent utiliser soit des kits commerciaux [11] soit des méthodes développées en interne par le labo- ratoire [12-16].
Principes et caractéristiques des techniques (Encadré 2)
Chromatographie échangeuse d’ions
Le dosage des AA par CEI est réalisé sur un analyseur dédié. Les AA sont séparés sur une colonne de résine synthétique échangeuse de cations. L’échantillon préala- blement déprotéinisé est dilué dans un tampon à pH 2,2.
Les AA sous forme cationique déplacent les ions Li+ de la résine et s’y fixent plus ou moins fortement en fonction de leur degré d’ionisation. La séparation des AA est obtenue en augmentant progressivement le pH et la force ionique des tampons et en faisant varier la température de la colonne. En sortie de colonne, les AA sont dérivatisés à chaud par une solution de ninhydrine donnant une coloration pourpre, ou jaune pour les imines. L’intensité de la coloration proportionnelle à la concentration est mesurée à 570 et 440 nm. Le rapport des absorbances 570 nm/440 nm est utilisé comme critère d’identification en plus du temps de rétention. Le dosage quantitatif des AA est réalisé grâce à une solution de calibration comportant tous les AA à quantifier (tableau 2) et inclus dans chaque série.
Les principaux avantages de cette technique sont sa limite de détection, de l’ordre de quelquesmol/L, qui est suffi-
Encadré 2
Caractéristiques des techniques applicables au dosage
des acides aminés
CEI LC-MS et
LC-MS/MS
Analyseur dédié O N
Kits commerciaux O O
Méthodes«maison» N O
Déprotéinisation échantillons
O O
Préparation échantillons
Simple et rapide
Dérivation Oui (ninhydrine) Pas obligatoire
Calibration externe O O
Etalons internes O O
Durée d’analyse 2h30 10-30 min
Sensibilité +++ +++
Spécificité + +++
O : oui ; N : non.
CEI : chromatographie échangeuse d’ions ; LC-MS : chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse ; LC-MS/MS : chromatogra- phie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem.
sante pour le diagnostic des erreurs innées du métabolisme et la préparation des échantillons qui est simple et rapide.
Les inconvénients majeurs de cette méthode sont la durée de l’analyse (2h30), le manque de spécificité, son coût, l’utilisation d’un analyseur dédié et l’identification des interférences qui implique de disposer d’un personnel qua- lifié et expérimenté.
Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse ou à la spectrométrie de masse en tandem L’échantillon est mélangé à une solution d’étalons internes avant déprotéinisation. Il est ensuite dérivatisé ou non avant d’être analysé. Le principe de la quantification repose sur l’utilisation d’une gamme de calibration comportant tous les AA à quantifier et le calcul du rapport entre le signal de l’AA à doser sur celui de son étalon interne (isotope stable ou molécule chimiquement très proche).
Les avantages des méthodes couplées à la spectromé- trie de masse sont un temps d’analyse court (10 à 30 minutes) et une plus grande spécificité dans l’identification des molécules à doser en particulier pour les techniques avec détection par spectrométrie de masse en tandem. Leur inconvénient est lié à la présence de molécules isobares ou
Tableau 2. Liste des acides aminés (AA) à quantifier.
AA et dérivés indispensables pour le diagnostic et le suivi des aminoacidopathies
Autres AA et dérivés à rendre en fonction du contexte si la technique le permet Panel commun (nutrition
et maladies métaboliques)
Panel minimal spécifique aux maladies métaboliques
Alanine Acide aminoadipique 1-méthyl-histidine
Arginine Acide argininosuccinique 3-méthyl-histidine
Asparagine Acide delta-aminolévulinique 4-hydroxyglutamate
Acide aspartique Allo-isoleucine Acide alpha-aminobutyrique
Citrulline Glycylproline (ou autres dipeptides) Acide bêta-aminoisobutyrique
Cystine Homocitrulline Acide formiminoglutamique
Glutamine Homocystine et/ou cystathionine Acide pipécolique
Acide glutamique Hydroxyproline Acide pyroglutamique
Glycine Sulfocystéine et/ou taurine Adénosylhomocystéine
Histidine Sulfure double cystéine-homocystéine Adénosylméthionine
Isoleucine Bêta-alanine
Leucine Diméthylglycine
Lysine DOPA
Méthionine GABA
Ornithine Hydroxykinurénine
Phénylalanine Hydroxytryptophane
Proline N-aspartylglucosamine
Sérine Phosphoéthanolamine
Thréonine Phosphosérine
Tyrosine Porphobilinogène
Valine Pyrroline-5-carboxylate
Saccharopine Sarcosine Tryptophane Panel commun (nutrition
et maladies métaboliques)
Quantification à rendre systématiquement Panel minimal spécifique
aux maladies métaboliques
AA à identifier impérativement pour le diagnostic des aminoacidopathies et à savoir évaluer quantitativement pour leur suivi thérapeutique.
isomères lorsqu’elles ne sont pas résolues par la séparation chromatographique.
Préparation des échantillons et des solutions de calibrations
Pour toutes les techniques, les échantillons doivent être déprotéinisés par précipitation par l’acide sulfosalicylique ou un solvant organique. Le volume d’échantillon injecté est faible de l’ordre de 50L.
Pour les techniques utilisant la spectrométrie de masse, une solution d’étalons internes constituée habituellement d’AA marqués par des isotopes stables (préparée à par- tir de composés purs ou de mélanges commerciaux) est ajoutée en quantité fixe avant déprotéinisation à tous les échantillons (standard, contrôle, inconnu). S’il n’existe pas d’étalon interne spécifique d’un AA, la quantification est
réalisée avec un étalon interne de structure la plus proche de la molécule à doser.
La calibration (un niveau de calibration pour la CEI et au minimum deux pour les méthodes de masse) est préparée à partir de solutions de mélange d’AA commercialisées (ex : Wako ou Sigma). Pour les AA pour lesquels il n’existe pas de solution de calibration commerciale, une solution aqueuse spécifique est préparée par le laboratoire à partir des composés purs lyophilisés.
Organisation des séries et gestion des urgences Les échantillons sont analysés par série. Chaque série doit être encadrée par des contrôles internes de qualité (CIQ). La taille et la fréquence des séries sont à définir par chaque laboratoire en fonction de l’organisation interne, du nombre d’analyses réalisées et de la stabilité des réactifs.
La technique utilisée doit permettre de répondre aux situations d’urgence métabolique.
Vérification technique d’une série
Dans tous les cas les intégrations des pics et leur identifi- cation est vérifiée par le technicien.
Pour la CEI une attention particulière sera apportée à la présence de pics surnuméraires et à la co-élution de certains AA (sulfocystéine/phosphosérine, cys- tine/acide pipécolique/saccharopine, leucine/acide argininosuccinique. . .) ou de certaines molécules théra- peutiques (exemple : antibiotiques) ; l’analyse des rapports des aires aux longueurs d’onde 570 nm/440 nm pourra être discriminante.
Pour la spectrométrie de masse, la vérification technique consiste dans un premier temps à vérifier le temps de réten- tion des molécules et l’intégration des pics, paramétrés sur le logiciel.
Pour les 3 techniques, les résultats des échantillons de patients peuvent être libérés si les résultats des 2 CIQ quan- titatifs de début et fin de série sont acceptés selon les règles de gestion des CIQ établies au laboratoire.
Validation de méthodes (Encadré 3)
Selon la norme NF EN ISO 15189 [17]], la validation de méthodes pour le dosage des AA plasmatiques correspond à une portée B ou une portée A si un kit commer- cial homologué pour l’appareil est utilisé, et répond à un processus simple. Compte tenu de l’absence d’effet matrice (Cf. &3.5.11), un seul SH Form pourra être réa- lisé pour le plasma, les urines et le LCR et le LA.
Les laboratoires s’aideront du SH GTA 14 rev01 [18]
ainsi que de leur procédure générale de validation des méthodes.
Ce groupe de travail propose des recommandations plus précises concernant la mise en œuvre de la validation de méthodes, compte tenu de la durée et du coût de l’analyse.
Il propose également des recommandations concernant les limites d’acceptabilité pour les différentes perfor- mances à atteindre, les données de la littérature étant très pauvres.
Chaque laboratoire doit inclure dans sa validation de méthode, une maîtrise de risques. L’évaluation et la gestion du risque sont propres à chaque laboratoire.
Une validation de méthode sera réalisée pour chaque AA rendu par le laboratoire.
Évaluation de la répétabilité
Nous recommandons d’évaluer la répétabilité sur au moins 6 injections du même échantillon et à partir d’au moins 2 échantillons de concentrations différentes. L’objectif de
coefficient de variation (CV) recommandé par le groupe des biologistes de la SFEIM doit être inférieur à 10 % [19].
Évaluation de la fidélité intermédiaire
Nous recommandons d’évaluer la reproductibilité d’au moins 2 échantillons de concentrations différentes dans au moins 6 séries différentes. L’objectif recommandé par le groupe des biologistes de la SFEIM est d’obtenir au mini- mum un CV<15 % [19]. Il est également possible d’utiliser les données Ricos qui existent pour certains AA.
Évaluation de la variabilité inter-opérateurs
La variabilité inter-opérateur peut être évaluée par le suivi des CIQ et l’obtention de résultats conformes quels que soient les opérateurs.
Évaluation de la justesse et de l’exactitude
Il n’est pas possible d’évaluer la justesse puisqu’il n’existe pas d’organisme de CIQ proposant une externalisation des CIQ.
L’exactitude doit être évaluée à partir des résultats des échantillons externes de qualité (EEQ) de l’année précé- dente.
Évaluation de la spécificité analytique
Les méthodes avec détection par spectrométrie de masse permettent de s’affranchir, en couplage avec la chroma- tographie liquide, de la plupart des interférences surtout pour celles utilisant la spectrométrie de masse en tan- dem en utilisant des transitions spécifiques. Cependant, il convient de se méfier des isobares et isomères et par exemple d’obtenir la résolution de la leucine, l’isoleucine et l’allo-isoleucine.
Pour la CEI, le rapport des aires des pics à 570 nm et 440 nm doit être documenté et comparé à des valeurs de références obtenues en matrice surchargée.
Évaluation de l’incertitude de mesure
L’incertitude de mesure (IM) peut être calculée en utilisant : – l’approche proposée par le guide technique SH GTA 14 [18] utilisant les résultats des CIQ et des EEQ. Cepen- dant, l’étendue du domaine de mesure étant très importante, le nombre d’enquêtes d’EEQ annuel faible et l’absence de concordances entre les niveaux de concentration des EEQ et des CIQ, cela limite la pertinence du résultat obtenu ;
– le calcul dulong-termCV [20].
Dans la littérature, à l’exception des travaux de Corte [21]
et de Ricos [22], il existe peu de données concernant ces IM. Le groupe de biologistes de la SFEIM recommande à chaque laboratoire de surveiller l’évolution de cet indicateur plutôt que de le comparer à un objectif.
Évaluation de l’intervalle de mesure
Chaque laboratoire doit déterminer ses limites de détection, de quantification et de linéarité, ces limites étant propres
Encadré 3
Recommandations pour la validation de méthode
Méthode d’évaluation Objectifs
Répétabilité 2 échantillons de concentrations différentes 6 injections/échantillon/1 série
CV<10 % Fidélité intermédiaire 2 échantillons de concentrations différentes
1 injection/échantillon/6 séries
CV<15 %
Variabilité inter-opérateurs Quantitatif : suivi des CIQ /
Justesse NA /
Exactitude Exploitation des EEQ (qualitatif et quantitatif) / Spécificité analytique CEI : rapport 440/570 nm
SM : NA
/
Incertitude de mesure Cf SH GTA 14 ou calcul dulong-termCV
Corteet al.[21] ou Ricoset al.[22]
Limite de détection 8 injections phase mobile LOD = 3xET
CV<10 %
Limite de quantification 8 injections phase mobile LOQ = 10xET
OU
plus faible point de la gamme de calibration pour lequel la concentration calculée pourra s’exprimer avec un CV<20 %
CV<15 %
Limite supérieure de linéarité Dilution d’un échantillon surchargé Adapté aux besoins cliniques Contamination inter-échantillons 1 séquence = injection de 3 échantillons
de concentration élevée suivis de 3 échantillons de concentration faible
Séquence répétée 3 fois
% contamination<CV de répétabilité
Stabilité des réactifs Suivi a posteriori des CIQ /
Interférences CEI : rapport 440/570 nm
SM : NA
/
CEI : chromatographie échangeuse d’ions ; CIQ : contrôle interne de qualité ; CV : coefficient de variation ; EEQ : échantillon externe de qualité ; ET : écart-type ; LOD : limite de détection ; LOQ : limite de quantification ; NA : non applicable ; SM : spectrométrie de masse.
à la technique et au matériel (analyseur dédié ou non).
L’intervalle de mesure devra être adapté aux besoins diag- nostiques.
La limite de détection peut se déterminer avec 8 injections de phase mobile. Elle sera égale à 3 fois l’écart-type des résultats obtenus pour chaque AA.
La limite de quantification sera égale à 10 fois l’écart-type obtenu avec ces 8 injections. Elle peut également corres- pondre au plus petit point de la gamme de calibration pour lequel la concentration calculée s’exprimera avec une fidé- lité (CV%) de 20 %.
La limite supérieure de linéarité sera définie par défaut comme étant égale au dernier point de la gamme de calibration, elle pourra être supérieure mais devra alors
être définie par des tests de dilution d’échantillons surchargés.
Évaluation de la contamination inter-échantillons Compte tenu du coût et de la durée de l’analyse, le groupe recommande d’évaluer la contamination inter-échantillons, en analysant un échantillon de concentration élevée, trois fois consécutivement suivi d’un échantillon de faible concentration également analysé trois fois et de répéter trois fois cette séquence. Le taux de contamination calculé selon la formule décrite dans le SH GTA 01 doit être inférieur au CV de répétabilité.
En cas de contamination inter-échantillons, des règles de repasse des échantillons seront définies.
Évaluation des interférences
Pour la CEI, la présence d’interférence peut être identi- fiée en cas de tracé chromatographique incorrect (pic non symétrique, épaulement de pic) et de rapport des aires de pic 570/440 nm non cohérent avec ceux relevés dans la solution de calibration.
La présence de pics interférents liés au paracétamol ou à certains antibiotiques est fréquemment retrouvée dans les urines pour la CEI.
Pour les techniques utilisant la spectrométrie de masse, il n’est pas utile de réaliser des essais afin d’étudier les interférences, puisqu’il s’agit d’une méthode par dilution isotopique.
Évaluation de la stabilité des réactifs
La stabilité des réactifs est indiquée par le fournisseur pour les réactifs commerciaux, une trac¸abilité des dates d’utilisation et de péremption de ces réactifs ainsi que des lots réactifs doit être mise en place. Pour les solutions pré- parées par le laboratoire, la stabilité des réactifs peut être évaluée en analysant a posteriori le suivi des CIQ.
Évaluation de l’effet matrice
Un groupe de biologistes de la SFEIM a étudié l’effet matrice selon la méthode des ajouts dosés. Pour chacune des matrices testées (plasma, urine, LCR), des échantillons de 2 niveaux de concentration en AA ont été analysés et comparés à des solutions aqueuses de même niveau de concentration. Pour chaque AA, un graphe des concentra- tions mesurées dans les solutions aqueuses en fonction des concentrations mesurées dans le plasma ou l’urine ou le LCR a été établi. L’équation des droites obtenues était de type y = ax + b et les coefficients directeurs (a) étaient compris entre 0,90 et 1,10, témoignant donc d’une absence d’effet matrice et justifient la réalisation d’un seul SH Form pour l’ensemble des types d’échantillons et pour toutes les techniques. Cette absence d’effet matrice s’explique en par- tie par le prétraitement des échantillons (déprotéinisation puis dilution en tampon) et est cohérent avec l’utilisation d’une solution aqueuse d’AA comme solution de calibra- tion commune à l’ensemble des matrices. Enfin les CIQ et EEQ commercialisés sont obtenus exclusivement à par- tir d’une matrice plasmatique, ce qui limite l’évaluation de certaines performances telles que l’IM sur les urines ou le LCR.
La validation de méthode sera réalisée en portée A en cas d’utilisation de kits commerciaux sinon en portée B selon un processus simple. Compte tenu de l’absence d’effet matrice, un SH Form pour l’ensemble des matrices sera rédigé.
Évaluation de la qualité et suivi des performances Contrôles internes de qualité
Chaque laboratoire choisit son fournisseur de CIQ (com- mercialisés par différentes sociétés : MCA laboratory
SKML, Recipe). Il est recommandé d’utiliser au moins deux niveaux de concentrations différentes. Chaque labo- ratoire définit sa stratégie de gestion des CIQ (fréquence, niveaux, bornes d’acceptabilité. . .) dans sa procédure de gestion des CIQ.
Toutes les actions entreprises suite à un résultat de CIQ non conforme doivent être tracées selon la procédure interne de chaque laboratoire.
Évaluation externe de la qualité
L’ERNDIM (European research network for evaluation and improvement of screening, diagnosis and treatment of inherited disorders of metabolism) propose une évaluation externe de la qualité pour les AA selon 4 modalités : – un programme quantitatif « Amino acid » : huit échantillons plasmatiques sont à analyser durant l’année.
L’évaluation porte sur la performance analytique du dosage d’un large panel d’AA préalablement défini ;
– un programme « Special assay in dried blood » : dix buvards imprégnés de sang total sont transmis par an ; – un programme qualitatif «Cognitive amino acids» (trois à six enquêtes/an). Actuellement en phase pilote, chaque enquête est élaborée à partir d’un cas clinique et de valeurs d’AA, les participants devant conclure sur le diagnostic de MHM et les compléments d’exploration biologique à réaliser.
Suivi de performances
Les valeurs de temps de rétention et/ou de concentra- tions et/ou d’aires des pics de plusieurs AA (au choix des laboratoires) du poolet/ou de la calibration pourront être systématiquement relevées dans un formulaire spécifique et le calcul annuel du CV de ces paramètres permettra d’étudier le vieillissement du système chromatographique et d’évaluer la robustesse de la technique.
De plus le suivi de la fidélité intermédiaire, de l’exactitude, de l’IM, l’analyse de la conformité des EEQ et le taux de CIQ rejetés peuvent être utilisés pour le suivi des perfor- mances de la méthode.
Post-analytique (Encadré 4)
Délai de rendu des résultats
Toute demande de chromatographie d’AA dans un contexte d’urgence métabolique doit être justifiée par un clinicien senior compétant en maladies métaboliques, le labora- toire doit pouvoir garantir un délai de rendu de résultat de 48 heures maximum (hors week-end). En dehors de ce contexte, il convient de réaliser l’analyse dans les quinze jours suivant le prélèvement.
Encadré 4
Recommandations post-analytiques
Délai de rendu de résultats
•En contexte d’urgence : 48 heures (hors week-end et jour férié) suivant le prélèvement et sur prescription d’un métabolicien senior
•Hors contexte d’urgence :<15 jours Modalités de rendu de résultats
•Commentaire formulé par un biologiste habilité
•Résultat quantitatif des acides aminés de 1reintention systématiquement mentionné dans le compte rendu
• Acides aminés de seconde intention mentionnés dans le compte rendu s’ils sont présents sur le chromatogramme, ainsi que leur quantification ou semi- quantification en vue du suivi
• Interprétation globale du profil : absence de seuils d’alerte par acide aminé
Modalités de rendu des résultats
Le profil des AA sera interprété par un biologiste quali- fié et habilité qui rendra une conclusion systématiquement retranscrite sur le compte rendu. Ce dernier devra au mini- mum mentionner les AA de première intention, listés dans letableau 2, ainsi que leur résultat quantitatif. Les résultats sont à interpréter en fonction des intervalles de référence établis par le laboratoire ou vérifiés à partir de données publiées (par exemple [23-25]) et des variations de concen- trations des AA les uns par rapport aux autres.
La présence d’un AA de seconde intention devra être men- tionnée dans le compte rendu, ainsi que sa quantification ou semi-quantification en vue du suivi. Il est également possible de rendre certains AA non indispensables au dia- gnostic des aminoacidopathies, si la technique le permet (tableau 2).
Il n’a pas été défini des seuils d’alerte par AA car c’est le profil chromatographique dans sa globalité qui permet de suspecter avec une forte probabilité une aminoacidopathie.
Interférences et sources de variation du profil
Le statut nutritionnel, les traitements médicamenteux, des situations physiologiques ou pathologiques autres qu’une MHM peuvent impacter les résultats, et doivent donc être pris en compte lors de l’interprétation biologique du profil des AA. En conséquence, il est indispensable de disposer avec tout échantillon d’un formulaire de renseignements cliniques, diététiques et thérapeutique. Pour une interpréta- tion pertinente des résultats et dans le cadre de la prestation de conseil, un dialogue clinico-biologique peut s’avérer nécessaire.
Conservation post-analytique
Le stockage des données brutes et des résultats doit répondre aux exigences de chaque laboratoire.
Il est recommandé de conserver les échantillons primaires tout en accordant une vigilance particulière aux AA sen- sibles tels que glutamate, glutamine et cystine [1].
Remerciements. Les auteurs remercient les relecteurs : Stéphanie Badiou, Jean-Franc¸ois Benoist, Isabelle Bentz- de-Bretagne, Caroline Moreau, Chris Ottolenghi et Isabelle Redonnet.
Liens d’intérêts :les auteurs déclarent ne pas avoir de lien d’intérêts en rapport avec cet article.
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