Introduction
La rougeole est une maladie infectieuse d’origine virale causée par le virus de la rougeole membre de la famille des paramyxoviridae. Cette pathologie virale pose un problème de santé publique. On recense chaque année environ 30 millions de cas à travers le monde (WHO, 2005) et 454.000 décès dont la moitié se concentre en Afrique (WHO, 2006). Malgré que le virus soit sérologiquement monotypique, l’analyse génétique des différentes souches a montré que ce dernier présente des variabilités aussi bien génétiques qu’antigéniques.
Il existe, en effet, 8 clades (A-H) et 23 génotypes décrits jusqu’à présent (OMS, 2005).
Génotypage du virus de
la rougeole par PCR en temps réel:
Cas des souches virales isolées au Maroc
pendant la saison 2004-2005
Résumé: Le génotypage du virus de la rougeole (VR) est un outil important dans la surveillance de la rougeole. Il permet d’identifier l’origine du virus, ses voies de transmission et d’évaluer les programmes de vaccination. Vu l’importance du génotypage du VR dans le programme de l’élimination de la rougeole, une technique rapide a été développée. Cette technique se base sur l’identification des génotypes par PCR en temps réel, les différents génotypes sont distingués par leur température de fusion (Tm). Cette méthode constitue une alternative efficace pour l’investigation des épidémies de rougeole dans les pays en phase d’élimination.
Les souches du virus de la rougeole isolées pendant la saison 2004-2005 ont été identifiées par PCR en temps réel puis confirmées par le séquençage des gènes H et N. cette étude, a permis de montrer une rapide diversification des génotypes qui circulent au Maroc. Parmi ces génotypes, certains sont importés de l’Afrique de l’Ouest et de l’Europe, d’autres correspondent à la souche autochtone. Ces résultats montrent la nécessité de renforcer la couverture vaccinale et d’introduire une nouvelle stratégie de vaccination dans le but d’éliminer la maladie.
Mots clés : Rougeole, vaccination, génotypage, PCR en temps réel, température de fusion.
Amal Alla1, Diane Waku-Kouomou2
1 Laboratoire de référence pour la rougeole, Institut National d’Hygiène –Rabat- Maroc 2 Inserm U40469365- Lyon- France
Article de synthèse
Stratégie vaccinale de lutte contre la rougeole
L’absence de réservoir animal pour le virus de la rougeole rend l’éradication de cette maladie possible.
L’OMS vise actuellement son élimination qui signifie l’interruption de la transmission du virus dans un pays donné. L’éradication à l’échelle mondiale sera le résultat de l’élimination du virus dans tous les pays. A cet effet, en 1988, l’OMS a lancé l’initiative de l’élimination de la rougeole à l’horizon de l’an 2010. La stratégie de lutte contre la rougeole est basée sur le maintien d’une couverture vaccinale supérieure à 95% et l’administration de 2 doses de vaccin dont la première doit être administrée entre l’âge de 9 et 15 mois. Cependant, la vaccination à l’âge de neuf mois pose le problème d’interférence avec les anticorps maternels ce qui réduit l’efficacité du vaccin à 85%. Cette efficacité peut atteindre 90-95% quand la vaccination est pratiquée entre 12 et 15 mois. Le problème de l’âge de la vaccination se pose essentiellement dans les pays en voie de développement où la vaccination à l’âge de 9 mois s’impose vu le risque élevé de contagiosité. Les programmes de vaccination devraient choisir entre une vaccination précoce avec comme conséquence une faible immunité ou augmenter l’âge de la primo-vaccination avec le risque d’augmenter la mortalité chez les nouveaux nés.
La stratégie d’élimination de la rougeole se base aussi sur la mise en place d’un système de surveillance capable de recenser tous les cas suspects et d’assurer aussi bien une investigation épidémiologique que biologique.
Diagnostic de la rougeole.
Les méthodes de diagnostic de la rougeole se basent essentiellement sur le titrage des IgM par des techniques enzymatiques ELISA ou EIA, la détection de l’antigène par immunofluorescence, l’isolement du virus sur des lignées cellulaires sensibles ou la détection du génome par RT- PCR. La technique la plus recommandée par l’OMS dans le cadre du programme d’élimination de la rougeole, est le test sérologique basé sur le dosage des IgM anti-rougeoleux par la méthode de capture de l’anticorps et de détection par le test ELISA ou EIA. C’est une technique efficace, simple et offre l’avantage de la rapidité des résultats (6h).
Le diagnostic biologique de la rougeole permet de confirmer le diagnostic clinique car les signes cliniques de cette maladie ne sont pas des critères suffisants pour poser un diagnostic efficace. En effet, il existe plusieurs agents pathogènes responsables des maladies à fièvres éruptives qui pourront induire en erreur le diagnostic clinique et par conséquent les données épidémiologiques d’où l’intérêt de procéder à la confirmation par des tests efficaces.
Epidémiologie de la rougeole au Maroc
Au Maroc, la surveillance épidémiologique de la rougeole a débuté en 1975. L’analyse des données épidémiologiques montre que cette maladie est endémique. En effet, avant la généralisation de la vaccination, le nombre de cas déclaré annuellement
était compris entre 80.000 et 140.000 puis en 1981, le programme élargi de vaccination a introduit le vaccin contre la rougeole (1 dose à l’âge de 9 mois) ce qui a permis une réduction considérable des cas de rougeole.
En effet, pendant les 10 dernières années, le nombre de cas déclaré a varié entre 1300 et 2700 cas pendant les phases endémiques et entre 7000 et 11.000 cas pendant les phases épidémiques (fig 1).
Fig 1: Distribution des cas de rougeole, 1975-2005, Maroc. (DELM, 2005) Toutefois, jusqu’à présent, la rougeole reste endémique avec des cycles épidémiques de 4-5 ans. De plus, il a été noté que
actuellement, les enfants âgés de 5-15 ans sont les plus atteints par la maladie (fig 2).
Fig 2 : Distribution des cas suspects de rougeole selon les groupes d’âge, Maroc ,1998-2005. (DELM, 2005) Jusqu’à l’année 2001, les cas suspects de rougeole étaient classés essentiellement sur la base du diagnostic clinique.
Afin d’optimiser l’analyse des données épidémiologiques, le ministère de la santé en collaboration avec l’OMS ont introduit la confirmation biologique des cas suspects de rougeole. Cette activité est assurée par le laboratoire de virologie à l’Institut National d’hygiène. En effet, les cas suspects sont confirmés par la recherche des IgM anti- rougeole par le test d’ELISA indirect (Dade Behring , Germany). Dans le même cadre, le laboratoire assure le diagnostic différentiel par la recherche des IgM anti- rubéole et procède à l’isolement du virus de la rougeole sur la lignée cellulaire B95-a.
L’un des objectifs principaux de l’analyse des données épidémiologiques et biologiques est de permettre le choix de la meilleure stratégie vaccinale pour éliminer la rougeole au Maroc. L’analyse des données épidémiologiques a montré que la stratégie vaccinale basée sur l’administration d’une seule dose a réduit considérablement le nombre de cas de rougeole mais n’a pas permis l’interruption de la transmission du virus. Pour palier à ce problème, les responsables du programme national d’immunisation ont introduit une deuxième dose de vaccin à l’âge de 6 ans en 2003.
Génotypage des souches marocaines par la technique de séquençage
Le génotypage des souches du virus de la rougeole joue un rôle important dans l’évaluation des stratégies vaccinales, il permet de documenter l’interruption de la transmission des souches autochtones et d’identifier l’origine du virus.
La technique standard de génotypage est basée sur le séquençage des gènes les plus variables du génome, il s’agit de la totalité du gène d’hémagglutinine et les 450 pb codant pour la partie C-terminale du gène de la nucléoprotéine N (OMS, 2001).
Dans le but d’identifier le génotype autochtone responsable des épidémies de rougeole au Maroc, une étude a été effectuée sur des souches isolées pendant les cycles épidémiques déclarés en 1998 et 1999. Les résultats de cette étude ont montré qu’un seul génotype circulait et était responsable des épidémies qui ont fait plus de 17.000 cas, il s’agit du génotype C2. (Alla et al, 2002).
Génotypage des souches marocaines par PCR en temps réel
En 2006, l’équipe de Waku-Kouomou et al, a développé une nouvelle technique de génotypage par PCR en temps réel pour palier aux inconvénients de la méthode standard. En effet, le séquençage des gènes H et N est une technique « d’or » mais l’inconvénient réside dans la lourdeur des manipulations techniques surtout quand il s’agit d’analyser un nombre élevé d’échantillons pendant les pics épidémiques. Le principe de cette technique repose sur l’amplification du virus par des amorces spécifiques à chaque génotype. La détection du produit PCR est réalisée par PCR en temps réel en utilisant le marqueur de fluorescence SYBR- GREEN. 7 paires d’amorces ont été sélectionnés pour amplifier les génotypes A, B2, B3.1, B3.2, C2, D7 et D8 (tableau 1) (Waku et al, 2006 ; Alla et al, 2006). Les différents génotypes sont distingués par leur température de fusion (Tm). La Tm est obtenue après chauffage du produit de PCR de 60°C à 95°C pendant 20 min.
Amorces1 Géno-
type Séquences nucléotidiques2
Taille du produit PCR (pb) Warms As
A nt1574-1596*,5’GAAGGTCAGCTGACGCCCTGgaT3’
Warms Aas nt1644*-1675,5’GATTTCTGTCATTGTACACatT3’ 104 Warms B2s
B2 nt1400-1422*,5’GATGGGGGGCAAGGAGGATtcA3’
Warms B2as Nt1500*-1522,5’GTGTGCCGGTTGGAAGATGccTG3’ 125 Warms B3.1s
B3.1 nt1417-1439*5’GACAGGAGGGTCAAACAGtcC3’
Warms B3.1as nt1587*-1608,5’GGCTTGCAGCCTAAGCAGGcgA3’ 196 Warms B3.2 s
B3.2 nt1417-1439*,5’GAGGACAGGAGGGTCAAACtcG3’
Consensus B3.2 as nt1510-1158,5’CTAGGGGTGTGCCGGTTGG3’ 119 Warms C2 s
C2 Nt 1292-1314*, 5’CAGAGAATTGCAATGCATACTtgA3’
Warms C2 as Nt 1450*-1472,5’GCCCGGTTTCTCTGTAGCTCagT3’ 185 Consensus D7 s
D7 Nt 1442-1464 5’GAGAAGCCAGGGAGAGCTACAGAG3’
Warms D7 as Nt 1572-1594, 5’GCAGGGCGTCAGCTGACCGTgcG3’ 155 Warms D8s
D8 nt 1322-1351 5’GACAGAGTCGGGGAGAAGCCAGGGAGAcgA3’
Warms D8 as nt1375-13995’GATGGGCAGCTC TCGCATCGCTatA3’ 77
Tableau 1: Amorces spécifiques pour la réaction ARMS-PCR en temps réel
* Indique la position du SNP selon Cattaneo et al., 1989 1 : a et as indique respectivement le sens positif et négatif de la transcription du gène
2 : Mismatches introduits dans les amorces de la réaction ARMS-PCR en temps réel sont représentés par la lettre minuscule et sont soulignés.
La sélection des amorces se fait suite à un alignement multiple des 450 nucléotides du gène N puis l’identification de SNP
(single nucleotide polymorphisme) spécifique à chaque génotype. Afin d’optimiser l’amplification, les amorces sont choisies pour amplifier des fragments entre 100 et 200 pb sauf pour le génotype D8 où la taille de l’amplicon est de 78 pb. La spécificité de la technique est améliorée par l’introduction de mismatches au niveau des deux nucléotides du côté 5’du SNP (tableau 1) (Waku-Kouomou et al, 2006).
Dix huit souches marocaines isolées pendant les épidémies de 2004-2005 ont été analysées par PCR en temps réel puis confirmées par une analyse phylogénétique. Les amorces choisies pour détecter les génotypes A, C2 et D8 sont hautement spécifiques vu que seul le génotype correspondant est amplifié. Les Tm sont spécifiques pour chaque génotype.
Les amorces correspondant au génotype B3.2 réagissent préférentiellement avec ce dernier mais amplifient en même temps le génotype C2 ainsi que le génotype A mais avec une efficacité moindre (fig3).
Température de fusion (°C)
Génotypes 1ere étude* 2éme étude**
A 83.2 83.5
B3.2 86.2 86.5
C2 82.4 82.7
D7 85.7 86
Tableau 2 : Variation des températures de fusion au sein d’un même génotype génotype.*Waku et al, 2006,** Alla et al, 2006
Fig 3: Génotypage par PCR en temps réel des souches
appartenant aux génotypes A, B3.2 et C2. Les courbes de fusion correspondant à ces génotypes ainsi que leur Tm sont indiquées ci-dessous (A,B et D). La courbe de dissociation C) montre que les amorces Warms B3.2 amplifie préférentiellement le génotype B3.2 et avec une moindre efficacité les génotypes C2 et A.
Un résultat similaire a été observé pour le génotype D7.
Toutefois, les produits PCR des différents génotypes peuvent être différenciés par leur température Tm (fig 3 [D])
L’analyse des courbes de fusion et des Tm a montré qu’il
Taxonomie
Le virus de la rougeole est un virus enveloppé, à ARN simple brin de polarité négative, appar- tient à l’ordre des Mononégavirales et la fa- mille des Paramyxoviridae. Ce virus est classé dans le genre des Morbillivirus, il s’apparente aux virus de la peste bovine, le virus des pe- tits ruminants et du chien (maladie de Carré).
Récemment, plusieurs Morbillivirus ont été identifiés chez les mammifères aquatiques dont les phoques et les cétacés tels que les dauphins et les marsouins.
Structure
Le virus de la rougeole est un virus pléimor- phique, d’une taille comprise entre 100 et 300 nm de diamètre, l’enveloppe est formée d’une bicouche lipidique issue de la membrane cellu- laire dans laquelle sont insérées deux glycopro- téines transmembranaires : l’Hémagglutinine H et la protéine de fusion F. La membrane est associée à une troisième protéine virale disposée sur la face interne : la protéine de la matrice M.
L’ARN viral est encapsidé par la nucléoprotéine N sous forme d’une particule ribonucléoproté- ique hélicoïdale et nucléocapside. A la nucléo- capside sont également associées la protéine « large » L et la phosphoprotéine P qui forment les deux sous unités de la polymérase virale nécessaire à la transcription et à la réplication.
Organisation du génome
Le génome du virus de la rougeole est constitué d’un brin monocaténaire d’ARN, non segmen- té, d’une taille d’environ 16.000 nucléotides. Il est essentiellement occupé par les séquences géniques disposées dans l’ordre N-P-M-F-H- L auxquelles s’ajoute une région leader en 3’
et de petites séquences inter- géniques de 3 nu- cléotides. Aucune recombinaison homologue n’a été détectée dans le génome du virus de la rougeole.
Pathologie
Le virus se dissémine sous forme d’aérosol et
entre par les voies respiratoires. Les cellules
épithéliales, trachéales et bronchiques constitu-
ent le premier site de réplication avant une pre-
mière dissémination par les macrophages au
niveau des ganglions lymphatiques. Le virus
se dissémine dans tous les organes lymphoïdes
ainsi que les autres organes tels que la peau,
existe une variation des Tm de l’ordre de 0.3°C par rapport aux valeurs reportées lors d’une étude antérieure ( Waku- kouomou et al,2006 ; Alla et al,2006) (fig 4) (tableau 2)
Fig 4 : Exemple de variation des températures de fusion (génotype C2) entre deux essais techniques réalisés en des temps différents.
Cette faible variation serait probablement due aux fluctuations de la concentration des sels tel que le MgCl2. En effet, on suppose que le changement de kit d’analyse au cours des essaies techniques pourrait être à l’origine de cette variation.
Les résultats du génotypage par PCR en temps réel ont été confirmé par le séquençage des gènes N (fig. 5) et ont montré que plusieurs génotypes ont co-circulé au Maroc entre 2004 -2005, il s’agit des génotypes : A, C2, B3.2, D7 et D8 (fig. 3, 5).
Les souches appartenant au génotype A sont généralement associées aux souches vaccinales. Dans cette étude il s’agit de patients récemment vaccinés.
Les souches du génotype B3.2 isolées au Maroc présentent
Fig 5 : Analyse des souches isolées au Maroc en 2004-2005 en se basant sur les séquences nucléotidiques du gène N. Les séquences des souches marocaines ont été comparées aux souches de référence de l’OMS (WHO, 2001). L’arbre a été établi par le programme Clustal X version 1.8, utilisant l’algorithme Neighbor-Joining, boostrap100 replicates.
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BIBLIoGRaPhIE
les reins, le tractus gastro-intestinal et le foie.
La dissémination correspond à une période d’incubation de 10 à 14 jours au cours desquels apparaissent la fièvre, les signes respiratoires, une conjonctivite et les tâches de Koplik, le dernier signe étant l’exanthème caractéristique.
L’exanthème dure entre 3 et 5 jours et est com- posé de cellules capillaires endothéliales infec- tées et d’un filtrat de cellules mononuclées.
Données épidémiologiques
Malgré la présence d’un vaccin efficace, la rougeole est considérée comme l’une des prin- cipales cause de la mortalité infantile dans de nombreux pays du monde. Avant la généralisa- tion de la vaccination en 1960, on comptait 135 millions de cas annuels entraînant 6 millions de décès. Après la mise en place d’une politique de vaccination de masse dans la majorité des pays, la mortalité infantile a nettement diminuée. En effet, le taux de mortalité annuel est passé de 871.000 cas de décès en 1999 à 453.000 en 2004. 95% de la mortalité infantile se focalise dans les pays Africains et le sud de l’Asie. Il reste ,cependant encore de très nombreux cas de rougeoles en raison d’une couverture vaccinale non optimale mais aussi en raison de l’échec de la vaccination dans près de 15 % des cas quand la vaccination est pratiquée à l’âge de 9 mois.
une forte homologie avec les souches isolées à Ghana (Hanses et al, 1999) et en Gambie (Kouomou et al.,2002) ce qui laisse suggérer qu’il s’agit d’une importation de l’Afrique de l’ouest.
En effet, vu la position géographique du Maroc, de nombreux immigrés des pays de l’Afrique subsaharienne transit par le nord du Maroc vers l’Europe.
Les génotypes D7 et D8 circulent dans de nombreux pays de part le monde et ont été récemment isolées en France, l’Espagne et l’Inde (Mosquera et al., 2005, Ramamurty et al., 2006 ; Zandotti et al., 2004)
Les souches marocaines appartenant au génotype D7 sont identiques aux souches isolées en France Zandotti et al., 2004), celles du génotype D8 présentent une forte homologie avec les souches isolées en Espagne en 2003 (Mosquera et al., 2005). Les fréquents échanges entre l’Europe et le Maroc dus au tourisme ou l’immigration peut expliquer la circulation de ces génotypes.
L’analyse des souches de rougeole qui circulent au Maroc pendant la saison 2004-2005 a montré une rapide diversification des génotypes due probablement à des importations de l’Europe et de l’Afrique sub-saharienne, en plus de la circulation du génotype autochtone. Cette situation montre la nécessite de mettre en place une bonne stratégie vaccinale en vue d’éliminer la rougeole au Maroc.
La circulation des génotypes importés souligne l’importance de l’implication effective de tous les pays si on veut atteindre l’objectif de l’éradication de cette maladie d’ici l’an 2010.
Conclusion
Le génotypage par PCR en temps réel constitue une approche rapide de l’investigation des épidémies de rougeole et une alternative efficace qui pourra être appliquée facilement dans la plupart des laboratoires dans les pays en voie de développement.
