THESE. présentée. 2 l'universite DE TECHNOLOGIE DE COHPIEGNE. pour obtenir. le titre de DOCTEUR EN BIOLOGIE. per. Florence HELLIO

THESE

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présentée

2 l'UNIVERSITE DE TECHNOLOGIE DE COHPIEGNE

pour obtenir

le titre de DOCTEUR EN BIOLOGIE

per

Florence HELLIO

SYNTHESE PEPTIDIQUE PAR CATALYSE EN2YMATIQUE : APPLICATION NOUVELLE A LA RADIOSYNTHESE TOTALE D'UNE HORMONE, LA LEUCINE-ENKEPHALINE

TRITIEE, A L'AIDE DE LA CARBOXYPEPTIDASE Y

Soutenue le 21 octobre 1986 devant le jury coapoeé de

MM. J.N BARBOTIN P. FROMAGEOT B. RIBADEAU-DUMAS M. THELLIER D. THOMAS

F. HELLIO

"Synthèse peptidique par catalyse enzymatique : application nouvelle à la radio- synthèse totale d'une hormone, la leucine-enképhaline t r i t i é e , à l'aide de la carboxypeptidase Y".

Ce mémoire décrit une nouvelle méthode de radiomarquage d'hormones peptidiques, par voie enzymatique.

L'enzyme utilisée, une protease, la carboxypeptidase Y, est capable dans certaines conditions de catalyser la formation de liaisons peptidiques.

Cette propriété a été appliquée à la synthèse totale d'un pentapeptide, la leucine-enképhaline t r i t i é e , synthèse au cours de laquelle chaque acide aminé radioactif a été incorporé.

La molécule marquée ainsi obtenue a une radioactivité spécifique de 139 Ci/mnole. Ses propriétés biologiques (liaison aux récepteurs et immuno- réactivité) sont identiques à celles de leucine-enképhalir,e native.

A paraître dans : Thèse de Docteur en Biologie dont la soutenance est prévue le 21 Octobre 1986 à l'Université de Technologie de Compiègne.

THESE

présentée

i 1'UNIVERSITE DE TECHNOLOGIE DE COHPIEGNE

pour obtenir

le titre de DOCTEUR EN BIOLOGIE

per

Florence HELLIO

SYNTHESE PEPTIDIQUE PAR CATALYSE ENZYMATIQUE : APPLICATION NOUVELLE A LA RADIOSYNTHESE TOTALE D'UNE HORMONE, LA LEUCINE-ENKEPHALINE

TRITIEE, A L'AIDE DE LA CARBOXYPEPTIDASE Y

Soutenue le 21 octobre 1986 devent le Jurv coapoii de :

MM. J.N BARBOTIN P. FROMAGEOT B. RIBADEAD-DUMAS M. THELLIER D. THOMAS

Je remercie Monsieur Comar qui m'a a c c u e i l l i e dans son Département.

Je t i e n s à exprimer ma reconnaissance â Monsieur Fromageot qui m'a permis de r é a l i s e r c e t t e thèse dans le Service q u ' i l d i r i g e .

Je remercie sincèrement Monsieur Morgat qui m'a f a i t p r o f i t e r de son expé- rience dans le domaine du marquage des p e p t i d e s .

Q u ' i l me s o i t permis d'exprimer ma profonde g r a t i t u d e à Monsieur Gueguen qui m'a consacré beaucoup de son temps. Les nombreuses discussions dont i l m'a f a i t p r o f i t e r ont é t é un soutien efficace l o r s de la r é a l i s a t i o n de c e t t e t h è s e .

Je t i e n s à remercier Messieurs Ribadeau-Dumas et Thomas d ' a v o i r accepté d ' ê t r e l e s rapporteurs de ce mémoire.

J ' a d r e s s e également mes remerciements à Messieurs Barbotin et T h e l l i e r qui ont bien voulu juger ce t r a v a i l .

Enfin, je remercie chaleureusement l'équipe* de Monsieur Morgat :

0. Lebourguals, G. Lecocq, R. Genêt, J . Roy a i n s i que toutes l e s personnes du Service de Biochimie pour leur accueil et leur sympathie.

ABREVIATIONS

B.A.W. n-butanol/acide acétique/eau Boc ter-butyloxycarbonyle Bz Benzoyle

C.C.M. chromatographic sur couche mince Cl Curie (1 Ci - 2.22.101 2 dpm)

CL.H.P. chromatographic liquide haute performance CPD-Y carboxypeptidase Y

cpm coup par minute

DFP diisopropylfluorophosphace DMF dlméthylformamide

dpm désintégration par minute (dpm - cpm x rendement du compteur de radioactivité)

fmole fento-mole (10 mole) Pd/c palladium sur charbon PdO oxyde de palladium

p-HMB parahydroxymercuribenzoate P.M. poids moléculaire

pmole picomole (10 * mole)

PMSF phénylmétanesulfonylfluorure R.A.S. radioactivité spécifique (Ci/mmole) Rf distance de rétention

R.I.A. dosage radioimmunologique TEA triéthylamine TEAF formiate de triéthylamine TFA acide trifluoroacétique

Tris trihydroxyméthylaminométhane

- 2 -

INTRODUCTION

A c t u e l l e m e n t on a s s i s t e à une a c c é l é r a t i o n des r e c h e r c h e s en e n d o c r i n o l o g i e j u s t i f i é e p a r l ' i m p o r t a n c e d e s m o l é c u l e s é t u d i é e s , l e s h o r m o n e s , qui i n t e r v i e n - n e n t dans l a p l u p a r t d e s p r o c e s s u s p h y s i o l o g i q u e s e t p a t h o l o g i q u e s . Parmi c e s f a c t e u r s de r é g u l a t i o n f i g u r e n t nombre de p o l y p e p t i d e s . Leur i s o l e m e n t s ' a v è r e s o u v e n t d i f f i c i l e en r a i s o n de l e u r f a i b l e c o n c e n t r a t i o n t l s s u l a l r e e t de l e u r n a t u r e c h i m i q u e q u i l e s r e n d e n t v u l n é r a b l e s aux p r o t e a s e s l i b é r é e s d è s l e s p r e - m i è r e s é t a p e s des e x t r a c t i o n s .

Dès l o r s que c e s o b s t a c l e s s o n t f r a n c h i s e t que l ' o n d i s p o s e de l ' h o r m o n e , de nombreuses q u e s t i o n s d o i v e n t ê t r e é l u c i d é e s :

- d'abord l o c a l i s e r au niveau t i s s u l a i r e puis c e l l u l a i r e les s i t e s de l i a i - son de l'hormone,

- i d e n t i f i e r ces s i t e s , l e s dénombrer et é t u d i e r leurs c a r a c t é r i s t i q u e s , - déterminer l ' a f f i n i t é de l'hormone pour son récepteur,

- mesurer la concentration du peptide tant dans les conditions normales qu'au cours de s i t u a t i o n s pathologiques.

Un des moyens de d é t e c t e r une hormone et de mesurer sa concentration esc d ' i n t r o d u i r e un isotope radioactif au sein de la molécule.

Le radioélément u t i l i s é doit respecter le maintien des propriétés physico- chimiques et biologiques de l'hormone et l u i conférer une r a d i o a c t i v i c é s p é c i - fique compatible avec une détection dans les conditions de concentration physiologique.

Si l'on considère que dans des échantillons t i s s u l a i r e s l'hormone est pré- sente en quantité bien i n f é r i e u r e à la picomoie, par exemple 0,01 pmole, et que l ' o n veut d é t e c t e r une r a d i o a c t i v i t é de 1000 cpm, l'hormone devra avoir une r a - d i o a c t i v i t é spécifique de 10 cpm/mole.

Cela correspond à une r a d i o a c t i v i t é spécifique de 90 Ci/mmoJe pour un comp- teur de r a d i o a c t i v i t é ayant un rendement moyen de 50 X.

Des r a d i o a c t i v i t é s spécifiques comprises entre 20 et 50 Ci/mmole pourront s u f f i r e s i l ' o n u t i l i s e des é c h a n t i l l o n s de t i s s u plus importants ou s i l ' o n compte une r a d i o a c t i v i t é plus f a i b l e .

La préparation d'hormones marquées peut s'envisager selon deux voies : - remplacer un ou plusieurs atones c o n s t i t u t i f s par des atomes r a d i o a c t i f s .

Le polypeptide marqué e s t a l o r s un traceur dont le comportement dans l e s systèmes biologiques se rapproche au mieux de c e l u i de la molécule paren- t a l e . Or un polypeptide comporte essentiellement quatre atomes : C,H,0,N.

12 1

Seuls C et H possèdent des isotopes r a d i o a c t i f s i n t é r e s s a n t s sur le plan p r a t i q u e . L'isotope C a une r a d i o a c t i v i t é spécifique de 10 Ci/matome, mais est actuellement t r è s difficilement u t i l i s a b l e en raison de sa demi-vie égale à 20 mn. L'isotope C dont la r a d i o a c t i v i t é n ' e s t que de 62 mCi/matome s e r t p l u t ô t à la préparation de molécules marquées dont la concentration c i r c u l a n t e est t r o i s ordres de grandeur supérieure à c e l l e des hormones. Le t r i t i u m ³H , de r a d i o a c t i v i t é spécifique

29 Ci/matome, se trouve dans la zone u t i l e et sa demi-vie, égale à 12,7 a n s , permet de mettre en oeuvre la chimie c l a s s i q u e . C'est donc l ' i s o t o p e de choix d ' a u t a n t q u ' i l peut ê t r e i n t r o d u i t directement dans le polypeptide.

- ajouter un atome non c o n s t i t u t i f , comme l ' i o d e , ou un groupement chimique supplémentaire porteur d'un ou plusieurs atomes r a d i o a c t i f s . On ootient a l o r s un analogue de l'hormone considérée ayant des p r o p r i é t é s d i f f é r e n - t e s de c e l l e s du polypeptide p a r e n t a l .

Les méthodes de marquage au t r i t i u m d'un polypeptide tiennent compte de la s t a b i l i t é de la l i a i s o n chimique comportant l ' i s o t o p e H.

- 4 -

On s a i t que la présence de t r i t i u m sur un atome d'oxygène, de soufre, d'azote ne permet pas un marquage s t a b l e de la molécule c o n s i d é r é e , en raison de l'échange dû à des phénomènes d ' i o n i s a t i o n , entre l'atome de t r i t i u m et l e s p r o - tons du solvant. Les positions stables sont c e l l e s qui ne sont pas ionisables dans l e s conditions d ' u t i l i s a t i o n du peptide t r i t i é . I l s ' a g i t en général des groupes - CT, - , - CT, - , - CT - , a i n s i que des atomes de t r i t i u m l i é s aux c a r -

X bones des noyaux aromatiques.

En ce qui concerne les p e p t i d e s , l ' i n t r o d u c t i o n d'atomes H ne peut s ' e n v i - sager que sur la chaîne l a t é r a l e des acides aminés c o n s t i t u t i f s .

La d i v e r s i t é des méthodes u t i l i s é e s permet le marquage au t r i t i u m sur de nombreux résidus d i f f é r e n t s .

Pour augmenter la r a d i o a c t i v i t é spécifique de l'hormone, afin de la d é t e c t e r à des concentrations toujours plus f a i b l e s , i l p a r a i t judicieux de m u l t i p l i e r le nombre d'acides aminés r a d i o a c t i f s .

La première méthode envisageable s e r a i t la synthèse chimique permettant de r e c o n s t i t u e r le peptide par addition successive de chaque acide aminé t r i t i é . Cette méthode p r é s e n t e r a i t toutefois de nombreux inconvénients car l'expérience montre que :

1 - l e s rendements de la synthèse chimique décroissent au fur et à mesure de l ' é d i f i c a t i o u de la chaîne peptidique, c e l l e - c i devenant de plus en plus volumineuse et de moins en moins soluble dans l e s solvants u t i l i s é s , 2 - dans l e s formes miniaturisées de la synthèse peptidique on met en oeuvre

quelques milligrammes de chaque acide aminé dont les fonctions sont j u d i - cieusement bloquées e t / o u a c t i v é e s . C'est pourquoi une synthèse peptidique ne peut ê t r e e n t r e p r i s e que s i l'on dispose au départ d'une dizaine de mil- ligrammes de chaque acide aminé.

Prenons l'exemple d'une synthèse radioactive u t i l i s a n t 10 mg d'un acide aminé dont la r a d i o a c t i v i t é spécifique est de 25 Ci/mmole et dont le poids mo- l é c u l a i r e est de 100 D. La r a d i o a c t i v i t é t o t a l e mise en jeu a t t e i n d r a i t 2,5 Ci pour ce seul acide aminé.

Outre le niveau de r a d i o a c t i v i t é peu compatible avec la mise en oeuvre de la synthèse elle-même a i n s i que l e s manipulations u l t é r i e u r e s t e l l e s que la dépro- t e c t i o n des fonctions l a t é r a l e s des acides aminés et la p u r i f i c a t i o n du peptide obtenu, i l faut considérer le prix de revient particulièrement p r o h i b i t i f . Dans l'exemple évoqué, sachant que le m i l l i c u r i e d'acide aminé t r i t i é coûte 200 F, l e s 2,5 Ci reviendraient à 500 000 F.

Si l'on veut maintenant s y n t h é t i s e r un p e p t i d e , marqué au niveau de plu- s i e u r s acides aminés, on m u l t i p l i e les c h i f f r e s indiqués par le nombre d'aminoacides envisagés. On a t t e i n t a i n s i des grandeurs hors des r é a l i t é s .

La mise en oeuvre d'aminoacides r a d i o a c t i f s dans la synthèse d'un peptide ne devient pratiquement possible que s i l'on peut réduire de t r o i s ordres de gran- deur l e s quantités n é c e s s a i r e s .

C'est a l o r s q u ' a p p a r a î t l ' i n t é r ê t p o t e n t i e l d'une autre voie de synthèse p e p t i d i q u e , c e l l e qui f a i t i n t e r v e n i r les enzymes p r o t é o l y t i q u e s .

C'est en 1898 que Van't Hoff émit l'hypothèse de principe que l e s p r o t e a s e s , qui normalement hydrolysenc l e s l i a i s o n s p e p t i d i q u e s , puissent c a t a l y s e r la for- mation de ces l i a i s o n s ( 1 ) , pourvu que l e s conditions thermodynamiques soient f a v o r a b l e s .

En 1937, Bergmann et Fraenkel-Conrat r é a l i s è r e n t pour la première fois une l i a i s o n amide en présence de papa'ine ( 2 ) .

Depuis, la l i t t é r a t u r e nous a offert de nombreux exemples de synthèse p e p t i - dique par voie enzymatique qui ont permis l ' o b t e n t i o n de peptides t e l s que 1'aspartame, l e s Leu- et Met-enképhaline, la dynorphine ( 1 - 8 ) , l'élédo'isine ( 6 - U ) ( 3 ) .

Dans la perspective d'une synthèse d'hormone marquée, la voie enzymatique offre des avantages :

- i l sera possible de m i n i a t u r i s e r les r é a c t i o n s de façon à u t i l i s e r des q u a n t i t é s d'acides aminés de l ' o r d r e de la micromole, ce qui réduit la r a d i o a c t i v i t é t o t a l e mise en jeu à chaque étape d'un facteur 1000 par rapport à la synthèse chimique,

- 6 -

- par a i l l e u r s l'enzyme ne pouvant agir qu'en fermant un complexe avec des acides aminés de conformation L, 11 n'y aura pas de racémisation, - de plus la s p é c i f i c i t é de ce type de catalyseur é v i t e r a d'avoir à masquer

la chaîne l a t é r a l e d'acides aminés bifonccionnels, supprimant a i n s i la réaction de déprotection après la synthèse peptidique,

- enfin l e s conditions de synthèse enzynatique sont douces e t s'appliquent mieux â l ' i n c o r p o r a t i o n d ' a c i d e s aminés t r i t i é s dans des peptides de s t r u c t u r e f r a g i l e , t e l s les hormones.

Pour toutes ces raisons nous nous sommes proposés de r é a l i s e r la radiosyn- thèse enzymatlque d'un j e i t a p e p t i d e la Leucine-enképhaline. C'est une hormone c é r é b r a l e manifestant des p r o p r i é t é s analogues à c e l l e s de la morphine.

Au cours de la synthèse envisagée chaque acide aminé sera remplacé par son homologue r a d i o a c t i f afin d ' o b t e n i r le peptide Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu t r i t i é .

Quatre synthèses enzymatiques de Leu-enképhaline non marquée ont été d é c r i - t e s dans la l i t t é r a t u r e . L'examen de ces travaux nous a permis d'opter pour un c a t a l y s e u r enzymatlque et une s t r a t é g i e de synthèse compatible avec la marquage.

La première synthèse enzymatlque de Leu-enképhaline a été r é a l i s é e par Wong e t c o l l . et correspondait en f a i t à une voie d'hémisynthese puisque le pentapep- t i d e é t a i t obtenu par condensation de deux fragments peptidlques en présence de pepsine ou de papa'lne ( 4 ) . Ces fragments ont d ' a i l l e u r s été s y n t h é t i s é s par voie chimique, ce que nous ne pouvons envisager avec des acides aminés r a d i o a c t i f s pour l e s raisons invoquées précédemment.

Les mêmes remarques peuvent ê t r e f a i t e s concernant la synthèse r é a l i s é e par Mitin et c o l l . , u t i l i s a n t la papa'lne ( S ) .

En 1979 Kullmann proposait une voie de synthèse où toutes les réactions é t a i e n t c a t a l y s é e s par des enzymes ( 6 ) . Néanmoins, c e t t e méthode semble d i f f i c i - lement applicable s i l'on désire s y n t h é t i s e r le peptide radioactif car les acides aminés à incorporer subissent plusieurs transformations chimiques. De p l u s , i l faut noter des temps de r é a c t i o n longs qui peuvent ê t r e p r é j u d i c i a b l e s pour la molécule r a d i o a c t i v e .

La d e r n i è r e méthode de s y n t h è s e e x i s t a n t a é t é p r é s e n t é e p a r Widmer e t c o l l . e t c o n c e r n a i t l a M é t h i o n i n e - e n k é p h a l i n e q u i d i f f è r e de l a L e u - e n k é p h a l i n e p a r l ' a c i d e aminé C - t e r m i n a l (schéma 1 ) . N o t i e c h o i x s ' e s t néanmoins p o r t é s u r l e p r i n c i p e de c e t t e méthode c a r l e c a t a l y s e u r e m p l o y é , l a C a r b o x y p e p t i d a s e Y de Saccharomyces c e r e v i s i a e , p o s s è d e un l a r g e domaine de r é a c t i v i t é p e r m e t t a n t de l ' u t i l i s e r a u s s i pour l ' i n c o r p o r a t i o n de l a l e u c i n t ( 7 ) .

Bz-Arg-OEt CPD-Y H-Tyr-NH2

Bi-Arg-Tyr-NH2

CPD-Y 8z-Arg-Tyr-0H

I EtOH/HCl Bz-Arg-Tyr-OEt

CPD-Y H-Gly-OEt Bz-Arg-Tyr-Gly-Gly-OEt

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH Trypsin

Bz-Arg-Tyr-Gly-Gly-Phi v.et.-0![

CPD-Y H-Met-OH Bz-Arg-Tyr-Gly-Gly-Phe-OEt

] EtOH/HCl Bz-Arg-Tyr-Gly-Gly-Phe-OH

I CPD-Y

Bz-Arg-Tyr-Gly-Gly-Phe-NH,

Schéma 1 : Synthèse de Het-enlcéphaline c a t a l y s é e par l a CPD-Y ( 7 ) .

Afin d ' a d a p t e r c e t t e méthodologie au radiomarquage, nous étudierons d'abord l e s paramètres enzymatiques de chaque étape d<; synthèse qui sera r é a l i - sée dans un volume de 50 ^ i l .

Nous ferons e n s u i t e une synthèse t o t a l e de Leu-enképhaline en présence des acides aminés non r a d i o a c t i f s .

Enfin i l nous faudra obtenir l e s acides aminés marqués au t r i t i u m .

Les conditions seront a l o r s réunies pour r é a l i s e r le narquage à haute r a d i o a c t i v i t é spécifique de la Leu-enképhaline.

C H A P I T R E I

RAPPELS

A - LES ENKEPHALINES

Longtemps les chercheurs se sont demandés pourquoi i l e x i s t a i t dans le c e r - veau des récepteurs pour la morphine du pavot. Kette question fut élucidée en 1975 lorsque l ' o n découvrit les enképhalines, molécules endogènes dont la mor- phine est un analogue. I l s ' a g i t de deux pentapeptides Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu et Tyr-Gly-Gly-Phe-Met différant l ' u n de l ' a u t r e par leur aciae aminé C-terminai ( 8 ) .

Au niveau du cerveau i l s agissent comme nei.romédiateurs et induisent des ef- f e t s pharmacologiques t e l s que l ' a n a l g é s i e , la dépression r e s p i r a t o i r e , l ' e u p h o r i e . Mais ce sont aussi des hormones de l ' i n t e s t i n qui contrôlent les mouvements des aliments dans l e s voies d i g e s t i v e s en modifiant le rythme des c o n t r a c t i o n s musculaires I n t e s t i n a l e s .

Les enképhalines sont synthétisées à p a r t i r de grosses protéines précur- s e u r s , la proenkëphaline A et la proenképhaline B. La proenképhaline A contient six copies de Met-enképhaline et une de Leu-enképhaline, tandis que la proenné- phaline B contient uniquement t r o i s copies de Leu-enképhaline. Ainsi, la Met- enképhaline provient exclusivement de la proenKéphaline A, tandis que la Leu-enképhaline peut ê t r e synthétisée à p a r t i r de deux protéines précurseurs (schéma 2) ( 9 ) ,

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COUPURE ENZYMATTQUE COUFUM ENZYMATIOUE Mtt-ENKÉPMAUNE

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Schéma 2 : Synthèse des enképhalines

- 10 -

Dans les molécules précurseurs chaque enképhaline possède sur ses côtés deux acides aminés signaux : il s'agit de deux lysines, de deux arginines ou d'un de chaque ; il taut deux étapes enzyœatiques successives pour libérer 1'enKephaline du précurseur.

La première enzyme "1" réalise une coupure au niveau du carboxyle de chaque acide aminé basique (lysine ou arginine), ce qui laisse un acide aminé attaché à la molécule d'enképhaline. La seconde enzyme "2" coupe cette liaison pour don- ner l'enkêphaline "3".

De nombreuses enzymes peuvent mener à bien les deux étapes de conversion de la proenképhaline en enképhaline. Pourtant il semble qu'il existe des enzymes spécifiques telles que l'enkêphaline convertase dont le rSle serait de libérer la Met-enkêphaline par hydrolyse de la liaison Met-Arg du peptide

Tyr-Gly-Gly-Phe-Mec-Arg (10) (11).

De même il n'est pas impossible que la première étape de maturation de la proenképhaline nécessite une peptidase spécifique.

Par contre, on connaît l'existence de proteases permettant d'interrompre la transmission enképhalinergique en clivanc le peptide pour donner des fragments inactifs (12) :

dipepcidylaminopeptidase

I I i

Gly - Phe - Met (Leu)

î I I

enképhalinase, ACE*

aminopeptidase Tyr - Gly -

t I I I

Angiotensin I Converting Enzyme

Ces enzymes appartiennent au groupe des métalloprotéases. Les deux plus im- portantes sont 1'enkêphallnase et l'aminopeptidase M, toutes deux découvertes dans le rein mais également présentes dans le cerveau.

La mise au point d ' i n h i b i t e u r s de ces enzymes permet d ' é t u d i e r le role phy- siologique des enképhallnes c é r é b r a l e s et d'envisager un nouveau type

d ' a n a l g é s i e n a t u r e l l e en augmentant la concentration des peptides op'loides endo- gènes .

C'est a i n s i que l'équipe du Professeur B.P. Roques a préparé des molécules t e l l e s que le thiorphan et le rétro-thiorphan toutes deux inhibant

l ' e n k ë p h a l i n a s e , puis le kélatorphan, premier i n h i b i t e u r complet du métabolisme des enképhallnes, inhibant à la fois l ' e n k ê p h a l l n a s e , la dipeptidylaminopeptida- se et l'aminopeptidase H (13) (14) (15).

Parallèlement à ce type de recherche, un effort important est actuellement e n t r e p r i s pour préparer des analogues structuraux des enképhallnes afin de mieux connaître l e s différentes c l a s s e s de récepteurs ( o. , 2> , k ) , et pour obcenir des molécules 100 X agonistes pour un récepteur en p a r t i c u l i e r .

C'est a i n s i qu'une meilleure connaissance des neuropeptides t e l s que l e s en- képhallnes permet d'envisager la f a b r i c a t i o n de nouveaux médicaments qui a g i - r a i e n t sur la synthèse, la l i b é r a t i o n et les récepteurs de neuropeptides spécifiques et dont l ' a c t i o n s e r a i t particulièrement s é l e c t i v e et e f f i c a c e .

B - LE MARQUAGE AO TRITIUM DES ENKEPHALINES

Dans notre l a b o r a t o i r e , d i f f é r e n t e s méthodes chimiques ont été développées permettant d ' i n t r o d u i r e de façon s t a b l e un ou p l u s i e u r s atomes de t r i t i u m dans des hormones polypeptidiques ( 1 6 ) .

Si l'on considère la s t r u c t u r e primaire des enképhallnes,

Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu et Tyr-Gly-Gly-Phe-Met, p l u s i e u r s p o s s i b i l i t é s de marquage sont a i n s i o f f e r t e s .

La méthode la plus simple c o n s i s t e en une hydrogénolyse c a t a l y t i q u e des dé- r i v é s iodés des enképhallnes.

- 12 -

L'intermédiaire halogène est obcenu en présence d'iode sous forme I+ (ICI) qui se fixe sur les deux carbones voisins de l'OH phénolique de la tyrosine.

On procède ensuite à la substitution des atomes d'iode par des atomes de tritium, ceci en présence d'un catalyseur tel que le palladium et de gaz tritium (17).

OH OH OH

§ -*- '§' -£- f

C H² CH² C H²

•vWrNH - C H - C - * v - -vw-NH - CH •• C ' W - - w - N H - C H - C - v w -

Il « » 0 0 0

Cependant dans le cas de la Met-enképhaline on ne peut empêcher l'oxydation de la methionine en présence du r é a c t i f iodant. Four é v i t e r c e t t e d i f f i c u l t é , on prépare par synthèse chimique la Met-enképhaline sur la t y r o s i n e . Le plus sou- vent i l s ' a g i t du dérivé di-bromé halogène. Par hydrogénolyse c a t a l y t i q u e de ce composé, en présence de palladium et de t r i t i u m , on obtient la Met-enképhaline t r i t i é e sur le résidu tyrosyle ( 1 8 ) .

I l e s t par a i l l e u r s possible de marquer l e s enképhalines sur le résidu Phe.

Pour ce f a i r e , on s y n t h é t i s e d'abord l ' i n t e r m é d i a i r e mono- t r i - ou penta- halogèné (l'halogène é t a n t l ' i o d e , le c h l o r e , le brome). Au moment opportun une déshalogénation en présence de palladium at de gaz tritium conduit au peptide t r i t i é ( 1 9 ) .

Si l ' o n souhaite obtenir la Leu-enképhaline t r i t i é e sur le résidu Leu, i l e x i s t e une méthode qui le permet (20).

Elle consiste à s y n t h é t i s e r tout d'abord, par voie chimique, un analogue du peptide comportant une déhydro-leucine ( û - 3 , 4 ) .

Par réduction de la double l i a i s o n en présence de c a t a l y s e u r et de gaz t r i - tium on incorpore deux atomes de t r i t i u m par molécule.

Enfin, 3i l'on veut marquer la Met-enképhaline sur le résidu méthionyle, on peut u t i l i s e r deux méthodes.

La première se décompose en deux étapes p r i n c i p a l e s (21) :

tout d'abord allcylation à l ' i o d u r e de méthyle t r i t l é de la fonction t h i o - é t h e r puis déalkylation ménagée de l'ion sulfonium pour obtenir la Met-

enképhallne marquée avec une r a d i o a c t i v i t é spécifique égale à la moitié de c e l l e de l ' i o d u r e de méthyle.

-vw- CO - CH - NH ~Nf - w - CO - CH - NH -<W"- -Wr CO - CH - NH -»w-

I _ - _ I _ - , I.

( C H²) j I S C H³

r C H *³l 1 ( C H²)² r _ N a _ J L H C O O H J U^eC H³ L NH³ J

( C H²)² T^Na 1 ^l^^{H 2}'³

^ C H³ L NH³ J s CH

CH}

La seconde méthode permet de marquer le peptide avec la même r a d i o a c t i v i t é spécifique que c e l l e du donneur de méthyle. Cependant, on forme non pas la Met- enképhaline mais la Met-enképhaline amide. Une r é a c t i o n de désamidation doit ê t r e envisagée sur le peptide t r i t i ë ( d é s a o i d a t i o n par la CPD-Ï par exemple).

La méthode de marquage dont i l e s t question peut ê t r e d é c r i t e comme s u i t (22) :

- on forme d'abord un précurseur homocysteine S-terbutyle par a l k y l a t i o n de l a methionine par le terbutyloxycarbonyl amide (Boc-NFU), s u i v i e d'une déméthy- l a t l o n au t h l o g l y c o l a t e de sodium. Ce composé e s t ensuite transformé en homocys- t e i n e thiolactone par a c t i o n d ' a c i d e fluorhydrlque.

- 14 -

- enfin on réalise une alkylation à l'aide du tosylate de méthyle tritié, en présence d'ammoniac liquide, ce qui conduic au peptide porteur de la methionine amide tritiée sur le méthyle.

•NH-CH-CONH,

(ÇH,),

S - C - t C H , ) ,

S T R O N G A C I D

!'

S T R O N G A C I D

!'

•NH-CH

L_> ^'s

- N H - Ç H - C O N H , ( C H J J J - S - C ' H , C-terminal methionine

Amide

Schéma d ' a p r è s CHASSAING G. e t c o l l . ( 2 2 )

C - LES PROTEASES : UH OUTIL EH SYNTHESE PEPTIDIQUE

La fonction principale des proteases est d'hydrolyser l e s l i a i s o n s p e p t i d i - ques.

Le mécanisme le plus commun consiste en la p o l a r i s a t i o n de la l i a i s o n p e p t i - dique par l ' a t t a q u e nucléophile de la l i a i s o n C » 0 ( s o i t directement, s o i t par l ' i n t e r m é d i a i r e d'une molécule d'eau) en même temps q u ' i l y a t r a n s f e r t d'un proton sur l ' a z o t e du peptide ( 2 3 ) .

Figure 1 : Mécanisa» d'hydrolyse d'une l i a i s o n peptidique N : nucléophile B : base AH : donneur de proton

Dans l e s enzymes p r o t é o l y t i q u e s , c e r t a i n s acides aminés jouent le rSle de nucléophile et d ' a u t r e s se comportent comme des donneurs de protons ( 2 4 ) .

Chaque famille de proteases a ses c a r a c t é r i s t i q u e s propres qui sont basées sur de t e l s résidus fonctionnels dont la configuration forme le s i t e a c t i f . Les familles les mieux connues sont l e s serine p r o t e a s e s , les t h i o l p r o t e a s e s , l e s proteases acides et les métalloprotéases (tableau 1).

- 16 -

Families Exemple de Résidus caractéristiques

protease du site actif * 1

Serine proteases chymotrypsine trypsine élastase

A s p1 0 2, S e r1 9 5, H i s5 7 |

carboxypeptidase ¥

subtilisine A s p3 2, S e r2 2 1, H i s6 4 |

1 Thiol proteases papalne C y s2 5, H i s1 5 9, A s p1 5 a |

| Proteases acides pepsine

pénicillopepsine ré ni ne

A s p " , A s p2 1 3 |

Métalloprotéases carboxypeptidase A Zn, G l u2 7 0, T y r2 4 8 | carboxypeptidase B

1 thernolysine

1 Zn, G l u1 4 3, H i s2 3 1 |

1

Tableau 1 : Fanilles d'enzyaes protéolytiques et résidus caractéristiques du site actif

* la numérotation des résidus correspond à la séquence d'acides aminés des enzymes soulignées dans la colonne 2.

Tableau extrait de la référence (23).

Beaucoup d'autres familles de proteases existent, telles que les aminopepti- dases, les collagénases, les proteases â calcium ; cependant leur classification en terme de structure et de mechanisme d'action reste à déterminer (25) (26) (27).

L'étude détaillée des propriétés hydrolytiques des proteases est indispensa- ble si l'on veut les utiliser pour catalyser la formation de liaisons peptidi- ques.

En e f f e t , c ' e s t la s t r u c t u r e RCO-NHR' t o u t e e n t i è r e qui I n f l u e n c e l e r e n d e - ment d ' h y d r o l y s e de la l i a i s o n CO-NH, e t qui e s t a u s s i impliquée dans l a s y n t h è - s e de c e t t e même l i a i s o n .

En ce qui concerne 2e comportement des p r o t e a s e s du p o i n t de vue rie l ' h y d r o l y s e , on peut c o n s i d é r e r deux grands groupes :

- c e l l e s à grande s p é c i f i c i t é qui en tant que p r o c é a s e s ne forment un com- p l e x e qu'avec c e r t a i n s a c i d e s aminés ( 2 8 ) ( 2 9 ) . C i t o n s la t r y p s i n e pour l e s r é s i d u s basiques ( a r g i n i n e , l y s i n e ) e t la chymotrypsine pour l e s déi.'.- v é s aromatiques ( t y r o s i n e , p h e n y l a l a n i n e ) ( 3 0 ) ( 3 1 ) ( 3 2 ) . i n conséquence e l l e s ne peuvent c a t a l y s e r la c o n d e n s a t i o n d'un groupement aminé que sur des r é s i d u s bien d é f i n i s ,

- l e s a u t r e s p r o t e a s e s u t i l i s é e s p r é s e n t e n t un s p e c t r e de r é a c t i v i t é beau- coup p l u s l a r g e mais moins bien d é f i a i . E l l e s permettent la c o n d e n s a t i o n e n t r e des a c i d e s aminés de nature d i v e r s e mais demandent avant l e u r u t i - l i s a t i o n une étude p r é l i m i n a i r e pour f i x e r l e s c o n d i t i o n s de r é a c t i o n . Ces enzymes a p p a r t i e n n e n t à l a f a m i l l e des s e r i n e p r o t e a s e s comme l ' e l a s t a s e , l a thrombine, l a c a r b o x y p e p t l d a s e ï , ou à c e l l e des t h i o l p r o - t e a s e s comme la p a p a l n e , ou encore à c e l l e des p r o t e a s e s a c i d e s ( p e p s i n e ) ou e n f i n à c e l l e des m é t a l l o p r o t é a s e s parmi l e s q u e l l e s on trouve la t h e r - mol^siue e t l e s c a r b o x y p e p t i d a s e s A e t B.

Lui protea_.es c a t a l y s e n t l a formation de l i a i s o n s p e p t i d i q u e s s e l o n t r o i s r é a c t i o n s p r i n c i p a l e s ( 3 3 ) .

- l a c o n d e n s a t i o n

E

1) R'-NH-CH-COOH + NH,-CH-C00H Z~-> R'-NH-CH-CONH-CH-COOH + H,0 R, R-, R, R-,

- 18 -

- la t r a n s p e p t i d a t i o n

2) . . . NH-CH-CONH-CH-COOH + NH,-CH-COOH > . . . NH-CH-CONH-CH-COOH

I l L \ I !

NH-,-CH-COOH

l ' a m i n o l y s e d ' e s t e r

3) . . . NH-CK-COOCH, + NHi-CH-COOH > . . . NH-CH-CONH-CH-COOH + CH,0H E

I •> - | i i ->

R, R^

*1 R2 R3 * chaînes latérales d'acides aminés

R' - groupement bloquant

E » enzyme

Le premier type de réaction 1) correspond à l'inverse de l'hydrolyse.

On obtien: «es rendements de synthèse élevés soit en limitant la solubilité du produit, soit en faisant intervenir des solvants organiques miscible avec l'eau (3) (34).

Lorsque l'on utilise de fortes concentrations en substrats, la précipita- tion du produit a lieu.

En solution aqueuse celui-ci, exclu naturellement de l'équilibre réaction- nel, s'accumule dans le milieu.

On peut aussi utiliser un système de solvants biphasique (eau, solvant or- ganique non miscible apolaire) permettant d'isoler le produit s'il est unique- ment soluble dans la phase organique.

Une deuxième façon d'extraire le peptide synthétisé consiste à le complexer avec un composé ne participant pas à la réaction de condensation.

L'inconvénient de la méthode basée sur la faible solubilité du produit est qu'elle limite le choix des substrats et du produit qui doivent présenter des caractéristiques précises que nous venons d'évoquer.

Pour augmenter le rendement de synthèse peptldique il est par ailleurs pos- sible de mettre en jeu des solvants organiques qui modifient le pK des acides aminés de la réaction. Si l'on réécrit la réaction 1) en tenant compte des for- mes ionisées des acides aminés, il vient

R'-NH-CH-COOH

I

Ka

-NH-CH-COO^"-'

I

Ri

E

NH.

(

Kb

•CH-COOH

R'-NH-CH-CONH-CH-COOH + H,0

I I '•

R^X R2

H

Il apparaît que dans l'eau (55 M ) , l'équilibre global est déplacé vers la gauche en raison notamment des processus d'ionisation thermodynamiquement favo- rables à l'hydrolyse.

Far contre, en présence de cosolvants organiques, non seulement on réduit la concentration en eau mais le pKa des acides augmente alors que le pKb des bases varie peu, ce qui va dans le sens de la synthèse peptidique.

Cependant cette approche reste difficile car l'activité catalytique des proteases diminue lorsqu'on augmente la concentration de cosolvant, ce qui né- cessairement accroît le temps de réaction pour aboutir au produit désiré.

Ainsi la mise en oeuvre de réactions de condensation par les proteases n'est pas toujours aisée et limite leur application en ce qui concerne la synthèse totale. Citons néanmoins la synthèse de l'aspartame réalisée par Oyama et Kihara (35).

Le second type de réactions catalysées par des proteases sont des réactions de transpeptidation 2 ) . Elles correspondent au remplacement d'un acide aminé par un autre, à la suite d'une réaction nuclëophile.

- 20 -

De façon tout à fait parallèle, on peut siettre en oeuvre un ester, réaction 3 ) , pourvu que la protease ait aussi des propriétés d'estécase. Les enzymes ca- pables de catalyser les réactions d'aminolyse d'ester sont des serine ou des thiol proteases dont les plus communes sont la chymotrypsine, la trypsine, l'élastase, la papa'ine, la chymopapa'ine et la carboxypeptidase Y.

Le fonctionnement des proteases qui catalysent les réaccionr de transpepti- dation ou d'aminolyse d'ester implique au moins un type de structure intermé- diaire, une combinaison entre le carboxyle du substrat et l'enzyme. C'est cette structure intermédiaire qui ust produite par la coupure d'une liaison peptide ou ester, et qui est dissociée par aminolyse avec formation d'une liaisor. peptidi- que.

R O R , I / / I¹

NH-CH-C-NH-CH-COOH R 0 . .. NH-CH-C

R ,0 , Enz I // - "

. . . NH-CH-C-0CH³

S t r u c t u r e i n t e r m é d i a i r e acylenzyme

Bien évidemment, l ' e a u e s t un c o m p é t i t e u r t r è s e f f i c a c e en r a i s o n de sa c o n c e n t r a t i o n , e t tend à décomposer l ' a c y l e n z y m e en s e s c o n s t i t u a n t s .

Le grand i n t é r ê t de c e s r é a c t i o n s e s t l e r ô l e c e n t r a l joué par l ' a c y l e n z y m e dont l a c o n c e n t r a t i o n à l ' é t a t s t a t i o n n a i r e peut ê t r e proche de l a c o n c e n t r a t i o n de l ' e n z y m e . L'acylenzyme r e p r é s e n t a n t une forme a c t i v é e du groupe c a r b o x y l e , e t l ' u n des s i t e s de l'enzyme p r é s e n t a n t une a f f i n i t é pour l ' a c i d e aminé en v o i e de l i b é r a t i o n e t pour l ' a c i d e aminé à i n c o r p o r e r , on c o n s t a t e un p o s i t i o n n e m e n t a p - p r o p r i é dans l ' e s p a c e des p a r t e n a i r e s . La c o n c e n t r a t i o n de l'enzyme dans l e m i l i e u peut ê t r e extrêmement I n f é r i e u r e à c e l l e qui s e r a i t n é c e s s a i r e s i l ' o n c o n s i d é r a i t , i n i t i a l e m e n t , qu'une s o l u t i o n de deux a c i d e s aminés, c ' e s t - à - d i r e l e c a s 1 ) .

L ' u t i l i s a t i o n de p r o t e a s e s pour r e c o n s t i t u e r une l i a i s o n p e p t i d i q u e a s s o - c i a n t des a m i n o - a c i d e s d i f f é r e n t s de ceux i n i t i a l e m e n t p r é s e n t s a vraiment p r i s un e s s o r nouveau avec l e s travaux de Johansen e t c o l l . : des exemples r é c e n t s , comme l a s y n t h è s e t o t a l e de l a M e t - e n k é p h a l i n e ( 7 ) ou de fragments du f a c t e u r de c r o i s s a n c e de l'êpiderme de s o u r i s ( 3 7 ) montrent l ' e f f i c a c i t é Je l a c a t a l y s e e n z y m a t i q u e .

C e l l e - c i s ' a v è r e p a r t i c u l i è r e m e n t adaptée à la s y n t h è s e de p e t i t e s q u a n t i t é s de p e p t i d e s . C ' e s t l e domaine p r i v i l é g i é de la mise en oeuvre de r a d i o é l é m e n t s .

D - LA CARBOXYPEPTIDASE Y ( E . C . 3 . 4 . 1 2 . 1 )

1 - P r é s e n t a t i o n d« l ' « n « y n e

I l y a presque v i n g t ans D o i , Hâta e t Hayashi i s o l a i e n t une n o u v e l l e e n - zyme p r o t é o l y t l q u e de l e v u r e s de b i è r e , q u ' i l s a p p e l è r e n t p r o t e i n a s e C dé l e v u r e ( 3 8 ) ( 3 9 ) ( 4 0 ) .

Hayashi at c o l l . p r o p o s è r e n t 1- - i H t - de '-> sauner — -h^xypop' ' ' Y ( y e a s t ) pour la d i s t i n g u e r des a u t r e s c a r b c x y p e p t i d a s e s ayant des p r o p r i é t é s s i m i l a i r e s mais provenant de f e u i l l e s de c i t r o n , de peau de c i t r o n , de f e u i l l e s de h a r i c o t , e t c ( 4 1 ) .

C e t t e p r o t é a c s e l o c a l i s e dans l e s v a c u o l e s de Saccharomyces c e r e v i s i a e ( 4 2 ) . E l l e e s t s y n t h é t i s é e dans l e r e t i c u l u m endoplasmique sous l a forme d'un p r é c u r s e u r de 67 kd qui u l t é r i e u r e m e n t a t t e i n t un poids m o l é c u l a i r e de 69 kd dar.s l ' a p p a r e i l de G o l g i - Le p r é c u r s e u r i n a c t i f s u b i t une m a t u r a t i o n par c l i v a g e d'un p e p t i d e a m i n o - t e r m i n a l de 8 kd (43) ( 4 4 ) .

La CPD-Y e s t une g l y c o p r o t é i n e composée d'une chaîne p o l y p e p t i d i q u e com- prenant 430 r é s i d u s ( 4 5 ) . Sa masse m o l é c u l a i r e e s t de 61 kd ( 4 6 ) , dont 23 £ r e - v l e n n n e n t à des h y d r a t e s de carbone ( 4 7 ) , la nature e x a c t e de c e s

o l i g o - s a c c h a r i d e s v a r i a n t s e l o n l a l e v u r e à p a r t i r de l a q u e l l e l'enzyme e s t pu- r i f i é e ( 4 8 ) . Ces c h a î n e s o l l g o - s a c c h a r l d i q u e s sont l i é e s au p o l y p e p t i d e par l ' i n t e r m é d i a i r e des r é s i d u s a s p a r a g i n e ( 4 7 ) .

La forme mature de l'enzyme possède quatre a c t i v i t é s s e l o n l a nature du s u b s t r a t mais a u s s i f o n c t i o n du m i l i e u r é a c t i o n n e l : e x o p r o t ë a s e , e s t e r a s e , ami- d a s e , p e p t l d y l a m i n o - a c i d e amide h y d r o l a s e .

- A c t i v i t é e x o p r o t é a s e

A pH a c i d e l a CPD-Y l i b è r e n'importe quel a c i d e aminé, y compris l a p r o l i n e , de l ' e x t r é m i t é C- t e r m i n a l e de - ^ - j t é i n e s ou de p e p t i d e s ( 4 1 ) . S e u l s

- 72 -

l e s acides aminés de la série L peuvent ainsi être l i b é r é s . Si le peptide ou la protéine possède un acide aminé de la série D en position C- terminale l'hydro- lyse enzymatlque n'a pas l i e u (49) (50). C'est entre pH 6 et 7 que les dipepti- des N- bloqués contenant seulement des acides aminés neutres sont hydrolyses.

S ' i l s contiennent un acide aminé acide, l'optimum de l ' a c t i v i t é peptidase se situe à pH 5,5. Far contre s i ces peptides contiennent des acides aminés basiques l'optimum se situe à pH 7,5 (49). La nature des deux acides aminés influence fortement le rendement d'hydrolyse. De même la nature du groupement N- terminal influe sur le niveau de réactivité des différents substrats. Ces groupements étant préfèrenttellement dans l'ordre (49) :

- Z (benzyloxycarbonyle) - Bz (benzoyls)

- Ac ( a c e t y l e )

- A c t i v i t é s esterase et amidase

Contrairement aux carboxypeptidases A et B qui n'hydrolysent que des substrats ayant le groupement carboxyle l i b r e , la CPD-Y est capable d'hydrolyser la fonction amide ou ester des peptides, ou des acides aminés N- bloqués, comportant un groupement ester ou amide à l'extrémicé C- terminale (51). Les pH optima de ces a c t i v i t é s sont : 6,5 à 8,0 pour l ' a c t i v i t é amidase et 8,0 à 8,5 pour l ' a c t i v i t é e s t e r a s e . Les rendements de désamidation de dipeptides N- blo- qués ne sont pas influencés par la nature des groupements N- bloquants. Par contre la nature des deux acides aminés est déterminante pour l ' a c t i v i t é amidase (52). En ce qui concerne l ' a c t i v i t é esterase, la CPD-Y a une plus grande a f f i - nité pour l e s acides aminés de nature hydrophobe N- bloqués et e s t é r i f i é s (53).

La nature du groupement ester influe sur le rendement d'hydrolyse. On peut c l a s - ser dans un ordre décroissant Bzl (benzyle), Et ( é t h y l e ) , Me (méthyle) selon le rendement obtenu ( 5 1 ) . Les paramètres cinétiques de l'hydrolyse par la CPD-Y de substrats e s t é r i f i é s et amidés sont proches de ceux obtenus en présence de chy- motrypsine ( 5 1 ) .

- Activité peptidyl amino-acide amide hydrolase

Lorsque le substrat de la CPD-Y est un peptide amide M - bloqué com- portant au moins trois acides aminés, on voit apparaître une a c t i v i t é peptidyl

amlno-acide amide hydrolase q entraîne la libération de l'acide aminé amidé C- terminal. Le pH optimum de cette a c t i v i t é se situe à 9,5 (54).

2 - Propriété» physico-chimique* de 1» CPD-Y

La s t a b i l i t é et la solubilité de l'enzyme ont été mesurées en suivant l ' a c t i v i t é peptidase. La CPD-Y est stable pendant 8 heures entre pH 5,5 et 8 à 25° C, et pendant 2 heures entre pH 6 et 8 à 37" C (55).

Une congélation et décongélation répétées d'une solution d'enzyme, ainsi que la conservation à température ambiante provoquent une autolyse de l'enzyme libérant des acides aminés à p a r t i r de l'extrémité C- terminale de la protéine (41).

La CPD-Y est relativement stable en présence d'agents dénaturants des protéines ou de certains solvants.

Des concentrations jusqu'à 4 M en urée n'affectent pas l ' a c t i v i t é de la CPD-Y (55). Elle ne perd que 20 Z de son a c t i v i t é après lh d'incubation à 25° C en présence d'urée 6 M (41).

En solution dans 1C Z de methanol ou d'éthanol, l'enzyme reste p a r f a i t e - ment stable et active entre pH 5 et 8 pendant 8 heures à 23° C (56). En présence de 30 t de dioxane ou de 60 Z d'êthylèneglycol l'enzyme est stable au moins 15 minutes à pH 7 (57).

La CPD-Y est très soluble jusqu'à 1,5 M en KC1 et on ne constate pas de modification de l ' a c t i v i t é dans cet intervalle de force ionique (49).

Le point isoélectrique de l'enzyme est 3,6 (56).

La concentration de la CPD-Y peut être connue par détermination de l'absor- bance à 280 nm en u t i l i s a n t le coefficient A 1 * - 15 ( 4 6 ) .

1 cm

- 24 -

3 - Effet d«« t g e n t i ehiaique»

La CPD-Y n ' e s t pas inactivée par l'EDTA ou la 0- phénantroline (agent c h é l a t e u r des ions métalliques) (58) : après une dialyse quatre jours contre une s o l u t i o n d'EDTA 10 M, l e s a c t i v i t é s peptidase et e s t e r a s e sont totalement conservées. De plus lorsque la CPD-Y est préincubée avec des ions métalliques on c o n s t a t e que l e s a c t i v i t é s peptidase et e s t e r a s e sont modifiées : une préincuba- t i o n avec Ag , Rg , Cu , à une concentration 10" M entraîne une perte t o t a l e d ' a c t i v i t é s ; de même une concentration 1Û~'^J M en ions Cu*, Mg , Ca , Ba , Cr , Mn , Fe ou Ni provoque une perr.e supérieure à 50 % de l ' a c t i v i t é pep- t i d a s e (59).

Ces données montrent que les ions métalliques ne p a r t i c i p e n t pas à la fonction c a t a l y t i q u e . La CPD-Y, en c e l a , d i f f è r e des carboxypeptidases A et B qui sont des métalloprotéases d'origine pancréatique contenant un atome-gramme de z i n c , par mole de p r o t é i n e , indispensable à leur a c t i v i t é .

Par contre la CPD-Y e s t inactivée de façon stoechiométrique et i r r é v e r - s i b l e par le diisopropylfluorophosphate (DFP) comme on peut l ' a t t e n d r e d'une s e r i n e p r o t e a s e . Effectivement en Incubant l'enzyme et du [ P] - DFP on observe 32 la formation d'une mole de serine marquée par mole d'enzyme ( 6 0 ) . En présence de DFP ce sont toutes l e s a c t i v i t é s de la CPD-Y qui sont inhibées. L'enzyme est a u s s i inactivée stoechiométriquement par le fluorure de phénylméthanesulfonyl (PMSF), ce qui e n t r a î n e l ' i n h i b i t i o n des a c t i v i t é s peptidase et e s t e r a s e (59).

La CPD-Y possède 11 résidus cysteine par molécule donc un seul est sous forme de cysteine ( 6 0 ) . Le -SH l i b r e correspondant r é a g i t avec le p-HMB (parahydroxymercuribenzoate) en même temps que l'enzyme s ' i n a c t i v e ( 5 7 ) . Le com- plexe i n a c t i f CPD-Y - p-HMB peut ê t r e réaccivé par la cyscéine ou d ' a u t r e s com- posés soufrés. Par a i l l e u r s l'enzyme inactivëe par le p-HMB ne r é a g i t plus avec l e DFP et réciproquement. D'autres dérivés mercuriels se l i a n e avec le groupe- ment -SH donnent des r é s u l t a t s variables (53) (61) : soie une diminution de l ' a c t i v i t é peptidase ou e s t e r a s e , soit une augmentation. Ces v a r i a t i o n s sont c o r r e l l é e s avec la t a i l l e des dérivés mercuriels a i n s i qu'avec leur hydrophobi- c i t é mais aussi avec la nature des s u b s t r a t s u t i l i s é s (importance de l ' a c i d e aminé " n - 1 " des dipeptides et importance de la nature des acides aminés

N- bloqués e t e s t é r i f i é s ) . Toutes ces données indiquent que le groupement -SH, bien que ne p a r t i c i p a n t pas à la fonction c a t a l y t l q u e , e s t l o c a l i s é au niveau du s i t e a c t i f de la CPD-Y (62).

Une chlorométhyl cétone spécifique des résidus h i s t i d y l e s , la benzyloxy- carbonyl L- phénylalanylchlorométhane (L-Z-Phe CH, C l ) , inactive de façon s t o e - chiométrique la CPD-Y. Les a c t i v i t é s peptidase et e s t e r a s e sont inhibées irréversiblement (63) (64). De plus l'enzyme inhibée par la L-Z-Phe CHj Cl ne r é a g i t pas avec le DFP et réciproquement.

Des modifications spécifiques des résidus méthionyles t e l l e s que l ' a l k y - l a t i o n par des dérivés bromes montrent qu'une methionine se trouve dans le s i t e a c t i f ( 5 2 ) . Lorsque la CPD-Y e s t modifiée au niveau de la methionine, l e s a c t i - v i t é s peptidase et esterase sont a f f e c t é e s , c e c i en fonction de la nature de l ' a c i d e aminé C- terminal pour l e s d i p e p t i d e s , et en fonction de la nature de l ' a l k y l e pour l e s acides aminés N- bloqués et e s t é r i f i é s . Des r é s u l t a t s s i m i l a i - res sont obtenus quand le résidu méthlonyle est oxydé ( 6 5 ) . Lorsque la réaction d'oxydation a l i e u dans du tampon a c é t a t e , une seconde methionine est modifiée.

Toutes l e s a c t i v i t é s de la CPD-Y, comportant a l o r s deux methionines oxydées, sont augmentées. Par contre la s t a b i l i t é de l'enzyme à la chaleur décroît f o r t e - ment.

Le traitement de la CPD-Y par du fluorodinitrobenzêne entra.'.ne la forma- t i o n d'un dérivé fluoré au niveau d'un résidu t y r o s y l e . Toutes les a c t i v i t é s de l'enzyme sont a l o r s modifiées. Ces v a r i a t i o n s peuvent ê t r e r e l i é e s à la nature des groupements amides ou e s t e r s ou des acides aminés hydrolyses au sien des d i f f é r e n t s s u b s t r a t s (65). I l y a donc une tyrosine l o c a l i s é e dans le s i t e a c t i f mais ne p a r t i c i p a n t pas à la fonction c a t a l y t l q u e .

4 - Site a c t i f «t mécanisa» catalytlque

Le s i t e a c t i f de la CPD-Y comporte deux résidus e s s e n t i e l s Ser et His.

I l e s t a i n s i possible de comparer la séquence autour du résidu Ser (Ser-146) <S:>

la CPD-Y avec c e l l e d ' a u t r e s s e r i n e proteases (Tableau 2 ) . On ne connaît pas la p o s i t i o n de l ' h i s t i d i n e .

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ENZYMES SEQUENCE D'ACIDES AMINES

Carboxypeptidase Cy -Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Glu-Leu- Carboxypeptidase C^{u b} -Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Glu-Leu- Carboxypeptidase Y -Ala-Gly-Glu-Ser-Tyr-Ala-Ris-Gly- Trypsine<bovine) -Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Val- Chymotrypsine(bovine) -Met-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu- Elastase(cochon) -Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu- Plasmine(humaine) -Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu- Thrombine(bovine) -Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Pho- S u b t i l i s i n e BPN -Asn-Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Ser-Pro-

Tableau 2 : liqucoc* d'«cid«» u i n d de parc et d'autre du rtaidu Scr (66)

Peu d'analogies de séquence apparaissent de part et d ' a u t r e des résidus Ser de la CPD-Y et des différentes enzymes considérées.

A part la serine (Ser-146), l e s a u t r e s résidus du s i t e a c t i f de la CPD-Y dont la p o s i t i o n e s t Identifiée sont : Met-313, Met-398, Cys-341 (voir figure 2 ) .

La chymotrypsine et la s u b t i l i s i n e contiennent un résidu methionine qui peut s'oxyder en présence d'I^O,, ce qui entraîne une a l t é r a t i o n de leurs p r o p r i é t é s enzymatiques. Cependant i l n ' y a pas d'analogie de séquence autour de ces r é s i - dus et autour des résidus Met-313 et Met-398 de la CPD-Y ( 6 7 ) .

De nombreuses serine carboxypeptidases possèdent un résidu c y s t e i n e , sans doute présent dans le s i t e a c t i f mais ne p a r t i c i p a n t pas directement à l a fonc-

t i o n c a t a l y t i q u e , comme dans le cas de la CPD-Y.

10 Y 20 i y S - n t - C y s - A l p - P r o - C y s - n i - U U - G l y - n p - A s p - P r o - A i n - V A l - T h r - G l f t - T y r - r i i r - a l y - T y r -

30 «0 l « - A l p - * « l - S 1 l i - A l p - 6 ï « - A s p - i y S - H H - P f t i - P t : » - P I > t - r r 9 - n ! l ' - P h « - a l u - S « r - A r s - A S R - A J B -

S0 SO pw-Al«-tyi-Asp-PTT»-¥*l-n«-Uu-rrp-tty-AM-Sly-Gîy-Pi-^1y-eyï-S*ï--Str-l.ta-Thr-

70 80 Gly-iw-Phi-Pht-Glu-t.tu-ûly-PrQ-Str-Str-U«-41ï-Pro-*ip-i.t«-î.ys-?i'B-nt-S1y-*M-

Pro-iyr-Sir-Trp-»tii-Sir-«iii-«1i-nir-ïjT-H«-nM-Uu.«lp-«t»-"«-nI-««"-»«'-S'y-

110 120 P»-Str-ryr-S«r-«ly-S€r-S«r-Gly-Ml-S«r-Al«-T>ii'-Yil-Al«-Al«-Gly-l.y».Aip-V«l-t,r-

130 J«0 Ain-Pt»-L«-G1u-liU-Ph«-Phi-Alp-Gln«pWPHî-«ltl-Tyr«Vll-A*n-l.ys-Gly-Gl(i-Asp-?lit-

• ISO 160 H1l-Ilt-«ll-«ly-Slu-Str.Tyr-»U-HH-«ly-Tyr-llt.Pn)-»«l-Pht-A".l-S»r^ilu-n«-LPU-

9 170 180 Str.Hti-Lyi-A«p-Ar9-Ain-Phi-Ain-Ctu-.hr-S«r-ïA7-Uu-n«-aly-Ain-Gly-Lpu-Thr-Aip.

190 200 Pro-Uu-Thr-GIn-Tyr-AM-ryr-Tyr-Glu-Prfl-^-AU-Cyj-Gly-Glu-Gly-Gly-Glu-Pro-SAr-

210 220 MÎ-Uy-Pw-Sfr-Gîti-Glu-Cyl-Str-AÎA-w-GÎB-Asp-Ser-Uu-Glu-Arj-Cys-Uu-GJy-Ltu-

230 240 np-Slu-S«r-Cys-îyr-Aïp-S«f-S3n-S#r-Y*ï-ïrp-S«r-eys-V«l-PrB-A!«-Thi--iïe-îyr-s.ys-

250 2&0 Aj«-AM-A7i-61n-l»u-AU-Prp-Tyr-tttfl-Arg-Thr-$ïy-Arg-Aln-¥t3-îyr-Asp-llt-Arg-t.yl-

270 280 Aw-Cyl-Slu-Gly-Gly-Ain-Uu-Cyi-Tyr-Pro-Thr-uu-Gl A-Asp-(l«-A5p-Aio-Glu-(.'.u-Asn-

Sl »-AJp-Tyr-V«l -Ly»-51u-Al 4-M1 -Gly-Alâ-Glu-ÏJl -Ajp-HH-Tyr-GJ it-Scr-Cys-Atn-PM- Ajp-nt-Asn-Ar9-Atn-Pm-LfU-Pll»-All-Gïy-Ajp-Trp-^St-Lyi-Pro-Tyr-t11s*Tfir-All-ïlT-

130 MO TTir-ASP-L*u-Ltu-Am-Gln-Asp-Uu-PPO-Il t-ltg-Vil-Tyr-AU-Gly-Aip-LyS-Asp-Ptie-11 «-

SH

Cys-Ain-Ti^-Uu-Gly-Aan-lyi-An-Tr^-TRr-Aip-Vil-ltu-Pro-Trç-Lyj-ryr-Asp-Glu-Glu-

9 370 J80 Pïi*-Al«-3*r-5ir.-l.>'S-';jl-ftr3-AïR-Trp-Thr-»U-Ssr-Il*-T»!r-»!p-Jïlii-v»l-Al»-Gly-GTu-

«•l-lyl-Str-Iyr-l.y»-H)i-Plit-nir-Iyr-Uu-Ar9-»«l-Pht-Ain-Gly-Gly-HH-«t-Ml-Ppo-

410 420 P(*-Aip-ïaî-Pro-Sl<i-Alîï-AÎ*-ttu-Str-*1*t-ï«î-Aîfî-6îa-Tfp-lî«-Ml5-Gly-A!p-Pht-Sfr-

FlKure 2 : séquence de la CPD-Y (67) l e résidu Ser 146 e s t la serine du s i t e a c t i f . Les résidus Aso sont l e s aaparagines porteuses des chaînes oligosaccharidiques.

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La position du résidu Cys a é t é i d e n t i f i é e dans la séquence de la cher- mi tase de Thennoactinomyces vulgaris mais aucune homologie de séquence de part et d ' a u t r e du résidu n'a été constatée avec la CPD-Ï ( 6 7 ) .

En ce qui concerne c e t t e dernière outre la serine et l ' h i s t i d i n e , néces- s a i r e s à l ' a c t e c a t a l y t i q u e , au moins quatre amino-acides contribuent au bon positionnement du substrat i n t e r a g i s s a n t avec l'enzyme. Les methionines Met-313 ec Met-398 a i n s i que la cysteine Cys-3«1 et une tyrosine font p a r t i e de ce type de r é s i d u s .

Par mutagénèse dirigée on a remplacé c e r t a i n s de ces acides aminés (Met-398 —> Leu-398) et étudié l e s a c t i v i t é s peptidase et e s t e r a s e de la CPD-Y modifiée (68). On a a i n s i confirmé leur l o c a l i s a t i o n dans le s i t e a c t i f en plus de la détermination effectuée après action d'agents chimiques. Les methionines Met-313 et Met-398 a i n s i qu'une tyrosine font p a r t i e du s i t e S'^ a l o r s que la cysteine Cys-341 appartient au s i t e Sj (schéma 3).

— S , — * S',-

SCOSL£BONO Q

P-NH-CH- C - N H - C H - C - 0^{+ ,}X^{l o )}

I *Stmtiitiiim '\\\imimmmmiuw.

2 l î

H-C-NH-CH-C-

P-NH-CH-C-NH-CH-C-NH, +^(b)

P-NH-CH-C-NH, +|(c)

yntiit/i .4 tut tni

•tmtitttlllà , 11miturirink uttiiuitHUHlèMtii.

I 9 |

P - N H - C H - C - O - C H j +f(d)

-^pr

Schéma 3 : représentation schématique du site actif de la CPD-Y. Mode de liaison de peptides, de peptides amidés ou de peptides estérifiés (activités peptidase (a), peptidyl amino-acide amide hydrolase (b), amidase (c) et esterase (d)).

schéma extrait de (69)

L'importance de la serine au sein du s i t e actif de la CPD-Y a i n s i que la présence d'une h i s t i d i n e p a r t i c i p a n t à l ' a c t i v i t é catalytlque i n c i t e r t à penser que le mécanisme réactlonnel de l'enzyme est proche de c e l u i des endoprocéases â s e r i n e . Le mécanisme d ' a c t i o n de ces enzymes consiste en un système de r e l a i s de charge impliquant l e s résidus s é r y l e , h i s t i d y l e et aspartyle (69).

5 - P t l l l i a t i o n d« 1» CPD-Y en synthèse peptidique

La CPD-Ï de par ses p r o p r i é t é s esc capable de c a t a l y s e r la formation de l i a i s o n s peptldiques selon le schéma suivant (70) (71) :

R, o '' 1

-CH-C-OH •>

R, 0 ^k R, O

R - N H - C H - C - R , • EH . > R ; N H - C H - C - E * RjH

*-f K. 0 R, O R - N H - C H - C - N H - C H - C - R . * EH

Ro - groupement b l o q u a n t

c h a î n e l a t é r a l e d ' u n

R-j ™ — OCH'j y —OC « H e , —OC-jH^

R4 - - O H , - N H , , - O C H3

EH • e n z y m e

Schgm 4 : mécanisme de 1* synthase d'une l i a i s o n peptidiqu* catalysée par la CPD-Ï

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En présence d'un acide aminé N- bloqué et e s t é r i f i é ( I ) i l se forme r a - pidement un acylenzyme qui e s t désacylé de façon compétitive par l ' e a u et par l ' a c i d e aminé qui se comporte comme un accepteur nucléophile ( I I ) .

Le f a i t que le s u b s t r a t s o i t e s t é r i f i é permet de remplir la condition k2 » k3 * kv

Par a i l l e u r s s i l ' o n admet que kj » k , et que l'on se place dans les conditions où k⁴ » k_^, lorsque en outre on a k^ [nucléophile] > k, [H,Oj , le produit de synthèse se forme plus rapidement que le produit d'hydrolyse.

En d'autres termes l'augmentation de la concentration en acide aminé nu- cléophile favorise la formation du produit de synthèse.

En ce qui concerne le s u b s t r a t e s t é r i f i é le blocage de l ' e x t r é m i t é N- terminale de p e t i t s peptides augmente le rendement de t / n t h è s e . La t a i l l e du groupement alkylant influence peu le rendement ( 7 1 ) .

L'acide aminé C- terminal du substrat a i n s i que l ' a c i d e aminé à i n t r o - duire doivent ê t r e des L- énantiomères. Cependant la présence d'un acide de la s é r i e D en avant dernière p o s i t i o n sur le peptide substrat n'empêche pas la syn- thèse peptidique mais f a i t chuter le rendement ( 7 1 ) .

Lorsque le s u b s t r a t porte un e s t e r et lorsque le nucléophile propose est un acide aminé l i b r e i l e s t important de r é a l i s e r la réaction à un pH supérieur à 9 afin que le groupement NH0 s o i t aussi bien déprotoné que p o s s i b l e .

A ce pR la CPD-Y conserve une a c t i v i t é escérase élevée a l o r s que son a c - t i v i t é peptidase e s t minimale. Ainsi on évite que le produit de synthèse subisse une hydrolyse après sa formation (70) (71).

Malgré ces précautions le rendement de condensation ne dépasse pas 50 ï . De plus 11 dépend fortement de la narure de l ' a c i d e aminé nucléophile a i n s i que de la longueur et de la séquence du substrat e s t é r i f i é ( 7 2 ) .

Si le nucléophile e s t un acide aminé e s t é r i f i é la réaction de synthèse se complique dans la mesure où le peptide formé e s t aussi sous forme e s t é r i f i é e .

La CPD-Y peuc a l o r s 1 ' u t i l i s e r comme subscraC pour une nouvelle syrchese, ce qui diminua le rendement: de la réaction i n i c i a l e (73) (74).

Les meilleurs nucléophiles sont les acides aminés amidés. I l s sonc à l ' o r i g i n e des rendements de synthèse l e s plus élevés ( e n t r e 50 et 95 X). Un pH supérieur à 9 n ' e s t pas strictement nécessaire puisque l'on '.vite l ' i n f l u e n c e du groupe carboxylique sur le groupe NH2 du oucléophile ( 7 2 ) .