VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION

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FAVV – BESTUUR LABORATORIA

AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE LABO : LFSAL SECTION : Chimie humide

VALIDATIERAPPORT – RAPPORT DE VALIDATION

Méthode d’analyse Code I-MET: MET-LFSAL-115

Code scope BELAC: 1037

Détermination de la teneur en Phosphate par HPLC-CI

Technique HPLC-CI

Matrice / Groupe de matrices

Boissons Paramètre / Groupe de

paramètres

Phosphates

Type de validation¹ Scope fixe Totale

Responsable pour le suivi de la validation

Nicolas Di Cintio

Début validation 2009 Fin validation 2010

Le personnel qui a participé à la validation: La tâche :

Isabelle Monisse Essais de validation

Naam:

Nom:

Datum:

Date:

Rédaction du rapport par :

N. Di Cintio 15/01/2019

Vérification du rapport par²:

O. Pallares 30/07/2019

&

06/08/20019 Méthode approuvée et

jugé convenable par³:

P. Genot 07/08/2019

Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals beschreven in de procedure van het desbetreffend domein.

Ce qui suit est une description des résultats de l'étude de validation comme décrit dans la procédure du domaine concerné.

1 Supprimer ce qui ne convient pas

2 Différent de l'auteur

3 Le chef de section ou le manager du laboratoire

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AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE

LABO : LFSAL SECTION : Chimie humide

Samenvatting validatiegegevens – Résumé des données de validation

Groupe de matrice Sodas

Domaine de validation Gamme de quantification 100 mg/l – 1000 mg/l PO4

Modèle mathématique quadratique

Etalonnage Critère sur l'étalonnage ± 10 %

Critère sur l'identification par temps de

rétention ± 1 min

Sélectivité, Spécificité

Technique analytique HPLC -CI

Critère sur le rendement entre 80% et 110 %

CVr MAX (= 2/3 CVHOR) 4,8%

Répétabilité

CVr 0,73%

Répétabilité 10,7 mg/l

CVr MAX (=CVHOR) 6,3%

Reproductibilité intra- laboratoire

CVRr 1,3%

Reproductibilité 19,1 mg/l Incertitude de mesure basée sur la fidélité

intermédiaire et le biais 13,2% 11,6% Incertitude de mesure

• La validation répond aux exigences des la procédures LAB 00 P180

• Le laboratoire qui veut appliquer cette méthode doit démontrer que les critères ci- dessous soient remplis :

a) Répétabilité et reproductibilité intra-laboratoire : les coefficients de répétabilité et de reproductibilité devront être inférieurs ou égaux aux coefficients présentés dans le dossier de validation.

b) Justesse : Dans la mesure du possible, participation à des tests inter-laboratoires (ou comparaison avec un laboratoire accrédité) et obtention de résultats corrects. A défaut, les rendements sur des échantillons supplémentés seront utilisés pour évaluer le rendement apparent (les résultats devront être compris entre 70% et 110 %).

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Historique de validation :

Edition Révision par/date Motif de la révision Modifications 1 Etienne-Thewissen

Fabian – 08/10/2013 Adaptation au nouveau template Adaptation au nouveau template du dossier de validation.

2 Etienne-Thewissen Fabian – 21/10/2013

Adaptation en fonction des remarques pour publication

Approbation par P. Genot

3 Nicolas Di Cintio – 15/01/2019

Révision quinquennal, adaptation au nouveau template, suivi de l’AI

L’ensemble du document

Table des matières.

1. Généralités sur les phosphates 2. Critères de validation

Domaine de validation Modèle de régression Sélectivité

Spécificité

Répétabilité et reproductibilité intra-laboratoire Rendement apparent

Justesse Robustesse LOD LOQ

Incertitude de mesure 3. Résultats

Domaine de validation Modèle de régression Sélectivité

Spécificité

Répétabilité et reproductibilité intra-laboratoire Rendement apparent

Robustesse LOD LOQ

Incertitude de mesure

Annexe 1 : Flowchart de la méthode

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1. Généralités

Les phosphates exprimés en acide phosphorique sont des additifs alimentaires représentés par le symbole E338 sur l’étiquette.

Il peut être présent dans les sodas mais avec une teneur maximale autorisée de 700 mg/l exprimée en pentoxyde de phosphore (P2O5).

Même s’il ne présente pas un risque majeur pour la santé, certaines études suspectent qu’une consommation quotidienne de sodas contenant de l’acide phosphorique à concentration élevée, pourrait attaquer l’émail des dents, voire entrainer une décalcification des os.

Calendrier des essais :

Date Analyste Blanc

méthode Matrice Dopé New Cal. Nbre level Contrôles

28/05/2009 I.MONISSE OUI Soda* Non OUI 6 1ère ligne

05/01/2010 I.MONISSE OUI Soda* Oui OUI 6 1ère ligne

*Matrice contenant naturellement des phosphates.

2. Critères de validation

• Domaine de validation

Le domaine de validation de la méthode sera caractérisé par la gamme de concentration où la méthode aura été validée et les matrices analysées.

• Modèle de régression

La courbe d’étalonnage sera construite sur un minimum de 5 points et le modèle de régression appliqué entre la concentration extrapolée et la concentration théorique devra conduire à une déviation inférieure à 10%.

• Sélectivité

Une méthode d’analyse est sélective si elle est capable de discerner le composant à déterminer des autres composants interférents ou de la matrice. L’analyse HPLC devra permettre de séparer les phosphates des autres constituants de la matrice.

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• Spécificité

Une méthode d’analyse est spécifique si elle ne mesure que la caractéristique (par ex. composant) que l’on souhaite mesurer. La spécificité de l’analyse sera assurée par l’absence d’un pic supérieur à 0,5 x le level 1 au temps de rétention des phosphates (+/- 1minute par rapport au contrôle) lors de l’injection d’un blanc matrice.

• Répétabilité et Fidélité intermédiaire

La répétabilité et la fidélité intermédiaire seront calculées à partir de minimum 3 séries de 3 essais. Pour être dans les conditions de reproductibilité intra-laboratoire, il faut faire varier au moins un paramètre (analyste, jour, appareil, ...) d'une série à l'autre.

Les %RSDr et %RSDRW calculés devront être inférieurs ou égaux aux valeurs maximales admissibles découlant de l'équation d'Horwitz :

%RSDr < CVHor x 2/3

%RSDRw <CVHor

En présence de normes, la répétabilité et la reproductibilité devront être inférieures ou égales aux valeurs mentionnées.

• Rendement apparent

Le rendement apparent sera estimé au départ d’échantillons supplémentés en phosphate et devra être compris entre 70% et 110%

• Justesse

Dans la mesure du possible, le laboratoire participera à des études inter-laboratoires et la justesse sera estimée sur base du Z-score : -2 < Z-score <2

• Robustesse

Les facteurs principaux risquant d’influencer le résultat doivent être envisagés au cours de la validation de la méthode (Ex : opérateur, jours, colonne, insert, entretien du système, etc…). La robustesse est évaluée par le respect des critères de qualité de la méthode.

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• LOD

La plus faible quantité mesurée d’un composant qui peut être détectée dans l’échantillon d’analyse, avec une certaine probabilité statistique, à l’aide de la méthode d’analyse. Il s’agit d’un critère qualitatif qui résulte en un rapport signal/bruit de 3. S’il existe une norme et que le rapport S/N à la norme est supérieur à 20, la LOD ne sera pas calculée.

• LOQ

La plus faible concentration mesurée d’un composant qui peut être quantifiée dans l’échantillon d’analyse, avec une certaine fidélité et justesse, à l’aide de la méthode d’analyse. Il s’agit d’un critère quantitatif qui résulte en un rapport signal/bruit de 6. S’il existe une norme et que le rapport S/N à la norme est supérieur à 20, la LOQ ne sera pas calculée.

• Incertitude de mesure

L’incertitude de mesure sera calculée conformément à la procédure centralisée LAB00 P508.2014/830/LAB

« Validation de la méthode et scope d'accréditation » au point 5 « Incertitude de mesure ».

3. Résultats des données de validation :

L’ensemble des résultats présentés dans le dossier sont exprimés en PO4

MM PO4 : 94,97 MM P2O5 : 141,94

Domaine de validation :

La méthode est validée pour déterminer la teneur en phosphates (exprimée en P2O5) aux environs de la norme de 700 mg/l.

Modèle de régression

La droite d’étalonnage, construite sur un minimum de 5 points, couvre une gamme de concentrations comprise entre 100 mg/l et 1000 mg/l. Le modèle de régression quadratique entre le signal mesuré et la concentration théorique conduit à une déviation inférieure à 10% entre la concentration théorique et la concentration mesurée.

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PHOSPHATES - Droite de calibration du 28/05/2013

Valeur théorique (mg/l) Valeur mesurée (mg/l) % de déviation

Level 1 10 10,10 -1,04

Level 2 25 24,87 0,52

Level 3 50 49,91 0,17

Level 4 75 75,19 -0,26

Level 5 100 99,92 0,08

Sélectivité

La sélectivité de la méthode est assurée par la séparation chromatographique sur une colonne Metro A Supp 150 mm x 4 mm.

Spécificité

Aucun pic supérieur à 0,5 x le Level 1 n’est observé au temps de rétention du phosphate (+/- 1 minute) lors de l’injection de la solution d’extraction.

y = 0,00003366x²+ 0,07487380x - 0,14057169 R² = 0,99998536

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00

0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00

Surface

mg/l PO4 : modèle quadratique

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Chromatogrammes d’une solution à 10 mg/l et d’un Blanc

Répétabilité et fidélité intermédiaire

Les essais ont été réalisés sur un cola, matrice qui contient naturellement des phosphates.

6 essais à 500 mg/l par série, 3 séries.

JOUR 1 (mg/l PO4) JOUR 2 (mg/l PO4) JOUR 3 (mg/l PO4)

E1 516 515 520

E2 528 519 521

E3 529 514 520

E4 529 516 524

E5 528 513 526

E6 533 516 521

Level 1

Blanc

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Concentration

(mg/l) n x p Répétabilité : 2,8 x Sj (mg/l)

Reproductibilité :

2,8 x Sj (mg/l) CVr (%) CVr

Max (%) – 2/3 CVHor

CVR (%) CVR

Max (%) – CVHor

521,6 3 x 6 10,7 19,1 0,73 4,2 1,3 6,3

Rendement apparent

Le rendement apparent est évalué sur les échantillons de limonade supplémentés en phosphate à 3 niveaux.

Série du 04/01/2010 Niveau dopage

333 mg/l (%)

Niveau dopage 500 mg/l (%)

Niveau dopage 750 mg/l (%)

Essai 1 100.9 103.2 103.1

Le rendement apparent de chaque série respecte le critère 70%-110%.

Robustesse

Les paramètres suivants ont varié lors des essais de validation : jour, opérateurs, colonne HPLC, lots de solvants. La robustesse de la méthode est également évaluée au cours du temps au départ de la carte de contrôle. L’ensemble des critères qualité de la méthode ont été systématiquement respectés.

Limites de détection et de quantification :

Le rapport S/N d’un échantillon dont la teneur en phosphates est proche de la norme est > à 50. Par conséquent, les limites de détection et de quantification n’ont pas été calculées.

Incertitude de mesure

L’incertitude de mesure de 13,2% est calculée selon la procédure P508 au départ de la carte de contrôle sur 35 résultats.

L’incertitude de mesure combinée recalculée en 2019 pour les matrices arômes et limonade sur base des données de validation initiales, des cartes de contrôles et des PT est de :

11.6 %

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L’incertitude de mesure actualisée est disponible dans la liste des Incertitudes de mesure de la section Chimie Humide L-010-01-Incertitude mesure AL et le calcul de celle-ci se trouve dans le dossier M:\LABORATOIRE\SECTIONS\Chimie Humide\Analyse\méthode\MET115-Phosphates\IM

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ANNEXE 1

Flow chart : « Détermination de la teneur en phosphates dans les sodas par HPLC-CI

Prélever environ 100 ml.

Dégazer environ 10’

au bain à US.

Prélever précisément 10 ml.

Amener à 100 ml avec de l’eau déminéralisée

SI ECHANTILLON DOPE :

Ajouter précisément 5 ml de NaNH4HPO4.4H2O au 10 ml d’échantillon.

Amener à 200 ml avec de l’eau déminéralisée si c’est un cola.

Amener à 100 ml avec de l’eau déminéralisée si c’est une limonade.