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la translocation de Candida albicans à travers la barrière
intestinale
Tracy Paradis
To cite this version:
Tracy Paradis. Les jonctions serrées des entérocytes comme cible pour la translocation de Candida albicans à travers la barrière intestinale. Médecine humaine et pathologie. Université Bourgogne Franche-Comté, 2021. Français. �NNT : 2021UBFCI005�. �tel-03230541�
THESE DE DOCTORAT DE L’ETABLISSEMENT UNIVERSITE BOURGOGNE FRANCHE-COMTE PREPAREE à l’UMR PAM A, équipe VAlMis, Agrosup Dijon
Ecole doctorale n°554 Environnement-Santé
Doctorat de Sciences de la Vie
Par PARADIS Tracy
Les jonctions serrées des entérocytes comme cible pour la translocation de
Candida albicans à travers la barrière intestinale
Thèse présentée et soutenue à Dijon, le 25 Mars 2021
Composition du Jury :
M. Christophe d’Enfert Professeur des Universités, Unité de Biologie et Pathogénicité Fongique Président
(INRAUSC2019), Institut Pasteur, Paris
Mme. Sophie Thenet Directrice d’étude à l’EPHE, UMR_S938 Centre de recherche Saint- Rapporteure
Antoine (CRSA), équipe Microbiote Intestin Inflammation, Hôpital St-Antoine, Paris
M. Boualem Sendid Professeur des Universités, Inserm U1285 « Glycobiology in Fungal Rapporteur
Pathogenesis and Clinical Applications », CNRS UMR8576 unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, Université de Lille
International Center (LIRIC), faculté de Médecine, Université de Lille 2
M. Frédéric Dalle Professeur des Universités, UMR PAM A, équipe VAlMIs, Agrosup, Directeur de thèse
Université de Bourgogne, Dijon
Mme. Fabienne Bon Maîtresse de conférences, UMR PAM A, équipe VAlMIs, Agrosup, Codirectrice de thèse
Université de Bourgogne, Dijon
M. Dominique Ferrandon Directeur de recherche, UPR 9022 du CNRS, Institut de Biologie Invité
THESE DE DOCTORAT DE L’ETABLISSEMENT UNIVERSITE BOURGOGNE FRANCHE-COMTE
PREPAREE à l’UMR PAM A, équipe VAlMis, Agrosup Dijon
Ecole doctorale n°554
Environnement-Santé
Doctorat de Sciences de la Vie
Par
PARADIS Tracy
Les jonctions serrées des entérocytes comme cible pour la translocation de
Candida albicans à travers la barrière intestinale
Thèse présentée et soutenue à Dijon, le 25 Mars 2021
Composition du Jury :
M. Christophe d’Enfert Professeur des Universités, Unité de Biologie et Pathogénicité Fongique Président
(INRAUSC2019), Institut Pasteur, Paris
Mme. Sophie Thenet Directrice d’étude à l’EPHE, UMR_S938 Centre de recherche Saint- Rapporteure
Antoine (CRSA), équipe Microbiote Intestin Inflammation, Hôpital St-Antoine, Paris
M. Boualem Sendid Professeur des Universités, Inserm U1285 « Glycobiology in Fungal Rapporteur
Pathogenesis and Clinical Applications », CNRS UMR8576 unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, Université de Lille
International Center (LIRIC), faculté de Médecine, Université de Lille 2
M. Frédéric Dalle Professeur des Universités, UMR PAM A, équipe VAlMIs, Agrosup, Directeur de thèse
Université de Bourgogne, Dijon
Mme. Fabienne Bon Maîtresse de conférences, UMR PAM A, équipe VAlMIs, Agrosup, Codirectrice de thèse
Université de Bourgogne, Dijon
M. Dominique Ferrandon Directeur de recherche, UPR 9022 du CNRS, Institut de Biologie Invité
Remerciements
• Cette thèse fut réalisée au sein de l’unité mixte de recherche « Procédés Alimentaires et Microbiologiques » (UMR PAM). Elle est le résultat d’un long travail personnel mais surtout collaboratif. Je tiens à adresser tous mes remerciements aux personnes sans lesquelles cette thèse n’aurait pas pu aboutir et qui m’ont ainsi permis d’avancer dans mon projet professionnel. Premièrement, je remercie Monsieur Frédéric Dalle, Professeur à l’Université de Bourgogne et directeur de mon travail de thèse, de m’avoir donné l’opportunité de réaliser cette thèse au sein de son équipe. Je remercie également Madame Fabienne Bon, Maîtresse de Conférences à l’Université de Bourgogne, co-directrice de ma thèse. A tous les deux, je vous remercie du temps que vous m’avez consacré, de vos enseignements, de la transmission de vos expériences professionnelles et des conseils que vous m’avez dispensé au cours de ces trois années.
Je remercie Madame Sophie Thenet, Directrice d’étude à l’EPHE, Monsieur Boualem Sendid, Professeur à l’Université de Lille, et Monsieur Christophe d’Enfert, Professeur à l’Institut Pasteur, pour m’avoir fait l’honneur d’évaluer cette thèse en tant que rapporteurs et examinateurs.
Je remercie également Monsieur Bernard Bonnotte, Professeur à l’Université de Bourgogne, ainsi que Monsieur Dominique Ferrandon, Directeur de recherche au CNRS à Strasbourg, pour avoir accepté de constituer mon comité de suivi de thèse. Echanger avec vous sur mon projet de thèse fut agréable et constructif. Je vous remercie de la justesse de vos conseils.
J’adresse aussi mes remerciements à ma référente de thèse, Aurélia Bugaiska. Nos échanges me permirent de prendre du recul et de relativiser sur mes attentes de la thèse et de l’apprécier à sa juste valeur.
Enfin, je remercie l’ensemble de l’équipe du B3 Médecine au sein de laquelle cette thèse fut réalisée. Merci au Dr. Louise Basmaciyan, au Dr. Marc Sautour, au Dr. Pierre Lapaquette et au Dr. Hervé Bègue pour votre convivialité, la richesse de vos conseils et le partage de votre expérience de la vie en laboratoire.
• La réalisation d’une thèse de science est également une expérience de vie faite de belles rencontres avec de bons moments passés venant équilibrer certains moments de doute et d’incertitude.
Ainsi, un merci à Amandine, technicienne indispensable de l’équipe où j’ai réalisé cette thèse. Ta bonne humeur communicative et ton incroyable patiente d’écoute (et dire que j’ai su mettre le niveau très haut, tu ne peux pas en dire le contraire) ont égayé ces trois années. Ce fut un plaisir de t’avoir eu comme collègue !
Merci également à Camille, la petite stagiaire qui est devenue une véritable amie. Tu as su éclaircir des moments nuageux de ma thèse par ta positivité. J’espère que notre rencontre n’est que le début d’une longue amitié. Merci aussi à Marjorie, l’autre petite stagiaire. Ta joie de vivre et ta gentillesse sont une vraie bouffée d’air frais !
Enfin, des remerciements à Elise pour le partage de son expérience de doctorante. Dire que notre amitié repose sur une rencontre ambigüe en formation ! C’est un plaisir d’être ton amie.
• Par l’investissement personnel qu’elle demande, la thèse va également au-delà du temps passé au laboratoire. Je tenais donc, tout naturellement, à remercier mes proches, famille et amis, qui m’ont toujours soutenu et encouragé dans mes choix personnels et professionnels.
Pour commencer, un petit clin d’œil pour Néro : ton flegme reste un mystère pour moi et une source d’inspiration.
Je tiens ensuite à remercier ma grand-mère pour sa sagesse et son écoute. Nos discussions dans le cadre calme et verdoyant de ton jardin me permettent de me ressourcer.
Un merci également à Julie, ma sœur jumelle, la personne qui me connait le mieux et avec qui je partage cette relation si privilégiée. Malgré la distance, tu es toujours présente dans les meilleurs comme les moins bons moments de ma vie.
Je remercie aussi mes parents. Je suis fière des valeurs que vous avez su transmettre à vos enfants comme la rigueur dans le travail, la persévérance, et l’optimisme qui m’ont été si utiles dans ce chapitre de ma vie.
Enfin et surtout, je remercie mon charmant breton, Kilian, un homme aimant et patient qui sait m’apaiser. Tu es un véritable pilier sur qui je peux compter. Je n’imagine pas construire les prochains chapitres de ma vie sans toi.
1
Sommaire_______________________________________________
Liste des Figures ... 7
Liste des Tableaux ... 9
Liste des Abréviations ... 10
Introduction ... 15
Revue bibliographique ... 18
I Candida albicans ... 19
1. Biologie de l’agent fongique ... 19
1.1. Taxonomie ... 19
1.2. Morphologie et reproduction ... 20
1.3. Structure cellulaire et moléculaire ... 21
1.3.1. Le génome ... 21 1.3.2. Contenu cytoplasmique ... 22 1.3.3. Membrane plasmique ... 22 1.3.4. Paroi ... 23 a. Les glucanes ... 24 b. La chitine ... 24 c. Les mannanes ... 25
d. Les protéines pariétales ... 26
e. Les lipides et glycolipides ... 27
1.4. Le sécrétome ... 28
1.4.1. Les processus de sécrétion ... 28
1.4.2. Méthodes d’études du sécrétome par extrapolation génomique ... 29
1.4.3. Analyse du sécrétome par spectrométrie de masse... 31
1.4.4. Fonctions des protéines du sécrétome ... 35
1.4.5. Modulation du sécrétome protéique ... 39
a. Modulation en fonction de la forme morphologique... 39
b. Modulation en fonction des conditions environnementales/sites d’infection .... 39
1.5. Les facteurs de pathogénicité ... 42
1.5.1. Le dimorphisme ... 42
1.5.2. La transition phénotypique ... 43
1.5.3. Le thigmotropisme ... 44
2
1.5.5. Les attributs liés à sa réponse vis-à-vis de son environnement... 46
1.5.6. Les adhésines ... 47
a. Les protéines « Agglutin Like Sequence » (Als) ... 47
b. Les protéines « Hyphal Wall » et « Repressed by Tup1 » ... 48
c. La protéine « Enhanced Adherence to Polystyrene » ... 49
d. La protéine « Integrine-like surface » et la mannosyltransférase Mnt1 ... 49
e. La protéine « Hyphally regulated » et protéines de la famille IFF ... 49
1.5.7. La sécrétion d’hydrolases et autres enzymes lytiques ... 50
a. Les « Secreted aspartyl proteinases » ... 50
b. La candidalysine ... 51 c. Les phospholipases ... 52 d. Les lipases ... 52 2. Les candidoses ... 53 2.1. Facteurs favorisants ... 53 2.1.1. Facteurs intrinsèques ... 53 2.1.2. Facteurs extrinsèques ... 54
2.2. Les candidoses superficielles ... 55
2.2.1. Candidoses cutanées et unguéales ... 55
2.2.2. Candidoses génitales ... 55
2.2.3. Candidoses oro-digestives ... 55
2.2.4. Candidoses urinaires ... 56
2.3. Les candidoses invasives ... 56
2.3.1. Epidémiologie ... 57 2.3.2. Sources de contamination ... 57 2.3.3. Manifestations cliniques ... 58 II Barrière intestinale ... 61 1. La barrière intestinale ... 61 1.1. La paroi digestive ... 61 1.2. L’épithélium ... 62 1.2.1. Organisation cellulaire ... 62
a. Les cellules souches et les cellules de Paneth ... 63
b. Les entérocytes ... 64
3
d. Les cellules entéro-endocrines ... 65
e. Les cellules M ... 65
f. Les cellules Tuft et les cellules Cup ... 65
1.2.2. Les jonctions intercellulaires ... 66
a. Les jonctions communicantes ... 66
b. Les desmosomes ... 67
c. Les jonctions adhérentes (JAs) ... 67
1.3. Les jonctions serrées (JSs) ... 68
1.3.1. Organisation structurale ... 69
a. Claudines ... 70
b. Occludine ... 72
c. Tricelluline ... 73
d. Molécules d’adhérence jonctionnelles (JAMs) ... 74
e. Zonula occludens (ZO) ... 74
1.3.2. Fonctions des JSs ... 75
1.3.3. Formation des JSs ... 76
1.3.4. Modulation des JSs ... 76
a. Modulation du complexe actine/myosine péri-jonctionnel ... 77
b. Influence de la composition de l’alimentation sur l’intégrité des JSs ... 78
c. Peptides et composés non alimentaires ... 82
d. Cytokines et médiateurs inflammatoires ... 82
1.3.5. Perméabilité de la barrière intestinale... 84
2. Interactions barrière épithéliale/micro-organismes ... 85
2.1. Modulation des JSs par les agents microbiens ... 85
2.1.1. Micro-organismes et altération des JSs ... 85
2.1.2. Micro-organismes et renforcement des JSs ... 93
2.2. Translocation d’agents pathogènes à travers la muqueuse intestinale ... 96
2.3. Cas particulier : interaction de C. albicans avec la barrière épithéliale intestinale 97 2.3.1. Colonisation de la muqueuse ... 97
2.3.2. Adhérence aux cellules épithéliales intestinales ... 99
2.3.3. Translocation et invasion ... 99
a. Transcytose ... 99
4
2.3.4. Dommages cellulaires ... 102
Valorisation scientifique et résultats ... 103
I Premier article : Article de synthèse sur la barrière intestinale et les interactions de Candida albicans avec son hôte. Publié dans Tissue Barrier, Juin 2019. ... 104
1. Présentation ... 104
2. Article: Candida Albicans Interactions With The Host: Crossing The Intestinal Epithelial Barrier - Tissue Barrier – Juin 2019 ... 106
II Second article : Article de synthèse sur les jonctions serrées intestinales et leur modulation par les agents pathogènes du tractus digestif. Publié dans The International Journal of Molecular Sciences, Mars 2021. ... 137
1. Présentation ... 137
2. Article: Tight junction as a key for pathogens invasion in intestine epithelial cells – International Journal of Molecular Sciences – Mars 2021 ... 138
III Résultats des travaux de thèse : Interaction de C. albicans avec les cellules épithéliales intestinales : modulation des jonctions serrées (JSs) intestinales par le sécrétome de la levure potentialisant son endocytose ... 159
1. Introduction ... 159
2. Matériel et méthodes ... 160
2.1. Cellules entérocytaires et conditions de culture ... 160
2.2. Évaluation de la cytotoxicité des protocoles appliqués sur les cellules entérocytaires……….…..161
2.3. Cellules fongiques ... 161
2.3.1. Souches de C. albicans ... 161
2.3.2. Préparation des inocula de C. albicans ... 162
2.3.3. Préparation des inocula d’hyphes de C. albicans ... 162
2.3.4. Préparation des inocula de C. albicans inactivé par le thimérosal ... 162
2.3.5. Préparation du sécrétome de C. albicans ... 162
2.4. Traitement des cellules Caco-2 avec des peptides de synthèse ... 163
2.5. Mesure de la TEER ... 164
2.6. Observation microscopique de l’occludine et de ZO-1 ... 164
2.7. Quantification protéique par Western blotting ... 164
2.8. Expression des gènes de ZO-1 et occludine des JSs ... 165
2.9. Inhibition de la formation du protéasome et de la voie de recyclage autophagique ………..166
2.10. Test d’adhérence ... 166
5
2.12. Analyses statistiques ... 167
3. Résultats ... 168
3.1. Modulation la perméabilité de la monocouche d’entérocytes Caco-2 par le sécrétome de Candida albicans ... 168
3.1.1. Optimisation du protocole de production du surnageant de culture fongique et conservation du sécrétome fongique ... 168
a. Influence du pH du milieu de culture servant à la préparation du surnageant de culture sur les propriétés modulatrices de perméabilité cellulaire du sécrétome .... 169
b. Influence de l’inoculum fongique (servant à la préparation du surnageant de culture) sur les propriétés modulatrices du sécrétome ... 171
c. Influence de la congélation sur les propriétés modulatrices sécrétome ... 172
3.1.2. Forme fongique impliquée dans l’effet modulateur du sécrétome sur la perméabilité de monocouches de cellules Caco-2 ... 173
3.1.3. Etude de la stabilité de l’ouverture des JSs induite par le sécrétome fongique ………...175
3.2. Altération des jonctions serrées associée à l’augmentation de la perméabilité entérocytaire par le sécrétome fongique ... 176
3.2.1. Observations microscopiques de la localisation de protéines constitutives jonctions serrées ... 176
3.2.2. Quantification des protéines constitutives des JSs, ZO-1 et occludine, par Western blotting ... 178
3.2.3. Expression des gènes codant l’occludine et ZO-1 constitutives des JSs chez les cellules Caco-2 traitées par du sécrétome fongique ... 178
3.2.4. Investigation de la voie de dégradation des protéines des JSs... 179
3.2.5. Mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la modulation des JSs des cellules Caco-2 par le sécrétome fongique ... 181
a. Effet du sécrétome sur différents pôles cellulaires ... 181
b. Investigation de la voie impliquant le récepteur EFGr/PAR ... 182
c. Investigation de certaines voies impliquant des kinases ... 184
3.3. Etude du sécrétome de C. albicans : identification d’un peptide fongique candidat dans la modulation de l’intégrité des JSs entérocytaires... 185
3.3.1. Analyse protéomique du sécrétome fongique ayant un effet modulateur des JS ………...185
3.3.2. Identification de la ou les protéine(s) impliquée(s) dans la fonction modulatrice du sécrétome ... 188
6 a. Etude de la modulation de la perméabilité au cours de traitement avec du sécrétome de C. albicans obtenus à partir de mutants délétés pour les gènes ECE1,
HWP1, SAP5, SAP9/10 ou RBT1. ... 188
b. Caractérisation du peptide de Rbt1 impliqué dans modulation de la perméabilité entérocytaire ... 190
3.3.3. Caractérisation phénotypique de la souche rbt1Δ/Δ de C. albicans ... 194
a. Longueur des filaments ... 194
b. Adhérence aux cellules entérocytaires ... 195
c. Invasion des cellules entérocytaires ... 196
3.4. La perte d’intégrité de la barrière intestinale induite par C. albicans facilite son invasion par endocytose ... 197
IV Discussion ... 200
V Conclusion ... 209
7
Liste des Figures__________________________________________
Figure 1 : Classification phylogénétique de la levure C. albicans ... 19
Figure 2 : Différentes formes morphologiques de C. albicans ... 20
Figure 3 : Structure de la paroi de C. albicans.. ... 23
Figure 4 : Protéines potentiellement sécrétées de C. albicans d’après analyse du génome de la levure. ... 30
Figure 5 : Caractérisation du sécrétome protéique en présence de conditions favorisant soit la forme blastoconidie soit la forme filamentée.. ... 40
Figure 6 : Morphologie de C. albicans en phase dite « white » et en phase « opaque ». ... 44
Figure 7 : Etapes de la formation de biofilm par C. albicans sur une surface biotique. ... 45
Figure 8 : Physiopathologie des candidoses invasives. ... 59
Figure 9 : Coupe schématique de l’organisation de la paroi intestinale... 61
Figure 10 : Organisation schématisée de l’épithélium muqueux au niveau de l’intestin grêle et du côlon ... 63
Figure 11 : Organisation des jonctions intercellulaires des entérocytes. ... 66
Figure 12 : Structure des jonctions adhérentes, des desmosomes et des jonctions communicantes cellulaires. ... 68
Figure 13 : Structure des jonctions serrées entérocytaires. ... 69
Figure 14 : Structure schématisée et interactions des principales protéines transmembranaires et de la plaque cytoplasmique constitutives des jonctions serrées ... 70
Figure 15 : Voies et récepteurs impliqués dans la modualtion des jonctions serrées entérocytaires sous différents stimuli extérieurs ………..………81
Figure 16 : Présentation des différentes voies possibles de la translocation de C. albicans au travers de la barrière épithéliale intestinale ... 100
Figure 17 : Protocole de production du sécrétome de C. albicans. ... 169
Figure 18 : Impact du pH du milieu utilisé pour la préparation du sécrétome de C. albicans sur son effet modulateur de la perméabilité entérocytaire.. ... 170
Figure 19 : Impact de l’inoculum utilisé pour la production du sécrétome de C. albicans sur la modulation des jonctions intercellulaires des cellules Caco-2. ... 171
Figure 20 : Effet de la congélation sur la capacité du sécrétome de C. albicans à moduler la perméabilité de la monocouche de cellules Caco-2. ... 172
Figure 21: Influence du morphotype de C. albicans sur la modulation des jonctions serrées de cellules Caco-2.. ... 174
Figure 22: Evaluation de la stabilité de l’ouverture des JSs induite par un prétraitement avec du sécrétome.. ... 176
Figure 23 : Désorganisation des JSs observée chez des cellules épithéliales intestinales traitées avec du sécrétome de C. albicans. ... 177
Figure 24: Quantification protéique de l’occludine et de ZO-1 par Western blotting issus d’extraits protéiques totaux de cellules Caco-2 traitées avec du sécrétome fongique. ... 178
Figure 25 : Expression génique relative de deux protéines constitutives des JSs, occludine et ZO-1, au cours du traitement des cellules Caco-2 avec le sécrétome fongique.. ... 179
Figure 26 : Modulation de la perméabilité de cellules Caco-2 par le sécrétome de C. albicans suivant un traitement avec l’inhibiteur du protéasome MG132 ou avec la chloroquine ... 180
Figure 27 : Modulation de la perméabilité des cellules Caco-2 en fonction du lieu de traitement des cellules épithéliales intestinales par du sécrétome fongique. ... 182
8
Figure 28 : Modulation de la perméabilité entérocytaire de cellules Caco-2 par le sécrétome de
C. albicans suivant un traitement avec l’antagoniste GG-8.. ... 183
Figure 29 : Investigation des principales voies de signalisation cellulaire connues dans la modulation des cellules épithéliales intestinales lors d’un traitement avec du sécrétome de C.
albicans. ... 184
Figure 30 : Schéma des termes d’ontologie génétique (GO term) axé sur les GO terms de C
albicans. ... 186
Figure 31 : Investigation du rôle des protéines fongiques Ece1, Hwp1, Sap5 et Sap9/10 dans la modulation de l’intégrité des JSs de la barrière épithéliale intestinale par le sécrétome de C.
albicans.. ... 189
Figure 32 : La protéine fongique Rbt1 est impliquée dans la modulation de l’intégrité des JSs de la barrière épithéliale intestinale.. ... 190 Figure 33 : Localisation des différents peptides d’intérêt au niveau de la protéine fongique Rbt1. ... 191 Figure 34 : Influence d’un traitement par les peptides Rbt1 issus de la protéine fongique Rbt1 sur la perméabilité entérocytaire. ... 193 Figure 35 : La déplétion du gène RBT1 ne modifie par les propriétés de filamentation de C.
albicans.. ... 194
Figure 36 : La déplétion du gène RBT1 n’induit pas de perte dans la capacité d’adhérence de
C. albicans aux cellules épithéliales intestinales... 195
Figure 37 : La déplétion du gène RBT1 induit une de perte dans la capacité d’invasion de C.
albicans des cellules épithéliales intestinales. ... 196
Figure 38 : L’invasion des cellules épithéliales intestinales par les formes levures et hyphes de
C. albicans SC5314 est augmentée par mécanisme d’endocytose lors du prétraitement des
entérocytes avec le sécrétome fongique présentant les peptides
9
Liste des Tableaux________________________________________
Tableau 1 : Liste non exhaustive des protéines identifiées dans le sécrétome de C. albicans.. ... 32 Tableau 2 : Répartition des différentes protéines des sécrétomes de la forme levure et de l’hyphe de C. albicans.. ... 36 Tableau 3 : Répartition des différentes protéines provenant du sécrétome des VEs et de la fraction soluble du surnageant de culture de C. albicans. ... 37 Tableau 4 : Liste non exhaustive de composés apportés par l’alimentation présentant un effet modulateur sur la perméabilité intestinale... 79 Tableau 5 : Cytokines pro- et anti-inflammatoires et facteurs de croissance présentant un effet modulateur sur la perméabilité intestinale... 83 Tableau 6 : Présentation de différents agents pathogènes et les mécanismes mis en jeu au cours de l’altération des jonctions serrées au niveau de la barrière épithéliale intestinale. ... 89 Tableau 7 : Présentation de différents probiotiques qui renforcent l’intégrité des JSs. ... 94 Tableau 8 : Souches de C. albicans utilisées au cours de travaux de cette thèse ... 161 Tableau 9 : Nom, localisation et séquence en acides aminés des différents peptides d’intérêt issus de la protéine fongique Rbt1. ... 163 Tableau 10 : Nom et séquence des peptides de la zonuline ... 163 Tableau 11 : Anticorps primaires et secondaires utilisés pour les Western blot... 165 Tableau 12 : Pourcentages des différents morphotypes fongiques obtenus après subcultures de 1 heure ou 4 heures.. ... 174 Tableau 13 : Protéines apparentées aux peptides identifiés dans le sécrétome de C. albicans modulant l’intégrité des JSs intestinales.. ... 186
10
Liste des Abréviations___________________________________
AAF-II : aggregation adherence factor II Ahr : aryl hydrocarbone receptor
Als : agglutinin-like sequence
AMPc : adénosine monophosphate cyclique Bgl : β-(1,3) glycosyltransférase
C. albicans : Candida albicans
CD86 : cluster de différenciation 86 CEBs : cellules épithéliales buccales Cellules M : cellules Microfold CFW: calcofluor white
Chs : chitine synthase Cht : chitinase
CMH : complexe majeur d’histocompatibilité COP : candidoses oropharyngées
CopII : coat protein complex II
Cph1: Candida pseudohyphal regulator 1 CQ: chloroquine
CR3 : récepteur du complément de type 3
CRISPR-Cas9 : clutered regularly interspaced short palindromic repeats (Courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées) and caspase 9
DAF: decay-accelerating factor
Dfg5: defective for filamentous growth 5
DSB: double stranded breaks (cassures d’ADN double brin) EAEC : Escherichia coli entéro-agrégatif
Eap1: enhanced adherence to polystyrene 1 Ece1: extent of cell elongation 1
ECM : extra cellular matrice (matrice extra cellulaire) Ecm33: extracellular mutant 33
Efg1: enhanced filamentous growth 1 EGF: epidermal growth factor
11 EHEC : Escherichia coli entérohémorragique
Eng1 : endoglucanase 1
EPEC : Escherichia coli entéropathogène
ESI-TOF: Electrospray ionization – time of flight ETEC : Escherichia coli entéro-toxinogène Exg1 : exoglucanase 1
5-Foa : acide 5-floroorotique
FT-ICR : Spectrométrie de masse à résonnance cyclotronique ionique de Fourier GAP: GTPase activating protein
Gas1: glycophospholipid anchored surface 1
GDP : glucose degration product (produit de dégradation du glucose) GlcCer : glucosylcéramides
GlcNac : N-acétyl-D-glucosamine GPI: glycosylphosphatidylinositol GSL: glycosphingolipide
GTP: guanosine triphosphate
GUT : gastrointestinally induced transition HA/P: hémagglutinine protéase
Hgc1: hyphal specific expression and related to G1 cyclins
HOG MAPK: high osmolarity glycerol response mitogen activated protein kinase Hrd3: HMG-coa reductase degradation 3
Hwp1 et 2: hyphal wall protein 1 and 2 HSP: heat shock protein
HtrA: high temperature requirement protein A Hyr1: hyphally regulated 1
IFF: IPF Family F IL : interleukine InlC : internaline C
Int1 : integrin like surface 1 IPF : individual protein file
12 JAs : jonctions adhérentes
JSs : jonctions serrées KO: knock-out
Kre9: killer toxin resistant 9 LAP: Listeria adhesion protein LIGHT : lymphotoxin-like protein Lip : lipase
LPS : lipopolysaccharide
MAPK : mitogen activated protein kinase Mb : mégabases
Mdp1 : multicopy suppressor of PDI1 deletion 1 MET : microscopie électronique à transmission MIPC : mannose inositol phosphocéramides Mit1 : Muc1 expressed independent of TEC1 Mnn9 : mannosyltransferase 9
Mp65 : mannoprotein 65 MTL : mating-like type
Nedd9 : neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 9 NF-κB : nuclear factor-kappa-chain-enhancer activated B cells
Ngr1 : negative growth regulatory 1
NLRP3 : inflammasome NACHT, LRR, PYD domain containing protein 3 NO : oxyde nitrique
ODcase : orotidine-5-phosphate decarboxylase ORFs : open reading frame (cadre de lecture ouvert) Ost3 : oligosaccharyltransférase 3
PAMPs : pathogen associated molecular patterns PCR : réaction de polymérisation en chaine
PDGFBB : facteur de croissance BB dérivé des plaquettes Pga4 : processing of Gasp1 and Alp 4
13 Phr1 : pH responsive protein 1
PkA : protéine kinase A PkC : protéine kinase C PlB : phospholipase B PLM : phospholipomannane
PNNs : polynucléaires neutrophiles PRRs : pattern recognition receptors Rbt1 : repressed by tup1
RE : réticulum endoplasmique Rhd1 : red homology domain 1 ROS : reactive oxygen species
RP-LC-MS/MS : reverse phase liquid chromatography tandem mass spectrometry/ mass spectrometry
Sap : secreted aspartyl proteinase
Scj1 : Saccharomyces cerevisiae DNA J 1 Scw1 : soluble cell wall 1
SDC : salt dextrose complete
SIDA : syndrome de l’immunodéficience acquise Skn1 : suppressor of Kre null 1
Sod1 : superoxide dismutase 1 SPI: Salmonella pathogenicity island StB: Escherichia coli stable toxin B Sur7 : suppressor of Rvs167 mutation Swp1 : suppressor of a WbP1 mutation 1 TGFβ : transforming growth factor β TNFα : tumor necrosis factor α TLR: toll like receptor
UDP : uridine diphosphate Utr2 : unidentified transcript 2 VEs : vésicules extracellulaires VHC : virus de l’hépatite C
14 ZO : zonula occludens
Zot : zonula occludens toxin
A noter : dans l’ensemble de ce mémoire, les abréviations des protéines seront notées avec une première lettre en majuscule et les lettres suivantes en minuscules accompagnées ou non d’un chiffre. Les gènes seront abrégés avec des lettres en majuscules et en italiques accompagnées ou non d’un chiffre. Les dénominations de mutation de gène seront exprimées en minuscules et italiques. Exemple : le gène CHS1 de C. albicans code la protéine Chs1. La délétion de ce gène permet d’obtenir le mutant chs1Δ/Δ de C. albicans.
Introduction
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16
Candida albicans (C. albicans) est une levure commensale du microbiote intestinal de
l’Homme. Son commensalisme résulte d’un équilibre entre sa relation avec les autres membres du microbiote, les mécanismes de défense de l’hôte et les propriétés biologiques de l’agent fongique (Grubb et al., 2008; Naglik et al., 2011). C. albicans est de loin la plus fréquemment isolée en mycologie médicale avec 70% de la population colonisée (Wächtler et al., 2011). Néanmoins, elle peut devenir un redoutable pathogène opportuniste chez les patients hospitalisés présentant un terrain fragilisé. Dans ce contexte, C. albicans est responsable d’environ une candidémie nosocomiale sur deux (Wisplinghoff et al., 2004). Ainsi, les candidémies et candidoses disséminées ou invasives sont considérées comme une véritable problématique de santé publique.
La physiopathologie des candidémies et candidoses disséminées repose sur une première étape de colonisation des muqueuses, leur envahissement suivi par la translocation des levures au compartiment sanguin. A partir de celui-ci, les levures disséminent aux différents organes. Il est admis que ces infections disséminées ont essentiellement une origine endogène à partir du microbiote digestif (Ruhnke, 2002). Les caractérisations cellulaire et moléculaire de l’interaction de C. albicans avec les entérocytes apparaissent donc nécessaires pour mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors du passage du commensalisme à la pathogénicité. Une meilleure connaissance de ces mécanismes devrait également permettre l’amélioration de la prise en charge thérapeutique des patients développant des candidémies et candidoses disséminées. Différentes voies de translocation de la barrière intestinale par C. albicans ont été décrites : la transcytose à travers les cellules épithéliales et le passage paracellulaire (Richardson et al., 2018c). La transcytose implique deux mécanismes cellulaires : la pénétration active des hyphes de C. albicans, forme fongique considérée comme invasive, à travers les cellules épithéliales, et l’endocytose de l’agent fongique par les cellules épithéliales. Chez les cellules entérocytaires non altérées, seule la pénétration active des hyphes de C. albicans a été observée, contrairement à la muqueuse orale où les deux mécanismes sont possibles (Dalle et
al., 2010). Le mécanisme de l’endocytose de C. albicans par les cellules épithéliales repose sur
l’interaction d’invasines fongiques associées à la forme filamenteuse de C. albicans (dont Als3 et Ssa1) avec certains récepteurs des cellules épithéliales dont la nature est partiellement connue. Le récepteur le mieux décrit reste la protéine E-cadhérine constitutive des jonctions adhérentes (Phan et al., 2007). Néanmoins d’autres récepteurs cellulaires épithéliaux sont également impliqués (Wächtler et al., 2011; Zhu et al., 2012). Cette interaction est permise par l’organisation pluristratifiée et lâche (n’impliquant pas de jonctions inter-cellulaires serrées mais uniquement des jonctions lâches de type jonctions adhérentes et desmosomes) de l’épithélium buccal. A l’opposé, l’épithélium intestinal est organisé en une monocouche d’entérocytes intimement reliés entre eux par différentes jonctions cellulaires dont les jonctions adhérentes, les desmosomes mais surtout les jonctions serrées principalement responsables de l’imperméabilité et de l’effet barrière de l’épithélium digestif. Ainsi, les jonctions serrées jouent un rôle modulateur et protecteur des mécanismes d’invasion de C. albicans en limitant l’accès des invasines associées aux hyphes de C. albicans aux récepteurs cellulaires (dont la E-cadhérine) permettant l’initiation de l’endocytose (Perez-Moreno et al., 2003; Goyer et al., 2016). Par ailleurs, l’invasion tissulaire digestive par C. albicans est modulée par sa capacité à sécréter différents facteurs impliqués dans l’adhérence, l’invasion, la transcytose et in fine la destruction tissulaire digestive (Phan et al., 2007; Dalle et al., 2010; Moyes et al., 2016).
17 Parallèlement, il est rapporté que certains micro-organismes (bactéries entériques, levures commensales telles Saccharomyces boulardii, virus entériques…) et parasites sont capables de moduler l’intégrité des jonctions serrées par différents mécanismes, qui vont secondairement faciliter l’invasion digestive des agents pathogènes entériques ou au contraire renforcer l’effet barrière de la muqueuse digestive. Ces mécanismes modulateurs impliquent soit un contact direct de l’agent microbien avec les cellules épithéliales digestives, soit des molécules d’origine microbiennes sécrétées dans l’environnement épithélial digestif (exemple : protéases, toxines) (Berkes et al., 2003). Ainsi, dans ce contexte et compte tenu de l’originalité du modèle C.
albicans, qui en fonction des conditions environnementales peut se comporter en commensal
ou en pathogène, nous nous sommes posés la question de l’existence possible de tels mécanismes modulateurs des jonctions serrées, qui pourraient être initiés soit par la levure elle-même soit par des produits de sécrétion de C. albicans.
Ce travail débute par une revue bibliographique décrivant d’abord la biologie de C.
albicans et la physiopathologie des candidoses invasives suivies, dans une seconde partie, d’une
présentation de la barrière intestinale. Cette dernière partie s’achève par une présentation des micro-organismes et parasites capables de moduler l’intégrité des jonctions serrées entérocytaires et les conséquences de cette modulation sur la perméabilité digestive.
Cet état des connaissances représente ma contribution à un chapitre d’un article de synthèse portant sur les interactions de C. albicans avec la barrière digestive, et un article de synthèse sur la modulation des jonctions serrées et l’implication des micro-organismes entéro-pathogènes dans la rupture de la barrière digestive.
Mes travaux de thèse sont ensuite détaillés. Ils portent sur la modulation de l’intégrité des jonctions serrées par C. albicans dans un modèle d’interaction avec les cellules entérocytaires Caco-2, ainsi que sur la caractérisation des mécanismes cellulaire et moléculaire alors mis en jeu. Tout d’abord, nous avons montré une augmentation de la perméabilité épithéliale associée à une destruction de protéines constitutives des jonctions serrées en traitant les cellules entérocytaires par du surnageant de culture fongique, suggérant un rôle du sécrétome de C. albicans dans ces mécanismes modulateurs des jonctions serrées, pouvant impliquer un ou plusieurs facteur(s) fongiques. L’existence de ce ou ces facteur(s) a ensuite été investiguée par analyse protéomique de fractions du surnageant de culture fongique, qui nous a permis d’obtenir une liste de molécules peptidiques potentiellement candidates. Une caractérisation du/des facteur(s) candidat(s) a ensuite été réalisée par mesure de la perméabilité cellulaire après traitement de cellules entérocytaires par du sécrétome de différents mutants de
C. albicans et/ou par des peptides d’intérêt. Parallèlement nous avons réalisé l’étude des
mécanismes modulateurs des jonctions serrées alors mis en jeu par quantification de l’expression de certains gènes connus et impliqués dans les différentes voies de modulation des jonctions serrées. Pour finir, le rôle modulateur d’un peptide candidat, appartenant à la protéine Repressed by tup1 (Rbt1), a été mis en évidence. De plus, la modulation des jonctions serrées entérocytaires induite par C. albicans favorise alors son invasion en permettant son endocytose par les cellules entérocytaires.
Revue bibliographique
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19 I Candida albicans
Cette première partie porte sur une description de C. albicans et sa physiopathologie afin d’appréhender les mécanismes impliqués au cours des infections disséminées les plus sévères.
1. Biologie de l’agent fongique 1.1. Taxonomie
C. albicans est un organisme eucaryote unicellulaire appartenant au règne des Mycètes,
plus spécifiquement à celui des Micromycètes. La classification phylogénétique de ce champignon est présentée dans la Figure 1.
Figure 1 : Classification phylogénétique de la levure C. albicans (d’après les données
obtenues sur http://ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Broswer, septembre 2020).
Le genre Candida regroupe plus de 200 espèces mais seulement quelques-unes sont fréquemment isolées en pathologie humaine telles les espèces C. albicans, C. glabrata, C.
parapsilopsis, C. krusei et C. tropicalis (Mavor et al., 2005; Papon et al., 2013). D’autres,
comme C. dubliniensis, C. kefyr, C. lusitaniae, C. guillermondii et C. famata, sont plus rarement rencontrées en mycologie médicale (Kam and Xu, 2002). La prévalence des différentes espèces est dépendante du lieu géographique mais également du type de service hospitalier considérés (Pappas et al., 2018). Ces prévalences dépendent de l’émergence de nouvelles espèces, telle Candida auris isolée pour la première fois en 2009 qui peut être responsable de candidoses invasives graves en milieu hospitalier, en particulier chez les sujets immunodéprimés (Satoh et al., 2009; Jeffery-Smith et al., 2017). Néanmoins, l’espèce C.
albicans reste à ce jour la plus fréquemment isolée en milieu hospitalier (Kim et al., 2017;
20
1.2. Morphologie et reproduction
C. albicans est une levure aérobie, non pigmentée et non encapsulée. Elle présente la
capacité de croître sous diverses formes morphologiques aussi bien in vitro que chez l’hôte (Odds and Kerridge, 1985; Sudbery et al., 2004; Berman, 2006). Trois aspects différents sont majoritairement rencontrés : la levure, le pseudohyphe et le filament ou hyphe vrai (Figure 2).
Figure 2 : Différentes formes morphologiques de C. albicans Observations en microscopie
à l’état frais des formes levures, pseudohyphes et hyphes vrais. (A) Levure bourgeonnante, (B) Pseudohyphe avec constriction au niveau du col formé entre la cellule mère et la cellule fille (flèche blanche), (C) Hyphe avec branche, (D) Hyphe vrai sans constriction au niveau du bourgeon (pointe de flèche). Barre échelle : 10µm.
La forme levure, ou blastoconidie, est une cellule de forme sphérique à ovoïde, de taille variant de 2,7 x 2 µm à 10 x 6 µm. Elle se divise par bourgeonnement asymétrique (Bedell et
al., 1980).
Le développement des hyphes ou filaments vrais est associé à la formation de tubes germinatifs s’allongeant à partir de la levure, formant parfois des branches et pouvant également produire des blastoconidies (Odds and Kerridge, 1985). Des cloisons ou septa apparaissent secondairement afin de former une succession de compartiments appelés articles (Sudbery et
al., 2004).
Les pseudohyphes ou pseudofilaments sont considérés comme une forme de croissance intermédiaire entre celles de la levure et du filament vrai (Odds and Kerridge, 1985; Sudbery
et al., 2004). Ils résultent d’un allongement des bourgeons qui restent attachés à la cellule mère.
Les cellules pseudohyphes présentent alors une constriction au niveau du col formé avec la cellule mère mais aussi avec les bourgeons et à chaque jonction septale ultérieure mais sans cloisonnement. Ce caractère les différencie des filaments vrais. Les pseudohyphes s’organisent généralement en chainettes plus ou moins ramifiées. Leur morphologie varie énormément : de celle des levures avec des bourgeons allongés à celle semblable à des hyphes. Il n’est pas toujours aisé en microscopie optique de distinguer les formes hyphes et pseudohyphes qui sont souvent considérées conjointement sous le terme de « formes filamentées » (Odds and Kerridge, 1985; Sudbery et al., 2004).
En plus de ces trois morphotypes, C. albicans se présente sous une forme plus rare appelée chlamydospore. Ces spores possèdent une structure sphérique à paroi épaisse d’environ 10 µm de diamètre (Odds and Kerridge, 1985). Elles sont issues, théoriquement mais pas nécessairement, de cellules spécialisées appelées suspenseurs, des blastoconidies allongées qui se ramifient à partir d’hyphes et de pseudohyphes (Torosantucci and Cassone, 1983). Leur formation est favorisée en présence d’un environnement fortement limité en nutriments (Staib and Morschhäuser, 2006). Ces structures sont depuis longtemps observées in vitro mais ont été
21 récemment décrites in vivo, dans des reins de souris infectées par voie intraveineuse (Navarathna et al., 2016).
Par ailleurs, C. albicans forme des biofilms composés essentiellement d’une matrice extracellulaire renfermant une association de blastoconidies et de formes filamentées (Douglas, 2003).
Ce polymorphisme de C. albicans est influencé par des paramètres environnementaux comme la température, le pH, la disponibilité en nutriments, (…) (voir développement section facteurs de pathogénicité). Cette propriété lui confère la capacité de s’adapter, en particulier, aux différentes niches auxquelles C. albicans sera soumis au cours de l’invasion chez l’hôte (sang, différents organes, intestin…).
La reproduction de C. albicans est essentiellement asexuée, mitotique et donc clonale, par bourgeonnement de la forme levure (Legrand et al., 2019). Une reproduction sexuée est également possible dont le cycle implique des formes haploïdes, diploïdes et tétraploïdes (Legrand et al., 2019). Semblable aux loci sexuels MATa et MATα de Saccharomyces
cerevisiae, une région « Mating-Like Type » (MTL) code un régulateur transcriptionnel chez C. albicans. Ce régulateur contrôle l’expression de gènes spécifiques de la reproduction
méiotique et des éléments d’une voie de réponse aux phéromones (Hull and Jonhson, 1999; Tzung et al., 2001). Différentes souches sont décrites en fonction de leurs loci sexuels : souches homozygotes a/a et α/α et hétérozygotes a/ α. Des souches modifiées homozygotes a/a et α/α pour les loci MTL sont capables de s’accoupler et forment des cellules tétraploïdes aussi bien
in vitro qu’in vivo (Hull et al., 2000; Magee and Magee, 2000; Bennett and Jonhson, 2003).
Des formes haploïdes viables sont décrites in vitro en présence, par exemple, d’antifongiques comme le fluconazole, mais aussi in vivo dans un modèle d’infection systémique murin (Forche
et al., 2003, 2011). La combinaison de reproduction sexuée et la perte subséquente de
chromosome permet à C. albicans d’alterner entre diploïdie et tétraploïdie mais aussi haploïdie et diploïdie. Ce processus définit le cycle para-sexuel (Hickman et al., 2013). La majorité des isolats sont trouvés à l’état diploïde, considéré comme l’état de ploïdie préférentielle de cet agent fongique (Hickman et al., 2013).
1.3. Structure cellulaire et moléculaire
C. albicans présente l’ensemble des caractéristiques majeures des organismes
eucaryotes, et est caractérisé par l’existence d’un système vacuoles/vésicules important. 1.3.1. Le génome
Depuis 2004, le génome de la souche de référence SC5314 de C. albicans est complètement séquencé (Jones et al., 2004). Il se répartit en huit paires de chromosomes notées de 1 (la plus grande) à 7 (la plus petite). La huitième paire, notée R, contient une quantité plus ou moins variable d’ADN ribosomal. La taille des chromosomes varie de 1,03 à 4,3 Mégabases (Mb) portant à 16 Mb l’ensemble du génome. Un total de 6218 cadres de lecture ou Open Reading Frame (ORF) ont été identifiés et notés orf19.n (http://candidagenome.org). A ce jour, la fonction est connue pour seulement 27% d’entre eux.
22
1.3.2. Contenu cytoplasmique
Le cytoplasme contient un noyau, délimité par une double membrane nucléaire, et des organites dont des mitochondries, des peroxysomes, un réticulum endoplasmique, un appareil de Golgi, des phagolysosomes et des inclusions lipidiques. La présence d’un système vacuolo-vésiculaire développé caractérise également le contenu cytoplasmique de cette cellule fongique (Barelle et al., 2006). Ce système est d’ailleurs fortement impliqué dans la synthèse des constituants de la paroi et évolue en fonction des différentes phases du cycle cellulaire et des divisions de C. albicans (Richards et al., 2010).
De nombreuses protéines composent le cytosol fongique avec des fonctions structurales et des activités enzymatiques de type oxydase, phosphatase, peroxydase et ligase. Le nombre total de protéines cytosoliques exprimées est le même chez la levure et l’hyphe. Toutefois, la quantité relative de chaque protéine varie selon le morphotype (Martínez-Gomariz et al., 2009). Sur un total de 276 protéines cytosoliques identifiées, 156 d’entre elles sont sous-exprimées et 120 surexprimées chez la forme filamentée par rapport à la forme levure. A noter que seulement 83 protéines sur 276 ont été identifiées et leur fonctionnalité caractérisée, beaucoup d’entre elles intervenant dans le cycle cellulaire glucidique.
1.3.3. Membrane plasmique
La membrane plasmique est composée de deux feuillets. Chez la forme levure, elle contient majoritairement des protéines et des lipides ainsi qu’une petite fraction de carbohydrates et dans une très moindre mesure des acides nucléiques. L’ergostérol est le principal stérol qui compose cette membrane (Barnett et al., 1990). La membrane de la forme filamenteuse contient, quant à elle, significativement plus de carbohydrates (Marriott, 1975). Des différences quantitatives sont également observées pour les phospholipides, les stérols libres et estérifiés et les acides gras totaux des membranes, entre les formes levure et filamentées de C. albicans.
Les protéines constitutives de la membrane sont transmembranaires ou liées à celle-ci directement ou indirectement par des structures d’ancrage comme le glycophosphatidylinositol (GPI). Cabezón et al. ont identifié 214 protéines membranaires incluant 41 protéines déjà décrites comme protéines transmembranaires, 20 protéines associées à la membrane plasmique, 22 avec une localisation membranaire inconnue et 12 protéines à ancre GPI. Ces protéines à ancre GPI sont impliquées dans la biosynthèse de bio-polymères [exemple : protéines « glycophospholipid anchored surface 1 » (Gas1) et « unidentified transcript 2 » (Utr2)] et le remodelage membranaire [exemple : protéine extracellular mutant (Ecm33.3)](Cabezón et al., 2009). La protéine « suppressor of Rvs mutation » (Sur7) régule l’organisation de la membrane, la synthèse de la paroi et joue un rôle dans l’endocytose cellulaire (Alvarez et al., 2008; Wang
et al., 2016b).
La membrane plasmique constitue une barrière entre les composants intra et extra-cellulaires. Par ailleurs, elle est étroitement impliquée dans la croissance et la structure de la cellule, le transport des molécules dans et hors de la cellule et sert de base de support aux enzymes impliquées dans la synthèse pariétale (Shepherd, 1987; Jiang and Pan, 2018; Rane et
23
al., 2019). Enfin, des protéines membranaires sont impliquées dans l’invasion fongique comme
la « Secreted Aspartyl Proteinase » (Sap) 9 ou encore la phospholipase B (Ripeau et al., 2002). La membrane plasmique est une des principales cibles des traitements antifongiques (Lee et al., 2018; Khandelwal et al., 2018; Jiang and Pan, 2018).
1.3.4. Paroi
La paroi agit comme une barrière perméable et confère la forme caractéristique à la cellule fongique (Figure 3). Elle permet les interactions physiques entre le micro-organisme et son environnement, incluant les cellules de l’hôte (Cassone, 1989; Chaffin et al., 1998; Ruiz-Herrera et al., 2006; Gow et al., 2017).
Figure 3 : Structure de la paroi de C. albicans. Cette représentation schématique montre les
composants majeurs de la paroi et leur distribution. La couche interne repose sur la membrane plasmique. Elle se compose principalement de chitine (poly-β-(1,4)-N-acétylglucosamine) dans laquelle sont enchâssées différentes protéines. Par-dessus cet ensemble, une couche intermédiaire se compose majoritairement de β-(1-3)-glucanes et de β-(1-6)-glucanes. Enfin, des mannanes sont essentiellement retrouvées dans la couche pariétale la plus externe mais sont aussi présents sur toute l’épaisseur de la paroi. Des protéines pariétales sont retrouvées attachées au cytosquelette via des ancres glycosylphosphatidylinositol (GPI) mais aussi des protéines comprenant des domaines internes répétés (Pir). Adaptation personnelle de Shepherd, 1987; Smits et al., 2001; Netea et al., 2008.
La paroi représente 30% du poids sec de la cellule fongique (Sullivan et al., 1983). Environ 80 à 90% des constituants de cette paroi sont de nature glucidique. Trois constituants représentent les principaux polysaccharides de cette paroi : (i) des polymères ramifiés de glucose reliés par des liaisons osidiques de type β-(1,3) et β-(1,6) (ou β-glucanes) ; (ii) des polymères non ramifiés de groupements N-acétyl-D-glucosamine (GlcNAc) liés entre eux par des liaisons osidiques de type β-(1,4) (ou chitine) et (iii) des polymères de mannoses (ou mannanes) associés pour certains de manière covalente à des protéines (glyco [manno]-protéines). Les protéines représentent 6 à 25% des composants de la paroi. Elles regroupent des protéines à ancre GPI et des protéines « Proteins with Internal Repeats » (Pir). Enfin, des lipides sont retrouvés en petite quantité (1 à 7%) (Sullivan et al., 1983; Cassone, 1989; Calderone and Braun, 1991; Smits et al., 2001). Entre la forme levure et la forme hyphe, la quantité massique
24 totale de la paroi est similaire mais leur composition varie en glucanes, mannanes et chitine (Chattaway et al., 1968; Sullivan et al., 1983). Par exemple, la forme levure contient trois fois moins de chitine par rapport à la forme filamentée.
a. Les glucanes
La paroi contient uniquement des β-glucanes. Ces polysaccharides, les plus abondants, représentent jusqu’à 60% du poids sec pariétal (Ruiz-Herrera et al., 2006). Ils sont composés de molécules de D-glucose liées par des liaisons glycosidiques β-(1,3) et β-(1,6). Le β-(1,3)-glucane forme un squelette hélicoïdal soit en un seul résidu soit en une chaîne constituée de 3 brins liés par des liaisons hydrogènes. Le β-(1,6)-glucane est responsable de la ramification de la paroi par réticulation avec la chitine et une liaison par ancre GPI aux mannoprotéines (Surarit
et al., 1988; Kapteyn et al., 2000). Ces glucanes confèrent la rigidité à la paroi.
Les glucanes pariétaux sont impliqués dans la reconnaissance de la levure par les cellules hôtes comme les macrophages, les neutrophiles et les cellules dendritiques (Gantner et
al., 2005; Netea et al., 2008). Ainsi, la production de cytokines pro-inflammatoires (comme le
Tumor Necrosis Factor α (TNFα) et les interleukines IL-12, IL-6 et IL-17) ou anti-inflammatoires (comme l’IL-10) est activée suite à la reconnaissance des β-glucanes par le récepteur cellulaire du complément de type 3 (motif CR3) situé à la surface des cellules dendritiques, des monocytes ou encore des macrophages (Netea et al., 2008). De même, la reconnaissance des glucanes pariétaux par le récepteur Dectine-1 est impliquée dans le mécanisme de phagocytose chez les macrophages (Gantner et al., 2005). A noter également que les hyphes sont mieux reconnus par la Dectine-1, du fait de leur composition pariétale plus riche en β-glucanes par rapport à la forme levure (Yang et al., 2020b). Cette exposition du β-glucane est modulée par des protéines pariétales comme les protéines Endo-1,3-β-glucanase (Eng1) et « Yeast Wall Protein 1 » (Ywp1), qui sont capables de masquer l’exposition de ce composé. Dans un modèle murin de candidoses disséminées, des mutants, dont le gène ENG1 est délété (eng1Δ/Δ), présentent ainsi une forte exposition de β-glucanes. Ils sont alors capables d’activer une réponse inflammatoire rénale plus importante mais délétère pour l’hôte car responsable de dommages tissulaires et associée à une survie diminuée (Yang et al., 2020b). Le taux d’exposition du β-glucane à la surface de l’agent fongique module ainsi la balance entre la protection immune et l’immuno-pathogénèse.
b. La chitine
La chitine est un polysaccharide linéaire composé de plus de 2000 unités de N-acétyl-D-glucosamine (2-acétamido-2-deoxy-D-glucose ou GlcNac) jointes par des liaisons osidiques de type β-(1,4) (Ruiz-Herrera et al., 2006). La chitine pariétale est organisée en microfibrilles regroupant 20 à 400 chaînes par liaison covalente hydrogène. L’homopolymère ainsi formé représente entre 0,6 et 2% du poids sec de la forme levure et jusqu’à 10% de celui de l’hyphe (Chattaway et al., 1968). La distribution de ce composé est hétérogène au sein de la paroi et varie au cours du cycle cellulaire, notamment en fonction de la composition environnementale en sels et en sucres (Watanabe et al., 2005).
25 La chitine est synthétisée par les chitines synthases (Chs) appartenant à une famille de quatre isoenzymes réparties en trois grandes classes : (i) la classe I avec Chs2 et Chs8, (ii) la classe II avec Chs1 et (iii) la classe IV avec Chs3 (Roncero, 2002). Ces enzymes sont codées par les gènes CHS1, CHS2, CHS3 et CHS8 (Lenardon et al., 2007). La protéine Chs1 est nécessaire pour la viabilité et la morphologie des cellules, ainsi que pour la formation du septum au cours du bourgeonnement. Des mutants délétés pour les gènes CHS1 montrent une croissance en milieu de culture mais leurs bourgeons restent liés à leur cellule mère, formant ainsi des chaînes de levures (Munro et al., 2003). Les chitines synthases participent à l’intégrité des cellules fongiques durant la croissance mais aussi lors d’exposition à des stress affectant la paroi comme un traitement avec des concentrations élevées en antifongiques de la classe des échinocandines dont la caspofongine (Walker et al., 2008; Lee et al., 2012; Preechasuth et al., 2015; Han et al., 2019; Leroy et al., 2019). Une augmentation de la quantité de chitine induite par régulation post-transcriptionnelle de la chitine synthase Chs3 maintient également la viabilité de C. albicans en l’absence de la synthèse de β-(1,6)-glucanes (Han et al., 2019). Ainsi, dans un modèle murin de candidose disséminée, des mutants déficients en chitine (par déplétion homo- ou hétérozygote du gène CHS3) conservent la capacité à coloniser les muqueuses mais la mortalité induite chez des souris immunocompétentes est réduite par rapport à la souche sauvage productrice de chitine (Bulawa et al., 1995).
c. Les mannanes
Les polymères de mannoses constituent la fraction glycosidique associée de manière covalente aux mannoprotéines (glyco-[manno]-protéines). Ils représentent environ 40% des polysaccharidiques pariétaux (Shepherd, 1987). Les unités de mannoses forment de longues chaînes linéaires liées en α-(1,6). Sur ces chaînes sont rattachées des unités ou de courtes chaînes de mannoses par liaisons α-(1,2), α-(1,3), α-(1,6) et /ou β-(1,2). Les mannoses peuvent être liés à des protéines par une liaison O-glycosidique au groupe hydroxyde des sérine ou thréonine, ou par une liaison N-glycosidique à l’asparagine des protéines (Netea et al., 2008). Ces mannoprotéines (ou mannanes), comme le phosphopeptidomannane peuvent être alors liées à la structure pariétale par des liaisons non covalentes. Des liaisons covalentes permettent également l’association de ces mannoprotéines soit directement au β-1,3 glucane pariétal (comme observé pour les protéines Pir) soit indirectement à d’autres protéines pariétales (via la formation de ponts disulfures) ou au β-1,6-glucane (via une ancre GPI partielle) (Smits et al., 1999; Netea et al., 2008). Le type structural des mannanes définit alors deux sérotypes A et B chez C. albicans. Le sérotype A est associé à la présence de liaisons β-(1,2) au niveau de la fraction de la chaîne latérale stable aux acides alors que le sérotype B est déterminé par des résidus mannoses terminaux liés en β-(1,2) et exclusivement retrouvés sur le phosphomannane (Shibata et al., 1989; Culter, 2001; Netea et al., 2008).
Les mannanes et mannoprotéines pariétaux ont une importante activité immuno-stimulatrice en induisant la production de cytokines par les cellules hôtes, la maturation des cellules dendritiques et l’induction des lymphocytes T (Vecchiarelli et al., 1991; Garner et al., 1994; Gomez et al., 1996, 2000; Pietrella et al., 2006). En effet, les N-mannanes, associés aux β-glucanes plus rares, constituent des motifs moléculaires associés aux pathogènes (pathogen-associated molecular pattern, PAMPs), reconnus par des récepteurs (pattern recognition
26 receptors, PRRs) des cellules de l’hôte (Gantner et al., 2005). Graus et al. ont constaté que les fonctionnalités structurales du N-mannane modulent l’exposition du glucane. Une perte de mannanes augmente la fréquence et la taille d’exposition du glucane à la surface de la paroi et ainsi favorise la reconnaissance de l’agent fongique, par le PRR Dectine-1 (Bain et al., 2014; Graus et al., 2018). Cette reconnaissance est associée à la maturation des phagosomes chez des macrophages murins.
La paroi est également composée de phospholipomannane (PLM). Ses structures et fonctions sont développées dans le paragraphe « e. Lipides et glycolipides » suivant.
d. Les protéines pariétales
Les protéines représentent entre 6 et 25% du poids sec de la paroi. Le séquençage complet du génome, l’amélioration des méthodes d’extraction protéique et l’apport de la spectrométrie de masse ont permis d’améliorer considérablement les connaissances sur les protéines pariétales ces deux dernières décennies (Ruiz-Herrera et al., 2006; Chaffin, 2008; Gil-Bona et al., 2018). Présentes essentiellement au niveau de la couche la plus externe, elles sont organisées en deux groupes : (i) des glycoprotéines liées de façon covalente à la paroi et (ii) des protéines dépourvues de groupement glucidique et inféodées à la paroi par des mécanismes restant indéterminés. Parmi les glycoprotéines sont retrouvées des protéines liées aux β-(1-6)-glucanes via une ancre GPI et des protéines Pir. Ces dernières sont fixées à la paroi par des liaisons alcalines labiles, probablement des liaisons O-glycosidiques avec le β-(1,3)-glucane (Kandasamy et al., 2000; Kapteyn et al., 2000).
De nombreuses protéines pariétales sont considérées comme atypiques car non liées de façon covalente aux constituants pariétaux. Certaines restent localisées dans la paroi comme la protéine Kre9, la β-glucanase mannoprotéine 65 (Mp65) ou encore la β-(1,3)-glucosyltransférase 2 (Bgl2). D’autres sont excrétées comme certaines phospholipases, lipases et protéases (dont celles de la famille des Saps) ou encore des glucoamylases (Chaffin, 2008). Les compositions protéiques qualitative et quantitative varient en fonction de la forme morphologique de l’agent fongique (Pitarch et al., 2002; Ebanks et al., 2006; Martínez-Gomariz
et al., 2009). Ainsi, la forme hyphe présente de plus grandes quantités de protéines Hsp90 (heat
shock protein) et Myo-inositol-1-phosphate synthase par rapport à la forme levure. La paroi de la forme levure est, quant à elle, plus riche en alcool déshydrogénases ou en pyruvate décarboxylases. Mormeneo et al. ont montré que la forme levure contient considérablement plus de protéines alcali-extractibles par rapport aux hyphes, suggérant que la forme levure possède plus de protéines Pir (Mormeneo et al., 1994). L’analyse protéomique par spectrométrie de masse au cours de la transition levure-filament révèle que des protéines comme l’adhésine « Agglutinin-like-sequence 3 » (Als3), la phospholipase 5 (Plb5), la superoxyde dismutase 5 (Sod5) ou d’autres protéines comme les protéines « Hyphal wall 2 » (Hwp2) et « Hydroperoxide resistance 1 » (Hyr1), sont retrouvées plus abondamment chez la forme hyphe alors que la prédominance des protéines Sod4, Rhd3 (« red homology domain ») et Ywp1 est rapportée chez la forme levure (Heilmann et al., 2011). Par ailleurs, Sosinska et al. ont montré que des variations de pH induisent des modifications du protéome pariétal. Les adhésines Als1, Als3, Hyr1, la transglucosidase Phr1 et les protéines Hwp1 et Sod5 sont
27 uniquement présentent dans la paroi des cellules fongiques cultivées à pH 7. A pH 4, le niveau de la transglucosidase Phr2 est beaucoup plus élevé qu’à pH 7. Ainsi, à pH 7, la croissance des hyphes est prédominante et elle favorise l’invasion d’un modèle in vitro de support de culture avec une surface semie-solide imitant une surface muqueuse. A pH 4, seules les formes levures et pseudohyphes sont présentes, impactant négativement la capacité d’invasion de C. albicans du support de culture précédent (Sosinska et al., 2011).
Les fonctions des protéines pariétales sont nombreuses. Certaines agissent au cours de la morphogenèse de la paroi, comme les protéines Dfg5 (« defective for filamentous growth ») et Dcw1 (« defective cell wall »), la chitinase 2 (Cht2), les gluconasyl-transférases Pga4 (« processing of Gasp1 and Alp ») et Phr1 (« pH-responsive protein 1 ») ou l’endo-β-(1,3)-glucanase Scw1 (« soluble cell wall ») (de Groot et al., 2004). Certaines protéines à ancre GPI sont essentielles au développement de la cellule fongique et la délétion de leur gène est létale (Spreghini et al., 2003). Enfin, des protéines à ancre GPI sont impliquées dans les interactions cellulaires hôte/levure, dont certaines adhésines comme la protéine Hwp1 et les protéines appartenant à la famille des Als (Sundstrom, 2002; Ruiz-Herrera et al., 2006).
e. Les lipides et glycolipides
Les lipides représentent 1 à 7% de la paroi (Chattaway et al., 1968; Sullivan et al., 1983). Les principaux lipides sont des triglycérides, des phospholipides et des stérols libres et estérifiés (Bianchi, 1966). Ils jouent un rôle dans la signalisation cellulaire, l’adhérence et la protection de la cellule (Ghannoum et al., 1986; Ruiz-Herrera et al., 2006). Leur nombre augmente lors du passage de la forme levure à la forme filamentée (Chattaway et al., 1968).
Parmi les glycolipides pariétaux, le phospholipomannane (PLM) appartient à la famille des mannose-inositol-phosphorylcéramides (MIPC). Sa structure est dépendante du pH et de la température de culture mais aussi du sérotype de la souche (Trinel et al., 2005). La synthèse du PLM s’opère via un mécanisme dérivant de la biosynthèse du MIPC. La délétion du gène MIT1, (« Muc1 expressed independent of TEC1 »), codant une GDP-MIPC mannose transférase, réduit la virulence de C. albicans au cours de candidoses disséminées ainsi que sa résistance à la lyse par les macrophages, suggérant l’importance des mannolipides dans la pathogénicité de
C. albicans (Mille et al., 2004). Par ailleurs, le PLM a la particularité de réagir avec les anticorps
spécifiques dirigés contre les β-(1,2)-oligomannosides (Trinel et al., 2002; Mille et al., 2004). Les β-(1,2)-oligomannosides agissent comme des adhésines et induisent la production de cytokines et d’anticorps protecteurs par les cellules de l’hôte (Li and Cutler, 1993; Fradin et al., 2000; Dalle et al., 2003). De plus, le PLM stimule la production in vitro de cytokines comme le TNF-α, en interagissant avec les récepteurs cellulaires Toll Like Receptor (TLR) dont TLR2 chez des macrophages murins (Jouault et al., 2003). Au niveau des cellules épithéliales, son interaction avec les récepteurs TLR2, TLR4, TLR6 et TLR9 entraine la production de β-défensines in vitro. Ce composé est aussi impliqué dans l’adhérence, la reconnaissance par les macrophages et la signalisation cellulaire (Ruiz-Herrera et al., 2006). Par ailleurs, ce sphingolipide assure l’intégrité de la cellule fongique. La délétion des gènes fen1 et fen2, impliqués dans sa synthèse, entraîne un défaut dans la formation des hyphes et de développement de biofilm, ainsi qu’une augmentation de la sensibilité à l’antifongique amphotéricine B (Alfatah et al., 2017).
