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Effets neurotoxiques des nanoparticules de diesel lors
d’une exposition gestationnelle sur le bulbe olfactif des
foetus de lapins
Céline Serrano
To cite this version:
Céline Serrano. Effets neurotoxiques des nanoparticules de diesel lors d’une exposition gestationnelle sur le bulbe olfactif des foetus de lapins. Sciences du Vivant [q-bio]. 2017. �hal-02786107�
M A S T E R
« Biologie et Santé »
Finalité
« Signalisation cellulaire, Neurosciences »
---Mémoire présenté par Madame Céline Serrano
préparé dans l’Unité: Neurobiologie de l’Olfaction à l’INRA de Jouy-en-Josas sous la direction de : Madame Christine Baly
Année universitaire 2016 - 2017
Effets neurotoxiques des
nanoparticules de diesel lors d’une
exposition gestationnelle sur le bulbe
Remerciements
Je remercie chaleureusement Edith Pajot et Christine Baly pour m’avoir permis d’effectuer mon stage de Master 2 au Laboratoire de Neurobiologie de l’Olfaction. Merci à l’ensemble de l’unité NBO : Marie Annick, Claire, Marielle, Aurélie, Karine, Audrey, Isabelle, Patrice, Gérard, Sacha, Birte, Cristian, Adrien et Didier, pour m’avoir accueilli dans l’unité NBO.
Merci à Abdel et Julie de la plateforme d’histologie de l’INRA de Jouy-en-Josas pour l’utilisation du scanner.
Un grand merci à Estefania et Clara pour leur soutien infaillible ainsi que leur aide et conseils pour la rédaction du rapport.
Je tiens particulièrement à remercier Florence, ma collègue de bureau et amie, pour sa gentillesse, sa joie de vivre et pour tous les fous rires qu’on a pu avoir. Sans toi, les pauses café n’étaient plus les mêmes…
Un grand merci à Gaëlle et Virginie de m’avoir pris sous leurs ailes et soutenu dans ma formation de stage.
Merci à ma maman du labo : Catherine pour m’avoir appris toutes les petites ficelles du métier et pour les rires que nous avons partagés.
Evidemment mes plus grands remerciements à Martine et Amélie de l’unité BDR pour m’avoir coaché et aidé à créer un protocole (Encore merci pour les Anticorps !).
Un grand merci, à Nicolas, Bertrand et Vincent pour leurs conseils avisés ainsi que Olivier pour les discussions enrichissantes sur le cerveau et son anatomie que nous avons pu avoir.
Je souhaite remercier, en cette fin de parcours à l’Université Paris-Saclay, les professeurs et chercheurs qui n’ont cessé de croire en moi : Morgane Locker, Odile Bronchain, Line Duportets, Mr.Saule, Roseline Poirier et Serge Laroche ainsi que tous ceux qui ont participé à ma formation universitaire.
Merci à ma famille et mes amis qui m’ont toujours soutenu dans tous mes projets et sans qui je ne serai pas qui je suis.
Index
5-HT : sérotonine AC : anticorps
ATV : aire tegmentale ventrale BO : bulbe olfactif
DA : dopamine DE : diesel exhaust
DR : récepteur à la dopamine
GD : gestational day, age gestationnel GL : couche glomérulaire du bulbe olfactif GR : couche granulaire du bulbe olfactif
HPLC : High Performance Liquid Chromatography MO : muqueuse olfactive
NSO : neurone sensoriel olfactif
PM : Particulate Matter, ou matière particulaire qPCR : quantitative polymerase chain reaction RCPG : récepteurs couplés aux protéines G RT: reverse transcription
SN :substance noire
SNC : système nerveux central TH : tyrosine hydroxylase
Table des matières
I Introduction (p.1)
1. Les particules inhalées peuvent transloquer vers le système nerveux central (SNC) via la voie olfactive et induire une neurotoxicité (p.1)
2. Etude de système olfactif dans un environnement riche en particules : mise en évidence des altérations du système olfactif et plus particulièrement le bulbe olfactif (p.2)
3. La pollution particulaire induirait des altrétions cérébrales au stade prenatal (p.3) a) Les neuromodulateurs (p.3)
b) Etude des effets indirects aux particules de diesel lors d’une exposition gestationnelle (p.4) 4. Etat des connaissances et présentation du projet de stage (p.4)
II Matériels et Méthodes (p.7)
1. Animaux et prélèvement des BO (p.7) 2. Immunohistochimie (p.7)
3. TUNEL assay (p.8) a) Densité cellulaire b)
4. RTqPCR (p.9)
a) Extraction des ARNs totaux et transcription inverse b) qPCR quantitative
5. Analyses statistiques (p.11)
III Résultats (p.11)
1. Effet de l’exposition indirecte aux particules de diesel sur la sérotonine et ses récepteurs dans le BO (p.11)
2. Existe-il une dérégulation de la dopamine et de ses récepteurs dans le BO ? (p.12) a) Comptage des neurones TH-positifs (p.12)
b) Niveau d’expression des récepteurs Daminergiques (p.13)
3. Les NDP induisent-il une réponse cellulaire ? Etude des cellules apoptotiques dans le BO
(p.13)
a) La densité cellulaire (p.13)
b) Nombre de cellules apoptotiques rapporté à la densité cellulaire (p.13)
IV Discussion (p.16)
1. Matériels biologiques utilisés (p.16)
2. La neuroinflammation et la dérégulation des voies dopaminergique (p.17) 3. La Dopamine et son implication dans la régulation de la neurogenèse (p.18)
V Perspectives et conclusion (p.19)
VI Bibliographie
I Introduction
La pollution atmosphérique est un mélange complexe de matières particulaires, de gaz et de composés organiques présents dans l'air extérieur et intérieur qui est devenue une préoccupation majeure de santé publique de plus en plus associée à la morbidité et la mortalité dans le monde.
Parmi les divers polluants de l’air, la phase particulaire ou Particulate Matter (PM) s'avère avoir un impact sanitaire significatif et semble être impliquée dans l'établissement de broncho-pneumopathies chroniques obstructives, d’altérations du développement de la fonction respiratoire chez l'adulte et l'enfant, de maladies cardiovasculaires ou encore de cancers du poumon (1, 2, 3, 4, 5, 6)
La pollution de l'air liée à l'activité anthropogénique contribue de manière importante à la pollution atmosphérique globale, et le gaz d'échappement issu de moteur diesel (DE pour Diesel Exhaust) est son composant le plus important (7). Le DE contient plus de 40 polluants atmosphériques toxiques et est un constituant majeur du PM ambiant, raison pour laquelle l'exposition au DE est souvent utilisée comme mesure de la pollution de l'air extérieur.
1. Les particules inhalées peuvent transloquer vers le système nerveux central (SNC) via la voie olfactive et induire une neurotoxicité
De taille nanométrique, les particules présentent des propriétés particulières telles qu’un rapport surface/volume très élevé et une surface d’échanges augmentée (6), ce qui fait qu’elles peuvent pénétrer profondément dans le tractus pulmonaire ou bien franchir la barrière cutanée pour gagner par voie systémique de nombreux organes, dont le cerveau (8). Plus inquiétant encore, un transfert de particules au niveau cérébral a récemment été démontré via la voie olfactive, atteignant en premier la structure cérébrale impliquée dans la détection des odeurs : le bulbe olfactif (BO) (9-14).
Il s'avère que les PM ont un caractère cytotoxique dépendant de leur taille, les plus petites étant capables de pénétrer plus facilement dans les cellules et exercer des effets toxiques (15,16). La présence physique de ces particules au niveau de divers tissus nerveux pose donc naturellement la question de leur toxicité, à laquelle peu d’études ont été consacrées jusqu’à présent.
Au-delà des effets néfastes des particules au niveau respiratoire et cardiovasculaire, les données épidémiologiques suggèrent que l’émission de particules fines liée au trafic automobile peut être à l’origine de troubles neuronaux pouvant entraîner des pathologies graves dans des populations directement exposées.
Les travaux de Calderón-Garcidueñas et collaborateurs, ont montré, entre autres, une accumulation de particules liées à la pollution automobile dans l'épithélium nasal des habitants de Mexico, et ont mis en évidence la rupture de la barrière épithéliale des voies respiratoires nasales, ainsi qu’une inflammation systémique et cérébrale (17). En particulier, on observe une accumulation de plaques béta-amyloïdes et une dégénérescence neurofibrillaire, deux phénomènes caractéristiques de la mise en place et du développement de la maladie d’Alzheimer, maladie qui mène à des altérations cérébrales région-spécifiques de certains métabolites associés notamment à la régulation des systèmes neuro-modulateurs (18). D'autres études ont, quant à elles, montré que les déficiences cognitives augmentaient proportionnellement avec la concentration en particules dans l'air inhalé (19-24).
Les données expérimentales récentes obtenues tant in vivo qu’in vitro sont en accord avec les résultats épidémiologiques disponibles, ce qui permet d’affirmer aujourd’hui que la pollution atmosphérique, et plus particulièrement la phase particulaire constitue un réel danger pour le cerveau quelle que soit la tranche d’âge considérée (19). Plusieurs mécanismes tels que des processus inflammatoires, un stress oxydatif, une activation microgliale, une altération de la différenciation des neurones corticaux et de la synaptogenèse hippocampique ont été montrés comme contribuant à la neurotoxicité induite par une exposition à ce type de pollution (25-29).
2. Etude de système olfactif dans un environnement riche en particules : mise en évidence des altérations du système olfactif et plus particulièrement le bulbe olfactif
L’étude des circuits bulbaires et l’intégration des informations olfactives grâce à la neurotansmission est fondamentale pour la compréhension des effets neurotoxiques suite à une DE.
Figure 1. Le système olfactif : Présentation structurale et fonctionnelle de la MO et du BO
A. La muqueuse olfactive : interface entre le milieu interne et externe. Siège de la transduction du signal olfactif (coupe histologique de MO de souris)
B. Le BO principal, le premier relai d’intégration et de transmission du signal olfactif : Traitement et codage spatiotemporel des odeurs. Lien entre la MO et les cortex secondaires (coupe
sagittale du BO de souris).
Les neurones sensoriels olfactifs de la MO présentent à leurs extrémités dendritiques les récepteurs olfactifs qui baignent dans le mucus (Figure 1A). Une fois les molécules odorantes fixées aux récepteurs, le signal chimique est converti en un signal électrique. Un neurone olfactif exprime majoritairement un seul type de récepteur. L’ensemble des terminaisons axonales des neurones exprimant le même récepteur se regroupe en faisceau autour de cellules engainantes et va se projeter dans le BO, dans une structure intégratrice nommée glomérule. Les cellules basales sont impliquées dans le renouvellement de la MO. Les cellules de soutien sont nécessaires à la cohésion, l’intégration du tissu et la sécrétion de composés du mucus, avec les glandes de Bowmann.
Le BO est une structure sphéroide en couches concentriques (Figure 1B). La couche du nerf
olfactif, la plus superficielle, est constituée des arrivées axonales des NSO.
La couche glomérulaire (Gl) est formée de structures sphériques appelées glomérules qui constituent le véritable carrefour entre les NSO, les cellules mitrales et les cellules en panache. En périphérie de ces structures sont localisées les cellules juxtaglomérulaires de 3 types : périglomérulaire (interneurones PG), cellule à panache externe (T) et cellule à axone court. Les
A
Inspiré de Kensaku Mori et al., (1999)
glomérules intégrent le signal transmis par les NSO provenant de la MO, les cellules périglomérulaires le modulent.
La zone plexiforme externe contient les dendrites latérales des cellules mitrales et granulaires ainsi que les corps cellulaires des cellules à panache et axones courts.
Les cellules mitrales possèdent une unique dendrite apicale projetée sur un seul glomérule et des dendrites apicales projetant sur les cellules granulaires. Leur rôle est d’intégrer et de transmettre le signal olfactif au cortex secondaire.
La couche plexiforme interne contient majoritairement les axones de cellules mitrales.
Les cellules granulaires constituent les interneurones et lieu d’entrée des neuroblastes migrant
des ventricules latéraux vers les différentes couches du BO, sa densité cellulaire est très forte. Elles modulent le signal olfactif.
En plus des neurones, les glomérules sont entourés par les corps cellulaires des astrocytes. Ces astrocytes assurent l’approvisionnement en énergie et exercent un contrôle sur l’activité hémodynamique et synaptique dans le glomérule en particulier.
A l’arrivée de l’influx nerveux transmis pas les OSN aux glomérules, du glutamate est libéré dans la fente synaptique, il active les récepteurs glutamatergiques ionotropiques de type AMPA et NMDA situées sur les cellules mitrales et périglomérulaires. De la dopamine et du GABA sont libérés localement par les cellules périglomérulaires pour réguler l’activité intraglomérulaire. D’autre régulations impliquant des retours sérotoninergiques et cholinergiques sur les glomérules et des régulations via les boucles excitato-inhibitrices s’installent (voir ci-dessous). Une fois activées, les cellules mitrales envoient un potentiel d’action vers les cortex.
3. La pollution particulaire induirait des altrétions cérébrales au stade prenatal
a) Les neuromodulateurs
Les neurones sérotoninergiques sont localisés les noyaux du raphé du tronc cérébral et projettent sur l’ensemble du cerveau et dans la moelle épinière. La sérotonine est impliquée dans de nombreux processus physiologiques comme le rythme circadien, l’anxiété et le contrôle moteur. Il existe 7 types de récepteurs sérotoninergiques. Tout comme les récepteurs sérotoninergiques et DAminergiques appartiennent à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), qui agissent sur l’activité enzymatique de l’adénylate cyclase.
La dopamine (DA) est la catécholamine majoritaire présente dans le SNC. Elle est synthétisée au niveau de deux régions : la substance noire (SN) et dans l’aire tegmentale ventrale (ATV). Les axones de la SN projettent vers plusieurs structures tel que le striatum dorsal (noyau caudé et putamen). Cette voie est impliquée dans la motricité. En effet la dégénérescence de ces neurones est une des causes des symptômes de la maladie de Parkinson. Les fibres dopaminergiques de la ATV projettent sur la région ventrale du striatum (septum, hippocampe, axe hypophysaire) mais aussi sur le cortex frontal et temporal. Cette voie est impliquée dans l’apprentissage, la mémoire et la prise alimentaire.
Des études récentes mettent en évidence la diversité des neurones dans la couche juxtaglomérulaire/périglomérulaire (30); les interneurones dopaminergiques représentent plus de 75% de cette population. Les cellules synthétisant la dopamine dans le BO sont : les cellules PG de type I (TH+/GABA+ ou GABA+) ainsi que les cellules superficielles à axones courts (AC). Une cellule PG de type I communique avec un unique glomérule, alors qu’une cellule à AC est connectée à plusieurs glomérules. Ces neurones effectuent un rétrocontrôle négatif sur le ou les glomérule(s) avec lesquels ils sont connectés.
D1 et D2 sont majoritaires dans le SNC. D1 est présent dans la totalité du BO alors que D2 est localisé uniquement dans les cellules GL et GR (31). Les récepteurs DA sont des RCPG. L’activation du récepteur D1 active l’adénylate cyclase alors que l’activation de D2 inhibe l’activité de cette enzyme. Leurs inhibitions pharmacologiques ou génétiques induisent des troubles moteurs ; ils sont essentiels liés à la coordination des mouvements volontaires (32).
b) Etude des effets indirects aux particules de diesel lors d’une exposition gestationnelle
Si la plupart des données neurotoxiques de la matière particulaire ont été obtenues suite à une exposition directe post-natale, des études épidémiologiques récentes suggèrent que l’exposition gestationnelle à des niveaux élevés de polluants atmosphériques semble être associée à divers altérations anatomiques, cognitives et comportementales dans le cerveau des enfants (33 ; 34). Cependant les effets évoqués précédemment sont dépendants du degré d'exposition des individus, paramètre difficile à contrôler. Une corrélation entre les effets de la pollution particulaire et l’évolution neurocomportementale de l’enfant reste donc difficile à démontrer.
Plusieurs études expérimentales animales (au cours desquels les niveaux d'exposition aux polluants atmosphériques ont pu être contrôlés) ont confirmé l’existence d’un lien de causalité entre la pollution de l'air et une gamme d'effets néfastes sur le développement cérébral, telles que le suggéraient les études menées chez l’homme (35,36).
D’autres études d’exposition gestationnelle répétée au PM chez la souris ont aussi montré que la cinétique de développement postnatal (27 ;37), les niveaux d’inflammation pulmonaire et la réponse immunitaire (38), la neuromodulation monoaminergique (30) et même le potentiel reproductif (39) des descendants pouvaient être modifiés à l'âge adulte. L’étude de Susuki et collaborateurs met en évidence qu’une DE pendant la gestation induit une dérégulation des neuromodulateurs (de la DA, 5HT et la noradrénaline dont le niveau est augmenté ou diminué en fonction des régions cérébrale étudies), une augmentation généralisée de cellules apoptotiques ainsi qu’une trouble de la locomotion (40). D’autres études confirment ces résultats démontrant une altération du métabolisme de la dopamine en lien avec une augmentation du stress oxydatif et du processus inflammatoire (41). Une activation microgliale et la production de peroxyde par les astrocytes seraient les causes de la dérégulation du métabolisme dopaminergique (28). En revanche, peu de choses sont connues à propos des effets d’une exposition de la mère gestante aux polluants atmosphériques sur la mise en place et le maintien des circuits nerveux chez le fœtus. Seul Wong et collaborateurs ont récemment mis en évidence une perturbation du développement cérébral via une dérégulation de la plasticité synaptique fœtale (42). Les répercussions de l’exposition maternelle sur la maturation du cerveau à une période critique de son développement, ainsi que sur l’évolution neurocomportementale de la descendance restent donc inconnues.
4. Etat des connaissances et présentation du projet de stage
Comme évoqué précédemment, les études épidémiologiques commencent à évoquer les effets délétères d’une exposition maternelle à la pollution atmosphérique sur le développement fœtal, ainsi que sur leur contribution dans la mise en place de neuropathologies chez les descendants. Néanmoins, les mécanismes d'actions des différentes molécules toxiques retrouvées dans l'air ambiant ne peuvent pas être clairement établis. Si bien des modèles animaux ont ainsi été mis en place afin de répondre à de telles problématiques, ces derniers ne permettent pas de tirer de réelles conclusions car leur comparaison est trop complexe en raison de la grande diversité des techniques, des concentrations, des périodes et des temps d’exposition, lesquelles (en plus) reflétent rarement les conditions d’exposition humaine.
C'est ainsi que le projet EPPAP, projet de grande envergure financé par des fonds européens (European Research Council et Agence Nationale de la Recherche) a été mis en place. L’objectif de cet étude est de mesurer les conséquences à court et à long terme d’une exposition gestationnelle, modélisant la réalité de l’exposition humaine, sur le développement fœto-placentaire et l'établissement de maladies métaboliques descendance, ainsi que l'analyse des possibles effets intergénérationnels d'une telle exposition. Le modèle utilisé est le lapin car: i) il présente un type de placenta qui est très proche de celui de l’homme et représente donc très bien le développement de la sphère fœto-placentaire humaine, ii) il est de taille suffisante pour permettre des investigations in utero de mesure des échanges fœto-placentaires (Doppler) et pour autoriser des dissections aisées, en particulier au niveau du cerveau, iii) il présente une
caractéristique comportementale propre à l’espèce qui est liée à l’interaction mère-jeune dans les premiers jours de vie postnatale permettant d’évaluer l’impact de la pollution subie pendant la gestation dès la naissance (43), et iv) le développement du cerveau est à l’image de celui des rongeurs habituellement utilisés (rat, souris) et se déroule de manière progressive au cours des périodes pré- et post-natale tout comme chez l’homme (44).
Ainsi, des lapines gestantes ont été exposées, uniquement par voie intra-nasale, du troisième au vingt-septième jour de gestation (GD3 à GD27), à raison de deux séances d’une heure par jour (matin et soir), à de l’air pur ou à une atmosphère polluée dont la concentration en particules correspond au seuil d’alerte français en moyenne journalière (80µg/m3) [Annexe 1].
Cette étude a montré que l’exposition gestationnelle aux particules issues de moteur diesel entraînait des défauts de vascularisation placentaire provoquant des défauts de croissance fœto-placentaire, des perturbations des environnements intra-utérin et post-natal précoce (lactation) des fœtus, et des dérégulations métaboliques importantes qui se répercutent à l’âge adulte et sur la génération suivante (45).
Les animaux produits dans cette expérimentation ont été mutualisés par plusieurs équipes afin d’étudier les effets de la pollution indirecte dans différents tissus. Ainsi, le programme de recherche BrainAirPoll (financé par l'ADEME et l'ANSES) a été mis en place [Annexe 1].
Ce programme de recherche, au sein duquel s'effectue le travail doctoral d’Estefanía Bernal-Meléndez, consiste à étudier la neurotoxicité développementale de l’exposition précoce et répétée à des particules ultrafines de fumées de diesel chez des lapereaux nés de mères exposées quotidiennement pendant la gestation. Il évalue la plasticité des circuits périphériques liés à l’olfaction ainsi que les voies centrales chez les jeunes afin de caractériser les conséquences à court et à long terme sur le développement et la santé de l’individu d’une exposition à ces fumées survenant pendant la vie embryonnaire, et d’évaluer les possibles effets intergénérationnels de cette exposition.
Les travaux de Bernal-Meléndez et collaborateurs (article en préparation) ont mis en évidence que l'exposition gestationnelle et répétée aux particules de fumées de diesel mène à des perturbations du développement et du maintien des circuits neuronaux centraux et périphériques au stade fœtal [Annexe 2]. Ce constat s’appui sur :
1. La mise en évidence d’altérations importantes des niveaux sérotoninergique et dopaminergique bulbaire (mis en évidence par HPLC pour High Performance Liquid Chromatography),
2. La mise en évidence, par MET (pour microscopie électronique à transmission) de nanoparticules (5-20nm de diamètre), et
3. L’observation de déstructurations majeures des tissus olfactifs (on remarque notamment un phénomène de « swelling » -inflammation généralisée de la cellule, ainsi que l’apparition de cavités au niveau des structures olfactives), ainsi qu’une condensation et une marginalisation de la chromatine de différents types cellulaires qui les constituent chez les fœtus issus de lapines exposées (phénomènes observés par MET).
Il est intéressant de remarquer que ces derniers phénomènes évoqués posent la question sur l'éventuel établissement des réponses cellulaires majeures de type inflammatoire et apoptotique. Cette exposition semble également mener à des modifications précoces de la fonction olfactive chez les lapereaux [Annexe 2], suite à la réalisation du test de reconnaissance à la phéromone mammaire de lapin, 2-NBT (46), bien qu’il ne soit pas possible, à ce stade, de faire un lien direct entre les perturbations anatomo-fonctionnelles du système olfactif observées au stade fœtal GD28 et comportementales observées à un stade post-natal précoce PND2. De ce fait, plusieurs questions se posent :
1. Est-ce que les altérations sérotoninergique et dopaminergique observées sont le reflet d'atteintes des voies de synthèse des neuromodulateurs d'intérêt, ou alors le reflet d'atteintes cellulaires de ces voies monoaminergiques ? Est-ce que ces possibles altérations moléculaires et cellulaires peuvent permettre d'établir un lien entre les divers constats évoqués ci-dessus ?
monoaminergiques) sont le reflet des réponses cellulaires de type inflammatoire ou apoptotique ? Est-ce que ces phénomènes peuvent permettre d'établir un lien entre les divers constats observés ?
Mon stage s’inscrit ici dans une problématique qui vise à comprendre les effets d'une exposition gestationnelle et répétée aux particules fines de diesel sur le développement et le maintien des circuits neuronaux bulbaires chez le lapin au stade fœtal. Dans ce cadre, mon travail avait pour objectif de : 1) déterminer si les altérations neurochimiques étaient les reflet des désordres moléculaires et/ou cellulaires spécifiques aux systèmes monoaminergiques touchés et 2) déterminer si les destructurations des tissus olfactifs étaient le résultat d'une réponse cellulaire des composantes du tractus olfactif suite à une telle exposition.
Pour mon stage, je me suis intéressée, dans un premier temps, à l'étude des perturbations de la transmission sérotoninergique et dopaminergique bulbaire. Pour ce faire, j'ai mis au point un protocole d'immunomarquage sur coupe fine de bulbe olfactif de lapin afin de mettre en évidence d'éventuelles irrégularités sur le nombre des neurones et/ou des fibres neuronales des neuromodulateurs affectés ; puis, je me suis intéressée à l'analyse de l'expression des gènes impliqués dans les transmissions monoaminergiques d'intérêt pour ainsi mettre en évidence d'éventuelles modulations de l’expression de ces gènes suite à l'exposition gestationnelle aux NPD. Dans un deuxième temps, je me suis intéressée à l'évaluation des éventuelles réponses cellulaires déclenchées par ce type d'exposition. Pour ce faire, j'ai effectué des marquages TUNEL pour déceler des phénomènes apoptotiques pour, ensuite, analyser d'éventuelles modulations de divers gènes impliqués dans la réponse inflammatoire suite à une telle exposition.
II Matériels et Méthodes
1. Animaux et prélèvement des BOLes animaux ont été sacrifiés au 28ème jour de gestation et le prélèvement des échantillons a eu lieu avant mon arrivée au laboratoire. Quatre BO issus d’animaux témoins et 6 BO issus d’animaux pollués ont été sélectionnés pour cette étude. Pour les études de TUNEL et d’immunohistochimie, les bulbes olfactifs ont été récupérés et fixés dans du PFA 4%. Ils ont ensuite été cryoprotégés dans une solution de sucrose 30% pour être finalement stockés dans une solution d’enrobage (tissue TEK 10%/30%/60%/100%, Tissue-Tek® O.C.T. Compound, Sakura® Finetek) à -80°C pour une utilisation ultérieure. Quatre bulbes issus d’animaux mâles (2 témoins et 3 exposés) et 6 bulbes issus d’animaux femelles (2 témoins et 3 exposées) ont été sélectionnés afin d’effectuer des coupes sériées de 14µm (Leica 3050, température de réalisation des coupes à -20°C) et celles-ci ont été stockées à -80°C. Pour les analyses de RTqPCR, 7 BO issus d’animaux témoins et 7 BO issus d’animaux pollués ont été sélectionnés pour cette étude. Les bulbes olfactifs ont été plongés dans l’azote liquide avant d’être stocké à -80°C.
2. Immunohistochimie
Mise au point d’un protocole d’immunohistochimie
Afin d’étudier l’effet des NPD sur les différents organes, chaque équipe de ce grand projet a prélevé ses organes d’intérêts. Les cerveaux n’ont donc pas été perfusés et fixés pour que chaque équipe puisse travailler sur des organes n’ayant subi aucun traitement. Le problème majoritaire à déjouer dans cette situation est le marquage aspécifique des vaisseaux sanguins, et le fait de travailler sur des tissus de lapin, avec de forts risques de problèmes liés au croisement des réactivités des anticorps secondaires [Annexe 2]. J’ai choisi de tester différents anticorps (AC) disponibles au laboratoire et permettant d’analyser plusieurs cibles cellulaires par immunohistochimie (Tableau 1). Du fait de différentes difficultés, deux protocoles ont été testés et l’un d’entre eux a permis de diminuer le bruit de fond du tissu d’intérêt et de limiter le marquage des vaisseaux sanguins.
Il est possible de quantifier les neurones dopaminergiques de manière indirecte en marquant la tyrosine hydroxylase (TH). La TH est un enzyme qui synthétise la dopamine à partir de la tyrosine, son substrat. Dans le BO, les neurones dopaminergiques sont essentiellement localisés au niveau de la couche des cellules PG.
Tableau 1 : Liste des anticorps utilisés en immunohistochimie sur coupes de BO.
Figure 1 : Les BO ont été découpés en coupes sériées de 14 µm. Sur une même lame, trois coupes ont été déposées et espacées entre elles de 48 µm. Nous avons choisi cette organisation pour avoir sur la même lame, la vision de trois plans de couches cellulaires différentes (diamètre d’un noyau compris entre 5 et 10 µm). Les contrôles ont été effectués.
L’anti tyrosine hydroxylase (TH, Sigma T1299), Iba1 (allograph inflammatory factor 1, marqueur d’inflammation, AbCam ab5076), S100 beta-subunit (marqueur de cellules astrocytaires, AbCam ab4066), P75-NGF recepteur (marqueur de cellules engainantes, AbCam ab10494), GFAP (glial fibrillary acidic protein, marqueur d’astrocytes, directement conjuguée (Sigma C9205) ou pas (Santa-Cruz sc-6170) à un fluorophore, H3K9CH3(3) (marqueur nucléaire contrôle des histones ; Active Motif 39161) ont été testés avec les protocoles 1 et 2 sur différents tissus.
Protocole 1 : Lors du marquage des tissus d’intérêt, les lames ont été laissées à température ambiante (TA) pendant 20 minutes. Ces dernières ont été fixées (PFA 2% ; 20 min) puis lavées (PBS 1X ; 2 fois 10min ; TA). Elles ont été incubées dans une solution de perméabilisation (PBS 1X/ Triton 0.5%; 1 heure ; TA). Les lames ont été lavées (PBS 1X ; 1 fois 5 min ; TA) et plongées dans un tampon de saturation (PBS 1X/ BSA 2% ; 1h ; TA). Les tissus ont été incubés avec un AC primaire (PBS 1X/ BSA 2% ; 24h à 4°C). Après incubation, les échantillons ont été lavés (PBS 1X 4 fois 15 minutes ; TA), puis incubés à l’obscurité avec un AC secondaire (Alexa Fluo® ; BSA 2% ; 1h ; TA). Les échantillons ont été lavés (PBS 1X / Tween 0.05% ; 2 fois 10 minutes ; TA) et traités au Hoechst (dilution 1/1000 ; 15 min ; TA) afin de marquer les noyaux. Les lames ont finalement été montées (1 gouttes de Dako Fluorescence Mounting Medium sur chaque coupe) afin d’être observées grâce à un microscope à épifluorescence (Annexe 2).
Protocole 2 : Ce protocole classiquement réalisé au laboratoire utilise une technique de diminution du bruit de fond et de saturation différente.
• Premier lavage : PBS1X/glycine 0.1 M ; 30 min • Second lavage : PBS1X ; 3 fois 10 min
• Saturation : PBS 1X/ BSA 5%/ Triton X 0.3%, sérum d’âne 5 % ; 2h
• Incubation AC primaire : PBS / BSA 0.5%/Triton 0.3% ; 48 heures ; à – 20°C • Saturation : PBS /lait0.1 % ; 4 fois 15 min
• Incubation AC secondaire : PBS / BSA 0.5%/Triton 0.3% ; 2h
3. TUNEL assay
Les cellules apoptotiques ont été mises en évidence à l’aide du kit DeadEnd™ Fluorometric TUNEL system. Après séchage, les lames sont plongées dans un bain de NaCl 0,85% / Eau déminéralisée (5 minutes, TA), puis rincées dans un bain de PBS 1X (5 min ; TA). Elles sont ensuite fixées (PFA 4% ; déposées sous forme de gouttes ; 15 minutes, TA), lavées (PBS 1X ; 3 fois 5 minutes ; gouttes, TA) et perméabilisées (Protéinase K fournie dans le Kit ; dilution au 1/500 pour avoir 20 µg/ml, TA ?). Après un rinçage (PBS 1X ; gouttes ; 5 minutes ; TA), les tissus sont refixés (PFA 4% ; gouttes ; 15 minutes ; TA), et une nouvelle fois lavés (PBS 1X ; gouttes ; 3 fois 5 minutes, TA) avant d’être incubés dans le tampon d’équilibration (gouttes ; 10 minutes, TA). Le tampon d’incubation (44 µl de tampon d’équilibration, 5 µl de nucléotides et 1 µl d’enzyme TdT) a ensuite été déposé sur chaque coupe (50 µL ; gouttes ; 1 heure ; 37°C en chambre humide). Les lames sont plongées (SSC 2X ; gouttes ; 15 minutes) puis rincées (PBS 1X ; bain ; 3 fois 5 minutes). Enfin, les noyaux sont marqués grâce au Hoechst (dilution 1/1000 ; 10 minutes ; TA) et les lamelles sont rincées (PBS 1X ; bain ; 3 fois 5 minutes ; TA). Les lames ont ensuite été montées (Cf protocole 1).
Figure 2 : Traitement des images et exportation des données
Une fois les lames scannées, les images sont importées sur Pannoramic Viewer. Tous les échantillons ont été analysés de la même manière. Trois à quatre photos (zoom X10) ont été prises au hasard, sur une coupe par lame (4 lames par échantillons), pour être analysées à l’aide d’outils du logiciel Image J. La délimitation des régions d’intérêt (ROI), a été effectuée sur l’image marquée au Hoescht. Après cerclage manuel des différentes zones d’intérêt, l’aire et le pourcentage d’aire marquée au Hoechst ont été calculés en utilisant l’algorithme le plus adapté pour ce type de marquage (triangle), ce qui permet d’avoir une estimation de la densité cellulaire. Le nombre de cellules marquées a été compté à l’œil nu. Une cellule était considérée comme positive si et seulement si le marquage d’intérêt (TH ou TUNEL) et le marquage au Hoechst étaient superposés. Les cellules non visibles sur le plan de la coupe n’ont pas été prises en compte, car le nombre de cellules positives est rapporté à la densité cellulaire.
Pour le TUNEL assay, trois zones ont été définies. La zone granulaire (ZGR) est très riche en cellules et la zone glomérulaire (ZGL) est caractérisée par les structures glomérulaires. A un tel niveau de développement bulbaire, il est difficile de délimiter strictement les différentes couches du BO. C’est pourquoi, j’ai décidé de regrouper trois couches cellulaires (la plexiforme interne et externe) en une seule que j’ai nommée zone intermédiaire (ZI). Dans le cas de l’analyse immunohistochimique, la TH est présente uniquement dans les cellules péri-glomérules, c’est donc sur cette zone que l’analyse a été faite.
4. RTqPCR
a) Extraction des ARNs totaux et transcription inverse
Afin de quantifier l’expression des gènes cibles choisis (Tableau), les ARNs totaux des échantillons de bulbe olfactif ont été extraits à l’aide du kit RNeasy Micro® (Quiagen). Une transcription inverse permettant de synthétiser de l’ADNc à partir des ARNs totaux extraits précédemment a été réalisée grâce au kit « SuperScript™ Fist-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) » selon les conditions préconisées. Un contrôle négatif a été réalisé (où l’ADN a été remplacé par de l’eau). La concentration en ADNc a été mesurée au Nanodrop.
b) qPCR quantitative
Les amorces utilisées en qPCR sont présentées dans le tableau 1. Leurs séquences ont été choisies grâce au logiciel NCBI et vérifiées sur Ensembl mais aussi grâce à la bibliographie, car certains gènes étaient mal annotés sur le génome de lapin (47; 48). Afin de vérifier leur efficacité et leur spécificité, une gamme étalon d’ADNc (120ng, 60ng et 6ng) a été réalisée sur du cerveau entier de lapin adulte ainsi que sur des BO de fœtus pollués ou non. Dans chacun des 96 puits disponibles sur une plaque de PCR, est ajouté 5 µl d’ADNc dilué, 12,5 µl de Mix PCR du kit MESA Blue d’Eurogentec (deoxynucleotides tri-phosphates, Meteor Taq polymérase, MgCl2, Sybr
Green, colorant, référence interne et stabilisateurs), 2,5 µl de l’amorce sens (« forward »), 2,5 µl de l’amorce antisens (« reverse ») et 2,5 µl d’eau, pour un volume total de 25 µl. Les échantillons
sont déposés en duplicat. Un contrôle négatif (ou l’ADNc est remplacé par de l’eau) a été réalisé sur chaque plaque. On suit en temps réel le processus de polymérisation à l’aide de sondes fluorescentes, ici le SybrGreen. Les données de fluorescence sont collectées à chaque cycle et représentent la quantité d’ADN amplifiée. La réplication étant semi-conservative, lorsqu’un brin d’ADNc est néosynthétisé, la quantité d’ADNc initiale est doublée et suit une loi exponentielle. La réaction d’amplification est ensuite enregistrée par le thermocycleur StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biogazelle). L’amplification des ADNs s’est faite sur 60 cycles à 60°C. Lorsque la fluorescence dépasse le seuil de fluorescence du bruit de fond, on obtient un point nommé Ct (threshold cycle). Grâce à ces Cts est tracée une gamme étalon afin de déterminer la valeur de la pente (b) de l’équation (R² = ax+b). Le coefficient logarithmique (R²) renseigne sur l’intensité de la liaison entre les Ct. Plus R² est proche de 1, plus l’intensité de liaison entre les Ct est forte. L’efficacité de la réaction de PCR peut être calculée grâce à l’équation suivante :
E =
10
(-1/b).
L’efficacité de la PCR est comprise entre 1 et 2 (Tableau X). Une efficacité suffisante estcomprise entre 1.7 et 2 soit entre 70 et 100%. En plus de ces paramètres (régression logarithmique et efficacité de la réaction), j’ai vérifié que, suite à la qPCR, un seul produit d’amplification est présent dans chaque puits et que le Ct du système considéré n’est pas supérieur à 35 cycles.
Tableau 2 : Liste des gènes étudiés par RT-qPCR. Pour chacun d’entre eux est donnée la
séquence des amorces choisies, leur température de fusion (TM), la taille du produit amplifié, la pente de la courbe étalon entre 120 et 6 ng de matrice ADN, l’efficacité brute et en % et le coefficient de corrélation. On voit ici que les amorces des gènes HT3A et DAT ne satisfont pas aux critères de qualité de la gamme étalon, ils ont été retirés de l’étude.
Les résultats obtenus pour chaque échantillon pollué ou témoin, c’est à dire les Ct de chaque gène, sont transférés sur Excel. Après avoir vérifié la qualité des données (duplicats variant de moins d’un Ct, absence de variation du gène de référence entre les échantillons pollués et témoins), l’expression des gènes est normalisée pour chaque échantillon à l’aide de 3 gènes de référence, ici l’actine B, la GAPDH et la cyclophiline A (Tableau 2). Ensuite, on calcule le delta CT : ΔCt (Ct gène d’intérêt-Ct gène référence), puis on mesure le ΔΔCt (ΔCt témoin- ΔCt pollué). Si l’écart-type est inférieur à 2, on peut considérer les résultats obtenus comme étant fiables. Le RQ (Relative quantification= 2(-ΔΔCT) renseigne sur la sous- ou sur-expression des gènes étudiés. Si RQ > 1, les gènes sont sur-exprimés chez les témoins, si RQ < 1, les gènes sont sous
exprimés. On considère une variation comme physiologiquement significative lorsque RQ est >1.5 ou < à 0.5.
5. Analyses statistiques
Le nombre d’échantillons disponibles pour réaliser l’étude immunohistochimique et du TUNEL étant faible (Témoins n=4 et Pollués n= 5), un test de permutation de Fischer-Pitman a été réalisé sur R commander.
La significativité des résultats de RTqPCR a été déterminée grâce à un test non paramétrique (n < 30), le Wilcoxon.
III Résultats
Comme il a été dit précédemment, nous avons étudié l’hypothèse d’une dérégulation de différents neurotransmetteurs et de leurs récepteurs suite à une exposition gestation à des NPD chez les G28F1 à l’aide des différentes techniques à notre disposition. L’analyse a été menée au niveau protéique par immunohistochimie et/ou au niveau transcriptionnel par la mesure du niveau de transcrit des gènes correspondants.
1. Effet de l’exposition indirecte aux particules de diesel sur la sérotonine et ses
récepteurs dans le BO
L’Anticorps 5HT utilisé pour quantifier les fibres sérotoninergiques n’a pas fonctionné sur les coupes de BO des G28F1, malgré la vérification de sa spécificité sur coupe de cerveau de rat (voir § Matériel et méthodes et Annexe 2). Cependant, les résultats obtenus suite à l’étude de l’expression transcriptionnelle des récepteurs lui correspondant, nous ont renseigné sur une possible dérégulation de ce neuromodulateur dans les tissus olfactifs. L’expression transcriptionnelle des gènes codants 4 récepteurs sérotoninergiques 5HT 1A, 2A, 2C et 7, le récepteur HT3A ainsi que SLC6 n’ont pas donné de signal d’amplification robuste (voir matériel et méthodes) a été finalement normalisée grâce à deux gènes de référence (GAPDH et Cyclophiline A), car les résultats obtenus suite à la normalisation par l’actine se sont révélés inexploitables (Tableau 3). On observe que les quantifications relatives par rapport aux deux gènes de normalisation sont cohérentes pour HT2A, HT2C et HT7, mais pas pour HT1A (Figure 3). La tendance des récepteurs HT2A et HT2C à une surexpression chez les animaux pollués et une sous-expression de HT7 n’atteignent pas la significativité statistique. De plus, les variations entre échantillons pollués et témoins sont très faibles (RQ entre 0.7 et 2). Les résultats montrent qu’il n’existe pas de différence significative dans l’expression transcriptionnelle des gènes codants les récepteurs sérotoninergiques (5HT 1A, 2A, 2C et 7) entre les bulbes des animaux pollués et témoins.
Tableau 3 : Analyse transcriptionnelle des gènes codants pour les différents récepteurs
sérotoninergiques des bulbes olfactifs chez les animaux nés de mères polluées ou témoins. Récapitulatif des moyennes des ΔCt et des écarts-types (l’écart type permet de s’assurer de la
fiabilité des Cts obtenues pour les récepteurs sérotoninergiques). Les p values ont été obtenues suite à un test de Wilcoxon.
2. Existe-il une dérégulation de la dopamine et de ses récepteurs dans le BO ?
a. Comptage des neurones TH-positifs
La quantification des neurones dopaminergiques a été réalisée en comptant le nombre de cellules positives à la TH rapporté à la densité cellulaire mesurée dans chacune des coupes de BO d’animaux pollués ou témoins (Figure 4). Nos résultats montrent qu’il n’y a pas de différence significative du nombre de neurones positifs à la TH entre les BO des animaux pollués et les témoins (z = 1,3102 ; p = 0,1901). Cependant il semble y avoir une tendance qui suggère qu’il y a une augmentation (d’un facteur deux) du nombre de neurones dopaminergiques chez les animaux pollués comparés aux témoins (Figure 4).
Figure 4: Etude des variations de la densité des cellules TH positives, comme marqueur indirect
des neurones dopaminergiques.
A. Quantification du nombre de neurones dopaminergiques rapporté sur la densité cellulaire au niveau des cellules péri-glomérulaires chez les G28F1 témoins (en blanc) et pollués (en gris). La
A
Figure 3 : Histogramme montrant le profil
d’expression relative des gènes codant pour les récepteurs dopaminergiques dans le BO des G8F1 rapportées à la GAPDH (noir) et la cyclophiline (violet claire)
Témoin Pollué B N o m b re d e cellu les ap o p to tiq u es/ D ensi té cellu lair e
barre représente la médiane, la croix représente la moyenne, et le premier quartile est fixé à 10% et le troisième, à 90%.
B. Illustration représentative du marquage à l’anticorps anti-TH, dans la zone des cellules PG d’un BO d’animal pollué permettant de marquer indirectement des neurones dopaminergiques (flèche blanche). Image obtenue suite au scan (fluorescence) réalisé à la plateforme d’histochimie de Jouy-en-Josas.
b. Niveau d’expression des récepteurs Daminergiques
L’étude de l’expression des gènes codant les récepteurs dopaminergiques (DRDI et DRD2) montre également qu’il n’y a pas de différence de niveau transcriptionnel entre les animaux pollués et les témoins. En particulier, pour le récepteur DRD2, les quantifications par rapport aux gènes de normalisation ne sont pas cohérentes entre elles et les écarts-types très importants.
Tableau 3 : Récapitulatif les moyennes des delta CT et des écarts types (l’écart type permet de s’assurer de la fiabilité des Cts obtenus pour les récepteurs dopaminergiques (Cf tableau 1).
3. Les NDP induisent-il une réponse cellulaire ? Etude des cellules apoptotiques dans le BO
Nous avons quantifié par TUNEL le niveau d’apoptose des BO en travaillant sur 3 zones distinctes, la zone granulaire (GR), glomérulaire (GL) et intermédiaire (ZI).
a. La densité cellulaire
La densité cellulaire a été obtenue en rapportant la surface marquée au Hoescht (noyau) sur l’aire totale sélectionnée. Les résultats indiquent qu’il n’y a pas de différence significative de densité cellulaire pour les trois zones testées (GR : z = 0,25198, p= 0,8011 ; ZI : z = 0,3605, p=0,7184 ; GL : z = 1,6918, p=0,0907) entre les fœtus G28F1 pollués et témoins (résultats non présentés).
b. Nombre de cellules apoptotiques rapporté à la densité cellulaire
Afin de normaliser l’ensemble des résultats, j’ai rapporté le nombre de cellules apoptoptiques, grâce au marquage TUNEL, à la densité cellulaire obtenue précédemment. Il n’existe aucune
Figure 5 : Profil d’expression des
gènes codant pour les récepteurs dopaminergiques dans le BO des G28F1.
L’expression du récepteur DRD1 semble être sous-exprimée chez les animaux pollués, mais n’atteint pas la significativité.
différence significative entre les G28F1 pollués et les témoins pour l’ensemble des zones du BO (z = 1.265 ; p= 0,08) ou pour les couches individuelles GR (z = -0,85644 ; p=0,3918) et GL (z = 0,36632 ; p=0,7141) (Figure 6). Cependant, les tests statistiques indiquent qu’il existe une différence à la limite de la significativité (z = -1,8927 ; p = 0,058) dans la ZI (couche plexiforme interne, mitrale et plexiforme externe) entre les G28F1 pollués et les témoins. Il y aurait plus de cellules en apoptose chez les témoins au 28ème jour de gestation que chez les pollués (Figure 6).
B
C A
Figure 6 : Les NDP induisent-il une réponse cellulaire ? Etude des cellules apoptotiques dans le
BO des fœtus de lapin en gestation. (A) Coupe sagittale d’un BO (G28F1) témoins ayant été traité au TUNEL assay. Zoom sur un cellules apoptotique (B) et (C) : les noyaux sont marqués au Hoechst (bleu) et les cellules apoptotiques, en vert. (D) Représentation du nombre de cellules apoptotiques rapporté à la densité cellulaire, dans les différentes couches des cellules du BO (en noir), GL (en bleu), ZI (en rouge) et GR (en vert),chez les lapins G28F1 témoins (en blanc) et pollués (en gris). La barre représente la médiane, la croix représente la moyenne, et le première quartil est fixé à 10% et le troisième, à 90%.
IV Discussion
En mettant en place plusieurs approches méthodologiques complémentaires, j’ai testé l’hypothèse d’une perturbation de la transmission sérotoninergique et dopaminergique ou de la dynamique cellulaire dans le BO de lapereaux au stade G28 suite à une exposition indirecte aux particules de diesel. Je n’ai pas mis en évidence de modification majeure de l’expression de ces neuromédiateurs ou de leurs récepteurs dans le BO, ni d’inflammation notable des tissus. En revanche, une légère diminution de l’apoptose dans les couches intermédiaires du BO a été observée.
1. Matériels biologiques utilisés
Le modèle expérimental de pollution atmosphérique a été mis en place pour répondre aux questions : Quel est l’impact de la pollution sur la santé du fœtus et son devenir à l’âge adulte ? Et quels sont ces impacts intergénérationnels ? Comme il a été très lourd à mettre en place et a fait intervenir un grand nombre d’animaux et sur plusieurs générations (Annexe 1), plusieurs contraintes méthodologiques ont limité la portée de mon étude.
Pour des questions éthiques, le nombre d’animaux utilisés a été ajusté. Le lapin est un animal fragile et très sensible à la variation de son environnement, il l’est encore plus lors de la gestationnelle. La perte de lapereaux pendant la gestation ou à la naissance fait partie des facteurs expliquant le petit nombre d’animaux disponibles pour les expériences que j’ai réalisées, ce qui a pu impacter la significativité des tests statistiques.
Cette étude s’inscrivant dans un grand consortium et dans le respect des techniques utilisées par chaque équipe sur les différents organes, y compris pour des études épigénétiques, les lapereaux n’ont pas subi de traitements ou injections avant abattage et récupération des tissus. Les cerveaux n’ont pas été perfusés, seulement post-traités, ce qui les laisse plus auto-fluorescents et moins résistants aux traitements ultérieurs. Il aurait été possible d’améliorer l’intensité des signaux immunohistochimiques en faisant en parallèle des essais après marquage à la DAB, observable dans le visible. Cette technique a été testée en collaboration avec l’unité UC340 URAFPA (Nancy) sur la TH avec succès, mais elle ne permet pas de rapporter une intensité de marquage à une densité cellulaire, ce dont nous avions besoin ici.
Enfin, la plupart des AC disponibles en laboratoire sont faits chez le lapin, limitant le champ d’investigation et augmentant le risque marquage aspécifique de l’AC primaire.
Un autre élément ayant rendu difficile l’analyse des données peut être d’ordre neurophysiologique. Il semble que l’organisation du bulbe olfactif de lapin, encore mal connue, n’est pas aboutie au stade fœtal. Même si l’apprentissage olfactif commence in utero, car le liquide amniotique qui contient un grand nombre de molécules olfactives (49), la structuration du tissu nécessite probablement une maturation qui n’est véritablement possible qu’après la naissance, lorsque les fœtus se retrouvent en contact avec le milieu extérieur, par analogie avec d’autres mammifères. Le développement adéquat du système olfactif ainsi que son maintien à long terme demandent un minimum de stimulations sensorielles (50). En effet, le système olfactif croit et mature tout au long de la vie par le biais du renouvellement neuronal périphérique des OSN associé aux stimulations sensorielles et de la dynamique neuronale particulière au BO. En effet, le BO est, avec l’hippocampe, un lieu majeur de neurogenèse adulte.
De plus, il se peut que des différences entre fœtus, en lien avec le sexe ou la position dans la corne utérine ait pu induire des variations inter-individuelles fortes.
Finalement, l’ensemble de ces facteurs est à prendre en considération pour expliquer les écarts inter-individuels pour tous les paramètres testés ainsi que les difficultés rencontrées dans l’étude de ce tissu, et expliquer au moins partiellement, la non significativité des résultats obtenus.
2. La neuroinflammation et la dérégulation des voies dopaminergique
Il a été démontré chez les lapins adultes F1 et fœtaux une altération des neuromodulateurs par HPLC : augmentation de la DA et diminution de la 5HT, accompagnant le défaut de réponse à la phéromone mammaire (Annexes). Pour conforter ces résultats, j’ai quantifié le nombre de neurones dopaminergiques ainsi que l’expression transcriptionnelle des récepteurs DA et 5HT. Les résultats, bien que non significatifs, laissent dégager une tendance. En effet, en moyenne, il y aurait deux fois plus de neurones DA chez les polluées par immunohistochimie. Cependant, je n’ai trouvé aucune différence significative d’expression transcriptionnelle pour les récepteurs dopaminergiques et sérotoninergiques, même si les tendances vont dans le même sens que les résultats obtenus par HPLC et qu’une régulation uniquement post-traductionnelle n’est pas exclue. Néanmoins, la bibliographie appuie la validité de cette hypothèse et d’une altération des neuromodulateurs induite par les DE. Il a été mis en évidence un disfonctionnement de l’activité locomotrice suite à une exposition aux DE pour de faibles concentrations (40). Or l’activité locomotrice et les mouvements volontaires sont corrélés à/ ou contrôlés par la DA et ces récepteurs. Il pourrait donc avoir un lien entre l’altération de ces neuromodulateurs et l’altération olfactive, qui finalement, pourrait traduire également un défaut de l’activité motrice de l’animal, puisque la réponse comportementale à la phéromone associe une réponse de type « sniffing » et un mouvement de tête et de succion.
La piste d’un effet des particules sur la neuroinflammation a également donné des résultats décevants dans ce modèle d’exposition indirecte. Pourtant, l’étude de Levesque et ses collaborateurs (28) montre qu’une exposition directe externe par inhalation DE induit une neuroinflammation du cerveau entier (TNFα, IL6 et IL 1) ainsi qu’une activation microgliale (Iba1). Cette neuroinflammation a aussi été mise en évidence dans le cerveau et dans la SN, suite à une exposition interne par injection dans le liquide céphalorachidien. Pour rappel, la SN est une des lieux privilégiés de synthèse de la dopamine par les neurones qui la composent. De plus, Costa et ses collaborateurs (51) montrent que la pollution atmosphérique due au trafic urbain entraine en plus d’une activation microgliale, un stress oxydatif, mais surtout une neurotoxicité des neurones dopaminergiques, ce qui n’a pas été mis en évidence ici. Mes tentatives pour montrer une inflammation des tissus n’ont pas abouti du fait de l’absence d’amplification par qPCR du gène du TNFα (non montré) et de l’absence de marquage avec Iba1 sur les tissus fœtaux ; il en est de même pour iNOS (non montré). Cependant, l’atrophie des axones des NSO ainsi qu’une marginalisation de la chromatine dans les tissus olfactifs observée chez le F1, est une marque d’inflammation (Annexe). Cette inflammation pourrait être impliquée dans l’altération du système olfactif observée chez les F1, mais les cibles testées ici n’ont pas donné de résultat en ce sens. Il est à noter que l’exposition aux DE, à l’âge adulte induit également une neuroinflammation : augmentation de l’expression transcriptionnelle et protéique de TNFα et IL1β (marqueurs utilisés usuellement en laboratoire pour mettre en évidence une inflammation) dans différentes régions du cerveau mais plus particulièrement dans le striatum (52). On peut émettre l’hypothèse qu’une inflammation induite par les DE dans le site de synthèse de la dopamine la SN et ses lieux de projections tel que le striatum, altère la voie de biosynthèse de la DA. Cette altération semble entrainer des conséquences ou répercussions sur l’ensemble des voies dopaminergiques.
Il est intéressant de noter que cette inflammation a été confirmée dans le cerveau de souris adulte suite à une inhalation de DE et plus spécifiquement dans le BO et l’hippocampe (53). Ils mettent aussi en évidence un effet sexe (les mâles semblent plus sensibles) et génétique (souris mutées sur une enzyme clé impliqué dans le stress oxydatif) montrant l’importance de ces paramètres dans la compréhension de ce type d’étude. Le stress oxydatif est une oxydation du tissu qui peut être contré par l’intervention des enzymes qui piègent ces oxydants comme le glutathion peroxydase qui catalyse la réduction des peroxydes appartement aux espèces réactives de l’oxygène. Une étude s’intéressant à l’effet prénatal d’une telle exposition sur le cerveau de souris a montré la présence de molécules oxydés (NO, SO et CO) dans les émanations de diesel. L’augmentation de molécules oxydantes entrant par la voie olfactive,
semblerait induire une réponse cellulaire de type stress oxydatif afin de réduire l’oxydation des tissus tels que la MO et le BO.
Les investigations de cette équipe ont aussi permis d’améliorer nos connaissances sur les impacts des DEP sur l’épigénome. Des modifications épigénétiques induiraient une configuration ouverte de la chromatine permettant l’accès aux promoteurs de gènes impliqués dans différenciation des cellules cardiaques et neural au 1er jour de gestation puis des gènes impliqués
dans la neurogenèse, la création de l’axe dorsoventral, la spermatogenèse, et la transition épithélium mésenchymateuse au 26ème jours de gestation (54). L’expression transcriptionnelle des gènes du développement et plus particulièrement dans la neurogenèse semble être « boostée » suite à une exposition gestationnelle au DEP.
3. La Dopamine et son implication dans la régulation de la neurogenèse
Suite aux résultats obtenus au test de phéromone mammaire, nous avions émis l’hypothèse que cette altération pourrait être due à une dérégulation de la dynamique cellulaire, en particulier du processus apoptotique dans la BO. Pour cela, j’ai quantifié le nombre de cellules apoptotiques dans l’ensemble des zones du BO et individuellement dans trois sous-zones de cette structure. Le niveau d’apoptose semble non affecté chez les animaux pollués comparés aux témoins. De plus, la densité cellulaire est invariante entre les témoins et les polluées. Cependant, sans une étude complémentaire de la neurogenèse, il est impossible de conclure sur l’absence d’effet. Comme il a été dit précédemment, le BO est un lieu de neurogenèse embryonnaire et adulte qui se poursuit tout au long de la vie. Ce processus est impliqué dans l’apprentissage et la mémoire (olfactif et hippocampique) et implique plusieurs étapes telles que la prolifération, la différenciation, la migration et l’intégration de ces nouveaux neurones au système préexistant. Les cellules souches bulbaires se situent dans une structure antérieure au BO : les ventricules latéraux. De là, elles vont ensuite se différencier en progéniteurs neuronaux et migrer selon la voie rostrale pour plonger dans la zone granulaire et poursuivre leur migration vers la périphérie du BO. Suite à toutes ces étapes, seulement 20%, des nouveaux neurones feront parties intégrantes du système à long terme chez l’adulte. Cette diminution drastique du nombre de neurones arrivés à terme est essentiellement due à la mort de ces cellules pendant la migration, il est donc normal de trouver de l’apoptose dans le BO. Il semblerait que cette étape ne soit pas altérée suite à une exposition aux DE aux vues de mes résultats. Cependant, l’étude (55) a mis en évidence une surexpression des sous unités des récepteurs NMDA et du BDNF (brain-derived neurotrophic factor). L’activité neurale nécessite l’activation des récepteurs NMDA pour induire une entrée massive de calcium intracellulaire, aboutissant à l’activation des voies de signalisation des MAPK. Les kinases activent alors des facteurs de transcriptions nécessaire à l’expression de gènes précoces comme BDNF et cFOS (56). Or les résultats obtenus dans l’étude de Win-Shwe et ces collaborateurs laissent suggérer un phénomène compensatoire vis-à-vis de l’agression subie par le tissu. Cependant, ce phénomène de compensation ne semble pas suffire à retrouver un phénotype témoin. En effet, des troubles de l’apprentissage et de la mémoire spatial ont été observés, toujours dans cette étude, chez les adultes pollués.
Le monde scientifique s’accorde sur l’implication des voies dopaminergiques dans le processus de neurogenèse hippocampique. C’est d’ailleurs une des thérapies employées pour lutter contre la maladie de Parkinson. En effet, il est possible de diminuer les symptômes de cette maladie en administrant du L-DOPA (dérivé de la DA) et ainsi augmenter le niveau de DA dans le cerveau (57). De plus, la DA contribue à l’ontogenèse en régulant la prolifération des cellules souches et peut-être aussi le processus différentiation (58). Cette dernière reste à confirmer.
Finalement, cette compensation pourrait être la conséquence de la dérégulation DAminergique observé chez les sujets soumis aux DEP. Une augmentation de niveau dopaminergique a été observée chez les fœtus et les adultes dans notre étude. On peut donc supposer que l’augmentation de DA suite à une exposition aux DEP, induirait une sur-activation du processus de neurogenèse permettant de compenser l’attaque physico-chimique. Cependant, ce phénomène de compensation de permettrait pas de restaurer un phénotype témoin.
Perspectives et conclusion
Pour compléter les données sur la dynamique cellulaire, il serait donc intéressant d’étendre nos recherches sur le processus de neurogenèse, afin de comprendre les éventuelles conséquences d’une dérégulation des voies dopaminergiques sur ce processus de neurogenèse. Comme nous en avons discuté, et même si nous ne l’avons pas confirmé ici, des études bibliographiques démontrent qu’une exposition au DE entraine une dérégulation des neuromodulateurs tels que la DA.
Cela nécessiterait de mettre en place une nouvelle cohorte d’animaux afin de poursuivre l’étude selon différents axes complémentaires :
Il serait intéressant d’analyser si le processus de neurogenèse du BO est perturbé par les DE en comparant les animaux pollués ou non. Pour cela, des injections au BrdU (BromodéoxyUridine) à différents temps, suivies d’une étude immunohistochimique, par co-marquages entre le BrdU et des marqueurs spécifiques exprimés par les différentes populations de neurones en croissance permettraient d’identifier les cellules affectées. De plus, un co-marquage au cFos/BrdU, permettrait de mettre en évidence les neurones fonctionnels et ainsi faire une étude semi-quantitative qui renseignerait sur la capacité des nouveaux neurones à s’intégrer au système existant. Nous pourrions aussi regarder les acteurs de la voie des MAPK en ciblant par exemple ERK et regarder si cette voie de signalisation est altérée. En effet, en effectuant une injection au BrdU avant le test à la phéromone mammaire et en sacrifiant les animaux à 2 ou 3 semaines, nous serons dans une fenêtre permettant d’étudier les neurones devenus matures mis en jeu dans la réponse au test. Finalement, il serait peut-être possible de caractériser les voies neurales impliqués dans la détection de cette phéromone mais aussi caractériser les dérégulations possibles du processus de neurogenèse suite à une dérégulation d’un neuromodulateur : la DA.
Afin de confirmer une implication de la dérégulation des voies dopaminergiques, nous pourrions compléter ces expériences, en injectant de la dopamine dans la SN et analyser de taux de DA dans les lieux de projections dopaminergiques comme le striatum, l’hippocampe, les ventricules latéraux et bien sûr le BO, afin de vérifier si une élévation du taux de DOPA dans les régions de production induit une augmentation de sécrétion au niveau de ses cibles. Cette étude devra être complété par une quantification des niveaux des neuromodulateurs (DA et 5HT) dans ces différentes régions ciblées, comme par exemple grâce à la technique HPLC, qui a déjà été effectué dans cette étude. Mais aussi étudier si, suite à une injection de DA, le ratio des différents neurotransmetteurs est altéré, dans le cerveau et dans le BO.
Cette étude in vivo peut-être complété par une étude in vitro en analysant la réponse de cellules souches neurales à une augmentation de dopamine dans le milieu de culture et caractériser la capacité des cellules souches à donner des progéniteurs neuronaux.
Cependant, pour ce type d’étude, il serait préférable de changer de modèle et utiliser des animaux de référence comme la souris ou le rat, offrant une bibliographie plus riche, des outils moléculaires plus nombreux et permettant d’utiliser des tests comportementaux plus complexes. Par exemple nous pourrions utiliser un test comportemental permettant d’étudier la discrimination olfactive (test dépendant de la neurogenèse). Nous pourrions étudier les effets de l’exposition aux DE sur l’apprentissage et la mémoire de animaux à discriminer deux odeurs ; soit grâce au labyrinthe en Y ou encore grâce à une cage munie d’un pédalier (Présentation de l’odeur A : appuyer sur la pédale = récompense ; si odeur B : pas de récompense ; si le rat se trompe : temps d’attente entre les deux essaies est rallongé).
Pour finir, d’autres pistes sont suivies sur ce modèle, en ciblant les BO des G28F1. Lors de l’extraction des ARN pour les RT-qPCR, nous avons récupéré la fraction protéique qui va faire l’objet d’une analyse protéomique complémentaire (C. Ronaldo, Lille). Une étude transcriptomique est également en cours sur les BO des animaux pollués et témoins F1 (C. Nemos, Nancy). Enfin, dans les autres zones cérébrales, les autres partenaires du projet BRAINAIRPOLL travaillent sur la neurochimie de différentes sous-régions du cerveau des fœtus G28 F1, en particulier l’hippocampe, le cervelet et l’hypothalamus, pour identifier d’autres voies
de transmission possiblement affectées par l’exposition. Enfin, le même type d’analyse est prévu sur la génération G28 F2 afin de voir si des effets intergénérationnels sont possibles.
