Phytoremédiation en zones humides construites d'eaux contaminées en cuivre

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Phytoremédiation en zones humides construites d’eaux contaminées en cuivre

Lilian Marchand

To cite this version:

Lilian Marchand. Phytoremédiation en zones humides construites d’eaux contaminées en cuivre.

Sciences du Vivant [q-bio]. Université des Sciences et Technologies (Bordeaux 1), 2012. Français.

�tel-02803261�

N° d’ordre : 4691

L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 1

ÉCOLE DOCTORALE SCIENCES

POUR OBTENIR LE GRADE DE

SPÉCIALITÉ : Écologie

Phytoremédiation en zones humides construites d'eaux contaminées

Directeur de recherche: Dr. Michel MENCH Soutenue le: 10 décembre 2012

Devant la commission d’examen formée de:

M. ALARD, Didier -

M. SCHWITZGUEBEL, Jean-Paul - M. VANGRONSVELD, Jaco -

M. FLETCHER, Tim -

M. HUNEAU, Fréderic -

Mme. RAVETON, Muriel - M. LE COUSTUMER, Philippe -

M. MENCH, Michel -

THÈSE

PRÉSENTÉE À

L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 1

ÉCOLE DOCTORALE SCIENCES ET ENVIRONNEMENTS

Par Lilian, MARCHAND

POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR

cologie évolutive, fonctionnelle et des communautés

diation en zones humides construites d'eaux contaminées en cuivre

Directeur de recherche: Dr. Michel MENCH Soutenue le: 10 décembre 2012

Devant la commission d’examen formée de:

- Professeur, Université Bordeaux 1, France Président du jury - Directeur de recherche, EPFL, Lausanne, Suisse Rapporteur - Professeur, Universiteit Hasselt, Belgique Rapporteur - Professeur, Melbourne university, Australie Examinateur - Professeur, Université de Corse Examinateur - Maître de conférences, Univ. J. Fourier, Grenoble Examinateur - Maître de conférences, Université Bordeaux 3 Examinateur - Directeur de recherche, INRA-Univ. Bordeaux 1 Directeur de thèse

L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 1

ET ENVIRONNEMENTS

évolutive, fonctionnelle et des communautés

diation en zones humides construites

Président du jury Rapporteur Rapporteur Examinateur Examinateur Examinateur Examinateur Directeur de thèse

1 Résumé

Ces travaux contribuent à caractériser des compartiments environnementaux (i.e. eau, sol et

solution du sol, substrat, macrophytes à l’échelle individuelle et des communautés) et leur

fonctionnement pour in fine améliorer l’efficacité de zones humides construites (CW) à décontaminer

une masse d’eau contaminée en cuivre. Les connaissances sur le maintien de l’homéostasie de Cu chez

les végétaux ainsi que sa phytotoxicité aux expositions élevées sont résumées. Les principaux

mécanismes physico-chimiques et biologiques intervenant en phytoremédiation d’eaux contaminées

en Cu en CW sont également discutés. Plusieurs solutions de phytoremédiation de type

phytostabilisation aidée ont été évaluées en lysimètres in situ sur un site de traitement du bois

contaminé au Cu, afin d’établir le potentiel de certains amendements à sorber Cu dans le substrat des

CW. Les concentrations en éléments traces potentiellement toxiques (PTTE, dont Cu) et

macroéléments des lixiviats migrants vers les horizons aquifères ont été quantifiées. Un laitier

sidérurgique de type Linz-Donawitz enrichi en P (LDS, 1%) a permis le meilleur développement de

Lemna minor L., utilisé ici comme bioindicateur, exposée aux lixiviats. En parallèle, les communautés

de macrophytes ont été suivies le long du parcours de la Jalle d’Eysines, une rivière urbaine

contaminée en Cu et autres PTTE. Les concentrations en PTTE ont été déterminées dans le sol, l’eau,

l’eau interstitielle et les feuilles de 7 espèces de macrophytes. Un modèle statistique multivarié

(analyse discriminante linéaire, LDA) a ensuite été élaboré sur la base des concentrations foliaires en

PTTE pour biosurveiller l’exposition des macrophytes. Des populations de macrophytes ont aussi été

prélevées sur des zones humides de contamination croissante en Cu en Europe (France, Espagne,

Portugal et Italie), Biélorussie et Australie. La production de racines chez les macrophytes exposées

pendant 3 semaines à des concentrations croissantes en Cu (0,08 ; 2,5 ; 5 ; 15 et 25 µM Cu) montre

une variabilité intra-spécifique de la tolérance au Cu pour des populations de Juncus effusus,

Schoenoplectus lacustris et Phalaris arundinacea. A l’inverse, une réponse similaire à une tolérance

constitutive a été obtenue chez Typha latifolia et Iris pseudacorus, deux espèces à forte production de

rhizomes. L’importance des rhizomes est discutée. Phragmites australis produit également des

rhizomes, mais a présenté une variabilité intra-spécifique dans sa production racinaire en réponse à

une exposition au Cu. En CW, à l’échelle du mésocosme (110 dm

), jusqu’à 99% du Cu de la masse

d’eau (concentration initiale: 2.5µM Cu) ont été éliminés dans les trois modalités plantées de Juncus

articulatus, P. arundinacea et P. australis, ainsi que dans le contrôle non planté. Les rôles du biofilm

microbien, du substrat et des macrophytes en CW ainsi que leurs interactions sont discutés. La

sélection d’écotypes de macrophytes tolérants aux PTTE pour leur utilisation en zone humide

construite ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués dans la variabilité intra-spécifique de cette

tolérance, notamment chez P. australis, sont deux thèmes de recherche à promouvoir.

2 Summary

This work aims at characterizing environmental compartments (i.e. water, soil and soil pore water, substrate, macrophytes at the individual and community scale) and their functioning to in fine improve the effectiveness of constructed wetlands (CW) for cleaning Cu-contaminated waters.

Knowledge on the homeostasis of Cu in plants and its phytotoxicity at medium and high exposures are

summarized. The main physico-chemical and biological mechanisms involved in the phytoremediation

of Cu-contaminated water in CW are discussed. Several aided-phytostabilisation options were in situ

evaluated in lysimeters at a Cu-contaminated wood preservation site to assess the potential of four

amendments to sorb Cu in a CW substrate. Concentrations of potentially toxic trace elements (PTTE,

including Cu) and macronutrients of leachates migrating from the root zone to the aquifers were

quantified. Based on the responses of Lemna minor L. used as a bioindicator, exposed to the

leachates,.Linz-Donawitz slag spiked with P (LDS, 1%) best performed to sorb labile Cu in the root

zone. In parallel, macrophyte communities were monitored along the Jalle Eysines River, an urban

river slightly contaminated by Cu and other PTTE. The PTTE concentrations were determined in the

soil, water, soil pore water, and in the leaves of seven macrophyte species. A multivariate statistical

model was developed based on the foliar PTTE concentrations for biomonitoring macrophyte

exposures. Populations of macrophytes were also collected in wetlands displaying an increasing Cu

contamination in Europe (France, Spain, Portugal, and Italy), Belarus and Australia. Root production

of macrophytes exposed for 3 weeks at increasing Cu concentrations (0.08, 2.5, 5, 15 and 25 µM Cu)

shows an intra-specific variability of Cu tolerance in populations of Juncus effusus, Schoenoplectus

lacustris and Phalaris arundinacea. In contrast, a similar response to constitutive tolerance occurred

for Typha latifolia and Iris pseudacorus, two species with high production of rhizomes. The rhizome

influence is discussed. Phragmites australis also produces rhizomes but showed intra-specific

variability in response to Cu exposure. In a CW at mesocosm scale (110 dm

), up to 99% of Cu in

water (initial concentration: 2.5µM Cu) was removed after 2 weeks in the three modalities planted

with Juncus articulatus, P. arundinacea and P. australis, and in the unplanted control. The

influences of microbial biofilms, the substrate, and the macrophyte species and their interactions in

CW are discussed. The selection of PTTE-tolerant macrophytes for their used in CW and the

understanding of molecular mechanisms underlying the intra-specific variability in PTTE- tolerance,

i.e for P. australis, require further investigations.

3

Qu’est ce que vous nagez bien chef ! Avant c’était mieux que ça, mais vous savez…c’est toujours pareil.

Pithiviers et Chautard (Mais où est donc passée la 7^e compagnie, 1973)

Robert Lamoureux

4

Remerciements

Cette thèse a été financée par le Fond AXA pour la Recherche

L’ensemble des laboratoires et personnes listées ci-dessous ont contribué – i.e. par leur aide lors de campagnes d’échantillonnage ou au travers de partenariat lors de l’interprétation des données et/ou le traitement de l’information pour les publications – à cette thèse. Je les en remercie.

All laboratories and people listed hereafter have contributed – i.e. in helping me during sampling campaigns or through partnerships during the data analysis and interpretation and paper drafting – in this thesis. I am very grateful to them.

Wet Ecosystem Research Group, Department of Biological Sciences, NDSU Dept. 2715, P.O. Box 6050, Fargo, ND 58108-6050, USA M. Otte, D. Jacob

EA4592 Géoressources & Environnement, ENSEGID, Université de Bordeaux 1, 1 allée F. Daguin, F-33607 Pessac, France P. Lecoustumer, F. Huneau, Y. Vystavna

Department of Civil Engineering, Monash university, Room 118, Building 60, Clayton Campus, Clayton Victoria 3168, Melbourne, Australia. T. Fletecher, A. Deletic, K. Lizama, C. Schang

Minnesota State University, Department of Biological Sciences, Mankato, Minnesota, 56001, USA B. Cook Dipartimento di Biologia Vegetale, Laboratorio di Fisiologia Vegetale, Universit `a di Firenze, via Micheli 1, I- 50121 Firenze, Italy C. Gonelli, I. Colzi

Departamento de Tecnologias e Ciências Aplicadas, Escola Superior Agrária - Instituto Politécnico de Beja, Rua Pedro Soares - Campus do IPB, Apartado 6155, 7801-295 BEJA, Portugal P. Alvarenga

Instituto de Investigaciones Agrobiológicas de Galicia, CSIC, Apdo. 122, Santiago de Compostela, 15780, Spain P. Kidd et al.

GRESE, Université de Limoges, 123 Avenue Albert Thomas, 87060 Limoges, France. F. Bordas

Department of Environment and Conservation, BSc (Chem)(EnvSc) Dip Public Safety (Forensic Inv) MRACI CCHEM Contaminated Sites Branch, Locked Bag 104, Bentley DC 6983, Australia P. Newell

ISTO, UMR 6113 CNRS - Université d'Orléans. Campus Géosciences, 1A Rue de la férollerie 45100 Orléans, France. M. Motelica

Mes Remerciements vont aussi à S. Branchu, J.M. Carnus et à toute l’équipe impliquée dans le programme TRANZFOR, programme m’ayant donné l’opportunité d’effectuer trois mois de ma thèse en Australie.

Mes remerciements vont enfin aux membres de mon jury : le Dr. J.P. Schwitzguebel, le Pr. J. Vangronsveld, le Dr. M. Raveton, le Pr. D. Alard, le Pr. T.Fletcher, le Pr. F. Huneau et le Pr. P. Lecoustumer.

5

Remerciements (suite)

Un remerciement particulier à Michel Mench pour son partage des connaissances, la liberté d’entreprendre qu’il a su me laisser…et les milliers de kilomètres que l’on aura parcouru ensemble !!

Et un énorme merci à vous tous !!

Baptiste Baptiste Baptiste Baptiste

Marie Caroline Marie CarolineMarie Caroline Marie Caroline

Un merci spécial pour ceux de toujours : Aline/Jean-Yves/Tibodrey Et des bisous à la meilleure : Reyitas

À mon père…

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Liste des publications Articles à Comité de lecture international

Marchand, L., Mench, M., Jacob, D.L., Otte, M.L. 2010. Metal and metalloid removal in constructed wetlands, with emphasis on the importance of plants and standardized measurements: a review. Environmental Pollution, 158, 3447-3461.

Marchand, L., Mench, M., Marchand, C., Le Coustumer, P., Kolbas, A., Maalouf, J.P. 2011. Phytotoxicity testing of lysimeter leachates from aided phytostabilized Cu-contaminated soils using duckweed (Lemna minor L.). Science of the Total Environment 410,146-153.

Maalouf, J.P., Le Bagousse-Pinguet, Y., Marchand, L., Touzard, B., Michalet, R. 2012. The interplay of stress and mowing disturbance for the intensity and importance of plant interactions in dry calcareous grasslands.

Annals of Botany. doi: 10.1093/aob/mcs152

Maalouf, J.P., Le Bagousse-Pinguet, Y., Marchand, L., Bâchelier, E., Touzard, B., Michalet, R. 2012.

Integrating climate change into calcareous grassland management. Journal of Applied Ecology, 49, 795-802.

Nsangawimana, F., Marchand, L., Mench, M. 2013. Arundo donax L., a candidate for phytomanaging water and soils contaminated by potentially toxic trace elements and producing plant-based feedstock. International Journal of Phytoremediation.

Articles soumis

Marchand, L., Mench, M., Nsanganwimana, F., Vystavna, Y., Huneau, F., Le Coustumer, P., Lamy, J.B, Cook, B.J. 2012. Macrophytes as biomonitors of trace element exposure along an urban river using a multimetric approach (Jalle d’Eysines River, France). Freswater Biology.

Communications orales

Marchand L., Mench M., Jacob D.L., Otte M.L. 2010. Are monocots more efficient than dicots for removing trace elements in constructed wetlands? 7^th International conference on phytotechnologies "Phytotechnologies in the 21^st century: challenges after Copenhagen 2009. Remediation-Energy-Health-Sustainability". University of Parma. Parma, Italy. September 26-29^th.

Marchand L., Mench M., Marchand C., Le Coustumer P., Kolbas A., Maalouf J.P. 2012. Phytotoxicity testing of lysimeter leachates from aided phytostabilized Cu-contaminated soils using duckweed (Lemna minor L.).

IWA Regional Conference on Wastewater Purification & Reuse. Heraklion, Crete, Greece. March 28-30^th. Marchand L., Mench M., Nsangwimana F., Oustrière N., Fletcher T. 2012. Copper tolerance in macrophyte populations: Innate tolerance and/or phenotypic plasticity? Panamerican Conference on Wetland Systems for water quality improvement, management and treatment. Technological University of Pereira, Pereira (Colombia). February 26^th - March 1^st.

Mench M., Bert V., Vangronsveld J., Kolbas A., Marchand L., Puschenreiter M., Kidd P., Kumpiene J., Cundy A. 2012. Phytotechnologies appliquées aux sites pollués: Etat de l’art à l’international. Ademe, Bioindicateurs et phytotechnologies, des outils biologiques pour des sols durables, Journées techniques nationales 16-17 octobre, Paris. 11 p.

Posters

Marchand L., Mench M., Vystavna Y., Kolbas A., Huneau F. 2010. Potential use of macrophytes as bio- indicators of trace element-contamination along the Jalle river (France). 12^th International conference on wetland systems for water pollution control. Venice, Italy, October 4-8^th.

Kolbas A., Mench M., Herzig R, Nehnevajova E., Marchand L. 2010. Copper phytoextraction using mutants lines of sunflower and tobacco. Sakharov readings 2010, Minsk, Belarus. p. 208. May 21-22th.

7

Marchand L., Mench M., Kolbas A. 2010. Are monocots more efficient than dicots for removing trace elements in constructed wetlands? International conference on environmental pollution and clean/bio phytoremediation.

Pisa, Italy, June 16-19th. pp 91. http://EPCR2010.azuleon.org.

Marchand L., Mench M., Vystavna Y., Kolbas A., Huneau F. 2010. Potential use of macrophytes as bio- indicators of trace element-contamination along the Jalle river (France). p. 79 in: Int. Conf. Environmental Pollution and Clean Bio/Phytoremediation. R. Izzo et al. (Eds.), June 16-19, Pisa, Italy, pp 79.

http://EPCR2010.azuleon.org.

Marchand L., Mench M., Marchand C., Le Coustumer P., Kolbas A., Maalouf J.-P. 2011. Phytotoxicity testing of lysimeter leachates from aided phytostabilised Cu-contaminated soils using duckweed (Lemna minor L.). Int.

Phytotechnology Conference, Portland, USA. September 13-16t^h.

Kolbas A., Mench M., Marchand L., Herzig R., Nehnevajova E. 2011. Copper phytoextraction using mutant lines of sunflower. Int. Phytotechnology Conference, Portland, USA. September 13-16th.

Kolbas A., Mench M., Marchand L., Herzig R., Nehnevajova E. 2011. Copper phytoextraction using mutant lines of sunflower. 2011. 11^th International Conference on the Biogeochemistry of Trace Elements (ICOBTE).

Firenze , Italy, July 3-7^th. Part. II, p. 97-98.

Marchand L., Mench M., Jacob D.L., Otte M.L. 2011. Metal and metalloid removal in constructed wetlands:

Emphasis on the Relative Treatment Efficiency Index to quantify the importance of macrophytes. 2011. 11^th International Conference on the Biogeochemistry of Trace Elements (ICOBTE). Firenze, Italy, July 3-7^th. Part.

II, p.417-418.

Kolbas A., Mench M., Marchand L., Herzig R., Nehnevajova, E. 2011. Biomonitoring of copper contaminated soils using a mutant line of sunflower. Doctoral student conference: Next generation insights into geosciences and ecology. Tartu (Estonia). May 12-13^th.

Mench M., Kolbas A., Atziria A., Herzig R., Marchand L., Maalouf J.-P., Ricci A. 2012. Field evaluation of one Cu-resistant tobacco variant and its parental lines for copper phytoextraction at a wood preservation site.

Proc. 4th Int. Congress Eurosoil 2012, Soil Science for the Benefice of Mankind and Environment, 12. Soil Pollution and Remediation, S12.08-Potentially harmful elements in soils, Bari, Italy. July 2-6. p. 2542.

Marchand L., Mench M., Kolbas A. Vystavna Y., Huneau F., Motelika-Heino M. 2012. Bioindicating properties of macrophytes for monitoring trace element exposure along the Jalle River (France). Proc. 4th Int.

Congress Eurosoil 2012, Soil Science for the Benefice of Mankind and Environment, 12. Soil Pollution and Remediation, S12.03-Biogeochemistry of contaminants in wetland, Bari, Italy. July 2-6. p. 2395.

Marchand L., Mench M., Nsangawimana F . 2012. Copper tolerance in macrophyte populations: Innate tolerance and/or Phenotypic plasticity? 9^th International conference on phytotechnologies "Plant based strategies to clean water, soil, air and provide ecosystem services". University of Hasselt. Diepenbeek, Belgium.

September 11-14^th.

Rapports

Mench M, A. Kolbas, L. Marchand, E. Hego, N. Oustrière, A. Atziria, F. Nsanganwimana, C. Bes, J.

Guinberteau, M. Monmarson, C. Bouquet, F. Le Pierres, V. Lozano, F. Schneider. 2011. 12^th month progress report, Gentle remediation of trace element contaminated land – GREENLAND, Project FP7-KBBE-266124, UMR BIOGECO INRA 1202, Talence, France. 51 p.

Mench M, Kolbas A, Marchand L, Bes C, Atziria A, Oustrière N, Hego E, Sureau M-C, Guinberteau J, Monmarson M, 2011. Solutions de phytoremédiation et pilotes de démonstration sur la plate-forme de phytoremediation BIOGECO (PHYTODEMO). 1^er rapport intermédiaire, convention ADEME 09 72 C0076 / INRA 22000460, Ademe, Département Friches industrielles et sols pollués. Angers, France. 131 p.

Mench, Marchand L, Nsanganwimana F, Kolbas A, Oustrière N 2011 Phytoremédiation en zone humide construite d’eaux contaminées d’un site de traitement du bois (plate-forme de phytoremédiation BIOGECO) (CWDEMO). 1^er rapport intermédiaire, convention: ADEME 1072C0081 / INRA 22000495, Ademe, Département Friches Urbaines et Sites Pollués (SFUSP). Angers, France. 31 p.

8

Mench M., Kolbas A., Marchand L., Hego E., Oustrière N., Rousseau F., Roumier P-H, Nibaudeau M., Boechat C., Sinchuk A., Nsanganwimana F., Guinberteau J., Monmarson M. 2012 18th month progress report, Gentle remediation of trace element contaminated land – GREENLAND, Project FP7-KBBE-266124, UMR BIOGECO INRA 1202, Talence, France. 33 p.

Bouchardon J-L, Faure O, Lespagnol G, Moutte J, Guy B, Mimoun D, Graillot D, Paran F, Croze V, Athénol J- D, Ferrando B, Boisson J, Perret S, Hitmi A, Verney P, Moussard Gauthier C, Ledoigt G, Goupil P, Sac C, Mench M, Oustrière N, Marchand L, Kolbas A, 2012. Physafimm: la phytostabilisation - méthodologie applicable aux friches industrielles métallurgiques et minières, 1^er rapport, convention: ADEME 0872C0119, Ademe, Département Sites et Sols Pollués, École des Mines, St Etienne, France. 142 p.

Reviewer pour:

"Bioresource Technology"

"Ecological Engineering"

"ESPR : Environmental Science and Pollution Research"

"KMAE : Knowledge and Management of Aquatic Ecosystems"

"Fresenius Environmental Bulletin"

"La terre et la vie"

9 Préambule

Les travaux de thèse se sont focalisés dès l’origine sur le développement de zone humides construites (CW), en mésocosmes, avec pour finalité la décontamination d’une matrice eau contaminée en cuivre.

Ce projet, financé par la Fondation AXA pour la recherche, s’inscrit à l’interface de l’écologie des communautés, de l’écologie de la restauration et de l’ingénierie écologique, dans le cadre des phytotechnologies appliquées à la remédiation de matrices polluées (phytoremédiation).

Les mécanismes régissant la décontamination des eaux en CW relèvent de la physico-chimie et de la biologie (activités des plantes et microorganismes). Ils reflètent des interactions biotiques et abiotiques dans l’eau, le sol (pour plus de facilité dans le texte, ce terme regroupe les autres substrats tels que sédiments, graviers, etc.), la rhizosphère (ici, volume de sol ou substrat directement influencé par les racines et les micro-organismes associés, i.e. bactéries, actinomycètes et champignons (Hinsinger et al., 2009) et la biomasse souterraine (racines et rhizomes). La réponse de ces compartiments à une exposition aux Éléments Traces Potentiellement Toxiques (en anglais PTTE) est conditionnée par leur nature, leurs interactions avec les autres compartiments, et leur variabilité potentielle (i.e. la possibilité d’un compartiment à modifier de lui-même son état premier en réponse à une variation de son environnement). La plasticité phénotypique des végétaux, comme leur plasticité génotypique, est un exemple de cette variabilité potentielle. L’évaluation de cette plasticité phénotypique chez les macrophytes – les espèces végétales visibles à l’œil nu et vivant en zone humide - en réponse à une exposition aux PTTE (ici Cu) est considérée comme prioritaire par nos travaux.

Les mécanismes physico-chimiques et biologiques régissant le comportement des compartiments

environnementaux listés ci-dessus sont complexes. Cependant de grands sujets de recherches se sont

dessinés en termes de compréhension des processus biologiques et physico-chimiques impliqués dans

la phytoremédiation au cours des vingt dernières années. Pilon-Smith. (2005) résume les bases de ce

thème de recherche dans un article intitulé Phytoremediation, publié dans l’annual review of plant

biology. Au cours de cette thèse, j’ai contribué à ces sujets de recherches pour mieux caractériser les

pollutions aux PTTE dans les compartiments eau et sols ainsi que leurs impacts sur le vivant (ici les

macrophytes). Fort des résultats et conclusions de la première moitié de la thèse, et en utilisant les

données de la littérature, nous avons développé notre propre CW dont nous présentons les

performances. Ce CW a été réalisé dans le but de décontaminer une eau à forte concentration en Cu,

PTTE souvent en excès dans les sols des vignobles en Aquitaine, France et d’autres pays, mais aussi

dans des effluents d’origine variée (ex: traitements du bois, rejets domestiques, lisiers, etc.).

10

Les chapitres s’articulent autour de six grandes parties. La première Le cuivre chez les végétaux supérieurs: de l’homéostasie à la phytotoxicité constitue la première moitié de l’introduction générale.

Elle résume les connaissances sur la place de l’élément cuivre dans le cycle végétatif de la plante, depuis sa nécessité en tant que cofacteur enzymatique jusqu’à sa phytotoxicité, notamment via sa contribution à la production de radicaux libres lors d’un stress oxydant. Les transporteurs membranaires impliqués dans le transport de Cu sont détaillés, avec un aperçu des techniques d’imagerie permettant de localiser les PTTE dans la plante, notamment les organites. L’accent est aussi mis sur les interactions entre Cu et les macrophytes. La seconde moitié de l’introduction, publiée sous forme d’un état-de-de l’art en 2010 sous le titre Metal and metalloid removal in constructed wetlands, with emphasis on the importance of plants and standardized measurements: a review résume les connaissances sur la phytoremédiation d’eaux contaminées en PTTE en CW. Les principaux mécanismes physico-chimiques et biologiques intervenant en CW y sont présentés et discutés.

Avant de décontaminer une matrice eau contaminée au Cu, des travaux ont été menés pour comprendre comment celle-ci se chargeait en Cu sur site après percolation à travers une matrice sol contaminée en Cu. La source de Cu était liée à une activité industrielle: le traitement de bois. Plusieurs solutions de phytoremédiation de type phytostabilisation aidée ont été testées in situ et la concentration en Cu des lixiviats migrants de la zone explorée par les racines vers les horizons aquifères a été quantifiée. Ceci a renseigné sur la composition des eaux à traiter. Un biotest avec Lemna minor L.

comme bioindicateur a permis d’évaluer l’impact des solutions de phytostabilisation, aidée ou non, sur

la phytotoxicité des lixiviats. Ces premiers travaux ont été publiés sous le titre Phytotoxicity testing of

lysimeter leachates from aided phytostabilized Cu-contaminated soils using duckweed (Lemna

minor L.) en 2011 et forment le premier chapitre post-introduction de ce manuscrit. Après cette

première phase pour comprendre les voies d’entrée du Cu dans l’eau et leurs impacts, des travaux de

biosurveillance (biomonitoring) de communautés de macrophytes ont été menés sur des sites

potentiellement contaminés en Cu (et autres PTTE) d’après l’étude des activités anthropique et des

dangers. Les concentrations en PTTE dans le sol, l’eau, l’eau interstitielle et les feuilles de

macrophytes ont été déterminées le long du parcours de la Jalle d’Eysines, une rivière urbaine au nord

de l’agglomération de Bordeaux. Selon nos travaux, elle présente une contamination croissante en

PTTE de sa source à son embouchure. L’hypothèse à valider était le lien entre l’exposition des

macrophytes à une contamination polymétallique et leurs concentrations foliaires en PTTE et

macroéléments. Ces travaux sont soumis sous le titre Macrophytes as biomonitors of trace element

exposure along an urban river using a multimetric approach (Jalle d’Eysines River, France) et

11

constituent le second chapitre de la thèse. Ils proposent un modèle statistique multivarié pour biosurveiller l’exposition des macrophytes aux PTTE au cours du temps. Parallèlement, la plasticité phénotypique des macrophytes a été une hypothèse de travail. Ces plantes de zone humide sont connues comme plus tolérantes aux PTTE que les plantes terrestres. Cette tolérance est définie comme constitutive dans la littérature, mais elle n’est pas validée par des jeux de données suffisant.

Cependant, pour hiérarchiser les facteurs permettant d’optimiser la conception de CW, il était nécessaire de savoir si cette hypothèse de tolérance, supposée constitutive, était validée ou bien si une variabilité intra-spécifique avait échappée aux investigations de la littérature: tous les individus d’une même espèce de macrophyte répondent-ils de la même manière à une forte exposition au cuivre, et ce indépendamment de leur site de croissance originel? Cette question a été abordée dans la littérature, mais à ce jour et à notre connaissance la plasticité phénotypique attendue n’a jamais été observée. Les travaux relatifs à cette question sont le sujet du troisième chapitre post-introduction : Does phenotypic plasticity explain Cu tolerance in macrophyte populations? Contrairement à l’hypothèse dominante, ils montrent une variabilité intra-spécifique de la tolérance au Cu pour des populations de Juncus effusus, Schoenoplectus lacustris et Phalaris arundinacea.

Sur la base des connaissances acquises lors de la première moitié du doctorat, notamment via l’état de

l’art Metal and metalloid removal in constructed wetlands, with emphasis on the importance of plants

and standardized measurements: a review et en s’appuyant sur les résultats obtenus sur la tolérance au

Cu et la plasticité phénotypique des macrophytes, un CW a été conçu et évalué durant la seconde

partie de la thèse. Il a permis de travailler la question première de cette thèse: peut-on décontaminer

une matrice eau contaminée au Cu dans un CW? Et si oui, quel est le rôle des acteurs que sont le

substrat, les macrophytes, les microorganismes et leurs biofilms. Les résultats afférents sont présentés

dans le quatrième chapitre post-introduction Copper removal from water using Bio-Racks planted with

Phragmites australis, Juncus articulatus and P. arundinacea. Une discussion générale synthétisant

l’ensemble des résultats conclut ce manuscrit.

12 Sommaire

Préambule 9

Introduction : partie I Le cuivre: un oligo-élément essentiel; homéostasie, carence et phytotoxicité selon l’intensité de l’exposition de la plante 16

I. Le cuivre: un oligo-élément essentiel pour la plante 17

1.1 Facing the challenges of Cu (Fe and Zn) homeostasis in plants 17

1.2 Acidification de la rhizosphère pour faciliter le prélèvement du cuivre 19

1.3 Prélèvement du Cu basé sur la réduction (Stratégie I) 20

1.4 Prélèvement de Fe et Cu chez les graminées (Stratégie II) 22

1.5 Transporteurs impliqués dans le prélèvement et le transfert du cuivre vers les parties aériennes 22

1.6 Transport intracellulaire du cuivre 23

II. Phytotoxicité et détoxification des effets délétères de l’excès de Cu 27

2.1 Les ROS et le système anti-oxydant 27

2.2 Impacts sur le développement racinaire 30

III. Le cuivre et les macrophytes 36

Introduction : partie II La phytoremédiation, les éléments traces, l’eau, les macrophytes et les zones humides construites 38

I. Rationale for using constructed wetlands for improvement of water quality 40

II. Metal removal processes in wetlands 41

2.1 Adsorption 41

2.2 Co-precipitation and redox reactions 43

2.3 Metal carbonates 45

2.4 pH 45

2.5 Erosion, sedimentation 46

2.6 The role of micro-organisms 46

2.6.1 Micro-organism mediated oxidation 48

2.6.2 Micro-organism mediated reduction 48

III. The roles of plant species 50

3.1 Emergent plants 50

3.2 Floating plants 54

3.3 Submerged plants 54

3.4 Adaptability of macrophytes to metal stress 55

IV. Importance of the plant ecotype 56

V. Selection of a data set for assessment of metal removal efficiency 57

VI. Removal of metals 60

6.1 Differences between systems planted in monoculture 60

6.2 Planted versus unplanted systems 63

6.3 Monoculture versus mixed stands 63

6.4 System size 63

6.5 Seasonal effects 65

VII. A new index: the relative treatment efficiency index (RTEI) 66

13

Conclusion 67

References 69

Chapitre I De la nécessité de traiter les sols contaminés au Cu afin d’en limiter le transfert vers les horizons aquifères…Le cas de la phytostabilisation aidée : vers une nouvelle perspective de zones humides construites 77

I. Introduction 81

II. Materials and Methods 83

2.1 Soils and amendments 83

2.2 Plant material and toxicity test 86

2.3 Statistical analyses 88

III. Results and Discussion 88

3.1 Composition of lysimeter leachates 88

3.1.1 UNT 90

3.1.2 LDS 90

3.1.3 DL 91

3.1.4 OM, OMDL, OMZ 91

3.1.5 PHYTO 92

3.2 Phytotoxicity and L. minor growth 93

Conclusion 96

References 97

Chapitre I : Take home message 101

Chapitre II Bio-surveillance de l’évolution de l’exposition des macrophytes aux PTTE…Le cas d’une rivière urbaine la Jalle d’Eysines 103

I. Introduction 108

II. Materials and methods 110

2.1 Description of the studied area 110

2.2 Water, soils and macrophytes sampling 111

2.3 Water and soil analysis 112

2.4 Mineral analysis of leaf samples 113

2.5 Statistical analysis 113

III. Results 114

3.1 Freshwater, soil and soil pore water 114

3.2 Foliar element concentrations of macrophytes 116

3.3 Modelling of macrophyte exposure by discriminant analysis of foliar PTTE concentrations 118

IV. Discussion 121

4.1 Copper and Zn in soils, soil pore water and macrophytes 121

4.2 Chromium, Fe, Mo, Cd and Pb in soils, soil pore water and macrophytes 121

4.3 Transfers from roots and rhizomes to leaves in hemicryptophyte and rhizomatous-geophytes 122

4.4 Biomonitoring of plant exposure to PTTE by using foliar PTTE concentrations in macrophytes in a linear discriminant analysis (LDA) 123

14

References 126

Chapitre II : Take home message 129

Chapitre IIIVariabilité intra-spécifique de la tolérance au Cu parmi les populations de 6 espèces de macrophytes 131

I. Introduction 136

II. Materials and methods 138

2.1 Sites 138

2.2 Plant sampling, vegetative reproduction and Cu testing 149

2.3 Statistical analysis 141

III. Results 145

3.1 Copper concentrations and physico-chemical characteristics

of the growth medium 145

3.2 Crossed effect of groth location and Cu exposure on root biomass production 146

IV. Discussion 153

4.1 Copper speciation in the growth medium 153

4.2 Inter/Intra specific variability vs constitutive tolerance to cope with excess Cu 153 4.2.1 Inter-specific variability of root biomass production across a Cu-gradient exposure 153 4.2.2 Intra-specific variability of root biomass production across a Cu-gradient exposure 154

Conclusion 157

References 158

V. Chapitre III Informations complémentaires 162

5.1 Matériel et Méthode 162

5.2 Résultats et discussion 163

5.2.1 Activité photosynthétique 163

5.2.2 Activité de la Gaïacol peroxydase 165

Chapitre III Take home message 168

Chapitre IV Traitement d’eaux contaminées par Cu en zones humides construites de type

Bio-Racks plantées de Phragmites australis, Phalaris arundinacea et Juncus articulatus 170

I. Introduction 173

II. Material and Method 174

2.1 Pilot plant setup 174

2.1.1 Plants 175

2.1.2 Sampling and analysis 176

2.1.3 Statistical analysis 179

III. Results and discussion 179

3.1 Physico chemical parameters and Cu removal in bio-racks during a 14-day

exposure period in alkaline conditions 180

3.2 Physico chemical parameters and Cu removal in bio-racks during a 14-day

exposure period in acidic conditions 186

15

Conclusion 187

References 189

Supplementary material 192

Chapitre IV Take home message 192

Synthèse générale 194

I – L’analyse statistique multivariée : une approche nécessaire en phytoremédiation pour l’interprétation des points finaux de mesure (dont le ionome). 196 II – Vers une standardisation nécessaire à la sélection des macrophytes et des substrats en

CW: Nécessité d’un Biotest. 198

III – Quel est le rôle des microorganismes en CW? 200

IV – Influence de la population chez les macrophytes utilisés en CW. 200 V – Apport d’amendements au substrat d’un CW pour décontaminer une masse d’eau à

forte concentration en Cu. 202

Références 205

Annexes 212

Liste des macrophytes en zones humides construites 213

Publications 256

Posters 261

Communications orales 266

Liste des abbreviations

ABCC ATP binding-cassette C Transporter, ACC 1-aminocyclopropane-1-carboxylate, ACCD ACC deaminase, AHA Arabidopsis H⁺ ATPase, AMD Acid Mine Drainage, ANOVA Analysis of Variance, APX Ascorbate Peroxidase, AsA Ascorbate, ATX Antioxidant, BR Batch Reactor, CAT Catalase, CCA Chromated Copper Arsenate, CCH Cu Chaperonne, CCS Cu Chaperonne for Cu/Zn SOD, CDF Cation Diffusion Facilitator, CDS3 Peroxisomal Cu/Zn Superoxide Dismutase, COPT Copper Transporter, COX Cytochrome Oxydase, CW Constructed Wetland, CYS Cystein, DBO5 Biological Oxygen Demand after 5 days, DL dolomitic limestone, DMA deoxy-mugineic acid, DOM Dissolved Organic Matter, ECx effective concentration, EC Electrical Conductivity, ECS glutamylcystein synthase, Eh Redox Potential, epi-DMA 3-epihydroxy- mugineic Acid, EPR Electron Paramagnetic Resonance, EXAFS extended X-ray absorption fine structure spectroscopy, FDR3 Ferric Reductase Defective 3, FDRL1 Ferric Reductase Defective Like 1, FRO2 Ferric Chelate Reductase, GLU Glutamate, GLY Glycin, GPOD Guaiacol peroxidase, GPX Glutathione Peroxidase, GR Glutathione Reductase, GSH Monomeric Glutathione (reduced form), GSSG Glutathione Disulfide (oxidized form), GST Glutathione-S-Transferase, HAVA hydroxyavenic Acid, HM Heavy Metal, HMA Heavy Metal ATPases, HMWC High Molecular Weigh Compound, HSSF Horizontal Sub Surface Flow, ICP-AES Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy, ICP-MS Inductively coupled plasma mass spectrometry, ITR1 Iron Transporter, LDA Linear Discriminant Analysis, LDS Linz- Donawitz slag, LMWOA Low Molecular Weight Organic Acid, MA Mugineic Acid, MDA malondialdehyde, MDHA Monodehydroascorbate, MDHAR MDHA reductase, µ-CT micro computed tomography, µ-XRF micro X-ray fluorescence mapping, MT Metallothionein, NA nicotianamine, NADP(H) Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate (Reduced), NOEC No observed effect concentration, OM Organic Matter, OMDL OM + dolomitic limestone, OMZ OM + zerovalent

16

iron grit, (Os)YSL (Oryza sativa) Yellow Stripe Like, P5CS delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthetase, PAA P-type ATPase Transporter, PC Phytochelatin, Pc Plastocyanin, PCS Phytochelatin Synthase, PHYTO untreated modality planted, POD Peroxidase, POP Persistent Organic Pollutant, PRO L-Proline; PRX Peroxyredoxin, PS phytosiderophores, PSI Photosystem I, PTTE Potentially Toxic Trace Element, QDA Quadratic Discriminant Analysis, RAN Responsive to Antagonist, RB Retarding Basin, ROS Reactive Oxygen Species, RTEI Relative Treatment Efficiency Index, SF Surface Flow, SOD Superoxide dismutase, SPL7 Squamosa Promoter Binding Protein Like7, S-XRF synchrotron-based x-ray fluorescence microscopy, TF Translocation Factor, TOM1 Transporter Outer Membrane 1, UNT untreated modality without plants, VSSF Vertical Sub Surface Flow, WHC Water Holding Capacity, WTP Wastewater Treatment Plant, XANES micro X-ray absorption near edge spectroscopy, XAS X-ray absorption spectroscopy, YS Yellow Stripe, ZIP Zinc/Iron-Regulated Transporter Like Protein

Introduction : partie 1

Le cuivre: un oligo-élément essentiel; homéostasie, carence et phytotoxicité

selon l’intensité de l’exposition de la plante

17

I. Le cuivre: un oligo-élément essentiel pour la plante

Si l’exposition excessive au Cu peut conduire à une phytotoxicité pour les macrophytes, Cu doit d’abord être considéré comme un oligo-élément nécessaire aux fonctions métaboliques et au développement de la plante (Palmer and Guerinot., 2009, Burkhead et al., 2009).

1.1 Facing the challenges of Cu (Fe and Zn) homeostasis in plants

Sous ce titre Palmer et Guerinot (2009) discutent les stratégies mises en place dans le règne végétal pour maintenir l’homéostasie du Cu (et d’autres métaux) dans la plante. Le Cu est un métal de transition - un élément chimique du bloc d du tableau périodique qui n'est ni un lanthanide ni un actinide (www.IUAPC.org) – qui est essentiel pour les plantes supérieures comme Fe, Zn, Mn, Mo et Ni (Tableau 1). Il existe sous de multiples formes redox grâce à sa faculté d’échanger des électrons depuis son orbite d (Palmer and Guerinot, 2009). Ce métal est un cofacteur dans la chaîne de transport des électrons dans la mitochondrie et le chloroplaste (Marschner, 2011). La plus fréquente protéine associée au Cu dans la cellule est la plastocyanine, chargée du transfert des électrons depuis le complexe b6f du cytochrome vers le photosystème I (PSI) (Tableau 2). Cu est aussi cofacteur des protéines impliquées dans la protection contre les dérivés réactifs de l’oxygène (ROS: reactive oxygen species).

Les ROS sont des espèces chimiques de l’oxygène telles que l'oxygène singulet

O

, les hydroxyles (HO ), les ions superoxydes (O

) et les peroxydes (H

O

), rendus chimiquement réactifs par la présence d'électrons de valence – les électrons de la couche superficielle de l’atome - non appariés. Les ROS sont d'origine exogène, e.g. produits par des rayonnements ionisants - ou bien endogène, sous-produits du métabolisme de l'oxygène, et jouent un rôle dans la communication entre les cellules. Leur concentration peut croître en période de stress - à cause d’une forte exposition aux éléments traces potentiellement toxiques (en anglais PTTE). Lorsque les mécanismes pro-oxydants dépassent les mécanismes antioxydants, il y a un stress oxydant. Une des oxydases clefs est la cytochrome oxydase (COX) (Yruela, 2009).

Cu est impliqué dans les processus de lignification des parois cellulaires. Il est le cofacteur de

l’amine oxydase, une enzyme associée aux parois cellulaires qui catalyse l’oxydation de la

18

putrescine et participe de fait à la production d’H

O

impliqué dans la lignification (Ramocha et al., 2002). Il participe également à la formation du pollen, au métabolisme des hydrates de carbone et la synthèse de composés phénoliques en réponse aux attaques de pathogènes (Marschner, 2011; Sancenon et al., 2004 ; Palmer and Guerinot, 2009).

Tableau 1 : Oligo-éléments essentiels aux plantes (Palmer and Guerinot, 2009)

Les deux matrices sources d’exposition racinaires des plantes au Cu sont l’eau, mais surtout le sol ; une exposition foliaire est possible, en lien avec une contamination diffuse ou ponctuelle, surtout chez les macrophytes immergés. Bien qu’abondamment présents dans une matrice, les métaux ne sont pas toujours faciles à prélever par les racines s’ils sont sous forme insoluble.

Le cuivre, à l’image du zinc, est un métal principalement présent sous forme insoluble car il

est adsorbé sur les argiles, les carbonates et les matières organiques. Cette insolubilité est

marquée dans les sols alcalins, qui représentent 30% de la surface terrestre émergée (Palmer

and Guerinot, 2009). Les plantes ont adopté diverses stratégies afin de pallier à cette

disponibilité limitée. L’ensemble des plantes, si l’on excepte les Graminées, ont recours à des

stratégies de prélèvement basées sur la réduction du Cu présent dans le sol (Figure 1). Les

Graminées basent leur stratégie de prélèvement, celle du Fe notamment, sur la chélation via la

production de phytosidérophores (Figure 2). Une troisième stratégie, commune à l’ensemble

des plantes, est l’acidification de la rhizosphère via l’excrétion de protons H

.

19

Tableau 2 : Fonctions et localisation des protéines associées au Cu chez les plantes (Burkhead et al., 2009).

1.2 Acidification de la rhizosphère pour faciliter le prélèvement du cuivre

Sur sols alcalins, les plantes peuvent exsuder des protons dans la rhizosphère via l’activité de l’ATPase. Le pH diminue alors légèrement au niveau de la rhizosphère et passe sous le seuil limitant la solubilité et le prélèvement des oligoéléments sous forme cationique (Palmgren et al., 2008). Ce mécanisme est fréquent lors de carences ferriques, le fer non soluble sous la forme d’oxydes Fe(OH)

pouvant être plus facilement solubilisé et prélevé sous sa forme Fe

avec formation concomitante de trois molécules d’eau. Les ATPases responsables de

l’acidification ne sont à ce jour pas formellement identifiées mais sont présupposées

appartenir aux AHA (Arabidopsis H

ATPases), notamment aux AHA1, 2 et 7 (Palmgren,

2001; Dinneny et al., 2008). L’acidification du sol peut induire une meilleure solubilisation

d’autres cations métalliques, dont Cu, en facilitant leur désorption des phases porteuses et des

particules du sol. L’acidification opérée dans la rhizosphère par les ATPases établit un

potentiel membranaire racinaire négatif [-100 to -250 mV] qui favorise le prélèvement des

cations, dont Cu (Palmgren et al., 2008).

20

Figure 1 : Transport de Cu, Fe et Zn à travers les cellules chez les dicotyledones (Palmer and Guerinot., 2009). Cu, Fe et Zn sont prélevés dans l’apoplasme par leurs transporteurs spécifiques localisés dans l’épiderme. La réduction de Fe et éventuellement de Cu par FRO2 et l’acidification du sol par les Arabidopsis H

ATPases (AHA) contribuent à augmenter le prélèvement. Le Cu peut emprunter la voie symplastique jusqu’aux vaisseaux conducteurs en passant la bande de Caspari au niveau de l’endoderme. Le transport dans le xylème n’est à ce jour pas totalement caractérisé mais impliquerait des transporteurs de la famille des Heavy Metal ATPases (HMA) et la pompe à citrate FRD3. Dans le xylème, Cu est transporté vers les parties aériennes via le flux généré par l’évapotranspiration. Le Cu est déchargé dans les parties aériennes par une protéine de la famille des YSL. Les transporteurs YSL sont potentiellement à la source de la translocation de Cu vers le phloème. Les carrés sombres représentent la bande de Caspari

1.3 Prélèvement du Cu basé sur la réduction (Stratégie I)

Désorbés des phases porteuses ou plus en compétition avec les protons pour les sites de

sorption, les ions libre Cu

dans la solution du sol sont plus accessibles à la fonction de

prélèvement des racines. Les transporteurs membranaires du rhizoderme, et plus généralement

des cellules, ont une affinité spécifique pour un état donné d’oxydation du métal. Le Cu est

prélevé par la racine sous sa forme Cu

par le transporteur COPT1 (Sancenon et al., 2004 ;

21

Puig et al., 2007). L’expression de la protéine COPT1 est renforcée en conditions de carence en Cu via l’action du facteur de transcription SPL7 (Squamosa Promoter Binding Protein Like7) (Sancenon et al., 2004; Yamasaki et al., 2009). Cependant, la forme Cu

est plus présente que la forme Cu

dans le sol (Puig et al., 2007). Il est possible que Cu

soit réduit par FRO2, la réductase du fer. L’enzyme FRO2 (Ferric chelate reductase) réduit Fe

en Fe

afin qu’il soit prélevé par la racine (Robinson et al., 1999). La forme Cu

peut aussi être prélevée via un transporteur de la famille des ZIP (Zinc/Iron-Regulated Transporter Like Protein), celle-ci étant connue pour le transport des cations divalents (Eide et al., 1996). Les transporteurs ZIP2 et ZIP4 s’expriment en conditions de carence en Cu (Wintz et al., 2003), notamment via l’action de SPL7 (Yamasaki et al., 2009), mais leur implication dans le prélèvement de Cu n’est pas clairement établie.

Figure 2 : Transport de Cu, Fe et Zn à travers les cellules chez les monocotyledones (Palmer and

Guerinot., 2009). Le Fe et Zn sont chélatés par les phytosidérophores puis prélevés via les

transporteurs Yellow Stripe-Like (YSL) localisés dans l’épiderme. Le Fe peut aussi être prélevé par

OsIRT1. Les métaux traversent l’espace apoplastique jusqu’à la bande de Caspari au niveau de

l’endoderme avant d’être chargés dans le xylème. La pompe à citrate FRDL1 intervient dans le

relargage du citrate dans le xylème et le transport du fer dans le xylème sous forme citrate-Fe

Le Fe

est alors transféré vers les parties aériennes via le flux généré par l’évapotranspiration. Les carrés

sombres représentent la bande de Caspari.

22

1.4 Prélèvement de Fe et Cu chez les graminées (Stratégie II)

Les Graminées prélèvent Fe par l’exsudation dans la rhizosphère d’acides aminés non protéinogéniques appartenant à la famille des acides muginéiques (MA), les phytosidérophores (PS). Les PS se déclinent en trois types: les MA, les acides déoxy- muginéiques (DMA) et les acides 3-épihydroxy-muginéiques (epi-DMA) (Tsednee et al., 2012). Les acides aveniques (AVA) et les acides hydroxyavéniques (HAVA) sont deux autres types de PS répertoriés par Fushiya et al. (1980) chez le genre Avena et plus récemment chez Poa pratensis cv Baron (Ueno et al., 2007) et Hordeum vulgare cv Himalaya (Tsednee et al., 2012). L’expression des gènes impliqués dans la biosynthèse des MA est induite par la carence en Fe et est régulée par l’homéostasie cellulaire de Fe (dont les ferritines sont une composante essentielle) (Vansuyt et al., 2000 ; Sappin-Didier et al., 2005). Pour chélater Fe(III), les graminées exsudent les PS via le transporteur TOM1 (Nozoye et al., 2011), puis le complexe PS-Fe(III) est prélevé par les cellules du rhizoderme via 2 familles de transporteurs: Yellow-stripe 1 (YS1) et YS1-like (Curie et al., 2009). Le transporteur OsYSL15 prend en charge le complexe Fe(II)-DMA. Le transporteur OsYSL16 interviendrait dans le transport du complexe Fe(III)-DMA. Outre Fe, les phytosidérophores mobilisent plusieurs métaux tels Ni, Zn, Cd, Mn et Cu (Mench and Fargues, 1994 ; Dell’mour et al., 2010; Tsednee et al., 2012). La nicotianamine (NA), un précurseur des PS, participe au prélèvement de Fe dans la rhizosphère des graminées sous la forme Fe(II)-NA, qui est prélevé via le transporteur OsYSL12.

1.5 Transporteurs impliqués dans le prélèvement et le transfert du cuivre vers les parties aériennes

Une fois prélevé et transféré via la voie apoplastique jusqu’à la bande de Caspari, Cu est transféré via la voie symplastique (cytoplasme) dans le péricyle l’endoderme (Figures 1,2,3).

A ce niveau, il est chargé dans le xylème par des protéines de la famille des HMA (Heavy

Metal ATPase) dont HMA5. La HMA5 est exprimée et régulée par la concentration en Cu

dans le péricyle (Andrés-Colas et al., 2006 ; Kobayashi et al., 2008 ; Waters et al., 2011). Le

transporteur HMA9 interviendrait également dans le transport de Cu dans le xylème, voire

dans la phloème (Lee et al., 2007). Les ligands de Cu pendant sa translocation dans le xylème

vers les parties aériennes seraient principalement des acides aminés (histidine, nicotianamine -

23

NA) (Pich and Scholz 1996 ; Liao et al. 2000) et des acides organiques (citrate) (Puig et al., 2007 ; Curie et al., 2009). La NA participe à la mobilisation de Cu dans la phloème depuis les plus vieilles feuilles jusqu’aux feuilles plus jeunes et aux graines via le transporteur OsYSL16 (Zheng et al., 2012).

.

Figure 3 : Coupe transversale de racine © Beauchamp's Tenth Horse CC by-nc-nd 2.0

1.6 Transport intracellulaire du cuivre

Le Cu est requis dans le chloroplaste, notamment dans la membrane des thylakoïdes en tant

qu’atome central de la plastocyanine, une protéine transferant les électrons depuis le

complexe b6f du cytochrome vers le photosystème I (PSI). Le Cu est aussi dans le

chloroplaste un cofacteur de la superoxyde dismutase (SOD), qui convertit les superoxydes

24

(O

-) en peroxyde d’hydrogène (H

O

) pour diminuer les dommages cellulaires causés par la libération de ces superoxydes au cours de la chaine de transport d’électrons (Alscher et al., 2002). Les transporteurs chloroplastiques de Cu sont de la famille P-type ATPase ; il s’agit de PAA1 (HMA6) et PAA2 (HMA8) (Shikanai et al., 2003 ; Abdel-Ghany et al., 2005) (Figures 4, 5). PAA1 est localisé à l’intérieur de l’enveloppe interne du chloroplaste et PAA2 sur la membrane des thylakoïdes. D’autres transporteurs seraient impliqués car le transport de Cu est actif chez des mutants ppa1paa2. Parmi ces transporteurs, HMA1 - une pompe Ca

/métal localisée dans l’enveloppe du chloroplaste - interviendrait pour le transport de Cu dans le chloroplaste (Moreno et al., 2008). Un autre transporteur de type HMA, HMA7, nommé aussi RAN1 pour Responsive to Antagonist, transfert Cu dans le réticulum endoplasmique où il participe à la formation de récepteurs fonctionnels à l’éthylène (Chen et al., 2002). L’éthylène est un signal du stress abiotique et du stress résultant de l’action des pathogènes. Une Cu-chaperonne (COX 17) livrerait du Cu à la mitochondrie (Maxfield et al., 2004), mais aucun transporteur n’est formellement identifié pour cet organite. Un transporteur de Cu, COPT5 a été caractérisé dans le tonoplaste – membrane qui sépare la vacuole du cytoplasme – d’A. thaliana (Jaquinod et al., 2007 ; Pilon, 2011 ; Klaumann et al., 2011 ; Garcia-Molina et al., 2011). Le COPT5 exporterait Cu de la vacuole au cytoplasme où il peut être réalloué aux autres organites. Selon Klaumann et al. (2011), COPT5 sert à la réallocation inter-organes de Cu, depuis la racine jusqu’aux parties aériennes. La forme Cu

est à la fois peu soluble et hautement réactive dans la cellule. Des protéines chaperonnes sont impliquées dans son transport. La Copper chaperone (CCH) permet son entrée dans le cytoplasme et son transport dans le réticulum endoplasmique (Yruela, 2009). L’ATX1 délivre Cu

au transporteur P-type ATPase HMA5 (Shin et al., 2012). La protéine CCS (Copper chaperone superoxyde) transfert Cu

aux Cu/Zn superoxyde dismutases CSD1 (Cu/Zn superoxyde dismutase du cytosol), CDS2 (Cu/Zn superoxyde dismutase du chloroplaste) et CDS3 (Cu/Zn superoxyde dismutase du peroxysome) via une interaction protéine-protéine (Yruela, 2009).

L’expression des protéines CSS et des superoxydes dismutases 1, 2 et 3 diminue lors d’une

carence en Cu ; leur régulation permet une utilisation optimale de Cu pour la photosynthèse

(Abdel-Ghany et al., 2005).

25

Figure 4 : Schéma du transport de Cu dans une cellule de plante générique. Les proteines de transport membranaires sont indiquées en orange, les Cu-Chaperonne en violet et les protéines liées au cuivre en bleu. CCH, Cu chaperone ; ATX, antioxydant 1 ; CCS, Cu chaperone pour la Cu/Zn superoxyde dismutase ; CDS3, Cu/Zn superoxyde dismutase peroxisomale ; COPT, transporteur de Cu; COX, cytochrome-c oxydase ; ER, réticulum endoplasmique ; FRO, ferric reductase oxydase ; HMA, Heavy metal P-type ATPase ; MT metallothionines ; NA, nicotianamine ; PAA, P-type ATPase d’

arabidopsis ; Pc, plastocyanine ; RAN1, responsive to antagonist 1 ; SOD, superoxyde dismutase ;

YSL, yellow stripe-like proteine ; ZIP, IRT-like protéine. (Yruela, 2009)

26

Figure 5 : Prédiction de la topologie de la membrane pour certains transporteurs des familles COPT et

HMA. Cette topologie est basée sur des prédictions qui n’ont pas été vérifiées expérimentalement

(Yruela, 2009).

27

II. Phytotoxicité et détoxification des effets délétères de l’excès de Cu

2.1 Les ROS et le système anti-oxydant

Le cuivre est défini comme un Élément Trace Potentiellement Toxique (en anglais PTTE) (Adriano, 2001); comme tout élément essentiel au développement de la plante, il peut induire des symptômes de toxicité (e.g. réduction de la biomasse, inhibition de la croissance racinaire, bronzing, chlorose, réduction du prélèvement de Fe, Zn et P, perte de l’intégrité du chloroplaste, etc.) à des expositions supérieures à l’homéostasie cellulaire de Cu (5-20 µ g Cu g

MS) (Marschner, 2011). Sa toxicité première vient de sa contribution à la production des ROS tels les superoxydes (O

), les radicaux hydroxyles (HO•) et le peroxyde d’hydrogène (H

O

) notamment via la catalyse des réaction de Fenton, i.e. Fe

+ H

O

→ Fe

+ OH

(aq)

+ HO•, et d’Haber-Weiss, i.e. •O

+ H

O

→ HO•+ OH

+ O

(Figure 6)

Figure 6 : Voie de synthèse des ROS lors d’une forte exposition aux métaux (HM). Le prélèvement d’HM et sa distribution aux organites par les transporteurs est suivi d’une production de ROS stimulée par l’activité rédox des HM et leur impact sur les mécanismes sub-cellulaires. L’activation de la NADPH oxidase localisée dans la membrane plasmique par les HM contribue à la production de ROS.

Les points rouges symbolisent la distribution des HM dans la cellule et l’apoplaste.

Les ROS produits peuvent peroxyder des lipides et oxyder des protéines et des domaines de

l’ADN, notamment au niveau de la guanine (Drazkiewicz et al., 2004 ; Sharma and Dietz.,

28

2009). En conditions non stressantes, la production de ROS a lieu principalement via les transferts d’électrons dans le chloroplaste et la mitochondrie. Dans ces conditions, le système de défense antioxydant maintient la teneur en ROS en dessous du seuil de toxicité. Le stress provoqué par une exposition supérieure à l’homéostasie du Cu dans les tissus rompt cet équilibre et stimule l’activité d’enzymes impliquées directement ou non dans l’élimination des ROS. Ce réseau d’enzymes se base sur un large réseau enzymatique (Figure 7). Les SOD sont impliquées dans l’élimination d’O

via les réactions Cu

SOD +O

→ Cu+/SOD+O

et Cu

/SOD+O

→ Cu

/SOD+H

O

Les catalases (CAT) catalysent la dismutation des peroxydes, 2H

O

→ O

+ 2H

O. Les peroxyredoxines (PRX) sont également impliquées dans la dégradation de H

O

, et les ascorbate peroxydases (APX) le dégradent en utilisant l’ascorbate (AS) comme substrat au cours de la réaction AS + H

O

→ MDHA+ 2 H

O, où MDHA représente le monodéhydroascorbate (Dietz et al., 2006). AS est régénéré à partir de MDHA via la MDHA réductase (MDHAR) en parallèle avec l’oxydation de NADPH en NADP

. Des isoformes de SOD, APX et PRX sont localisés dans l’ensemble des compartiments cellulaires. A l’inverse, CAT se retrouve majoritairement dans le peroxysome (Sharma and Dietz., 2009). D’autres enzymes participent au maintien de l’homéostasie cellulaire. Les glutathion peroxydases (GPX) dégradent les peroxydes via la réaction 2GSH + H

O

→ GS–SG + 2H

O, où GSH représente le glutathion monomérique et GS-SG le glutathion disulfure (Navrot et al., 2006). Le GSSG (glutathion oxydé) est à nouveau réduit en GSH via la glutathion réductase (GR) en parallèle de l’oxydation de NADPH en NADP

. (Figure 7). Les glutathion-S-transferases (GST) ainsi que les syringaldazine peroxydases (SPOD) et les Guaiacol peroxydases (GPOD) sont également impliquées dans l’élimination d’H

O

(Cuypers et al., 2002 ; Hung et al., 2005), tout comme la proline et l’α-tocophérol (Sharma and Dietz 2009). La L-proline, libre (PRO), s’accumulerait dans les plantes soumises aux fortes expositions aux PTTE (Sharma and Dietz, 2006) et aurait un rôle d’antioxydant.

Sous une forte exposition de Chlorella reinhardtii au Cd, le pool de GSH est 4 fois plus

oxydé chez les individus non transgéniques, à faible teneur en proline dans la cellule, que

chez les individus transgéniques surexprimant la delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthétase

(P5CS), l’enzyme de synthèse de PRO (Siripornadulsil et al., 2002). In vitro, la résonnance

paramagnétique électronique (EPR) révèle que la proline piège les ROS •OH et

O

(Kaul et

al., 2008). L’α-tocopherol réagit principalement avec

O

et au dernier stade de la chaine de

réaction lors de la peroxydation des lipides (Maeda et al., 2007). La concentration en α-

tocophérol augmente lorsque l’exposition au Cu et au Cd s’accroit chez A. thaliana (Collin et

al., 2008).