HAL Id: hal-01512185
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Submitted on 21 Apr 2017
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Analyse des phospholipides oxydés par LC (ESI) -MSMS
Spiro Khoury, Corinne Pouyet, Franck Giacomoni, Estelle Pujos-Guillot
To cite this version:
Spiro Khoury, Corinne Pouyet, Franck Giacomoni, Estelle Pujos-Guillot. Analyse des phospholipides oxydés par LC (ESI) -MSMS. 10. journées scientifiques du Réseau Francophone de Métabolomique et Fluxomique RFMF 2016, May 2016, Montpellier, France. 156 p., 2016, Livret des résumés 10JS RFMF. �hal-01512185�
+Prec (184.00): 24 MCA scans from Sample 1 (PAPC) of PAPC 10ppm prec184.wiff (Turbo Spray) Max. 6.6e7 cps.
500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 820 840 860 880 900 920 940 960 980 1000 m/z, Da
0.0 5.0e6 1.0e7 1.5e7 2.0e7 2.5e7 3.0e7 3.5e7 4.0e7 4.5e7 5.0e7 5.5e7 6.0e7 6.5e7
Intensity,cps
783.5
785.4
792.0
Analyse des phospholipides oxydés par LC (ESI) - MSMS : une approche lipidomique
Spiro KHOURY 1 @ , Corinne POUYET 1 , Franck GIACOMONI 1 , Estelle PUJOS-GUILLOT 1
1 Unité de Nutrition Humaine, UMR 1019 INRA (Plate-Forme d’Exploration du Métabolisme PFEM), Centre de Clermont-Ferrand – Theix, 63122 Saint Genès Champanelle, France
@ Contact: spiro.khoury@clermont.inra.fr
Introduction
- 10
èmesjournées scientifiques du Réseau Francophone de Métabolomique et Fluxomique (RFMF)
Montpellier, 31 mai - 2 juin 2016.
Problématique
Introduction & Problématique
Glycérol
Groupement phosphate
Hydrophobe
Acides gras
Hydrophile
CH2 C H2C
H O
O C
C
O P O O
R R'
O
OH O
X
sn-1
sn-2
sn-3
X =Les phospholipides (PLs) sont des molécules biologiques complexes, de structures très variées, et représentent une classe de métabolites d’intérêt pour l’étude des relations entre l’alimentation et le développement des maladies métaboliques. Cette classe de composés peut donner lieu à la formation d’un grand nombre de produits d'oxydation. Ainsi, les phospholipides oxydés (PLs-Ox) sont de plus en plus reconnus comme des marqueurs de différentes pathologies associées à l’inflammation, telles que l’athérosclérose et le diabète.
L’objectif de ce travail était d’acquérir des nouvelles connaissances sur les PLs-Ox afin de proposer une stratégie analytique pour leur analyse.
Ce travail a abouti à la mise en place d’une méthode de synthèse des PLs-Ox (PC oxydés) à partir de standards de PLs non oxydés. La méthode d’analyse développée en LC (ESI) - MSMS par l’usage du QTRAP 5500 a permis la caractérisation de produits divers d’oxydation, à chaînes courtes et à chaînes longues. La formation des produits d’oxydation est fonction de la structure des PLs. Le rapport de formes oxydées varie au cours du temps.
En perspectives: Ce travail sera poursuivi afin de séparer et d’identifier des produits d’oxydation de PLs sur d’autres classes phospholipidiques, et aussi dans les matrices biologiques. De même, l’identification des produits d’oxydation des PLs pourrait enrichir les bases de données de PLs.
Références: - Corinne M. Spickett, Ana Reis, Andrew R. Pitt. Free Radical Biology & Medicine, 2011, Volume 51, PP 2133–2149.
- Khoury Spiro, El Banna Nadine, Tfaili Sana, Chaminade Pierre. Anal. Bioanal. Chem, February 2016, Volume 408, Issue 5, pp 1453-1465.
Agilent 1260 Infinity SFC/UHPLC System in UHPLC mode (Chemstation®)
AB SCIEX QTRAP® 5500 System (Analyst®)
La disponibilité commerciale des standards de PLs-Ox:
Peu de standards de lipides oxydés et de PLs-Ox sont disponibles…
Synthèse des PLs-Ox
La préparation des PLs auto- oxydés a été faite à partir des standards de PLs non oxydés (exposition à l’air libre à température ambiante) pendant différents temps.
Les PLs étudiés possèdent un nombre et une position des insaturations différents:
Optimisation de la phase mobile:
Solvants utilisés:
( Hexane/Chloroforme/Isopropanol/H2O) - Cette phase a été supplémentée par 12.5 mM de formate d’ammonium.
Optimisation de la méthode LC-MS MS:
- Optimisation des paramètres dépendants des composés et des paramètres
« Source Electrospray ESI » en (+) et (-).
- Optimisation des conditions chromatographiques.
- Optimisation de la méthode MS et MSMS.
Système hybride UHPLC/SFC couplé à la spectrométrie de masse
P
O O– N+OO H O
O
O O
783,5
+Prec (184.00): 24 MCA scans from Sample 1 (PAPC ox J1) of PAPC ox J1 10ppm prec.wiff (Turbo Spray) Max. 3.5e6 cps.
500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 820 840 860 880 900 920 940 960 980 1000
m/z, Da 0.0
2.0e5 4.0e5 6.0e5 8.0e5 1.0e6 1.2e6 1.4e6 1.6e6 1.8e6 2.0e6 2.2e6 2.4e6 2.6e6 2.8e6 3.0e6 3.2e6 3.4e6 3.5e6
Intensity, cps
612.4
783.5
596.1
784.4
846.9 668.1
666.2
829.1 860.9 598.1
581.8583.8 614.4 622.3638.3628.4654.2670.0673.8687.9691.9 703.8733.5 741.4 767.5 795.1811.1801.3827.2 845.0856.9 879.9878.6894.5 900.5 932.5948.3
567.5 888.5
540.2 608.3 962.5
510.8 594.1 787.8 980.5
O
PO O–N+ O O H OO
O O H
POVPC
612,4
PGPC
O O P
– O +N
O
O H
O O
O O
HO
O
P
O O–N+OO H O
O
O O H
O
H
O PO
–O+N
O
O
H
O O
O O
O H O O
O O
O O P
–O O
N +
O
O H
O H
O H
O O
O O
O O P
–O O
N
+
O
O
HO
O
O O
OP
O O–O N+ O HO
PAPC
PAPC+(OOH) PAPC+(OOH)2 PAPC+(OOH)3 PAPC+(OOH)4
PEIPC
+Prec (184.00): 24 MCA scans from Sample 1 (PAPC ox J7) of PAPC ox J7 10ppm Prec.wiff (Turbo Spray) Max. 7.8e6 cps.
500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 820 840 860 880 900 920 940 960 980 1000
m/z, Da 0.0
5.0e5 1.0e6 1.5e6 2.0e6 2.5e6 3.0e6 3.5e6 4.0e6 4.5e6 5.0e6 5.5e6 6.0e6 6.5e6 7.0e6 7.5e6 7.8e6
Intensity, cps
612.4
666.2 596.1
846.9
860.7 598.1
583.9 626.4 638.4 662.1 688.0703.9 721.8 741.6 749.6 783.3 813.1 845.0 880.7896.5 914.6 833.0 850.9
567.5
540.2 602.2 636.4 715.7 801.1 816.8 928.2 944.4
510.7 619.5 646.4 968.7
O
PO O–N+ O O H OO
O O H
POVPC
612,4
PGPC
O O P
– O +N
O
O H
O O
O O
HO
O
P
O O–N+OO H O
O
O O H
PONPC
O O O P
–O N +
O
O
H
O O
O O
H O
OH
O
P
O O–N+OO H O
O
O O
O H O O
O O
O O P
–O O
N +
O
O H
OO
O O
HO
O
O O
OP
O O–O N+ H
PONPC
O O O P
–O N +
O
O
H
O O
O O
H O
O H
O H O
O O O
O O P
–O O +N
O
PAPC+(OOH)
PAPC
PAPC+(OOH)2 PAPC+(OOH)3 PAPC+(OOH)4 O
HO
O
O O
OP
O O–O N+ O HO
PEIPC
Exemple: Identification des formes oxydées d’une espèce moléculaire PAPC [ PC (16:0/20:4 (5Z, 8Z, 11Z, 14Z)) ]
PC(16:0/20:4), PC(16:0/22:6), PC(18:0/20:4), PC(16:0/18:1), PC(16:0/18:2)
+MS3 (846.40),(846.40): 231 MCA scans from Sample 1 (PAPC ox) of PAPC ox J7 10ppm MS3 846.4 pos AF2 0.250.wiff (Turbo Spray) Max. 4.1e5 cps.
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850
m/z, Da 0.0
2.0e4 4.0e4 6.0e4 8.0e4 1.0e5 1.2e5 1.4e5 1.6e5 1.8e5 2.0e5 2.2e5 2.4e5 2.6e5 2.8e5 3.0e5 3.2e5 3.4e5 3.6e5 3.8e5 4.0e5
Intensity, cps
281.0
249.1
295.1
663.4 265.1
369.1
828.5
478.3
810.5 327.0
437.2 620.4
389.0
251.0 355.1 792.5
313.2 496.3 627.4
184.1 269.0 282.1 333.1 371.0 407.2419.4429.1489.2 549.5575.5603.4 645.4 702.5 733.4 758.4 846.5
104.0 233.2 505.3
+EPI (846.40) CE (47): 56 MCA scans from Sample 1 (PAPC ox) of PAPC ox J7 10ppm EPI 846.4 pos.wiff (Turbo Spray) Max. 8.2e6 cps.
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z, Da 0.0
5.0e5 1.0e6 1.5e6 2.0e6 2.5e6 3.0e6 3.5e6 4.0e6 4.5e6 5.0e6 5.5e6 6.0e6 6.5e6 7.0e6 7.5e6 8.0e6 8.2e6
Intensity,cps
184.1
846.5
496.3 620.4 810.5 828.4
Les connaissances sur les PLs-Ox et leurs fragmentations:
o Réaliser une base de données, associée à un workflow d’aide à l’identification des PLs, implémentée dans la plateforme web Galaxy : W4M
(http://workflow4metabolomics.org).
o Enrichir la méthode de profilage d’extraits de lipides totaux plasmatiques par LC (ESI)-MS MS par l’intégration de la détection des PLs-Ox.
Tête polaire
PAPC-Sn2-H2O
PAPC -Sn2
[PAPC+(OOH)2] – 183
[PAPC+(OOH)2] – H2O
[PAPC+(OOH)2] – 2(H2O)
[PAPC+(OOH)2] – H2O
[PAPC+(OOH)2] – 2(H2O)
PAPC -Sn2 Tête polaire
0,00E+00 1,00E+07 2,00E+07 3,00E+07 4,00E+07 5,00E+07 6,00E+07 7,00E+07 8,00E+07 9,00E+07
0 1 2 3 4 5 6 7
Intensité [M+H]+
Temps d'oxydation (jours)
PC(16:0/20:4) 782.5 PC(16:0/22:6) 806.5 PC(18:0/20:4) 810.5 PC(16:0/18:1) 760.5 PC(16:0/18:2) 758.5
Evaluation de l’intensité de l’ion majoritaire des 5 espèces moléculaires de PC (variant en nombre et position des insaturations et en longueur de chaînes ) en fonction du
temps d’oxydation. Mode d’acquisition: Précurseur d’ion de 184 (+).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Lipides oxydés
PI PE PC PA PS PG Céramides
Avanti Polar Lipids ®
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Rapport de l'intensité des ions
Temps d'oxydation (jours)
[612/596] [596/666]
PC(16:0/20:4)
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Rapport de l'intensité des ions
Temps d'oxydation (jours)
[640/624] [811/731]
PC(18:0/20:4)
Rapport de l’intensité de certaines formes oxydées sur plusieurs espèces moléculaires de PC en fonction du temps d’oxydation. Mode d’acquisition: Précurseur d’ion de 184 (+).
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Rapport de l'intensité des ions
Temps d'oxydation (jours)
[581/598] [598/636]
PC(18:0/20:4) Structure d’un glycérophospholipide
Appareillage & Méthodes
Résultats
Conclusion & Perspectives
PAPC-Ox J7
Ionisation positive Ion : 846
Fragmentation en Q3(Linear Ion Trap LIT)
PAPC-Ox J7
Ionisation positive Ion : 846
Fragmentation en Q2(Enhanced Product Ion EPI)
Exemple: Comparaison de l’identification des ions fragments de l’ion 846 [PAPC+(OOH)2] par plusieurs modes d’acquisition.
Ion Ions fils Product Ion
(PI) EPI Q3 LIT
(AF2*=0,250)
Q3 LIT
(AF2*=0,500) Annotation
846
184 1,3949e6 8,2062e6 1,8e4 1,6667e4 Tête polaire
478 - - 7,3e4 7,8667e4 PAPC-Sn2-H2O
494 2,99e4 2,4214e5 2,4e4 2,4e4 PAPC -Sn2
663 - - 1,2267e5 7,8e4 [PAPC+(OOH)2] – 183
810 2,2e4 1,4327e5 6,0333e4 9,6667e4 [PAPC+(OOH)2] – 2(H2O)
828 2,2e4 2,0126e5 9,667e4 1,7033e5 [PAPC+(OOH)2] – H2O
846 9,8e4 7,3287e5 1,4e4 - PAPC
*AF2 = L'énergie d'excitation
PAPC-Ox J7
Précurseur d’ion 184 (+)
PAPC-Ox J1
Précurseur d’ion 184 (+)
PAPC
Précurseur d’ion de 184 (+) C44H80NO8P
