DEUXIEME PARTIE : MATERIELS ET METHODES

DEUXIEME PARTIE : MATERIELS ET

METHODES

DEUXIEME PARTIE : MATERIELS ET METHODES 1 Pharmacognosie

1.1 Molécules polyphénoliques utilisées dans le présent travail

L’acide gallique, la rutine, l’isoquercitrine et le kaempférol proviennent de Sigma (Saint-Louis, Etats-Unis) ; la quercétine, la catéchine, les acides chlorogénique, coumarique et ellagique ont été achetés chez ChromaDex (LGC standard, France). La quercétine-3-O- glucuronide ou miquelianine et la quercétine-3-O-galactoside ou hyperoside ont été achetés chez Carbosynth (Compton, Berkshire, Angleterre).

1.2 Matériel végétal et techniques d’extraction

Les différentes parties (feuilles, tiges feuillées, fleurs) de Agelanthus dodoneifolius, parasitant Vittelaria paradoxa, ont été récoltées dans la région de Ouagadougou (Coordonnées GPS : 30 P 0664286 ; UTM 1369592 ; Altitude 297^mt) entre Octobre et Novembre 2005. La plante est identifiée par le laboratoire de Biologie et d’Ecologie végétales (UFR/SVT, Université de Ouagadougou) et un échantillon a été déposé dans l’herbier de l’Université de Ouagadougou sous les numéros 01 & 02. Les différentes parties sont séchées à température ambiante, à l’abri du soleil et de la poussière au sein du laboratoire du département Médecine-Pharmacopée Traditionnelle/Pharmacie (MEPHATRA/PH) de l’IRSS (Institut de Recherche en Sciences de la Santé). Les différents tests pharmacologique et toxicologique ont été réalisés avec les extraits des feuilles de Agelanthus dodoneifolius.

1.2.1 Décoction aqueuse

L’une des utilisations traditionnelles de Agelanthus dodoneifolius consiste en l’ingestion d’une décoction. 100 g de la poudre sèche des feuilles de Agelanthus dodoneifolius sont portés à ébullition avec 1L d’eau distillée pendant 15 minutes. Après refroidissement, l’extrait est filtré puis lyophilisé (Christ Alpha 1-2 LD, Allemagne).

1.2.2 Extraction avec les solvants organiques

La méthode d’extraction utilisée a été faite d’après Foungbe et coll. (1976). Cette méthode permet l’extraction des composés polyphénoliques, en particulier des flavonoïdes.

Cette méthode a été utilisée parce que les analyses phytochimiques antérieures avaient montré la présence de ces composés dans la plante et aussi pour leurs nombreuses propriétés

(antioxydants, anti-inflammatoires, anticancéreux…). Une décoction méthanolique (2 L, Chem-Lab, Zedelgem, Belgique) est réalisée à partir de 200 g de la poudre sèche des feuilles de Agelanthus dodoneifolius. L’extrait est concentré au rotavapor à 40°C sous une pression réduite. Le résidu est repris avec de l’eau bouillante, dégraissé avec l’éther de pétrole (Chem- Lab, Zedelgem, Belgique) puis successivement épuisé avec l’éther diéthylique (4×150 ml, Merck, Overijse, Belgique), l’acétate d’éthyle (5×150 ml, Chem-Lab, Zedelgem, Belgique) et le butanol (4×150 ml, Merck, Overijse, Belgique). La figure 23 résume les différentes étapes de cette extraction.

Extraction MeOH (2 L) à chaud

H₂O à chaud

Dégraissage Ether de pétrole (4 × 150 ml)

Partition Ether diéthylique (4 × 150 ml)

Partition Acétate d’éthyle (5 × 150 ml)

Partition n-Butanol (4 × 150 ml)

Parties aériennes de A.

dodoneifolius 200 g

Résidu aqueux

Extrait aqueux

Fraction à l’éther

de pétrole Extrait aqueux

Extrait aqueux

Fraction à l’éther diéthylique (375.4 mg)

Fraction à l’acétate d’éthyle (1152.3 mg)

Extrait aqueux

Extrait aqueux Fraction butanolique

(3066.6 mg)

Figure 23: Schéma résumant les étapes de l’extraction des parties aériennes de A. dodoneifolius par les solvants organiques.

1.3 Méthodes chromatographiques analytiques

La chromatographie et la spectrométrie de masse sont des outils analytiques de plus en plus utilisés pour la séparation, l’identification et la quantification de composés chimiques dans des mélanges complexes comme des extraits de plante.

1.3.1 La chromatographie sur couche mince

La Chromatographie sur Couche Mince ou CCM est une méthode analytique couramment utilisée dans les laboratoires de phytochimie pour la séparation et l’identification rapides des constituants d’un extrait donné. Les plaques de CCM utilisées sont des plaques de verre constituées de silicagel de type 60 F₂₅₄ (Merck, Overijse, Belgique). Les plaques ont migré dans les systèmes de solvants suivants : S1 est constitué d’acétate d’éthyle (AcoEt)- acide formique- acide acétique- eau (100 : 11 : 11 : 27) (V/V) et S2 est formé d’AcoEt- acide formique-Eau (90 : 1 : 1) (V/V). A la fin de la migration, la plaque est séchée et examinée à l’UV (254 et 366 nm) ; les différents spots sont mis en évidence après pulvérisation avec le réactif 2-aminoéthyldiphénylborate de sodium ou réactif de NEU (Sigma, Saint-Louis, Etats- Unis) préparé à 1% dans du méthanol.

1.3.2 La chromatographie d’adsorption sur colonne

C’est une séparation liquide-solide dans laquelle la phase stationnaire ou adsorbant est contenue dans une colonne et la phase mobile peut être un solvant unique ou un mélange de solvants. Les fractions à l’acétate d’éthyle et au butanol ont été soumises à cette chromatographie. La fraction à l’acétate d’éthyle (1.07 g) est fractionnée sur une colonne de gel de silice (55 g, 60 Å, Sigma, Saint-Louis, Etats-Unis) et éluée avec l’éluant AcoEt- acide formique-Eau (90 : 1 : 1). 36 fractions ont été collectées et rassemblées selon leurs profils chromatographiques (Fr. I à Fr. VI). La fraction Fr. I (513 mg) est fractionnée sur une colonne de gel de silice (50 g, 60 Å, Sigma, Saint-Louis, Etats-Unis) puis éluée avec le mélange de solvants AcoEt- acide formique-Eau (60 : 1 : 1) ; 4 sous fractions sont collectées et rassemblées suivant leurs profils chromatographiques (F1a à F1d). La sous fraction F1a forme un précipité beige (Ac1) dans le mélange acétate d’éthyle/chloroforme (2 :1). La fraction Fr.

III (124 mg) est fractionnée sur une colonne de gel de silice (12 g, 60 Å, Sigma, Saint-Louis, Etats-Unis) puis éluée avec le mélange de solvants AcoEt- acide formique-Eau (90 : 1 : 1) ; 3 sous fractions sont collectées et rassemblées suivant leurs profils chromatographiques (F3a à F3c). La sous fraction F3a forme un précipité (Ac2) dans le mélange eau/chloroforme (2 :1).

La fraction butanolique (2.5 g) est chromatographiée sur une colonne de gel de silice (75 g, 60 Å, Sigma, Saint-Louis, Etats-Unis) et éluée sous la forme d’un gradient avec les mélanges de solvants acétate d’éthyle- acide formique- acide acétique- eau (de 18 :1 :1 :1 à 10 :1 :1 :1). 13 fractions sont collectées et rassemblées selon leurs profils en CCM (Fr.1 à Fr.13). La fraction Fr.1 (860 mg) est chromatographiée sur une colonne de gel de sephadex LH20 (27 g, 25-100 µm, Sigma, Saint-Louis, Etats-Unis) puis éluée avec le mélange eau/méthanol en augmentant progressivement la quantité de méthanol (de 60 :40 à 0 :100). 3 fractions sont collectées et rassemblées selon leurs profils en CCM (F 1a à F 1c). La sous fraction F 1c (But 1), de coloration rougeâtre, donne en CCM et après révélation avec le réactif de Neu une traînée de coloration violette.

La sous fraction F 1b (490 mg) est chromatographiée sur une colonne de gel de sephadex LH20 (25 g, 25-100 µm, Sigma, Saint-Louis, Etats-Unis) puis éluée de manière isocratique avec le mélange méthanol/eau (90 :10). Les fractions collectées ont été rassemblées après une analyse en CCM ; on obtient trois fractions (Fr. A, Fr. B ou But 2 et Fr. C).

1.3.3 La chromatographie liquide

- La HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Il s’agit d’une technique dotée d’une très bonne sensibilité et qui, contrairement à la chromatographie sur colonne (voir le paragraphe précédent), utilise un appareillage plus perfectionné muni d’un détecteur. La HPLC a été utilisée pour la séparation et la quantification des différents constituants des fractions de A. dodoneifolius. Deux chaînes HPLC ont été utilisées ; la première chaîne (Agilent Technologies 1100 series, Etats-Unis) est équipée d'une pompe binaire et d'un détecteur DAD (Diode Array Detector). La deuxième chaîne (Agilent Technologies, 1200 series, Etats Unis) comprend une pompe quaternaire et est reliée à un détecteur DAD et un spectromètre de masse. La colonne utilisée avec les deux chaînes est une C18 phase inverse (Discovery^®2.1×150 mm, 5 µm, Supelco, Etats-Unis).

L’élution est isocratique avec la phase mobile suivante : méthanol/eau/acide formique (40/60/0.2%). Le spectromètre de masse utilisé est un système quadripolaire à temps de vol (Q-TOF ou quadrupole-Time Of Flight) provenant de Agilent Technologies (Etats-Unis) ; ce système permet de réaliser les analyses de masse en tandem ou MS/MS. L’ionisation par électronébulisation ou électrospray (ESI) en mode positif a été utilisé.

- l’UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography)

Il s’agit d’une technique qui permet d’améliorer la HPLC dans la résolution chromatographique, la vitesse d’acquisition et la sensibilité. C’est un système qui utilise des colonnes avec des particules de faible diamètre (1.7 µm) et des pressions très élevées (de 8000 à 15000 psi). L’identification et la quantification des composés dans les extraits de Agelanthus dodoneifolius ont été effectuées sur un système UPLC (Waters, Etats-Unis) relié à un DAD et un triple quadripôle (Waters, Etats-Unis) pour les acquisitions en MS/MS. La quantification des composés identifiés à été réalisée par un étalonnage externe (R² ≥ 0.9).

L’ionisation par électronébulisation en mode négatif a été utilisée. Nous avons travaillé à trois différentes longueurs : 280 nm pour les dérivés des acides hydroxybenzoïques, 320 nm pour les acides hydroxycinnamiques et 360 nm pour les flavonols. La colonne utilisée est une C18 phase inverse (2.1×100 mm, 1.7 µm, Waters) et la méthode d’élution est une méthode en gradient inspirée de Tsao et Yang (2003).

1.4 Les dosages spectrophotométriques

La quantification des polyphénols totaux a été faite suivant la méthode de Singleton et coll. (1999). Ainsi, 800 µl du réactif Folin-Ciocalteu (Sigma, Saint-Louis, Etats-Unis) et 3 ml d’eau sont ajoutés à 200 µl d’une solution extrait à la concentration de 1 mg/ml. Après agitation à température ambiante, 1.2 ml d’une solution de carbonate de sodium (200 g/L, Sigma, Saint-Louis, Etats-Unis) et 4.8 ml d’eau sont ajoutés. Le blanc est préparé comme précédemment en remplaçant le réactif Folin-Ciocalteu par de l’eau. Après 2H d’incubation, l’absorbance est lue à 760 nm. La quantité de polyphénoliques totaux, exprimée en g équivalents acide gallique pour 1 kg d’extrait, est déterminée à partir d’une droite d’étalonnage tracée avec l’acide gallique (y = 426.47x + 0.0357 ; R² = 0.99).

Le dosage spectrophotométrique des flavonoïdes a été effectué suivant la méthode de Dowd adaptée par Arvouet-Grand et coll. (1994). Elle se base sur les propriétés chélatrices de l’ion aluminium. 2 ml d’une solution d’extrait à 1 mg/ml sont ajoutés à 2 ml d’une solution méthanolique de trichlorure d’aluminium (2%, Sigma, Saint-Louis, Etats-Unis). Le blanc est préparé comme précédemment en remplaçant le trichlorure d’aluminium par du méthanol.

L’absorbance est lue à 415 nm après 10 minutes d’incubation. La quantité de flavonoïdes totaux, exprimée en g équivalents rutine pour 1 kg d’extrait, a été estimée à partir d’une droite d’étalonnage tracée avec la rutine (y = 0.0139x – 0.0202 ; R² = 0.99).

2 Pharmacologie et Toxicologie 2.1 Le volet inflammation

Les techniques que nous avons utilisées dans le but d’étudier l’effet des extraits de Agelanthus dodoneifolius sur l’inflammation ont été mis au point par le Centre de l’Oxygène, Recherche et Développement (CORD) de Liège. Les méthodes mises au point ont pour but de déterminer la capacité d’un composé naturel ou synthétique à neutraliser les espèces radicalaires et à moduler l’activité des enzymes oxydantes telles que la myéloperoxydase, l’élastase et la NADPH oxydase.

2.1.1 Isolement, activation des neutrophiles et préparation des extraits

Le sang est prélevé sur EDTA (Merck, Belgique) à partir de chevaux sains provenant de la Faculté de Médecine Vétérinaire de Liège. L’isolement des neutrophiles ou PMNs s’est fait à température ambiante sur un gradient discontinu de Percoll (Sigma, Saint-Louis, Etats-Unis) selon une méthodologie adaptée de celle décrite par Pycock et coll. (1987). Le gradient (Figure 24), formé à partir d’une solution de Percoll à 90% (préparé avec du tampon HBSS (Hank’s buffered salt solution) 10×), est constitué de deux couches de Percoll de densités différentes ; au fond du tube la couche de Percoll est à 85% (par exemple pour 50 ml de solution, il faut : 42.5 ml de Percoll 90% + 7.5 ml HBSS 1×) et au dessus la solution est à 70% (par exemple pour 50 ml de solution, il faut: 35 ml de Percoll 90% + 15 ml HBSS 1×).

3 ml de sang sont déposés délicatement sur le gradient et une centrifugation de 45 minutes à 400g permet de séparer les différents constituants du sang. Les neutrophiles se retrouvent à l’interface de la couche de Percoll à 70% et celle à 85%.

(A) (B)

Figure 24: Schéma d’un gradient discontinu de Percoll.

(A) : Préparation du gradient et dépôt de l’échantillon (sang) et (B) Séparation en bandes distinctes des différents constituants du sang après la centrifugation.

Après élimination des premières couches (plasma, monocytes et percoll à 70%), les PMNs sont récupérés et placés dans des tubes contenant 4 ml de HBSS 1×. Une centrifugation de 10 minutes à 1500 trs/min permet d’éliminer le surnageant et le culot est remis en suspension dans 400 µl de tampon de lyse hypotonique (NH4Cl (0.15 M); EDTA (0.1 mM), NaHCO3 (10 mM), pH 7) pour provoquer l’éclatement des globules rouges. Les PMNs sont récupérés dans 2 ml de tampon PBS (phosphate-buffered saline solution, pH 7.4) après une centrifugation de 10 minutes à 1500 trs/min. La suspension cellulaire contient plus de 90% de neutrophiles caractérisés par une viabilité supérieure à 90% selon le test d’exclusion du bleu Trypan (Merck, Belgique).

2.1.1.2 Activation des neutrophiles et préparation des extraits

Le Phorbol 12- Myristate 13-Acétate ou PMA a été utilisé pour activer les neutrophiles ; cet ester de phorbol stimule la NADPH oxydase via une activation de la protéine kinase C ou PKC. Le PMA (Sigma, Saint-Louis, Etats-Unis) est dissous dans du DMSO (Merck, Belgique) et les aliquotes (10 µl) sont conservés à -20°C pour une utilisation ultérieure. Lors de l’utilisation, 990 µl d’eau ultra-pure (MilliQ) sont ajoutés aux aliquotes pour obtenir une solution stock de PMA à 16 µM ; la concentration finale du PMA au cours de chaque test est de 0.8 µM.

Sang

Percoll 70%

Percoll 85%

Plasma Monocytes et plaquettes Neutrophiles

Globules rouges 400 × g

45 minutes

Le décocté aqueux et les fractions à l’éther diéthylique, à l’acétate d’éthyle et au butanol sont respectivement dissous dans l’eau ultra-pure et le DMSO (la concentration finale de DMSO dans chaque expérience n’excède pas 1%) pour préparer des solutions stocks de 5, 2.5, 1, 0.5, 0.25, 0.1, 0.05 et 0.01 mg/ml. Dans chaque expérience, les solutions d’extraits ont été utilisées à des concentrations finales de 50, 25, 10, 5, 2.5, 1, 0.5 et 0.1 µg/ml. L’acide gallique et la quercétine ont été dissous dans le DMSO et utilisés respectivement à des concentrations finales de 12.8, 8.5, 4.3, 1.3, 0.9, 0.4 µg/ml et 22.7, 15.1, 7.6, 2.3, 1.5 µg/ml.

2.1.2 Détermination de l’effet antioxydant des extraits par chimiluminescence

2.1.2.1 Principe de la méthode

La chimiluminescence (CL) est une réaction d’oxydoréduction au cours de laquelle, des molécules, portées à un état excité, retournent à l’état fondamental en émettant de la lumière.

Dans les cellules, l’intensité de la CL est généralement très faible sans activateur ou amplificateur (Vladimirov et coll., 2007). L’amplificateur utilisé au cours de nos travaux est la lucigénine ou le Bis-N-méthylacridinium nitrate ; c’est un agent luminescent connu pour interagir plus spécifiquement avec l’anion superoxyde en produisant une lumière vert-jaune (Van Dyke et coll., 2003 ; Bartosz, 2006). Le mécanisme par lequel la lucigénine émet la lumière est résumé dans la figure 25 ; notamment, en présence de l’anion superoxyde, il ya une réduction monovalente de la lucigénine (LC²⁺) formant un anion radicalaire (Luc^•‾). Ce dernier peut interagir avec l’anion superoxyde pour donner un dioxétane (LCO₂) instable; le dioxétane se décompose rapidement en donnant deux molécules de N-méthylacridone. L’une de ces molécules se trouve dans un état électronique excité et lors du retour à l’état fondamental, la lumière est produite (Figure 25) (Bartosz, 2006). La lumière produite est proportionnelle à la production de l’anion superoxyde et est mesurée grâce à un luminomètre (FluoroscanAscent FL, Thermo scientific, Belgique).

Figure 25: Mécanismes réactionnels de la chimiluminescence avec la lucigénine (adapté de Bartosz, 2006).

2.1.2.2 Protocole

La mesure de la chimiluminescence s’effectue sur une plaque de 96 puits (White Combiplate 8, Thermo Labsystems, Finlande) d’après une méthodologie adaptée de Benbarek et coll. (1998). La suspension cellulaire (161 µl) des PMNs est distribuée dans les différents puits à raison de 10⁶ cellules/puits ; les cellules sont incubées 10 minutes à 37°C avec 2 µl des solutions stock des extraits. A la fin de l’incubation, 25 µl de CaCl2 à 10 µM (Merck, Belgique), 2 µl de lucigénine à 5 µM (Sigma, Saint-Louis, Etats-Unis) sont ajoutés dans les différents puits. L’activation des PMNs est obtenue en ajoutant 10 µl de PMA (0.8 µM final) dans les puits au moment de la mesure ; pour les neutrophiles non activés (NA), 10 µl d’une solution (composée de 10 µl de DMSO et 990 µl d’eau MilliQ) remplacent le PMA.

L’émission relative de lumière est enregistrée à 37°C pendant 30 minutes et les mesures sont exprimées en unités relatives de chimiluminescence. Deux contrôles représentant 100% de la réponse de chimiluminescence ont été utilisés ; le contrôle PBS (PMNs stimulés et 2 µl de PBS) pour le décocté aqueux et le contrôle DMSO (PMNs stimulés et 2 µl de DMSO) pour l’acide gallique, la quercétine et les fractions organique. L’expérience de chimiluminescence a été répétée 6 fois.

Lucigénine

2.1.3 Mesure de la quantité de MPO totale libérée par les neutrophiles stimulés au PMA : effet des extraits sur cette libération

2.1.3.1 Principe

La libération de la MPO totale a été mesurée à l’aide d’un test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) de type sandwich. Brièvement, l’antigène (ici la MPO) se lie aux anticorps (anti-MPO) préalablement coatés sur une plaque multi-puits. Après un lavage, un second anticorps, (anti-MPO) couplé à une enzyme est ajouté ; puis, le substrat de l’enzyme est ajouté après des étapes de lavage. L’enzyme transforme le substrat en un produit détectable (coloré). L’intensité de la coloration, proportionnelle à la quantité de MPO libérée, est mesurée à l’aide d’un lecteur Multiskan Ascent (Thermo scientific, Belgique).

2.1.3.2 Protocole

La première étape de ce protocole consiste à provoquer la dégranulation de la MPO par les neutrophiles. Pour ce faire, 10 µl de chaque produit à tester sont ajoutés à 940 µl d’une suspension cellulaire de PMNs (10⁶ cellules/ml) et placés dans un incubateur à 37°C pendant 10 minutes. A la fin de l’incubation, les PMNs sont stimulés avec le PMA (50 µl) et les tubes sont de nouveau placés à 37°C pendant 30 minutes. La deuxième étape du protocole permet de déterminer l’effet des extraits sur la dégranulation. Ainsi, après la stimulation, les tubes sont centrifugés (10 minutes à 450g) puis les surnageants récupérés délicatement. 100 µl des surnageants sont distribués dans les différents puits d’une plaque préalablement coatée avec des anticorps anti-MPO (obtenus chez le lapin) et la plaque est placée toute la nuit à 4°C.

Après 4 lavages (solution de PBS/Tween), un second anticorps (obtenu chez le cobaye) couplé à la phosphatase alcaline est ajouté et la plaque est placée dans l’incubateur à 37°C pendant 2H. La plaque est de nouveau lavée (4 ×) et 100 µl de para Nitro-Phényl-Phosphate (pNPP) (Sigma, Saint-Louis, Etats-Unis) sont ajoutés ; la plaque, recouverte de papier aluminium, est placée à 37°C pendant 30 minutes puis la réaction est arrêtée en ajoutant 100 µl d’une solution de NaOH. L’absorbance, mesurée à 405 nm, est proportionnelle à la quantité de MPO libérée par les neutrophiles. Les contrôles représentant 100% de la quantité de MPO libérée sont : le contrôle PBS (PMNs stimulés et 10 µl de PBS) pour le décocté aqueux et le contrôle DMSO (PMNs stimulés et 10 µl de DMSO) pour l’acide gallique, la quercétine et les fractions organique. L’expérience a été reprise 5 fois.

2.1.4 Détermination de l’activité de la MPO 2.1.4.1

Le SIEFED (Specic Immunological Extraction followed by Enzymatic Detection) est une technique développée par Franck et coll. (2006) pour mesurer spécifiquement l’activité de la myéloperoxydase. Le test comprend une étape d’immuno-extraction de la MPO à partir d’un échantillon biologique, des étapes de lavages et la troisième étape permet de révéler l’activité enzymatique. L’immuno-extraction permet de capturer la MPO par des anti-MPO (3 µg/ml obtenus chez le lapin) préalablement immobilisés sur une plaque multi-puits ; les étapes de lavage permettent d’éliminer toutes interférences éventuelles (molécules non fixées…) et la troisième étape révèle l’activité de la MPO par l’ajout des substrats de l’enzyme.

2.1.4.2 Protocole

250 µl d’une solution stock de MPO à 100 ng/ml (50 ng/ml final) sont ajoutés à 5 µl d’une solution d’extrait et 245 µl de tampon de dilution (20 mM de PBS; 0.1% Tween 20 (Sigma, Saint-Louis, Etats-Unis) et 5 g/l d’albumine de sérum bovin ou BSA (Roche, Allemagne). Les tubes sont placés à 37°C pendant 10 minutes ; puis, 100 µl de chaque tube sont distribués dans les différents puits d’une plaque multi-puits. La plaque est placée dans l’incubateur (37°C, 2H). A la fin de la période d’incubation, la plaque est lavée 4 × avec une solution de PBS/Tween. L’activité de MPO est révélée par l’ajout des substrats de la MPO constitués de l’amplex red (Molecular Probes, Invitrogen, Belgique), de l’eau oxygénée ou H2O2 (Merck, Belgique) et le nitrite de sodium (NaNO2) (Sigma, Saint-Louis, Etats-Unis) qui permet d’amplifier la réaction. L’amplex red est un composé stable et non fluorescent qui interagit avec le peroxyde d’hydrogène de manière stœchiométrique pour produire un composé fluorescent. Le milieu réactionnel (10 ml) est composé de 20 µl d’amplex red, 100 µl de H₂O₂ (11.5 µl d’une solution de H₂0₂ 30% + 988.5 µl d’eau MilliQ) et le tampon phosphate (9.880 ml). 10 µl de NaNO₂ sont distribués dans tous les puits suivis de 10 µl du milieu réactionnel. L’effet des extraits sur l’activité de la MPO s’effectue en mesurant la fluorescence (FluoroscanAscent FL, Thermo scientific, Belgique). Les contrôles représentant 100% de l’activité de la MPO sont : le contrôle MPO-PBS (250 µl MPO et 5 µl de PBS) pour le décocté aqueux et le contrôle MPO-DMSO (250 µl MPO et 5 µl de DMSO) pour l’acide gallique, la quercétine et les fractions organique. Le test de SIEFED a été répété 6 fois.

2.1.5 Analyses statistiques

Chacune des différentes expériences réalisées a été répétée au moins 3 fois avec différents lots de MPO équine pure ou de PMNs provenant de différents chevaux. Les résultats exprimés en valeurs relatives sont indiquées sous la forme de moyenne ± déviation standard (DS). Les valeurs des concentrations inhibitrices 50% (IC50) ont été déterminées avec le logiciel GraphPadPrism (version 3.0) grâce à une régression non linéaire. Les différences statistiques ont été identifiées en utilisant la correction de Welch (GraphPad Instat 3.05), p < 0.05 étant considéré comme significatif.

2.2 Le volet cancer

2.2.1 Le test colorimétrique MTT

2.2.1.1

Les huit lignées cellulaires cancéreuses utilisées dans cette étude ont été acquises à l’European Collection of Cell Culture (ECACC, Angleterre), la American Type Culture Collection (ATCC, Etats-Unis) et la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Allemagne). Il s’agit de sept lignées d’origine humaine et une d’origine murine. Les lignées cellulaires de cancers humains utilisées comprennent : les cellules A549 (DSMZ, code ACC107) provenant d’un cancer du poumon non à petites cellules, les cellules LoVo (DSMZ, code ACC350) obtenues à partir du cancer de côlon, les cellules MCF-7 (DSMZ, code ACC465) proviennent d’un cancer de sein, les cellules SKMEL-28 (ATCC, code HTB-72) obtenues à partir d’un mélanome, les cellules U373 (ECACC, code 89081403) et T98G (ATCC, code CRL1690) proviennent d’un glioblastome. La lignée cellulaire d’origine murine, B16F10, est un mélanome (ATCC, code CRL-6475).

Toutes ces lignées cellulaires cancéreuses ont été cultivées dans du RPMI (Gibco, Invitrogen, Belgique). Avant son utilisation, ce milieu est enrichi avec du sérum de veau fœtal 10% (Gibco), préalablement décomplémenté à 56°C pendant 30 minutes, et de glutamine 0.6 mg/ml (Gibco). Le milieu est ensuite supplémenté avec 200 UI/ml du mélange pénicilline et streptomycine ou Penstrep (Gibco) et 0.1 mg/ml de gentamicine (Gibco). Les cellules sont maintenues à 37°C dans une atmosphère de 5% de CO2.

2.2.1.2 Le principe du test

Le test colorimétrique MTT (Sigma, Belgique) ou bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2- yl)-2,5-diphényltétrazolium est un test qui permet d’évaluer la croissance globale d’une lignée cellulaire donnée. Il est basé sur la réduction du MTT en formazan par la succinate déshydrogénase présente dans la membrane interne des mitochondries. Le formazan est soluble dans le DMSO dans lequel il donne une coloration violette dont l’intensité est directement proportionnelle au nombre de cellules vivantes.

L’ensemencement est fait dans des plaques de 96 puits (Orange Scientific, Belgique) à des concentrations variant de 10 000 à 40 000 cellules/ml selon la lignée cellulaire étudiée.

Les cellules sont ensuite placées dans un incubateur (37°C, 5% CO₂) pendant 24H. Ensuite, les cellules sont incubées avec les différents produits à tester pour une durée de 72H. Les fractions de Agelanthus dodoneifolius et les molécules de référence ont été utilisées respectivement à des concentrations croissantes allant de 0.01 à 100 µg/ml et 10^-9 à 10^-5 M.

Chaque niveau de concentration a été répétée 7 fois. A la fin de l’incubation, le milieu de culture est retiré et remplacé par le réactif MTT (1mg/ml) solubilisé dans du RPMI blanc.

Après 3H d’incubation à 37°C, les plaques sont centrifugées 10 minutes à 1000 rpm et la solution de MTT est retirée en retournant délicatement les plaques sur du papier absorbant.

Les cristaux de formazan formés sont alors dissous dans du DMSO et la densité optique est mesurée à l’aide d’un lecteur de plaques de type Bio-Rad Model 680 XR (Bio-Rad, Belgique) à 570 nm.

2.2.2 La vidéo-microscopie quantitative

2.2.2.1

La visualisation directe des effets de la quercétine (Sigma, Belgique) à été réalisée au moyen de microscopes à contraste de phases assistés par ordinateur. Ce système est placé dans un environnement thermostaté à 37°C. La lignée cellulaire utilisée, T98G, est un glioblastome d’origine humaine. Ces cellules sont cultivées dans du RPMI comme expliqué dans le paragraphe précédent.

2.2.2.2 Principe

La vidéo-microscopie quantitative ou tracking permet de visualiser les effets d’un composé donné sur la morphologie, la prolifération et la migration cellulaires (De Hauwer et coll., 1998 ; Debeir et coll., 2005 ; Debeir et coll., 2008). Elle consiste à incuber des cellules

en présence ou non (contrôle) de la substance à tester puis à observer, à l’aide d’un microscope à contraste de phases surmonté d’une caméra, les effets de la molécule en comparaison avec la condition contrôle (Figure 26).

Figure 26: Dispositif utilisé pour réaliser la vidéomicroscopie.

Les microscopes à contraste de phase, placés dans une enceinte thermostatée à 37°C, sont surmontés d’une caméra reliée à un ordinateur. Un film est réalisé à la fin de l’expérience à partir des photos prises toutes les 4 minutes.

Les cellules T98G sont ensemencées dans des boîtes de culture cellulaire T25 (Sarstedt, Essen, Belgique) deux ou trois jours avant le test et les boîtes sont placées dans l’incubateur (37°C, 5% CO2). Le jour du test, le milieu est renouvelé et la quercétine est alors ajoutée à une concentration de 30 µM (l’IC₅₀, calculée à partir du test colorimétrique MTT est de 34 µM). Les boîtes sont introduites sous un microscope à contraste de phase (Olympus, Anvers, Belgique) dans un environnement thermostaté à 37°C. Les microscopes, surmontés d’une caméra reliée à un ordinateur, permettent de prendre une image numérisée du champ observé toutes les 4 minutes durant toute la durée de l’expérience (dans le cas présent elle est de 72H).

A la fin du test, un film est réalisé à partir des images prises. Le logiciel d’analyse permet de suivre chaque cellule et de déterminer la trajectoire suivie durant la durée de l’expérience (Debeir et coll., 2005 ; Debeir et coll., 2008). La technique permet de déterminer l’effet cytostatique ou cytotoxique de la quercétine sur la lignée cellulaire T98G.

2.2.3 Les tests biochimiques liés à l’activité kinase

L’effet de la quercétine (Sigma, Saint-Louis, Etats-Unis) sur plus de 300 kinases a été déterminé par la société ProQinase (Allemagne). C’est un dosage radiométrique (³³PanQinase^® Activity assay) réalisé sur des plaques de 96 puits (FlashPlatesTM, Perkin Elmer, Etats-Unis). Le test utilise de l’ATP non radioactif, l’ATP marqué [γ-³³P], des tampons (tampon HEPES-NaOH) et des protéines kinases avec leurs substrats. Les protéines kinases recombinantes humaines ont été exprimées chez les cellules d’insectes (SF9) ou de E. coli (Proqinase) ; leur purification est obtenue par chromatographie d’affinité sur gel d’agarose (type GSH-agarose ou Ni-NTH-agarose) (ProQinase). La pureté de chaque protéine kinase a été déterminée au moyen du gel de polyacrylamide dodécylsulfate de sodium ou SDS/PAGE (le colorant utilisé est le nitrate d’argent). L’identification de chaque protéine kinase a été vérifiée par la spectrométrie de masse (ProQinase).

2.2.3.2 Principe

Les kinases sont des enzymes qui catalysent les mécanismes de phosphorylation- déphosphorylation dans la cellule. On peut étudier l’activité d’une protéine kinase en suivant la phosphorylation d’une protéine donnée (substrat) via le transfert d’un groupement de phosphate à partir de l’ATP généralement marqué. Pour déterminer l’effet de la quercétine sur les kinases, la méthodologie utilisée a été précédemment décrite par Lamoral-Theys et coll.

(2010b). Le mélange réactionnel (50 µl) contient : 10 µl d’ATP non marqué solubilisé dans l’eau ; 25 µl d’un tampon contenant de l’ATP radioactif [γ-³³P] ; 5 µl de quercétine (2 ou 30 µM dans 10% DMSO) et 10 µl du mélange enzyme/substrat. Les plaques sont placées dans un incubateur à 30°C pendant 1H et la réaction est arrêtée avec 50 µl d’une solution de H3PO4

2% (v/v). Ensuite, les plaques sont aspirées et lavées deux fois avec 200 µl de NaCl 0.9%

(w/v). La radioactivité (incorporation du ³³Pi) a été déterminée grâce à un compteur de scintillation (Wallac Microbeta, Perkin Elmer, Etats-Unis). Tous les tests ont été réalisés dans un système robotisé (Beckman Coulter/Sagian, Allemagne).

Pour chaque plaque, un « contrôle faible » et un « contrôle élevé » ont été définis. Le

« contrôle faible » correspond à la fixation non spécifique de la radioactivité en l’absence de la protéine kinase, mais en présence du substrat ; il se calcule en déterminant la valeur médiane du nombre de coups par minutes (cpm) mesurés pour la colonne 1 de la plaque. Le

« contrôle élevé » représente l’activité totale mesurée à l’absence de tout inhibiteur ; c’est la valeur médiane du nombre de coups par minutes mesurés pour la colonne 2 de la plaque. La différence entre ces deux contrôles correspond à une activité de 100%. L’activité résiduelle (%) pour chaque puits se calcule avec la formule suivante :

Activité résiduelle (%)

= [

/

]