Quelques petits exemples  Ses méthodes  Son but  protéomique Vous donner une idée générale de ce qui se cache derrière le mot

(1)

Vous donner une idée générale de ce qui se cache derrière le mot

protéomique

 Son but

 Ses méthodes

 Quelques petits exemples

Cours AGG – 06/10/03

(2)

Après séquençage

protéome, transcriptome et autresomes

Évolution récente de la biologie Séquençage de génomes

Il y a 15 ans, 25% du génome de la levure était décrypté

(3)

Étude du contenu protéique d’une cellule

qualitatif - quantitatif

Électrophorèse bidimensionnelle

Spectrométrie de masse

(4)

La quantité d’une protéine dans la cellule dépend :

 de l’expression du gène

 Transcription (+/- régulée)

 Maturation de l’ARNm - export

 du bilan synthèse / dégradation

 de la traduction de l’ARNm

 Biais d’utilisation des codons

(5)

6200 gènes

5’ 3’

15 000 molécules d’ ARN ^m

50 millions de

molécules de protéines

(6)

Culture des cellules

Extraction des protéines

Séparation par électrophorèse 2D

Analyse des images

 milieu de culture

 conditions de culture

 marquage

 lyophilisation des cellules

 broyage des cellules

 tampon

Rester réalistes : nombreuses étapes = nombreux problèmes

 détails

(7)

Séparation par électrophorèse 2D

Utilisation de 2 caractéristiques physicochimiques des protéines

 Le point isoélectrique

séparation en 1 ^ère dimension

 La masse moléculaire

séparation en 2 ^ème dimension

(8)

Caractéristiques des acides aminés

chaîne latérale pK Mr

Ala A aliphatique hydrophobe non polaire 71,074

Arg R basique hydrophile polaire + 12,48 156,184

Asn N amide hydrophile polaire non chargé 114,104

Asp D acide hydrophile polaire - 3,65 115,086

Cys C sulfure hydrophile polaire non chargé 103,134

Gln Q amide hydrophile polaire non chargé 128,134

Glu E acide hydrophile polaire - 4,25 129,114

Gly G aliphatique hydrophile polaire non chargé 57,056

His H basique hydrophile polaire + 6,00 137,144

Ile I aliphatique hydrophobe non polaire 113,156

Leu L aliphatique hydrophobe non polaire 113,156

Lys K basique hydrophile polaire + 10,79 128,176

Met M sulfure hydrophobe non polaire 131,196

Phe F aromatique hydrophobe non polaire 147,174

Pro P imine hydrophobe non polaire 97,114

Ser S hydroxyle hydrophile polaire non chargé 87,074 Thr T hydroxyle hydrophile polaire non chargé 101,104

Trp W aromatique hydrophobe non polaire 186,214

Tyr Y aromatique hydrophile polaire non chargé 163,174

Val V aliphatique hydrophobe non polaire 99,134

(9)

La migration en 1ère dimension dépend du point isoélectrique

nombre d’acides aminés chargés

pK des charges

ampholines / immobilines

Gsp1p

(10)

Migration en 1 ^ère dimension

7

6

5

4

(11)

Migration en 2 ^ème dimension

SDS SDS

Elle dépend de la

masse moléculaire

(SDS)

(12)

6.8 6.0 5.0 4.2 180

100

60

40

30

15

(13)

Limites de la détection

 coloration bleu de Coomassie

 coloration au nitrate d’argent

 radioactivité ( ³⁵ S Met)

 10 ng (10 000 copies / cellule)

 2 ng (2000 copies / cellule)

 0,2 ng (200 copies / cellule)

(14)

Limites de la technique

 point isoélectrique (4-7)

 masse moléculaire (10-150 kDa)

 abondance

 protéines membranaires

(15)

Suite du feuilleton

 identification des spots

 analyse quantitative

 marquage ?

 exemples d’applications

(16)

Méthodes d’identification

 méthodes génétiques

 microséquençage

 spectrométrie de masse

 rapports d’acides aminés

 délétion

 surexpression

 comigration - anticorps

séquence

(17)

WT

 YDR516C

 GLK1

Délétion

(18)

micro- séquençage

protéique

rapports

d’acides aminés

spectrométrie de masse

Méthodes basées sur

la connaissance des séquences

 spots découpés

 dégradation chimique séquentielle à partir de l’extrémité NH2

 détermination de l’acide aminé par HPLC

 doubles marquages

 spots découpés et comptage des 2 isotopes

 comparaison des rapports de marquage avec les rapports d’acides aminés de chaque séquence

 spots découpés

 protéine digérée par la trypsine

 masse des peptides mesurée en SM

 recherche dans les banques

peu sensible aléatoire - onéreux

efficace - délicat très onéreux

sensible

rapide

(19)

(20)

(21)

Site WEB

www.ibgc.u-bordeaux2.fr/YPM 602 spots

417 gènes

(22)

Suite du feuilleton

 identification des spots

 analyse quantitative

 marquage ?

 exemples d’applications

(23)

coloration Méthionine S ³⁵

(24)

Suite du feuilleton

 identification des spots

 analyse quantitative

 marquage ?

 exemples d’applications

(25)

Analyse quantitative

 analyse d’images

 interprétations

 analyse des résultats

 marquage - gel

 acquisition de l’image

 détection des spots

 quantification

 matching

ImageMaster BioImage

PhosphorImager

(26)

Détection

(27)

12518

956 11293

8544

862 1263

(28)

Matching

(29)

Résultats

22 12,320352 8,222474 1,69464 2,714044 5,91395 9,03617

23 1,517472 - - 0,33774 - 2,084134

39 0,779328 0,723411 - 0,689336 0,181475 0,690404

49 7,00128 7,719361 6,6792 4,151604 4,067175 6,699134

57 7,19136 7,636005 1,16196 2,11 3,337005 8,074404

58 112,505184 128,838606 36,30504 38,772552 58,723175 115,912186

71 14,252832 9,192976 2,95872 6,167652 4,76532 10,66988

78 5,4648 5,825989 - 3,857164 3,10429 5,22418

81 2,318976 1,783223 2,07552 1,536284 1,21268 1,83677

84 14,157792 11,395956 13,51848 9,453256 3,964695 18,083416

89 88,520256 47,387886 14,6556 32,0853 19,742345 79,558908

92 0,801504 0,68471 0,58512 0,507476 - 0,53534

94 3,034944 3,325309 4,3608 2,080132 2,952705 4,779294

101 5,0688 3,566446 1,80228 1,84458 2,824605 2,929602

103 4,86 5,561036 14,03184 6,825812 2,248155 11,64826

107 1,99584 - 2,484 2,048956 1,701595 2,228122

111 80,619264 83,055323 46,62468 52,294276 39,871125 71,909084

122 1,336896 1,354535 1,71672 1,148316 1,04188 1,04299

136 8,338176 7,877142 11,98392 10,050796 6,69109 6,90404

147 12,250656 12,122344 22,22352 13,668944 14,56924 13,093678

152 29,883744 25,506936 35,93796 25,441348 18,277735 24,516726

155 - - 21,44796 20,146624 14,2618 13,915148

157 228,105504 209,229514 222,41184 183,07 115,83229 176,724964

159 6,43104 5,019222 8,2938 4,752608 3,18115 5,813054

160 3,155328 - - 3,157436 2,154215 2,10444

161 5,534496 1,798108 9,30396 4,626172 2,95057 5,665374

163 26,535168 13,146432 43,84812 24,658484 14,67599 29,318172

178 10,28016 10,928567 16,46616 10,223996 8,83463 8,190702

179 1,19 0,613262 1,76916 0,630448 - 1,022684

182 3,858624 4,676867 11,82936 4,155068 4,652165 5,375552

195 8,087904 4,087421 10,63428 4,09618 8,512245 5,154032

201 8,011872 6,617871 20,03208 10,705492 7,50239 8,644818

207 - - 0,63756 0,35 0,77287 0,400582

214 4,257792 5,906368 10,26996 6,275036 4,11628 4,450706

216 - - 1,26684 0,97858 - 0,843622

Trouver un sens

(30)

Types d’applications

• Mutant / sauvage

• Conditions physiologiques

• Expression tissu specifique

• Malade / état normal

• Effets d’une drogue

comparaison de 2 images

(ou groupes d’images)

• Expressions en fonction du temps

• Analyse multiples conditions analyse sérielle

(31)

Comparaison de 2 groupes d’images

souche/condition 1 souche/condition 2

composite 1

comparaison composites des

composite 2

Normalisation Spots matchés

Spot unique

(32)

Pour chaque spot

Test t

pour dire si la variation observée

est significative ou non

significative

(33)

fermentation adaptation

respiration

Analyse sérielle : transition diauxique

glucose DO

éthanol

0 glucose

↓

(34)

(35)

DO1 DO6 -1h 0 glu. +15

min. +1h +2h +3h DO16

126 568

384 29

255 168

692

(36)

formation des clusters

regroupements en fonction des différents

profils

d’expression

(37)

Suite du feuilleton

 identification des spots

 analyse quantitative

 marquage ?

 exemples d’applications

(38)

fermentation

0 glucose

respiration

(39)

WT cat8

Comparaison entre 2 souches

 Spots peu ou pas induits lors de la transition diauxique

 toutes les protéines identifiées sont nécessaires à la respiration

 confirmation du rôle régulateur de la protéine cat8p

(40)

acétyl-CoA

oxaloacétate

isocitrate

fumarate

succinate

-cétoglutarate

malate citrate

acétyl-CoA

Krebs cycle Krebs cycle

éthanol acétaldéhyde glucose-6-P

fructose-6-P fructose-1,6-P

PEP pyruvate

Glycolyse Glycolyse

citrate malate

glyoxylate

isocitrate oxaloacétate

-cétoglutarate succinate

acétyl-CoA

oxaloacétate

acétyl-CoA

Glyoxylate Glyoxylate

cycle cycle

lactate

Gluconeogenesis Gluconeogenesis

glucose-6-P

fructose-6-P fructose-1,6-P

PEP

acétate éthanol acétaldéhyde

acétyl-CoA

PCK1 FBP1

ICL1 JEN1

IDP2 MLS1

SFC1

ACS1

ADH2

CIT2 MDH2

DLD1

ALD6

CAT2 YAT1

CRC1

(41)

wt

nat1

Acétylations NH2 terminales

(42)

wt

nat1

wt + nat1

+ +

+

+ +

+

+ +

+

+ +

+ + + +

+ + +

+ + + +

+ +

+

+ +

+ + + +

+

+ +

+

(43)

(44)

Quelques petits exemples  Ses méthodes  Son but  protéomique Vous donner une idée générale de ce qui se cache derrière le mot

Vous donner une idée générale de ce qui se cache derrière le mot

protéomique

 Son but

 Ses méthodes

 Quelques petits exemples

Cours AGG – 06/10/03

Après séquençage

protéome, transcriptome et autresomes

Évolution récente de la biologie Séquençage de génomes

Il y a 15 ans, 25% du génome de la levure était décrypté

Étude du contenu protéique d’une cellule

qualitatif - quantitatif

Électrophorèse bidimensionnelle

Spectrométrie de masse

La quantité d’une protéine dans la cellule dépend :

 de l’expression du gène

 Transcription (+/- régulée)

 Maturation de l’ARNm - export

 du bilan synthèse / dégradation

 de la traduction de l’ARNm

 Biais d’utilisation des codons

6200 gènes

5’ 3’

15 000 molécules d’ ARN m

50 millions de

molécules de protéines

Culture des cellules

Extraction des protéines

Séparation par électrophorèse 2D

Analyse des images

 milieu de culture

 conditions de culture

 marquage

 lyophilisation des cellules

 broyage des cellules

 tampon

Rester réalistes : nombreuses étapes = nombreux problèmes

 détails

Séparation par électrophorèse 2D

Utilisation de 2 caractéristiques physicochimiques des protéines

 Le point isoélectrique

séparation en 1 ère dimension

 La masse moléculaire

séparation en 2 ème dimension

Caractéristiques des acides aminés

chaîne latérale pK Mr

Ala A aliphatique hydrophobe non polaire 71,074

Arg R basique hydrophile polaire + 12,48 156,184

Asn N amide hydrophile polaire non chargé 114,104

Asp D acide hydrophile polaire - 3,65 115,086

Cys C sulfure hydrophile polaire non chargé 103,134

Gln Q amide hydrophile polaire non chargé 128,134

Glu E acide hydrophile polaire - 4,25 129,114

Gly G aliphatique hydrophile polaire non chargé 57,056

His H basique hydrophile polaire + 6,00 137,144

Ile I aliphatique hydrophobe non polaire 113,156

Leu L aliphatique hydrophobe non polaire 113,156

Lys K basique hydrophile polaire + 10,79 128,176

Met M sulfure hydrophobe non polaire 131,196

Phe F aromatique hydrophobe non polaire 147,174

Pro P imine hydrophobe non polaire 97,114

Ser S hydroxyle hydrophile polaire non chargé 87,074 Thr T hydroxyle hydrophile polaire non chargé 101,104

Trp W aromatique hydrophobe non polaire 186,214

Tyr Y aromatique hydrophile polaire non chargé 163,174

Val V aliphatique hydrophobe non polaire 99,134

La migration en 1ère dimension dépend du point isoélectrique

nombre d’acides aminés chargés

pK des charges

ampholines / immobilines

Gsp1p

Migration en 1 ère dimension

7

6

5

4

Migration en 2 ème dimension

SDS SDS

Elle dépend de la

masse moléculaire

15 000 molécules d’ ARN ^m

séparation en 1 ^ère dimension

séparation en 2 ^ème dimension

Migration en 1 ^ère dimension

Migration en 2 ^ème dimension

 radioactivité ( ³⁵ S Met)

coloration Méthionine S ³⁵