Chapitre I : Introduction.

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I.1. Les métaux lourds dans l’environnement.

I.1.1. Histoire commune des hommes et de métaux.

Dès la préhistoire, les hommes ont utilisé des pigments naturels riches en métaux lourds pour réaliser des fresques murales. Ces pigments furent longtemps utilisés en toute méconnaissance de leur toxicité, par exemple, le blanc de plomb servit de fard à joues depuis l’antiquité romaine jusqu’au 18^ème siècle.

Le nom initial donné par les Romains au cuivre était aes cyprium, littéralement « métal de Chypre » qui devint « cuivre » en français. Bien que du cuivre élémentaire fut utilisé sous forme de plaque martelée sur une structure en bois pour la réalisation du colosse de Rhodes, ce métal fut surtout utilisé durant l’antiquité sous forme d’alliage de cuivre et d’étain, le bronze. Le contrôle du commerce de l’étain étant alors tout aussi important que celui du cuivre. Le bronze, dont on trouve déjà des traces en 5000 B.C. en Mésopotamie, était en effet beaucoup plus résistant que les traditionnelles flèches et haches de silex. Les Phéniciens, seuls marins à s’aventurer en Méditerranée occidentale et au-delà des colonnes d’Hercule durant la période (pré)hellénique, contrôlaient les routes d’approvisionnement en étain exploité en Armorique, en Ibérie et en Cornouailles. La fondation de la colonie de Massilia (Marseille) par des Grecs vers 600 B.C. mettra fin au monopole phénicien. Qui contrôlait la « route de l'étain », possédait la puissance et s'assurait le pouvoir!

Le Moyen-Âge sera en Europe un âge d’or pour l’étude des métaux. L’alchimie se donne comme objectif pratique principal l’étude de la transmutation des métaux, qui ne pourra se faire effectivement que des siècles plus tard, avec l’avènement de la chimie nucléaire. L’alchimie était d’ailleurs liée à toutes les sciences, dont la médecine. C’est au médecin-alchimiste Paracelse qu’on doit la phrase « Tout est poison, rien n'est sans poison. Seule la dose fait qu’une chose n’est pas un poison. » qui illustre bien le fait que tous les êtres vivants, des bactéries aux hommes, ont besoin de traces de métaux lourds tels que le cuivre et le zinc pour assurer le fonctionnement normal de leur métabolisme, mais que ces métaux deviennent toxiques aux hautes concentrations.

Au cours de l’ère industrielle, la production et l’utilisation des métaux a augmenté de façon telle qu’elle laissera de nombreux sites dits de « pollution historique ». Par exemple, les sites où l’on tannait les peaux sont contaminés au mercure : de nombreux abattoirs installés depuis le 19^ème siècle et encore en activité sont entourés de sites pollués par ce métal hautement volatil. L’exploitation des minerais et l’industrie métallurgique de transformation des métaux non ferreux est responsable de la contamination de nombreux sites dont beaucoup n’ont pas encore été réhabilités.

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L’une des principales utilisations actuelles des métaux lourds sont les industries électrique et électronique qui utilisent le cuivre, le plomb, le zinc, le cadmium, et le

mercure dans les circuits imprimés, les câbles et fils mais aussi les condensateurs électroniques, ce qui pose des problèmes de santé publique dans des pays comme l’Inde ou la Chine où on retraite les déchets de la révolution informatique. Les métaux lourds trouvent aussi des applications « inattendues » dans le domaine médical : les poignées de porte en inox d’un hôpital anglais de Birmingham vont être remplacées par des poignées en cuivre car ce métal permettrait de limiter la propagation des maladies nosocomiales. La firme

« Hansaplast » commercialise des sparadraps où le désinfectant organique est remplacé par des fils d’argent élémentaire.

I.1.2. Impact sanitaire des métaux lourds.

Les métaux lourds sont présents dans notre alimentation à l’état de traces. L’exposition alimentaire moyenne aux métaux lourds varie néanmoins fortement d’un pays à l’autre ; pour le plomb par exemple, le maximum est de 557 µg/personne/jour à Cuba contre seulement 52 en France et 8 aux Etats-Unis. Certains animaux que nous consommons accumulent des métaux, par exemple les poissons pour le mercure et les crustacés pour le cadmium. Une autre source d’exposition aux métaux lourds est l’air ; le plomb est un bon exemple de pollution atmosphérique puisqu’il fut longtemps ajouté à l’essence.

La toxicité des métaux lourds est principalement due à leur réactivité élevée : ils sont capables d’interagir et de déstructurer les parois cellulaires, les protéines et l’ADN. Cependant la toxicité varie suivant la forme chimique du métal. Ainsi, si le mercure liquide est peu toxique car il est très peu absorbé par voie orale (plus de 99% du Hg⁰ est éliminé par voie naturelle), il n’en va pas de même pour sa forme organique, le méthyl-mercure.

Les dysfonctionnements métaboliques liés aux métaux lourds sont dans certains cas dus à des maladies génétiques. Les maladies de Menkès et Wilson sont des pathologies orphelines liées au trouble du transport du cuivre dans l’organisme. Chez les patients atteints de la maladie de Wilson, il y a mutation du gène ATP7B, codant pour une ATPase (voir ci-dessous, point I.3.3.) des cellules hépatiques. La maladie de Menkès est due à une mutation dans le gène codant pour une protéine de transport du cuivre intracellulaire, une ATPase également. Silver et al. (1993) ont démontré l’identité élevée entre cette ATPase animale et CadA, une ATPase de Staphylococcus aureus. Les symptômes de ces maladies orphelines sont proches de celles d’Alzheimer et de Parkinson, avec des troubles hépatiques en plus.

I.1.3. Effets physiologiques des métaux lourds sur les plantes.

La pollution aux métaux lourds est une pression de sélection très contraignante pour les végétaux. En ce qui concerne le cuivre, les concentrations dépassant 5 µM sont déjà inhibitrices de la croissance, et pour la plupart des espèces non tolérantes, elles sont létales à partir de 50 µM (Verbruggen, communication personnelle).

L’exposition aux métaux lourds de plantes limite leur développement, et pose le problème de l’entrée de métalloïdes (arsenic) et des métaux lourds (cadmium, plomb, mercure) dans la chaîne alimentaire. Pour le cadmium, par exemple, les plantes constituent la principale voie d’entrée dans la chaîne alimentaire.

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Des épis de blé en culture sur un champ riche en minerai de cuivre présentent une diminution de la taille (25 %), du poids (5 %), de la surface des feuilles (7 %) et du poids sec des feuilles (5%) par rapport à des plants en culture sur le même type de sol sans cuivre. Il apparaît que le stress causé par le cuivre affecte les réactions photosynthétiques, conduisant à une inhibition de croissance (Lanaras et al., 1993). Des altérations structurelles des feuilles d’origan exposé au cuivre reflètent une réduction de l’activité métabolique de la plante causée par l’exposition au métal (Panou-Filotheou et al., 2001).

Les altérations physiologiques des plantes exposées au cuivre sont en partie dues à l’action de ce métal sur le photosystème II (PSII). La fixation des ions du cuivre sur les résidus histidines et tyrosines d’enzymes du PSII ou encore la compétition des ions Cu(II) pour les ions Fe(II) (ces derniers étant impliqués dans le transport des électrons du PSII) perturberaient la photosynthèse (Yruela, 2005).

Les plantes tolérantes caractérisées à l’heure actuelle sont principalement des exclueuses (et pas des accumulatrices).

I.1.4. Le cuivre dans l’environnement.

Le cuivre est un des rares métaux qui existe à l’état fondamental dans la nature, ce qui peut expliquer pourquoi il fut le premier utilisé par l’homme. Néanmoins, il est essentiellement présent dans la nature sous forme de dérivés soufrés de chalcopyrite (CuFeS2) et de chalcocite (Cu₂S). Les sites riches en métaux lourds sont généralement qualifiés d’ultramafiques, ce qui correspond en fait aux éléments du magma terrestre qui sont les premiers à se solidifier par refroidissement en remontant à la surface de l’écorce terrestre (sur base de la classification de Normand Bowen, en 1928).

La carte suivante montre (par des cercles rouges) les sites des gisements extraits ou non de plus de 100 000 tonnes de sulfures de Ni-Cu-EGP (« élément du groupe du platine ») (figure I.1).

Figure I.1 : carte des sites Ni-Cu-EGP dans le monde (Choltron, 2003).

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Les sites ultramafiques riches en cuivre, nickel et métaux précieux sont donc disséminés partout sur la surface du globe. L’exploitation des minerais de métaux provoque leur dissémination, qui est alors qualifiée de « pollution ».

En France, c’est essentiellement les sites de vignobles qui sont pollués au cuivre car la bouillie bordelaise (mélange de chaux éteinte et de sulfate de cuivre) est utilisée comme fongicide pour lutter contre le mildiou. Les concentrations totales y sont comprises entre 38 et 251 ppm et les concentrations en cuivre biodisponible sont comprises entre 1,6 et 29,7 ppm (Brun et al., 2001). En Californie, la bouillie bordelaise est utilisée pour les cultures maraîchères, c’est là que des souches cuprorésistantes de Pseudomonas syringae ont été sélectionnées (Cha et Coocksey, 1991). Le cuivre est aussi utilisé comme additif alimentaire et antianémique pour les porcelets : des souches de E. coli cuprorésistantes ont été isolées de leurs fèces (Tetaz et Luke, 1983). Sur le site antique de Polis (Chypre), les résidus d’extraction de cuivre contiennent encore de 1400 à 4000 ppm de cuivre, avec un maximum exceptionnel à 22600 ppm (Pyatt, 2001).

Dans le monde, le Katanga (RD Congo) est réputé pour sa richesse en minerais, de cuivre en particulier.

I.2. Les bactéries métallo-résistantes.

Comme tous les organismes vivants, le métabolisme bactérien nécessite certains métaux lourds à des concentrations de l’ordre du nanomolaire. Les bactéries métallorésistantes résistent quant à elles à des concentrations qui s’étalent du millimolaire chez les proteobactéries au molaire chez les acidophiles (Mergeay, 1997).

La plupart des métaux lourds sont des éléments de transition portant des orbitales-d incomplètes (Biro et al., 1995). Ces orbitales confèrent à ces métaux la possibilité de former des complexes qui peuvent présenter une activité rédox. Aux hautes concentrations en particulier, ces ions forment des complexes aspécifiques dont l’effet majeur est la génération de radicaux libres qui vont dénaturer les protéines et peroxyder les lipides. Les métaux sont également responsables de l’altération de la structure des acides nucléiques par l’association des ions métalliques avec les groupes phosphates, empêchant ainsi la transcription ou la traduction des gènes (Hengstler et al., 2003).

Nies (2003) distingue chez les bactéries différents modes de résistance aux métaux lourds. Il oppose ainsi les termes « résistance » (processus actifs) et « tolérance » (modes passifs de détoxication). A titre d’exemple le « pool thiol », soit l’ensemble des résidus soufrés des protéines, constitue un mécanisme général de tolérance puisque ces acides aminés ont la particularité de complexer tous les ions métalliques. Mergeay (1991) définit les mécanismes actifs de résistance comme des mécanismes inductibles et dirigés spécifiquement contre un métal ou un groupe chimique de métaux.

Des gènes codant pour des fonctions de résistance aux métaux lourds sont présents chez de nombreuses bactéries : Acidithiobacillus ferooxydans (Barreto et al., 2003), Enterococcus hirae (Solioz et Stoyanov, 2003), Escherichia coli (Rensing et Grass, 2003), Oscillatoria brevis (Liu et al., 2003), Aeromonas veronii (Francki et al., 2000), Pseudomonas putida (Canovas et al., 2003), Pseudomonas syringae (Cha et Coocksey, 1991), Pseudomonas aeruginosa (Caille, 2007) et bien sûr Cupriavidus metallidurans (Mergeay 2000, Mergeay et al., 2003). Ces gènes sont souvent associés à des plasmides ou à des transposons.

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I.3. Mécanismes de résistance aux métaux lourds.

On peut distinguer cinq stratégies différentes de résistance aux métaux (Rouch et al., 1995), de l’extérieur vers l’intérieur de la cellule (Hobman et al., 2007) :

• Séquestration extracellulaire du métal

• Prévention de l’entrée du métal par réduction de la perméabilité

• Transport actif des métaux en-dehors de la cellule

• Modification enzymatique du métal vers une forme moins toxique

• Réduction de la sensibilité aux métaux des cibles cellulaires

L’efflux est le mécanisme principal des résistances inductibles : il réalise le transport actif des ions métalliques via deux classes de protéines : soit des transporteurs primaires pour lesquels le transport est directement couplé à l’hydrolyse de l’ATP (ABC-transporter, ATPase), soit des transporteurs secondaires qui utilisent un gradient électrochimique (CDF, RND, MFS).

Les principaux mécanismes de résistance aux métaux lourds sont décrits ci-dessous.

I.3.1. Les systèmes « Cation Diffusion Facilitator » (CDF).

Les protéines CDF forment une famille de transporteurs métalliques dont le substrat principal est le Zn(II) mais qui transportent aussi le Co(II), le Ni(II), le Cd(II) et le Fe(II). L’énergie des systèmes de transport CDF est issue d’un gradient de concentration, d’un potentiel membranaire, d’une force proton-motrice ou d’un gradient en potassium.

Ces protéines ont des caractéristiques structurales communes, à savoir six hélices transmembranaires et des régions C et N-terminales riches en histidines (Paulsen et Saier, 1997). La plupart des protéines CDF ont une taille comprise entre 300 et 400 acides aminés (Nies, 2003).

Il y aurait une relation entre le transporteur et le rayon ionique du métal transporté. Les substrats courants des CDF sont le Zn(II), le Co(II), le Ni(II), le Cd(II) et le Fe(II) dont les rayons ioniques sont respectivement de 74 pm, 74 pm, 72 pm, 94 pm et 76 pm. Cela suppose que le Mn(II) (80 pm) est un substrat potentiel de ces transporteurs à l’inverse du Mg(II) (65 pm), Cu(II) (69 pm), Ca(II) (99 pm) et Hg(I) (110 pm) qui sont soit trop petits, soit trop grands pour les systèmes CDF en général. Le cadmium –bien que d’un diamètre ionique de 94 pm- serait quand même substrat des CDF car il est chimiquement proche du Zn(II) (Nies, 2003).

Les protéines CDF sont présentes dans tous les organismes vivants avec, par exemple, CzcD et CnrT de C. metallidurans chez les bactéries (Nies, 1992), MTP1 chez la plante Arabidopsis thaliana (Desbrosses-Fonrouge et al., 2005) et ZNT4 chez l’homme (Zalewski et al., 2005).

La structure de la protéine YiiP, CDF d’E. coli transporteuse du Cd(II) et du Zn(II), a été déterminées (figure I.2).

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Figure I.2 : Structure de la protéine YiiP d’E. coli (adapté de Lu et Fu, 2007).

Légende : homodimère de YiiP (un protomère en jaune et l’autre en turquoise) visualisé dans le plan de la membrane. Les sphères rouges représentent les ions Zn(II) et sont notés Z1 à Z4.

Les hélices transmembranaires sont notées 1 à 6 et les hélices-α feuillets-β^{dans le} cytoplasme sont notées H1 et H2 et S1, S2 et S3, respectivement.

Cette protéine consiste en un homodimère (Wei et Fu, 2004) dont chaque monomère a un domaine cytoplasmique où se lient deux ions Zn(II) et un domaine transmembranaire à six hélices (Lu et Fu, 2007). Deux aspartates (157 et 49) dans la région transmembranaire sont impliquées dans la liaison aux ions Cd(II) (Wei et Fu, 2006). Le remplacement de l’aspartate 157 par une alanine supprime la liaison YiiP-Cd(II), alors qu’une substitution par une cystéine ne modifie pas l’activité de transport du Cd(II). Une corrélation similaire a été établie pour le Zn(II) (Wei et Fu, 2006). L’étude cinétique de la protéine ZitB, une autre CDF d’E. coli, a montré que le transport du Cd(II) et du Zn(II) au travers de la membrane par ZitB répondait à une cinétique michaélienne (Chao et Fu, 2004).

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I.3.2. Les systèmes « Heavy Metal Efflux – Resistance Nodulation cell Division » (HME-RND).

Les protéines RND ont d’abord été décrites comme un groupe de protéines impliquées dans la résistance aux métaux lourds (C. metallidurans), la nodulation (Mesorhizobium meliloti) et la division cellulaire (E. coli). Les protéines RND sont souvent couplées à deux autres protéines : une protéine de fusion membranaire (MPF) et un facteur de la membrane externe (OMF - Outer Membrane Factor) (Nies, 2003). Ce type de mécanisme est appelé HME-RND (figure I.3) (Heavy Metal Efflux-Resistance Nodulation and Cell Division) lorsque le substrat est un ion ou un groupe d’ions de métaux lourds.

Figure I.3 : Modèle du mécanisme cellulaire des protéines RND (Nies, 2003).

Légende : OM : (outer membrane) membrane externe, CW : (cell wall) muréïne ; PP : (periplasmic space) espace prériplasmique, CPM : (cytoplasmic membrane) membrane cytoplasmique. Le complexe RND(rouge)-MPF(vert)-OMF(jaune) est présenté comme un complexe protéique multi-hétéromères. Les protons (points noirs), expulsés dans l’espace périplasmique (EP) par la chaîne respiratoire (1)- servent de co-transporteurs antiports aux ions métalliques (6). La force électrochimique générée par ce gradient permet d’accumuler le

substrat dans le canal MPF-OMF (4). La concentration élevée en ions dans celui-ci permet d’expulser les cations par diffusion (5). Ce modèle montre qu’un site actif (orange) localisé dans la protéine RND est le site de la réaction d’échange et ce quelle que soit la localisation

du substrat (2 a, b, c).

Le système CusABC d’E. coli correspond au modèle HME-RND établi par Nies pour le cas spécifique du cuivre (Rensing et Grass, 2003) (figure I.4).

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Figure I.4 : Modèle du complexe protéique CusABC de E. coli (Rensing et Grass, 2003).

Légende : Les ronds bleus représentent indistinctement les ions Cu(II) et Cu(I). L’entrée du cuivre peut se faire de façon directe au départ du périplasme (A), du cytoplasme (B) ou

encore grâce à une protéine chaperonne (C) : dans le cas présent CusF pourrait donc faciliter le transport du Cu(I) ou du Cu(II).

Le complexe protéique Cus est constitué de la pompe de la membrane interne CusA (RND), de la protéine périplasmique CusB (MPF) et de la protéine CusC (OMF) qui forme un canal au travers de l’espace périplasmique jusqu’au milieu extérieur.

La souche Cupriavidus metalidurans CH34 porte un système homologue à CusABC sur son mégaplasmide (Mergeay et al., 2003).

L’analyse structurale de CusF montre que la liaison CusF-Cu(I) est unique par rapport aux motifs de liaison connus protéine-cuivre et implique deux méthionines et une histidine (en positions 47, 49 et 36, respectivement) (Loftin et al., 2005). Ce site lie aussi l’Ag(I) avec une affinité plus élevée que le Cu(I) (Kittleson et al., 2006). Un tryptophane intervient également dans la stabilisation du site de liaison (Loftin et al., 2007).

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A l’heure actuelle, il n’existe pas de structure complète connue d’un système de type ABC.

Eswaran et al. (2004) ont associés trois structures connues des sous-unités de RND (ArcB), MFP (MexA) et OMF (TolC) qui permettent de visualiser la structure du complexe protéique (figure I.5).

Figure I.5 : Structures résolues de trois composants appartenant à la famille des RND transporteurs (Eswaran et al., 2004).

Légende : Modèle d'assemblage des trois composants des pompes de rejet multidrogues (RND). Ce modèle est composé d'un trimère de la protéine TolC d'E. coli (en rouge), d'un anneau de neuf molécules de MexA de P. aeruginosa (en Bleu) et d'un trimère d'AcrB d'E.

coli (en vert) (Eswaran et al., 2004).

La protéine TolC constitue un canal long de 140 Å et présente un site de liaison au métal impliquant six aspartates (Asp371 et Asp374 sur chaque protomère) capable de fixer un ion métallique. AcrB agit comme une pompe péristaltique pour réaliser l’efflux de son substrat en réalisant une rotation successive de chaque sous-unité autour de l’axe vertical du canal. Le substrat est ainsi poussé du cytoplasme vers le périplasme (Seeger et al., 2006).

MexA est la sous-unité du complexe qui réalise la liaison entre les deux composantes du canal transmembranaire. Chez P. aeruginosa, MexA est ancrée dans la membrane interne (région structurale non-définie) via la chaîne acylée fixée à son extrémité N-terminale et participe à l’efflux des antibiotiques en coordination avec les canaux formés par MexB (ancrée dans la membrane interne) et OprM (ancrée dans la membrane externe) (Yoneyaya et al., 2000).

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I.3.3. Les ATP-ases de type P.

Les ATPases de type P sont une superfamille de protéines transporteuses activées par l’hydrolyse de l’ATP. Les substrats de celles-ci sont des cations comme les protons, Na(I), K(I), Mg(II), Ca(II), Cu(I), Ag(I), Zn(II) et Cd(II).

Ces ATPases sont importantes dans l’homéostase des minéraux car elles sont responsables de systèmes d’import de macroéléments comme le Na(I), le K(I) et le Mg(II) et aussi le Cu(I) ou l’Ag(I) comme par exemple CopA de Enterococcus hirae (Solioz et Stoyanov, 2003). Les ATPases de type P exportatrices peuvent quant à elles détoxiquer les métaux lourds cationiques par efflux, l’étiquette « P » marquant la consommation d’une liaison phosphate hautement énergétique pour permettre l’expulsion.

Les ATPases de type P transportant les métaux lourds portent des régions où un résidu proline est suivi et/ou précédé d’une cystéine et sont donc appelées ATPases de type CPX (où X=C, H ou S). On distingue deux sous-familles : les CPX-ATPases à Cu (transport Cu(I) et Ag(I)) et les CPX-ATPases à Zn (transport du Zn(II), Cd(II), Co(II) et Pb(II)).

Outre ce motif, on trouve chez CopF et CupA de C. metallidurans CH34 (des Cu-CPX- ATPase) un motif CXXC alors que dans les ATPase CadA et PbrA de la même souche, une des cystéines est remplacée par deux glutamates. Du point de vue phylogénétique, les ATPases des deux familles sont distinctes (Mergeay et al., 2003). Alors que les Cu-ATPase ne reconnaissent que les ions Cu(I) (et parfois Ag(I)), il semble que les Zn-CPX-ATPase soient interchangeables et puissent utiliser plusieurs substrats. Il semble aussi que ZitA, Zn- CPX-ATPase, de C. metallidurans CH34 soit également impliquée dans la prise en charge du Tl(I) et Bi(III) (Monchy et al., 2006^b).

L’analyse de la première ATPase de type CPX identifiée, CadA de Staphylococcus aureus, montre l’existence de huit régions transmembranaires dont six ont un motif CPC commun. Le domaine de liaison à l’ATP se situe dans le cytoplasme et est constitué d’une région de 109 acides aminés riche en cystéines. Cette région est présente dans la plupart des CPX-ATPases.

(Nies, 2003).

Ces protéines portent généralement du côté N-terminal un motif répété CXXC caractéristique de la liaison au métal (Rensing et al., 1999).

Un exemple d’ATPase de type P bien étudié est la protéine CopA d’E. coli (Rensing et al., 2000) (figure I.6).

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Figure I.6 : Structure de l’ATPase CopA de E. coli (Rensing et al., 2000).

Légende : Modèle de l’ATPase CopA de E. coli. CopA pompe le Cu(I) du cytoplasme vers le périplasme. CopA porterait dans son domaine N-terminal deux sites de liaison au métal portant un motif CXXC (MBD 1 & 2) et huit segments transmembranaires, notés 1 à 8 en suivant la structure primaire. La connexion entre les segments 4 et 5 correspond au domaine

phosphatase. Le segment 6 est prédit être celui de translocation et porte la séquence consensus de type CPC. La connexion entre les segments 6 et 7 correspond au domaine de phosphorylation et de liaison de l’ATP. Le motif conservé (« conserved motif ») peut différer d’une ATPase à l’autre (à gauche, le motif de CopA, à droite, celui de la protéine de Menkès).

CopA présente une région N-terminale avec des motifs répétés CXXC qui constituent les sites de liaison au métal. Dans la structure primaire, les domaines de liaison à l’ATP et de phosphorylation se trouvent entre les domaines transmembranaires (Rensing et al., 2000).

Les substrats de cette protéine sont les ions monovalents Ag(I) et Cu(I) ; les ions divalents Cu(II), Zn(II) et Co(II) ne sont pas substrats (Fan et Rosen, 2002).

La région promotrice du gène copA de E. coli est sous contrôle de l’Ag(I), du Cu(I), du Cu(II) et de l’Au(III) (Stoyanov et Brown, 2003).

Bien que le motif CXXC ne soit pas nécessaire à l’activité ATPase de la protéine, la substitution d’une (ou des deux) cystéine(s) par une sérine diminue d’un facteur deux à trois la constante d’affinité de la réaction (Fan et Rosen, 2002).

Chez C. metallidurans CH34, on trouve une grande diversité d’ATPase de type P, dont CupA et CopF qui sont homologues à CopA de E. coli (Monchy et al., 2006^b).

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I.3.4. Les systèmes « Major Facilitator Superfamily » (MFS).

Les protéines MFS (Major Facilitator Superfamily) (figure I.7), sont présentes dans tous les règnes du vivant.Ces protéines ont des substrats variés comme les hydrates de carbone, les intermédiaires du cycle de Krebs, les antibiotiques, les acides aminés, les nucléosides, les vitamines, ainsi que les cations et anions, mais pas les macromolécules (Saier et al., 1999).

Figure I.7 : Organisation structurale des protéines MFS (Bolhuis et al., 1997).

Légende : organisation structurelle des MFS. Les segments en hélice-a sont représentés par des ellipses. Les région N et C-terminale sont dans le cytoplasme, de même qu’une large

boucle centrale (notée CL). Les motifs conservés sont notés sur la figure.

Elles présentent 12 à 14 hélices transmembranaires dans la structure secondaire et des motifs A (GX3D(R/K)XGR(K/R)) et B (GpilGPviGG), caractéristiques dans la séquence primaire (Bolhuis et al., 1997). Les régions N et C-terminales sont situées dans le cytoplasme de même qu’une large région centrale bouclée. Le motif A est situé entre les régions transmembranaires 2 et 3 pour la plupart des MFS et parfois dans une forme dégénérée entre les segments 8 et 9.

Le motif B, reconnu comme un motif d’extrusion du substrat, se trouve sur le segment transmembranaire 5. La protéine NreB de C. metallidurans 31A (anciennement Achromobacter xylosoxydans), dont la synthèse est induite par le Ni(II) et qui confère une résistance à la bactérie, est une protéine de type MFS qui lie les métaux (Grass et al., 2001).

Les gènes nreA et nreB codent pour un mécanisme de faible résistance au nickel (en comparaison avec le système ncc). La résistance s’exprime aussi bien dans C. metallidurans que E. coli (Schimdt et Schlegel, 1994). nreB est présent (sans nreA) sur pMOL30, et avec les gènes nccABC ; cependant nccB est partiellement délété et ces gènes ne sont pas induits par les métaux lourds (Monchy et al., 2007). NreA est homologue à NcrB de Serratia marcescens, NirB de Klebsiella oxytoca et NreA de Legionella pneumophila. Ces protéines pourraient être des régulateurs de l’expression des gènes ncrABC/nreAB(C) (Marrero et al., 2007).

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I.4. Cupriavidus metallidurans.

I.4.1. Niche écologique, phylogénie et physiologie.

Cupriavidus metallidurans CH34 (anciennement Wautersia metallidurans, Ralstonia metallidurans, Ralstonia eutropha et Alcaligenes eutrophus (Goris et al., 2001; Vandamme et Coenye, 2004; Vaneechoutte et al., 2004) a été isolée dans un bassin de décantation d’une usine de traitement de métaux non-ferreux, à Prayon (à proximité de Liège, Belgique) (Mergeay et al., 1978). C. metallidurans est une bactérie du sol gram-négative, chémolithotrophe facultative et auxotrophe. Elle est bien adaptée aux biotopes industriels fortement pollués (Diels et Mergeay, 1990).

Elle a une forme en bâtonnet, de 0,4 µm de diamètre et 1 à 2 µm de longueur. Sur milieu solide, ses colonies ont une forme circulaire opaque et rosée. Sa température optimale de croissance est de 30°C. A partir de 37°C, un phénotype mutateur particulier est observé (Mergeay, 2000). A 38°C on n'observe plus de croissance.

C. metallidurans possède aussi toute la machinerie cellulaire nécessaire au clivage des cycles aromatiques, ce qui lui permet de dégrader certains xénobiotiques tels que les BTEX (benzène, toluène, éthylbenzène, xylène) et des dérivés organo-chlorés (Nies, 2000).

Cette souche fait partie de la famille des Burkholderiacea (ordre des Burkholdériales), qui d’après le

« Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (éd. 2006) » assemble des procaryotes Gram négatifs, non sporulants qui présentent une grande diversité morphologique, métabolique et écologique. Cette famille comporte des bactéries chimio-organotrophes aérobies ou anaérobes facultatifs, des bactéries chimiolithotrophes obligatoires ou facultatives, des bactéries fixatrices d'azote et des bactéries pathogènes pour l'homme, les animaux et les plantes.

La famille de Burkholderiaceae, dont fait partie le genre Cupriavidus, comprend les genres principaux suivants :

• Les Burkholderia sp. dont l’habitat principal est le sol et les plantes et pour lesquelles quelques espèces sont pathogènes pour l’homme ou l’animal, certaines souches sont pathogènes opportunistes (Garrity et al., 2005).

• Les Cupriavidus sp. dont C. metallidurans CH34.

• Lautropia mirabilis (unique espèce du genre) isolée de la bouche et de patients atteints de mucoviscidose (Gerner-Smidt et al., 2005).

• Limnobacter thiooxidans (unique espèce du genre) isolée de sédiments d’un lac d’eau douce (Spring et al., 2001).

• Les Pandoraea sp. (Pandoraea apista, Pandoraea norimbergensis, Pandoraea pnomenusa, Pandoraea pulmonicola et Pandoraea sputorum) isolées de l'environnement, de lait en poudre et de prélèvement cliniques, notamment d’expectorations de sujets atteints de mucoviscidose (Coeyne et al., 2000).

• Paucimonas lemoignei (Pseudomonas lemoignei) (unique espèce du genre) isolée du sol (Jendrossek, 2001).

• Polynucleobacter necessarius (unique espèce du genre), un endosymbionte obligatoire de protozoaires vivant en eau douce (Heckmann et Schmidt, 1987).

• Ralstonia sp. dont plusieurs sont (phyto)pathogènes ou isolées de l’environnement.

• Les Thermothrix spp. (Thermothrix azorensis et Thermothrix thiopara) isolées d'eaux géothermales dont le pH est proche de la neutralité (Reysenbach et al., 2005).

(14)

Au sein des genres Cupriavidus et Ralstonia (auquel C. metallidurans fut très longtemps rattachée), on distingue les espèces suivantes :

C. eutrophus (aussi appelée C. necator) est au départ l’unique souche du genre Cupriavidus, cette bactérie du sol est capable de tuer, par un mécanisme encore inconnu, des bactéries à Gram positif ou négatif (Makkar et Casida, 1987).

C. taiwanensis, isolée pour la première fois à Taiwan des nodules de la plante Mimosa pudica, et qui est capable de fixer l’azote de l’air qu’il assimile pour les plantes (Chen et al., 2001).

C. basilensis et C. campinensis ont été isolés de biotopes industriels pollués aux métaux lourds, ces derniers contenaient également C. metallidurans (Goris et al., 2001). Leurs plasmides se transfèrent facilement à C. metallidurans.

C. gilardii, C. pauculus et C. respiraculi ont été isolées de cas d'infections humaines chez des sujets affaiblis (Coeyne et al., 1999, Vandamme et al., 1999, Coeyne et al., 2003b).

R. syzygii est pathogène pour les plantes du genre Syzygium et notamment pour Syzygium aromaticum (girofle ou giroflier) (Roberts et al., 1990).

R. solanacearum est une bactérie phytopathogène d'une importance considérable car elle est pathogène pour plus de 200 espèces de plantes réparties dans 50 familles. Elle est notamment importante pour son pouvoir pathogène vis-à-vis de la tomate, de la pomme de terre, du tabac, du bananier et de l'arachide (Yabuuchi et al., 1995).

R. insidiosa, R. mannitolilytica et R. pickettii sont isolées de l'environnement et de malades affaiblis. Elles sont responsables de méningites, d'ostéomyélites et d'infections nosocomiales (Coeyne et al., 2003a, De Baere et al., 2001).

I.4.2. Caractéristiques génétiques.

Le séquençage du génome complet de C. metallidurans CH34 a permis de faire l’inventaire des gènes de résistance aux métaux lourds (http://genome.ornl.gov/microbial/rmet/ , Monchy, 2007).

Ce séquençage a également permis la mise en évidence de nombreux paralogues chez C.

metallidurans CH34. Quand deux ou trois gènes sont identiques, généralement l’un d’entre eux est inductible par les métaux lourds alors que le ou les autres sont silencieux ou constitutivement exprimés (Nies et al., 2006).

Chromosome et mégaplasmide.

C. metallidurans CH34 porte un chromosome de 3.9 MB, un mégaplasmide (ou minichromosome) de 2.6 MB (figure I.8) et deux plasmides : pMOL28 de 177kb et pMOL30 de 233 kb. Cette organisation génomique avec deux réplicons majeurs se retrouve également chez R. solanocearum, R. picketii, C. eutrophus H16, C. pinatubonensis JMP134, C.

taïwanenesis et aussi chez les Burkholderia.

(15)

Figure I.8 : Cartes du chromosome et du mégaplasmide (MPL) de C. metallidurans CH34, orientées sur la réponse aux métaux lourds (Monchy, 2007).

Légende : Localisation des gènes de résistance aux métaux lourds sur le chromosome et le mégaplasmide de C. metallidurans. Les groupes de gènes soulignés en rouge codent pour des

systèmes d’efflux de type ATPase et ceux soulignés en bleu codent pour des systèmes d’efflux à trois composants.

Des gènes de transport de métaux lourds sont localisés sur les différents réplicons de C.

metallidurans. Le chromosome porte en particulier le groupe de gènes cupCAR où cupA code pour une ATP-ase homologue à copA d’E. coli, et dont le substrat est le Cu(I) (Monchy et al., 2006^b).

Le mégaplasmide porte plusieurs groupes de gènes impliqués dans le transport des métaux lourds : les gènes cusCBAX, homologues aux gènes cus d’E. coli (voir pt. I.3.2., figure I.3) dont le substrat est le cuivre, les gènes zntBCIA impliqués dans l’efflux du zinc, et les gènes copSRABCD, impliqués dans le transport du cuivre et décrits plus loin (Monchy, 2007).

Le génome de C. metallidurans se caractérise aussi par la présence de nombreux éléments IS ou de résidus de ceux-ci, comme cela a été également mis en évidence chez R. solanacearum (Mergeay et al., 2003).

Les plasmides de C. metallidurans comportent plusieurs îlots génomiques qui sont flanqués par des éléments IS (« insertion sequence ») (IS) qui sont souvent partiellement délétés.

Les éléments IS sont des séquences d’ADN de petite taille (généralement 700 à 2500 pb) qui ne codent que pour des fonctions de transposition de l’ADN. Ils ne portent donc pas, à l’inverse des transposons, des gènes de fonction comme une résistance à un antibiotique. Les éléments IS sont bordés par des séquences d’ADN palindromiques.

(16)

Un îlot génomique se définit comme un fragment d’ADN qui a les propriétés suivantes (Mergeay, communication personnelle) :

• la présence d’un site spécifique de recombinase et d’un gène d’ARNt adjacent à une extrémité,

• la présence de séquences IS aux extrémités,

• une composition (% GC) ou une phylogénie qui diffère de l’ensemble du génome (indiquant leur origine étrangère et l’acquisition via un transfert horizontal),

• un contenu en gènes hypothétiques plus élevé que dans les régions voisines,

• un pourcentage élevé de gènes liés aux éléments génétiques mobiles (intégrase, recombinase, éléments IS) ,

• une conservation de ces îlots entre des souches différentes et

• une concentration en gènes spécialisés (dans la résistance aux métaux, le catabolisme, des métabolismes particuliers).

Un îlot génomique est mis en évidence par la présence, à ses extrémités, de séquences de type IS « superposées » les unes dans les autres, et notées ∆IS, et qui ne sont pas toujours fonctionnelles du fait de leur superposition.

Le plasmide pMOL28.

Le plasmide pMOL28 (figure I.9), porte 164 orf dont des gènes de réplication, de maintenance et de transfert et trois groupes de gènes de résistance au métaux lourds : cnr (résistance au cobalt et au nickel), chr (résistance au chromate) et mer (résistance au mercure) (Monchy, 2007).

Figure I.9 : Carte du plasmide pMOL28 (Mergeay et al., en préparation).

Légende : carte du plasmide pMOL28 présent dans C. metallidurans CH34. Les îlots génomiques sont marqués en gris, la structure de base du plasmide (B) est marquée par une

ligne en pointillés.

(17)

Le groupe de gènes cnrYXHCBAT code pour des protéines de transport du cobalt-nickel : CnrCBA forment un canal transmembranaire, CnrYXH sont des protéines de régulation (Tibarzawa et al., 2000, Tibarzawa et al., 2001), CnrT est une protéine de transport de type CDF (Paulsen et al., 1997).

Le groupe de gènes de résistance aux ions chromate chrIBACEF code pour une pompe d’efflux ChrA1, une superoxyde dismutase ChrC, une protéine impliquée dans la formation de complexes chromate-glutathion ChrE, et trois régulateurs ChrB1, ChrI et ChrF1 (Juhnke et al., 2002).

Le groupe de gènes merRTPADE, sur le transposon Tn4378, code pour la résistance au mercure. Celle-ci consiste en la capture des ions mercure (Hg(II)) via la protéine périplasmique MerP et leur transport dans la cellule par la protéine MerT qui forme un canal dans la membrane interne (Hobman et Brown, 1997). Ensuite, une réductase cytoplasmique (MerA) réduit l'ion Hg(II) en Hg(0) non toxique. Ce dernier se volatilise hors de la cellule, du fait que le mercure élémentaire est volatil dans les conditions normales (à 298,15 K et 1 bar).

MerB clive les liaisons C-Hg(II) des composés organomercuriques et libère du Hg(II) qui sera réduit par la protéine MerA en Hg(0) (Misra, 1992). MerR régule finement ce groupe de gènes (Hobman et Brown, 1997; Summers et al., 1995, Parkhill et al., 1993, Ansari et al., 1995).

Tous ces gènes de résistance aux métaux sont regroupés dans l’îlot génomique CMGI-28a, délimité par deux dérivés d’éléments transposables (Monchy et al., 2007).

Le plasmide pMOL30.

Le plasmide pMOL30 (figure I.10) porte 247 orf identifiées (Monchy et al., 2007) dont des gènes de réplication, de maintenance et de transfert de plasmide et six groupes de gènes impliqués dans la résistance aux métaux lourds : czc (résistance au cadmium-zinc-cobalt), pbr (résistance au plomb), mer (résistance au mercure), nre-ncc (résistance au nickel-cobalt- cadmium), sil (résistance à l’argent) et cop (résistance au cuivre).

Deux ensembles de gènes grtABM, codant pour des glycosyltransférases impliquées dans la synthèse des membranes, sont situés entre les gènes de résistance sil et cop d’une part et à côté du gène czcP d’autre part.

(18)

Figure I.10 : Carte du plasmide pMOL30 (Mergeay et al., en préparation).

Légende : carte du plasmide pMOL30 présent dans C. metallidurans CH34. Les îlots génomiques sont marqués en gris, la structure de base du plasmide (B) est marquée par une

ligne en pointillés.

Les gènes czcNICBADRSE codent pour un système d’efflux de type HME-RND (CzcABC) (Mergeay et al., 2003, Nies 1995) et un système d’efflux de type CDF (Nies 1992) : CzcD permet l’influx des métaux quand ces éléments manquent, et permet l’efflux en présence d’une concentration élevée en ions (Anton et al., 1999).

Les protéines CzcR et CzcS constituent un système de régulation à deux composants où CzcS est une kinase senseur (« sensor-kinase ») qui détecte l’ion métallique et CzcR, qui après avoir été phosphorylé par CzcS, active la transcription des gènes czcCBA qu’il contrôle (Koretke et al., 2000, Grosse et al., 1999).

Les protéines CzcI (périplasmique) et CzcN (de la membrane interne) pourraient être impliquées dans la régulation de l'opéron czc, en particulier via la protéine CzcD (Anton et al., 1999). Les ORFs czcJ, czcE et czcM ont été mises en évidence par l’étude du transcriptome de la bactérie. Ces gènes montrent respectivement des taux d’induction de 22.8, 4.6 et 2.3 par le Zn(II) et 26.8, 12.1 et 2.2 par le Cd(II) (Monchy et al., 2007).

L’étude structurale de la protéine CzcE montre que cette protéine périplasmique lie quatre atomes de cuivre par dimère (Zoropogui et al., 2007). CzcJ est homologue à la protéine CopQ du groupe de gènes cop de pMOL30. Toutes deux présentent un motif d’expulsion périplasmique. CzcP est une ATP-ase de type P qui est située à 4.6 kb du groupe de gènes czc et qui est spécifiquement induite par le Zn(II) (Monchy et al., 2006^b). Elle est codée à 4,6 kb du gène czcJ.

(19)

Les gènes pbrTRABCD codent pour un système original où PbrT est une protéine d’influx du Pb(II), PbrA est l’ATP-ase d’efflux du Pb(II), PbrB est une lipoprotéine de la membrane externe qui se lie à PbrA dans le périplasme. PbrC est une lipoprotéine qui procède à la maturation de PbrB, et PbrR est un régulateur qui appartient à la famille des régulateurs de type MerR. PbrD séquestre les ions Pb(II) dans le cytoplasme (Borremans et al., 2001).

Le groupe de gènes merRTPADE de résistance au mercure est présent sur le transposon Tn4378 (Diels et al., 1985) et est identique au groupe de gènes présent sur le Tn4380 de pMOL28 (Mergeay et al., 2003).

Le groupe de gènes nre-ncc (pour « nickel resistance » et « nickel cobalt cadmium ») du plasmide pMOL30 est considéré comme non fonctionnel car il n’est induit par aucun des métaux lourds (Monchy et al., 2007). Les gènes ncc (codés sur le plasmide pTOM9) de la bactérie C. metallidurans 31A gouvernent une résistance au nickel nettement plus forte que celle gouvernée par pMOL28

Le groupe de gènes silABC code pour des protéines impliquées dans l’efflux des ions Ag(I) et Cu(I) (Mergeay et al., 2003, Auquier, 2007).

Le groupe de gènes copVTMKSRABCDIJGFLQE de pMOL30, sujet d’étude de cette thèse, comporte un système d’efflux périplasmique de type Pco/Cop (Cha et al., 1991, Lee et al., 2002, Mergeay et al., 2003) (voir point I.4.4).

Tous les groupes de gènes de résistance sont regroupés sur les îlots génomiques CMIGI-30a et CMGI30-b.

I.4.3. Analyse de la réponse globale aux métaux de C. metallidurans CH34.

Réponse transcriptomique des plasmides pMOL28 et pMOL30.

Cette analyse est consécutive au séquençage du génome de C. metallidurans CH34, elle a été réalisée dans le cadre d’une thèse de doctorat (Monchy, 2007).

Chez pMOL28 (figure I.11), le groupe de gènes cnr est induit par le Ni(II), le Cu(II) et le Cd(II) (et légèrement par le Pb(II) et le Zn(II) alors qu’une résistance élevée au nickel et au cobalt (plus modérée pour le cadmium et le zinc) est conférée par ces gènes.

Le groupe de gènes chr est faiblement induit par le Cu(II) et le Ni(II).

Les gènes mer sont induits par le Hg(II) mais il n’est pas possible de distinguer ces gènes de ceux du pMOL30 qui sont 100% identiques.

(20)

Figure I.11 : Taux d’induction des gènes de pMOL28 en présence de différents métaux (Monchy et al., 2007).

Légende : les taux d’induction sont repris en bas à droite sur la figure, chaque couleur correspond à un ion métallique et la coloration est d’autant plus intense que le taux d’induction est élevé. La zone notée « B » correspond aux gènes de maintenance et de transfert du plasmide pMOL28. Les éléments génétiques mobiles sont notés en brun, les

groupes de gènes ou gène identifié(s) sont notés en noir.

(21)

Chez pMOL30 (figure I.12), plusieurs gènes portés par des éléments génétiques mobiles sont induits par les métaux lourds.

Figure I.12 : Taux d’induction des gènes de pMOL30 en présence de différents métaux (Monchy et al., 2007).

Légende : les taux d’induction sont repris en bas à droite sur la figure, chaque couleur correspond à un ion métallique et la coloration est d’autant plus intense que le taux d’induction est élevé. La zone notée « B » correspond aux gènes de maintenance et de

transfert du plasmide pMOL30. Les lignes brunes et trait fin correspondent aux îlots génomiques de pMOL30 (notés (b) et (c)). Les éléments génétiques mobiles sont notés en

brun, les groupes de gènes ou gène identifié(s) sont notés en noir.

(22)

Le gène mmrQ (pour « muliple-metal-response ») est remarquable car il est fortement induit (de 3 à 77 fois) par tous les métaux testés.

Les gènes czc sont surtout induits par le Cd(II) et le Zn(II), mais czcN, czcA et czcP sont aussi induits par le Cu(II), czcN et czcI sont induits par le Ni(II) et czcN, czcI, czcC et czcB sont induit par le Pb(II).

Le groupe de gènes pbr est induit par le Pb(II) et le Cd(II).

Le groupe de gènes merRTP, qui possèdent entre 40 et 50 % d’identité avec les gènes mer codés par le Tn4380, n’est induit par aucun des métaux testés.

Les gènes cop sont fortement induits par le Ni(II), Zn(II), Co(II) et Cu(II) (figure I.13).

Figure I.13 : Taux d’induction des gènes cop en présence de différents métaux (adapté de Monchy et al., 2007).

Légende : Les taux d’induction sont mesurés par microarray. Les inductions sont mesurées en présence de 0,1 mM de Cu(II), 0,6 mM de Cd(II), 0,6 mM de Ni(II) ou 0,8 mM de Zn(II). Le

temps de contact est toujours de trente minutes entre C. metallidurans CH34 et l’ion métallique inducteur des gènes cop. TI = taux d’induction.

Les gènes copQ, copK et les gènes copSRABCD sont les plus induits parmi les gènes cop.

Les gènes sil, impliqués dans la résistance à l’argent, sont également induits par le Cu(II).

Enfin, les gènes gtr1 et gtr2 sont partiellement induits par le Zn(II), le Cd(II), le Cu(II).

L’étude du transcriptome plasmidien de C. metallidurans CH34 induit par les métaux montre l’existence de nombreuses réactions croisées puisqu’un même groupe de gènes est induit par différents métaux et qu’un métal induit plusieurs groupes de gènes.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

copV copT

copM copK

copN copS

copR copA

copB copC

copD copI copJ

copG copF

copL copH

copQ copE

Taux d'induction (/)

Cu(II) Cd(II) Ni(II) Zn(II)

TI = 71

(23)

Les protéines de C. metallidurans CH34.

L’étude du protéome de C. metallidurans CH34 a permis de caractériser 224 protéines issues de 352 spots obtenus sur un gel à deux dimensions chargés des protéines totales de C.

metallidurans CH34. De nombreuses protéines encore inconnues au moment de cette analyse ont ainsi pu être mises en évidence (Noël-Georis et al., 2004). L’analyse différentielle de l’expression du protéome a été réalisée en ajoutant un métal au milieu de culture cellulaire.

Cette méthode a permis de montrer que CzcB était fortement induite par le Zn(II) (Noel- Georis et al., 2004).

En présence de Cu(II), il y a expression de CopC, CopR, CopK et CopB (codées par le pMOL30), CopK étant la protéine la plus abondante. C’est aussi le cas des protéines CusC et CusB (codées sur le mégaplasmide). CopB, CusC, CusB sont aussi visibles après culture en présence d’Ag(I) (Mergeay et al., 2003).

I.4.4. Le système Cop/Pco de résistance au cuivre.

Le système de résistance au cuivre Cop/Pco est un système de transport du cuivre qui ne ressemble à aucune des grandes familles de transporteurs décrits plus haut. Ce système n’est cependant pas unique à C. metallidurans puisque ce groupe de gènes se retrouvent dans plusieurs bactéries (figure I.14, Mergeay et al., 2003).

Systèmes homologues étudiés dans d’autres organismes.

Figure I.14 : Organisation des gènes cop de résistance au cuivre de C. metallidurans et des systèmes homologues dans d’autres organismes

(adapté de Mergeay et al., 2003 et Monchy et al., 2006^a).

Légende : les flèches en trait noir indiquent les couplages transcriptionnels, « + » et « * » indiquent respectivement la présence d’un motif CXXC et Met/His dans la structure primaire

de la protéine correspondante. Les gènes copSRABCD sont conservés dans divers protéobactéries. Les gènes de régulation copRS ne sont pas orientés de la même façon. E. coli

porte un gène pcoE qui n’a pas d’homologues parmi les gènes cop de pMOL30.

Seuls les gènes copABCD et leurs régulateurs copRS sont communs aux quatre espèces.

(24)

L’arrangement des gènes varie suivant les espèces : les gènes de régulation sont transcrits de façon divergente chez C. metallidurans et R. solanacearum alors qu’ils sont transcrits dans la même orientation chez E. coli et P. syringae (Mergeay et al., 2003). Toutefois, il n’y a que 38 à 76 % d’identité entre les protéines Cop de ces deux dernières souches (Cooksey, 1994).

Les gènes pcoABCD pcoRS pcoE codant pour la résistance au cuivre d’E.coli sont localisés sur le plasmide pRJ1004 qu’on trouve dans des souches isolées de fèces de porcs, nourris avec un régime riche en sulfate de cuivre (Brown et al., 1992).

Les gènes copABCDRS de P. syringae sont localisés sur le plasmide pPT23D de souches phytopathogènes aussi dans des souches isolées de patients humains (Cooksey, 1994).

Un groupe cop se trouve sur le plasmide de virulence pLVPF de Klebsiella pneumoniae CG43 avec une organisation de type copEABCDRS où copE est divergent par rapport aux autres gènes (Chen et al., 2004), et sur le plasmide R478 de Serratia marcescens où le groupe de gènes copE₁ABCDRSE₂ fait apparaître deux fois le gène copE (Gilmour et al., 2004).

Il y aurait deux sous-groupes de résistance au cuivre : l’un lié à la prise en charge du cuivre périplasmique (qui correspondrait globalement aux protéines portant un motif Met/His dans la séquence primaire), l’autre au cuivre cytoplasmique (avec un motif CXXC dans la séquence primaire) (Monchy et al., 2006^a).

(25)

Modèle de fonctionnement du système CopABCD.

Actuellement, les systèmes Pco/Cop les mieux décrits sont celui de E. coli (figure I.15 - Rensing et Grass, 2003) et de P. syringae (Puig et al., 2002).

Figure I.15 : Mécanisme de résistance conféré par le système Pco d'E. coli (Rensing et Grass, 2003).

Légende : Les ronds bleus représentent indistinctement les ions Cu(II) et Cu(I). La fonction de la protéine PcoB n’est pas encore élucidée. Le cuivre peut être chélaté par des sidérophores

oxydés et le Cu(I) peut être oxydé en Cu(II) moins toxique par la multicuivre oxydase PcoA.

Afin de charger les ions du cuivre sur les sites catalytiques de PcoA, les ions sont présentés à PcoD par PcoC qui charge PcoA dans le cytoplasme. PcoE lie le cuivre dans le périplasme et

transmettrait le cuivre à PcoA.

La protéine PcoA (605 aa) est une « oxydase multicuivre » qui réaliserait la conversion du Cu(I) en Cu(II), comme le fait la protéine CueO de E. coli (Kim et al., 2001). Rensing et Grass (2001) ont démontré qu’un mutant délété du gène cueO, sensible au cuivre, retrouve le phénotype de la souche sauvage lorsqu’un plasmide contenant le gène copA de C.

metallidurans CH34 est introduit dans le mutant. Ces deux gènes sont donc fonctionnellement interchangeables. La protéine CopA de P. syringae est capable de lier 11 atomes de Cu (Cha et Cooksey, 1991).

PcoB (296 aa) est une protéine de la membrane externe qui est indispensable au fonctionnement de la résistance au cuivre. On trouve toujours un gène copB à côté d’un gène copA. Le rôle de PcoB n’est pas élucidé. Ces deux gènes seuls confèrent une résistance au cuivre, CopC et CopD n’étant nécessaires que pour une résistance maximale (Rensing et Grass, 2003).

(26)

PcoC (figure I.16 - 126 aa) se situe dans le périplasme qui est capable de lier un atome de Cu (Huffman et al., 2002). L’étude structurale de CopC de P. syringae (homologue à CopC de C.

metallidurans CH34 et à PcoC de E. coli) a montré la présence de deux sites de liaison au cuivre, l’un spécifique du Cu(I), l’autre spécifique du Cu(II) (Arnesano et al., 2002, Arnesano et al., 2003).

Figure I.16 : Structure de la protéine CopC de P. syringae et sites de liaison au cuivre dans la protéine (adapté de Arnesano et al., 2003).

Légende : les acides aminés impliqués dans des feuillets-β sont colorés en turquoise, en bleu les acides aminés impliqués dans la liaison au Cu(I) (site B), en rouge le site de liaison au

Cu(II) (site A).

La structure tertiaire de CopC de P. syringae fait apparaître les résidus de liaison au Cu(II), His1-Glu27-Asp89-His91. Le motif de liaison au Cu(I) observable dans la structure primaire de la protéine est MXXMXXMXHXXM.

PcoD (309 aa) serait une protéine de la membrane interne avec huit domaines transmembranaires (Klein et al.,1985).

Les homologues de pcoC et pcoD de Bacillus subtilis ne sont pas codés par des gènes séparés mais par un gène unique ycnJ. (Rensing et Grass, 2003).

Une souche mutante de P. syringae (délétée des gènes cop) dans laquelle on réintroduit les gènes copABCD devient résistante au Cu(II) (CMI à 1,2 mM). Le même mutant dans lequel on réintroduit soit copD soit copC garde le phénotype mutant (CMI à 0,4 mM), et le mutant dans lequel on réintroduit les gènes copCD devient hypersensible (CMI à 0,015 mM) (Cha et Cooksey, 1993). Le modèle est que les protéines CopC et CopD agissent ensemble pour réaliser l’influx du cuivre, et que l’une ne soit pas fonctionnelle sans l’autre. L’hypothèse est que PcoC présente les ions cuivre à PcoD qui réalise l’influx du cuivre (figure I.13).