Immunoélectrophorèse à contresens en gel d’agarose, avec des extraits de vignes (Vitis sp.) infectées par les virus du court-noué (grape fanleaf GFV et arabis mosaic AMV)

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Immunoélectrophorèse à contresens en gel d’agarose, avec des extraits de vignes (Vitis sp.) infectées par les virus du court-noué (grape fanleaf GFV et arabis mosaic

AMV)

J. Kuszala

To cite this version:

J. Kuszala. Immunoélectrophorèse à contresens en gel d’agarose, avec des extraits de vignes (Vitis

sp.) infectées par les virus du court-noué (grape fanleaf GFV et arabis mosaic AMV). Agronomie,

EDP Sciences, 1981, 1 (5), pp.389-390. �hal-02718917�

Immunoélectrophorèse ^à contresens en gel d’aga-

rose, ^avec des extraits de vignes (Vitis sp.) ^infec-

tées _par les virus du court-noué (grape fanleaf GFV

et arabis mosaic AMV)

Jean KUSZALA

LN.R.A., Station de Pathologie végétale, 28,

de Herrlisheim, F68021 Colmar

RÉSUMÉ

Immunoélectrophorèse, Diagnostic sérologique,

Vigne.

Une méthode d’immuno-osmophorèse

gel d’agarose ^s’est montrée efficace _pour déceler et identifier les virus (grape fanleaf virus et arabis mosaic virus) dans des extraits de tissus frais de vignes atteintes de

court-noué, préparés ^{à la} nicotine ; ^elle permet ^de révéler aussi bien les infections simples provoquées par l’un

ou

l’autre des virus que les infections mixtes.

SUMMARY

Immunoelectrophoresis,

Vine.

Counterimmunoelectrophoresis ⁱⁿ agar-gel ^{with extracts} of grapevines ^Vitis sp. infected by grape

fanleaf and arabis mosaic viruses.

A method of immuno-osmophoresis ⁱⁿ agar-gel ^has proved effective for detecting ^and identifying both grape fanleaf and arabis mosaic viruses in crude leaf tissue extracts prepared ^with nicotine, revealing single

mixed infections of grapevines.

1. INTRODUCTION

L’immunoélectrophorèse ^à contresens, ^{ou immuno-}

osmophorèse, ^{est basée sur la} migration ^{l’un vers l’autre de} l’antigène ^{et des} anticorps ^{dans un} champ électrique ^donné.

Cette migration ^{dans un} gel d’agarose ^se poursuit jusqu’à

leur rencontre. Il _y a alors formation d’un précipité qui ^ne migre plus ^et peut être observé ^sous forme d’un arc

opalescent : c’est l’arc caractéristique ^{de réaction. Avec des} anticorps ^hautement spécifiques, ^{il est} possible ^{de faire} apparaître ^avec chaque antigène correspondant ^une ligne ^de précipité, ^alors que d’autres antigènes continuent à migrer

sous l’influence du champ électrique. ^Les caractéristiques

de la migration ^dans l’électrophorèse dépendent ^{de l’inté-} grité ^{de la} substance ; ^celle-ci peut être dégradée par la conservation (P A U L ^& Q UERFURT H, 1979). ^L’immuno- osmophorèse ^a été utilisée _pour la première ^fois pour des virus végétaux par RAGET L I & WEI N TR A UB (1964). ^{Elle a} également ^été employée ^{avec succès} par VUITTE N EZ &

K U S

ZALA (1975) ^avec les virus du fanleaf de la vigne (GFV)

et de la mosaïque de l’arabette (AMV) dans des extraits de

chénopodes ^ainsi que par ADLER & DEL VECCHIO (1979)

avec des virus de champignons ^{et de l’ARN à 2 brins.}

Notre travail avait _pour but de mettre en évidence les virus GFV et AMV, ^soit séparément, ^{soit en} mélange, ^en partant directement de la vigne.

II. MATÉRIEL ET MÉTHODES

Les échantillons de vignes ^sont préparés ^en utilisant de

jeunes ^feuilles apicales ^{de Vitis} vinifera ^cv.

^Pinot noir »,

V. rupestris berlandieri cv.

Kober 5 BB _», soit saines soit infectées _par GFV

AMV. Comme milieu d’extraction

nous utilisons pour 1 g de feuilles, ⁴ mi d’une solution aqueuse à 2,5 p. 100 de nicotine additionnée de 0,5 ^ml par litre de détergent ^{Tween 20 ainsi} que 2 _p. 100 de polyvinyl- pyrrolidone ^{30 000} (PVP). L’homogénéisation ^{est faite dans}

un mortier puis ^le broyat ^{est soumis à une} petite centrifuga-

tion. Un volume de 0,05 ^{ml de} surnageant ^est utilisé _pour chaque expérience d’électrophorèse.

Le milieu gélosé ^{est constitué de 1 p. 100} d’agarose ^dans

un mélange tampon ^véronal 0,004 M, ^véronal sodique 0,02 M, ^EDTA sodique 0,005 M, ^{azide de sodium} 0,003 ^M (pH 8,6), ^{coulé sur des lames de verre} (porte-objet ^standard

de microscopie 7,5 ^{cm x} 2,5 cm), à raison de 3,5 ml par lame. Les lames placées côte à côte sont reliées individuel- lement aux cuves contenant les électrodes _par des ponts ^de papier ^filtre Whatmann N° 1 selon un montage ^en parallèle,

dans un appareil classique (Gelman Deluxe). L’électrolyte

est le tampon ^véronal 0,004 M — véronal sodique 0,02 ^M (pH 8,6). ^{Dans l’axe de} chaque lame, ^deux réservoirs (diam.

0,6 cm) ^{ont été} découpés ^à l’emporte-pièce enlevant le gel ;

le 1 er réservoir dont le centre est distant de 3 cm du bord (A)

de la lame recevra l’extrait de vigne, ^{le 2’} réservoir dont le centre est distant de 4,6 ^{cm du même bord recevra l’anti-} sérum.

Les antisérums GVF et AMV, ^{dont les titres sont voisins} de 1/ 2 000 en immunodiffusion double, ^sont employés ^soit séparément ^à la dilution 1 /5 soit en mélange ^à la dilution 1/ 2. Le volume mis dans chaque réservoir ^{est de} 0,05 ^ml.

L’électrophorèse ^est effectuée à la température ^ordinaire

du laboratoire. L’intensité du courant est fixée à 2 mA _par lame, ^{obtenue avec un} voltage de 300 V environ _pour 8 lames montées en parallèle ^{dans le cas de nos} expériences.

Deux directions opposées d’électrophorèse ^sont successive- ment réalisées : dans la 1 z &dquo; phase (durée ²⁰ min), le ^bord (A) de la lame étant côté anode et (B) ^côté cathode, ^il y ^a élimination vers l’anode des éléments les plus ^mobiles

contenus dans l’extrait. Dans la 2’ phase (durée ⁹⁰ min), qui

constitue l’opération d’immuno-osmophorèse proprement dite, ^{le bord} (A) étant relié à la cathode et (B) ^{à l’anode} par inversion des connexions, ^{le virus} migre ^{en direction du}

réservoir d’antisérum vers les anticorps IgG ^avec lesquels ^il

formera l’arc de précipité sérologique. L’observation de ce

précipité ^{nécessite une} coloration effectuée comme suit : les lames sont d’abord lavées (10 ^{à 12} h) ^{dans une solution de}

NaCl 1 M pour enlever les protéines libres, puis ^{rincées à}

l’eau distillée toutes les heures à 3 reprises. ^Le gel ^est

ensuite recouvert de papier ^{filtre et séché} par ^{un courant} d’air tiède. La coloration s’effectue _par trempage ^{dans un} bain de bleu de Coomassie 0,25 p. 100 dans un mélange d’alcool méthylique, ^acide acétique ^{et eau} (5 : ^{1 :} 5), ^suivi d’un lavage ^{dans le} mélange ^d’alcool méthylique, ^acide acétique ^{et eau} (45 : ^{10 :} 40).

III. RÉSULTATS

Avec cette méthode, ^{il nous a été} possible ^d’observer

l’arc de précipitation spécifique ^{entre les} réservoirs d’anti- sérum et de jus ^de plantes malades, ^alors qu’il n’y ^{a aucune} formation d’arc avec les jus ^de plantes ^saines.

En présence des deux virus (GFV ^et AMV) ^{dans le} jus, ^il

y ^a formation de deux lignes ^de précipité distinctes ; ^il semble que AMV migre ^{un peu} plus vite que GFV.

IV. DISCUSSION

Les essais réalisés selon la méthode primitive classique n’ont donné _que de très faibles résultats avec la vigne.

D’une part, ^en milieu tris-succinate déjà après ^{3 min d’élec-} trophorèse, ^il y ^a formation d’une zone de précipité (il ^ne s’agit pas d’un arc) qui apparaît également ^{avec le} jus ^sain.

Ce phénomène ^reste inchangé après ^{60 min ou 90} min, ^ou bien en inversant les pôles. ^D’autre part, l’emploi ^{de la}

SC SCA

M13 ,

1 1 ^M24

nicotine, indispensable pour ^une bonne extraction de virus à partir ^de vigne (V UITTENEZ ^& KUS Z nI.A, 1968) ^{rend diffici-} lement visible le précipité. ^Cet inconvénient ne se produit plus ^{avec notre} méthode, ^{où nous faisons} d’abord migrer ^les

substances gênantes pendant ^{20 min à} l’opposé ^du champ ^de formation de l’arc de précipité (elles ^ne bougeront plus ^lors

de la 2 e phase ^de l’électrophorèse, ^étant dénaturées ou

éliminées de la lame lors de la 1‘ re phase).

Nos expériences ^ont été réalisées à partir ^{de feuilles} prélevées ^au vignoble ^en juin ^et juillet 1980. Cette période

été extraordinairement fraîche. La reprise ^des expériences

en septembre ^{n’a donné} que de faibles résultats imputables

sans doute à la faible concentration du virus dans les vignes

en arrière-saison. Nous pouvons dire néanmoins _que cette

technique ^de test, appliquée ^{à bonne} période, ^{est utilisable}

chez la vigne.

Reçu ^{le 14} janvier 1981.

Accepté ^{le 11} février ^1981.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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