Etude physico-chimique des flavonoïdes

République Algérienne Démocratique et Populaire

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Ministère de /'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

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n --;vètsité de JLTEL

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Faculté des Sciences Exactes et Sciences de la Nature et de la Vie Département de Biologie Moléculaire et Cellulaire

Mémoire de Fin d'Etudes en vue de L 'Obtention du Diplôme d'Etude Supérieur (D.E.S)

Option : Biochimie

rtnème

Etude physico-chimique des flavonoïdes

~é<Par:

Benhamada Nadia

Benhamioud Samira Benhamioud Houda

Nous remercions et fouons <Dieu qui nous a âonné fa force, fa

<Patience et (a 'Vofonté tout au Collfj âes années âe nos étuâes et nous a honoré âe sa science pour

La réaûsation âe ce tra·vai{ âe recliercfie.

Nous tenons au terme âe ce tra'vai{ à exprimer Notre p{us granâ remerciement à monsieur 1(Œ/BJ<ECJ{Œ

;Moliameâ

Qui a suivi et âirÎfjé notre tra·vai{ a'vec patience et 6eaucoup CD' intérêt, nous {ui.s exprimons ·vi-vement

notre granâ respect.

Notre remerciement s'aâresse égaCement au~mem6res

C])e jury â a·voir accepter âe juger notre tra·vai{

Sans ou.6Cier Ces professeurs âu âépartement âe 6io{ogie Pour Ceurs efforts et Ceurs sincérité.

l

1

SOMMAIRE

Sommaire

Introduction ......... ... 1

CHAPITRE 1 Métabolisme des plantes

1-1- Définition ••.••••••••••••••••••••••••.•••••..•••••.•...••••••••••••••••••••..••••••••••••••••••••• 3 I- 2-Classification des métabolites secondaires ••••••••••••••••••••••.•.•••••••••••••••••••••••• 3 1-2-1-Les alcaloïdes ••••••...••.•.•.••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••...••••••••••• 3

I-2-2-Les terpénoïdes ••.•...•..•..••••••••••••••••••••••••••••••••••••.••••.•.•••.•.••.••••••••••••• 4 1-2-3-Les polyphénols •...•.••••.•••.••••••••••••••••••••••••••••.••••••••••••••.••••••••••••.•••••••• 5

CHAPITRE II Les flavonoïdes

11-1-l)éfinition •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 6

II-2-Distribution et localisation ••...•••.•••••••••••••••••••••••••••••••.••••.•••••...••••••• 6 11-3-Classification des flavonoïdes .•...•...•.•...•.•••.••.•.•....• 7 II-3-1- Chalcones et aurones ...•.•..•••.•••.•..••...•..•.. 9 11-3-2- Flavones et flavonols ••••••••••••••••••••.•••••....•..•••••..•.•.•••••••••••••••.•..••• 9 11-3-3- Flavanones .••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.•.•.••.•••.•..•.•.••••.••••.. 10 11-3-4- Isoflavones •••••••..•...•••••.••..•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.•.... l 0

1

II-3-5- Flavane-3 ols ••.••••....•.•.••••••••••••••••••••••••••••.•.•.•••...••••••••••••••....• 10 11-3-6-Les Anthocyanes ••.••••••••••.••.••••••••••••••••••.•••..•...•••.••••••••••••••... 11 11-4-Biosynthese des flavonoïdes .•••..•••••••••••.••••••••••••.•••...•••••••••••••••••••••••••...• 12 II-5-Metabolisme des flavonoïdes ••.••...•...••••..•••••...•.•••...• 12

CHAPITRE ID Propriétés physico-chimiques des flavonoïdes

111-1-Solubilité et extraction •.••••••••.•.•••••••••••.••••••••••...•••.•••.•.••....•...••••••••.. 14 III-2-Identification et dosage ...•..•.•.•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.•... 16

III-2-1-Chromatographie sur couche mince •.•••••.•••••••.•••••••••••••....••••••..•••••• 16 III- 2-2-La séparation par Chromatographie liquides à haute performance CLHP

et par électrophorèse capillaire ••••••••••••••••••••••.••••••••••••••••..•..••••••••••••••••••....•• 18 111-2-3-Analyse spectrale UV-Visible ••.•••••••••••.••••••••••••••••••••••••••••....••••• 18

III- 2-3-1-Absorption en milieu méthanolique neutre ••••••••••••...•..•.•••.•.•••• 18 III- 2-3-2-Spectre en présence d'acétate de sodium anhydre .•..••••••••••....•••• 21 III-2-3-3-Spectre en présence d'acétate de sodium et d'acide borique ••••••.•••• 21 III- 2-3-4-Spectre en présence d' Al Ch/ HCI. ••••.••••••••••••••••••••••.••••••••••• 21 III-2-3-5-Spectre en présence de soude ....•..•..•.•..•••••.•••••••••••••••••••••••• 22 111-2-4-Dosage colorométrique ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 24 III-3-Lumière ••...••.••••.•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.••• 24 111-4-Température ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 25 III-S-pll ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 25

111-6-Complecxation métallique •••••••••••••••.••••••••••••.•••••••••••••••••••..•...•••••••••••• 27 III-7-Complexation moléculaire ••••••.•••.•••••••••••••••.••••••••••••••••••••••••••••.•••...••••• 28 III- 7-1-Complexation flavonoïde-protéine ••••••••••••••••••••••••••••••.••••••••••••••• 28 III- 7-2-Complexation flavonoïde-flavonoïde ••••.•••••••••••••••••••••••••••••••.•.•••• 29 III-8-Nucléophilie ••••••••••••••..••.••...•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••...••• 29 III-9-Electrophilie ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.••••••••.•••••••••••••••••••••••••....•• 3 0 III-10-Propriétés redox des flavonoïdes ••.••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.... 31

III-10-1-Propriétés antioxydantes •••.••••.•••••••••.•••••.•.••..••••.••.••••••••••••..•.•...••••••••••••••• 31 IIl-10-2-0xydation ••.••••••••••••••••••••••••••••.•••••••••••••••••••••••••••••••..•.••••••• 32 III-10-3-Autooxydation •••..••••••••••••••••.••••••••••••••••••••••••••••••••••••.•••...•• 32

CHAPITRE IV Propriétés biologiques et pharmacologiques

IV-1-Rôle biologique •••••••••••.•.••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••..••••••• 3 8 IV-2-Popriétés pharmacologiques ••.••••••••.•••••••••••••••••••.•••.•.•....•..•...•....•.•..••• 3 8 IV -2-1-Effets anticancéreux ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••..•• 3 8 IV-2-2-Effets anti-allergiques •••••••••••.••••••••••••••••.••••••••••••••••••••••••••••.•.•.•• 38 IV-2-3-Effets anti-inflammatoires ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.. 39 IV-2-4-Effets anti-ulcérogénes •••••••••••••••••••.••••••••••••••••.•.•.•••..••.•••••••••••• 39

IV-2-5-Effets protecteurs vasculaires •••••••••••••••••••••••••.•••••••••••••.••••••••••••••. 3 9 IV-2-6-Autres effets pharmacologiques ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 40 Conclusion ... ... 41 Références bibliographiques.

1 Liste des abréviations

ABTS⁰+

Acide3- éthylBenzoThiazoline-6-Sulfonique.

ADN Acide DésoxyriboNucléique.

'

^{Arg ATP} Adénosine Tri-Phosphate. ^Arginine.

CLHP Chromatographie Liquide à Haute Performance.

EOR Espéces Oxygénées Reactives.

Fe++ Ions ferreux.

'

^Fe+++ Ions ferriques.

Fl-0° Le Radical flavonoxy.

FI-OH Les flavonoïdes.

1

^H+ _H202 ^Proton.

Péroxyde d'hydrogéne.

1

HR Hydroxyléthyl Rutoside.

HSV L 'herpés Simplex Virus.

LDL Low Density Lipoprotéine.

Lys Lysine.

Me _o- Méthyle.

02 anion superoxyde.

OH⁰ Radical Hydroxyl.

PAF Platel et Activating Factor.

QH2 Noyau catéchol.

Rr Retardation Factor.

Ro Radical.

R00° Radical péroxyde.

ROS Reactive Oxygen Species.

TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity.

Trp Tryptophane.

Tyr Tyrosine. UV Ultra -Violet.

VRS Virus Respiratoire Syncytial.

xo

Liste des figures

1

Figure 1: Structure de quelques alcaloïdes , codéines et morfines ••••••••.•..•...•.•••••••••• .4 Figure 2: Structure de quelques terpénoïdes ... ... .. 4 Figure 3: Structure de quelques polyphénoles ... ... ... 5 Figure 4: Structure générale des flavonoïdes ...... 6

Figure 5 : Représentation strucurale de butéine et aureusidine •••••••••••••••••••••••••••••••••••• 9 Figure 6: Représentation structurale d'apigénine et quercétine •••••••••••••••••••••••••••••••••••• 9 Figure 7: Structure de naringénine ... ... . 10 Figure 8: Structure d'un isoflavone (génistéine ) •••••••••.••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 10

Figure 9:Structure de catéchine ... 11

Figure 10: Structure d'anthocyanidine sous forme de cation

Flavy lium ... ..... .... 11 Figure 11: La biosynthèse des flavonoïdes •••••••••••••••••••••••••••.•••••••••••••••••••.•••••• 13 Figure 12: Protocole expérimental d'extraction des flavonoïdes •••••••••••••••••••••••••••••• 15

Figure 13: Les chromophores cinnamoyle et benzoyle ••.•••.•••••••••....•.•.•••••••••.•.••.• 19

Figure 14: Différents déplacements possible en présences des différents

Réactifs ... 2 0 Figure 15: Sites de chélation de l'acide borique avec les flavonoïdes ••••..•...••.•.•.•.... 21

Figure 16: Sites de chélation de chlorure d' Aluminium avec les flavonoïdes .•••••....•..•.• 22 Figure 17: Sites de chélation de l'aluminium avec les flavonoïdes •••••.••••••••••••••••••••••... 24

Figure 18: Forme en équilibre des anthocyanes glycosides en solution

aqueuse (pH 1 à 6-7) ... 26 Figure 19: Complexation métallique des flavonoïdes .•••••.••...•••••••••••••••••••• 27 Figure 20: Premiéres étapes de la copolymérisation de la

catéchine et de l'éthanal ... ..... ... 30

1

1

'

Figure 21: Réactivité électrophile des anthocyanes (ion flavylium) ••••••...•...•.•••••••••••.••.• 30 Figure 22: Piégeage des ROS (R ⁰⁾ par les flavonoïdes ••••••••••••••••••••••..•.•..••••••••••• 31 Figure 23: Oxydation des flavonoïdes présentant un noyau catéchol et principales

réactions des formes oxydées ....... 32

Figure 24: Valeurs de TEAC montrant l'importance du groupement catéchol au niveau du cycl B pour l'activité antioxydante

des flavonols .... ... . 3 5 Figure 25: Vleurs de TEAC indiquant l'importance du groupe 3-0H en

combinaison avec la double liaison C2-C3 ••••••••••••••••••••••••••.•••••••••••••. 36 Figure 26: Comparaison de l'activité antioxydante des différents 3,5,7,3',4'

Pentahydroxyphénols ... ... 3 6 Figure 27: Influence de la glycosylation sur l'activité antioxydante des flavones et

Flavanones ...... 3 7

Figure 28 : Eléments essentiels pour l'activité antioxydant des flavonoïdes ...•..••••••••••••• 3 7

Liste des tableaux

Tableau 1 : Caractéristique structurales des principaux flavonoïdes •••••••••••••.••.••.••••. 8

Tableau 2 :Composition de quelques anthocyanes communs •••••••••••••••••••••...••••••• 11 Tableau 3 : Relation R₁structure ... ... ... 16 Tableau 4 : La relation entre la fluorescence sous UV

et structure des flavonoïdes ...... 17 Tableau 5 : Les principales caractéristiques des UV-visible des classes

Flavoniques ... ... . 20 Tableau 6 : Les principales caractéristiques des spectres UV-visible

1

1

1

INTRODUCTION

1

1

Introduction

Depuis longtemps, la vie de l'homme est étroitement liée au monde des plantes, ces derniers ont la capacité de produire des substances naturelles très diversifiees. En effet, à côté des métabolites primaires ( glucides, protides, lipides, acides nucléiq~es ), ils accumulent fréquemment des métabolites dits « secondaires » dont la fi nction physiologique n'est pas toujours évidente, mais qui représentent une source impprtante de molécules utilisables par l'homme dans différents domaines tels qu' en pharmacologie, en cosmétologie, en agroalimentaire ... (Macheix et al., 2005).

Les métabolites secondaires appartiennent à des groupes chimiques variés ; alcaloïdes, terpènes et composés phénoliques, ces composés peuvent être regroupés en de nombreuse classes, parmi les quelles se trouvent les flavonoïdes.

De nos jours, plus de 3000 flavonoïdes ont été identifiés, ils sont con idérés comme des pigments responsables de la coloration des fleurs, des fruits et parfois des feuilles où ils se localisent. Structuralement, les flavonoïdes se repartissent en plfsieurs classes de molécules, dont les plus importantes sont : les anthocyanes, les flavones, les flavanols, les isoflavones ... Les flavonoïdes se rencontrent à la fois sous forme libres (génines) ou glycosides (Marfak, 2003).

Les études de la réactivité des flavonoïdes dans leur environnement ~aturels

(fruits, le vin, le thé ... ) sont loin d'entre achevées, donc l'isolement phytochimique est indispensable pour mettre en évidence leur composition qualitative et quantitative par les méthodes de fractionnement et d'identification telles que la chromatographie sur fouche mine ou à haute pression (CLHP) et le couplage de CLHP avec des techniques physico- chimiques moderne (spectrométrie de masse, résonance magnétique). De nom~:euses

études ces méthodes ont montrés des changements structuraux en fonction de l' ac~Eité du milieu, température, lumière, leur solubilité dans l'eau et leur tendance à l' asso~iation

avec d'autres facteurs tels que les métaux (Fe+^2, Ai+^3, Cu+^{2 ... ),} protéines et d'autres composés flavoniques (Mazza et Brouillard, 1987).

Les flavonoïdes sont reconnus essentiellement pour leur action antioxyd'tflte en ayant une capacité à piéger et neutraliser les radicaux libres, cette action dépend Ue leur affinité pour les radicaux libres et donc de leur structure (Bruneton, 1993).

A

~ôté de cette propriété, ils sont également reconnus pour leur activité biologique. En elfet, de nombreuses études montrent qu'une alimentation riche en flavonoïdes est bénéfiq e pour la santé humaine par leur effet anti-inflammatoire, antiviral, anticancérogéne.. Mais actuellement on s'intéresse davantage surtout à l'interaction des flavonoïdes a ec les radicaux libres et à ses conséquences possibles en termes de prévention.

Cependant, si les flavonoïdes ayant des conséquences de grandes importan9es tant sur le plan physiologiques des plantes et alimentaire, une approche physicochimique de ces composés phénoliques est d'une grande utilité dans le but de mettre en évidence une relation possible entre leur activité et leur structure chimique, c'est-à-dire une rf lation structure-fonction, d'une part et la variation de cette relation en fonction des pr9priétés -physicochimiques des flavonoïdes de l'autre part. C'est dans cette optique que sf· nscrit notre travail bibliographique ayant pour objectifs essentiels : d'aborder l'origi e des flavonoïdes, la classification, les propriétés physico-chimiques, illustrés par des ex mples

1

1

1 1

IntroUuction

faisant référence au principales classes des flavonoïdes, ainsi de mettre en évid nce la relation entre les différentes structures de ces composés et leur fonction biologjque et pharmacologique.

- 2 -

1

l

Chapitre/ Métabolisme de \plantes

1-1-Définition

Le métabolisme (du grec: métabole, changement) (Hopkins, 2003): Elt toute transformation des composés chimiques grâce au quelles un organisme ou

chac~ne

^des

cellules gagne de l'énergie et construit sa propre substance (Gerhard, 1993). \

Les végétaux ont la particularité de présenter deux voies métaboliques : prij aire et secondaire.

• Le métabolisme primaire : Est l'ensemble des voies cataboliques et anaboliques fournissant l'énergie et les molécules nécessaires à la vie des plantes

co~me

^les

sucres simples, les acides aminés, les protéines et les acides nucléiques (métabolites primaires).

• Le métabolisme secondaire : Est l'ensemble des voies métaboliques pro~uisant des composés, généralement de faible poids moléculaire, qui n'ont pas de f?nction apparente et vitale pour l'organisme qui les produit, ces molécules sont appelées métabolites secondaires (Marouf et Joël, 2007).

Contrairement aux métabolites primaires ils sont chimiquement très divers. Pilus de 1 OO 000 métabolites secondaires ont été identifiés à partir de l'analyse de seulemeht 20 à 30% des espèces végétales (Meyer et al., 2004).

1-2-Classification des métabolites secondaires

1

Chaque végétal produit au moins une centaine de métabolites secondaires. Pn les classe en trois catégories principales selon leur structure : les alcaloïdes, les terpé:roïdes et les polyphénols (Meyer et al., 2004 ).

1

1-2-1-Les alcaloïdes

Les alcaloïdes sont des substances organiques azotés (Hans, 2007), présent dans tous les organes de nombreux végétaux (racine, tige, écorce, feuilles ... etc.). Co~binés

aux acides organiques ou complexés avec des tanins (Brigitte et al., 2007). Il~ sont généralement stockés dans les vacuoles (Meyer et al., 2004). En réalité, ces corrtposés aromatiques nitrés sont mieux connus par leur action sur l'homme et les animaux

q f

^{e par}

leur véritable fonction dans le métabolisme végétal (Zaffran, 1998).

• Ils ont un rôle de défense contre les prédateurs. 1

• Ils sont à la base de nombreuses molécules thérapeutiques, mais à plus forte dose, ils sont responsables d'effets toxiques (Marouf et Joël, 2007). \ Parmi l' alcaloïdes les plus fréquents, on cite : la nicotine, la caféine, la morphipe, la codéine ... (figurel).

- 3 -

1

1 1 1 1

1

1

1

1 1

1 1 1 1

l

J

Chapitre/

N- CH₃ H

Codeine

HO

0 ~

'"' ...

HO~'·"

H

Morphine

Figure 1: Structure de quelques alcaloïdes, codéines et morphines (Buchanan et al., 2000).

1-2-2-Les terpénoîdes

Les terpénoïdes sont des lipides stockés dans les laticifères, les canaux à rés· e, les membranes de thylacoïdes, la cuticule. En connaît environ 20 000, tous construits à partir d'un motif de base, !'isoprène de formule générale: (CH_{3) 2}-HC=CH-CH₃ Les molécules terpéniques soient cycliques ou non. Leur squelette carbonique re enne généralement un nombre d'atome de carbone multiplie par 5, par exemple CIO (Monoterpènes), Cl5 (sesquiterpènes), C30 (triterpènes) ... (figure 2) (Meyer et al. 2004

; Wilhelm, 1998).

• Les huiles essentielles : les dérivés terpéniques présents dans les uiles essentielles sont essentiellement des mono-, des hémi, et des sesquiterpènes, qui p uvent être peu ou très volatils. Ces huiles sont l'origine du parfum et du goût des plantel mais elle possèdent aussi des propriétés répulsives à l'encontre des insectes (Hopkins, 20 3 ).

• Caroténoïdes : sont des pigments jaunes, orange, ou rouges qui intervienn nt dans la photosynthèse (Zaffran, 1998).

OH

H

a. Farenésol (sesquiterpène)

b.Menthol (monoterp ne)

c.L' apocaroténal un dérivé de caroténoïdes

Figure 2 : Structure de quelques terpénoïdes (Buchanan et al.,2000 -4-

1 1

1 1

Chapitre/ Métabolisme

~plantes

1-2-3-Les polyphénols

Composés phénoliques ou polyphénols forment une grande famille de c mposés chimiques très divers de puis les simples acides phénoliques jusqu'aux grands po ymères complexes (tannins condensés). La structure de base est le phénol, un cycle aro atique hydroxylé produit principalement à partir de la phénylalanine et tyrosine ( opkins, 2003 ; Murray, 2008). Parmi les composés phénoliques, certains ont une structur simple C6-C3, comme les coumarines, ou du type C6-C3-C6, comme les flavonoïdes. 'autres sont des polymères complexes de type (C6-C3) n comme la lignine, ou de type C6-C3- C6)0 comme les tanins condensés (figure 3).

Les composés solubles comme les flavonoïdes glycosylés et les tannins sont stocklés dans les vacuoles, parfois dans les parois, alors que les composés insolubles coclme les flavonoïdes lipophiles sont stockés dans la cuticule et les canaux résinifères (MeyJr et al., 2004).

OH a. Acide p- coumarique

HOyYOH

OH

y

COOH

b. Acide galique (acide phénoli ue)

c. Tannin condensé

Figure 3 : Structure de quelques polyphénols (Macheix et al., 2005)

1

1

1

'

₁

Chapitre ^{II :}

Les flavonoïdes

1 1

1

Chapitre Il

11-1-Définition

Le nom flavonoïdes est dérivé du mot «jlavus» en latin, qui signifi jaune (Gerhard, 1993). Furent découvertes en1936 par"Hongrois Szent Gyogui" dans le zest de citron, à l'origine il donna aux flavonoïdes le nom de «vitamine P»en raison de leur efficacité à réduire la perméabilité des vaisseaux sanguins. Cette dénomina ·on fut abandonnée puisqu'elle ne correspond pas à la définition classique des vit mines.

(Bruneton, 1993). Mais ils sont considérés comme des micronutriments im~ortants

puisque ils peuvent jouer des rôles antioxydants ou posséder des propriétés biol?giques diverses (Millan, 2004).

Les flavonoïdes sont des pigments colorés ou incolores, largement répandus dans 1 règne végétal. Ce sont des composés polyphénoliques issus des métabolismes seconda· es des végétaux (Marouf et Joël, 2007). Ce groupe comporte plus de 3000 composés di férents (Bénédicte et al., 2003). La structure générale des flavonoïdes est caractérisée par un squelette de base à 15 atomes de carbone (C6-C3-C6) de type phényl-benz pyrane (figure 4) (Roman et al., 2006).

2 · 0:"

3' 6'

6

4

Figure 4 : Structure générale des flavonoïdes (Pascale et Véronique, 2006).

11-2- Distribution et localisation

Les flavonoïdes sont présents dans toutes les parties des végétaux supé ieurs : racines, tiges, feuilles, fleurs, pollens, fruits, graines noies certains flavonoïdes so t plus spécifiques de certains tissus. Le monde animal est lui aussi concerné par les flavo oïdes, on trouve par exemple de la chrysine, de la quercetine, de la galangine dans la p opolis des abeilles. Ils peuvent également se trouver dans les glandes à sécrétion odorifér te du castor (Domart, 1990).

Les formes hétérosidiques des flavonoïdes, hydrosolubles, s'accumulent d ns les vacuoles et, selon les espèces, se concentrent dans l'épiderme des feuilles ou se repartissent entre l'épiderme et le mésophiles (mais ces deux tissus peuvent ace muler spécifiquement des structures différentes, comme chez certaines céréales). Dans le cas des fleurs, elles sont concentrées dans les cellules épidermiques.

Lorsque les flavonoïdes sont présents au niveau de la cuticule foliaire, il s'agit presque toujours de génines libres dont la lipophilie est accrue par la méthylation p ielle ou totale des groupes hydroxyle, Cela concerne surtout des plantes des région ari es ou semi arides (Bruneton, 1993).

1

1

1

1 1 1 1

Chapitre li

II-3-Classification des flavonoïdes

L'ensemble des flavonoïdes, de structure générale en C15 (C6-C3-C6) col rend à lui seul plusieurs milliers de molécules regroupées en plus de dix classes dont c rtaines ont une très grande importance biologique et technologique. Les variations a eur du squelette chimique de baseC15 portent principalement sur 3 points :

1) Le degré d'hydroxylation des différents cycles.

2) Le niveau de méthoxylation (groupements O-CH3 à la place des seules fi nctions phénoliques).

3) Le niveau de glycosylation.

~

¹

On peut distinguer notamment dans les flavonoïdes : Anthocyanes, Flavones, Fl vonols, Flavanones, Isoflavones, Flavan-3-ols, Chalcones, aurones ... Dont les caracté ·stiques structurales diffèrent d'une classe à l'autre (Tableau 1) (Macheix et al., 2005). I

- 7 -

-

Chapitre II Les fla onoïdes

Tableau 1 : Caractéristique structurales des principaux flavonoïdes (Pascale et Véronique, 2006)

Position des substituant sur les cycles

composé Cycle A Cycle C Cycle B

5 7 3 4 ^{2' 3'} 4'

Flavones

Apigénine OH OH H 0 H H OH

Chrysine OH OHH 0 H H H H

Lutéoline OH OH H 0 H OH OH

Flavonols

Quercétine OH OH OH 0 H OH OH

Fisétine H OH OH 0 H OH OH

Myricétine

OH OH OH 0 H OH OH

Kempférol OH OH OH 0 H H OH

Morine OH OH OH 0 OH H OH

Isoquercitrine

OH OH 0-

0 H OH OH

glucose Rutine

OH OH 0-

0 H OH OH

ru tin ose Flavanones

Eriodictyol OH H H,H 0 H OH OH

Hespérétine

OH OH H,H 0 H OH OMe

Naringénine OH OH H,H 0 H H OH

Eriocitrine

OH 0-

H,H 0 H OH OH

rutinose

Hespéridine 0 -

0 H OH OMe

OH rutinose H,H Naringine

OH 0-

H,H 0 H H OH

néohesp Isflavones

Génistéine

OH OH Cycle

0 H H OH

B Daidzéine

H OH Cycle

0 H H OH

B Flavan-3-ols

( + )-catéchine

Et (-)- OH OH OH H,H H OH OH

Epicatéchine

1

5' ¹

1

1

H ^l

1 1

H H ₁

1

H ₁ H 1

OH H H ¹ H H

H H H H H H

H H

H 1

1

Chapitre II Les flJ onoïdes

Il-3-1- Chalcones et aurones

Les chalcones sont différentes des autres types de flavonoïdes par l' ouve re du noyau pyranique central, elles sont constituées par deux unités aromatiques rel ées par une chaîne tricarbonée cétonique, a, B insaturée (figure Sa) (Marfak, 2003). Les

sont des composés dont l'hétérocycle comprend deux atomes de carbones, (fi (Harbome, 1994).

HO

^OH

CH ~- OH

a. Chalcones (ex. : butéine ) b. Aurones (ex. :aureus dine) Figure 5 : Représentation structurale de butéine et aureusidine

(Pascale et Véronique, 2006)

11-3-2- Flavones et flavonols

1

\

1 Ces composés se caractérisent par la présence de la double liaison C2-C3 (F rmica et Regelson, l 99S).Et la présence de tous au moins trois hydroxyles phénoliques n CS, C7, C4', cela étant d'entre eux peut être absent (Marfak, 2003). En plus, les fla onols sont dérivés des flavones par l'addition d'un groupement hydroxyle en positi n C3

(Gérhard, 1993). \

La plus part des flavones et flavonols sont des pigments jaunâtres ou incolor~s ces derniers sont susceptibles de modifier la couleur d'une plante en formant des com~lexes

avec des anthocyanes et des ions métalliques. Ce phénomène, appelé copigmentati n, est réspensable de la couleur bleu intense des fleurs (Peter, 2000). Les flavo oïdes représentatifs de ces deux classes sont l'apigénine et la quercétine (figure 6a, 6b).

1

OH

HO

HO

HO 0

a. Flavone (ex. : apigénine)

OH OI

1

1

OH O

~

^\

b. Flavonols (ex. :quercéJe) Figure 6: Représentation structurale d'apigénine et quercétine

(Pascale et Véronique, 2006). 1

1

\

- 9 -

•

Chapitre II

11-3-3- Flavanones

Ces composés se caractérisent par l'absence de la double liaison C2-C3 (L e et al., 1994 ;Formica et Regelson,1995), et aussi l'absence de groupement OH en positon C3.

Les flavanones ont des fortes similitudes de structure avec les flavonols (Charle et al., 2003). La plupart des flavanones sont glycosylées en position C7 par le rutinose ou le néohespiridose et parmi les formes aglycones, l'ériodictyol (Pascale et Véronique,, 2006).

Les flavanones représentatif de cette classe est la naringénine (figure 7).

OH HO

Figure 7 : Structure de naringénine (Pascale et Véronique, 2006).

11-3-4- Isoflavones

\

\

\

\

\

Les isoflavones sont caractérisés par un enchaînement C 15 réarrangé selon un motif 1,2 -diphényl propanique (Bruneton, 1993). Ils sont dérivés par

cyclisati~n

^des

chalcones dans lesquels le noyau B est lié au C3 du noyau C (figure 8) (Hah brock, 1981 ; Lee et al., 1994). Plus de 90% sont sous forme glycosylées, mais ce s ¹ nt les fromes aglycones qui ont l'activité antioxydante la plus forte (Naim et al., 1974). ₁

OH 0

~

~OH

Figure 8: Structure d'un isoflavone (génistéine) (Pascale et Véronique, 2006).

11-3-5- Flavane-3 ois

\

\

\

\

\

On les désigne souvent sous le terme générique de catéchines (figure 9). Ils ne comportent pas de double liaison sur le cycle C. Ils sont abondants dans le chocolati noir, le thé, les fruits rouges, le raisin et les pommes (Bors et al.,1990). Les flavane-3 ols se forment à partir des flavanediols par une simple réaction non enzymatique en une étape (Pascale et Véronique, 2006).

Chapitre II Les4noida

OH

OH

HO

' o

OH H

Figure 9 : Structure de catéchine (Pascale et Véronique, 2006).

11-3-6- Les Anthocyanes

Le terme anthocyane dérive des mots grecs anthos (fleur) et cyanes (bleu . Il fut utilisé en 1835 par Marquart pour designer le bleu des fleurs (Shenoy, 199f ). Ces molécules sont capables d'absorber la lumière visible et colorent les plantes en bleu, rouge, rose, ou orange (Harbome, 1967 ; Brouillard, 1993).

Leur structure de base est celle du cation flavylium (sous frome de chromophore ouge), ou phényl-2- benzopyrylium (figure 10) (Pascale et Véronique, 2006). Ces cof posés phénoliques sont glycosylés, le plus souvent en position C3 et CS, les aglycones des anthocyanes sont des anthocyanidine (Wilhelm, 1998).

R=R'= H: Pélargonidine R=R'=OH: Delphinidine R=R'=OCH_{3 :} Malvidine R=OH, R'=H: Cyanidine

HO

OH

R

Figure 10: Structure d'anthocyanidine sous forme de cation flavylium (Buchanan et al., 2000).

1

\

\

Certains anthocyanes ainsi que leur anthocyanidines correspondantes sont répert riées dans le tableau 2.

Tableau 2: Composition de quelques anthocyanes communs (Hopkins, 2003)

violanine

malvidine oemne

- 11 -

1

1

Chapitre li Les flavonoïdes

11-4-Biosynthèse des flavonoïdes

Sur le plan cellulaire, les flavonoïdes sont synthétisés dans les chlor4plastes, certains quittent le chloroplaste et s'accumulent dans les vacuoles (Kawaltoxski et al., 2001 ). Les flavonoïdes dont le squelette moléculaire de base à une double origine :

1) 3 molécules <l'acétyle COA qui se transforme en malonyl COA, par l'acéty~e COA carboxylase pour le cycle A. (Pascal et Véronique, 2006; Gerhard, 1993).

2) Une molécule de para-coumaroyl COA issus d'une désamination de la phény alanine qui est essentiellement due à une voie bien connue de l'acide shikimique pour le cycle B et l'hétérocycle C (Pascale et Véronique, 2006; Bruneton,1993 ).

Donc l'étape de la formation des flavonoïdes est la condensation catalysée par le chalcone-synthase de 3 molécules de malonyle COA avec une molécule de para- coumaroyl COA, c'est alors à partir de la chalcone ainsi formée par cette condJnsation chimique vont être mis en place les flavonoïdes appartenant aux diverses claJses. La biosynthèse des différents groupes des flavonoïdes implique un ensemble com~lexe de réactions (figure 5), comprenant des hydroxylation, méthylation, reduction, glycosylation ... (Pascale et Veronique, 2006).

11-5-Métabolisme des flavonoïdes

Les flavonoïdes aglycones sont absorbés au niveau de l'intestin grêle, ta~dis que les formes glycosylées doivent être hydrolysés par la flore intestinale au niveau dp colon avant de pouvoir être absorbés (Crespy et al., 2001 ; Manach et al., 2004). Les po~ymères

non absorbés au niveau de l'intestin grêle sont également dégradés par la micro~ore en molécule plus simple qui sont aussi absorbés au niveau du colon (Deprey et al., 2000).

Les flavonoïdes qui traversent la muqueuse intestinale sont en majorité tr~sportés

jusqu'au foie via la veine, porte sous forme liée à l'albumine. Le foie a la cap~cité de modifier les flavonoïdes et leur métabolites : il peut les méthyler, réduire les groupements carbonyle de l'hétérocycle, changer le nombre et la position des groupements hydrpxyles, ou encore produire des dérives conjuguées avec un sulfate ou un acide glucoronique par des enzymes dites de conjugaison (Boukkenheuser, 1987).

Les métabolites ainsi formés atteignent leur tissu cible pour avoir un effet biolog~que ou bien être éliminés dans les urines et surtout dans la bile, une foie excrétées d~s cette dernière ces métabolites sont déversés dans le duodénum où ils sont soumis à l' act,on des enzymes bactériennes avec libération de nouveaux aglycones qui éventueVement pourraient être réabsorbés et subir ainsi une circulation antérohépatique permettant de maintenir une concentration non négligeable dans le sang (Hugues, 1996).

1

'

₁

Chapitre Il

i

Hydrates de carbone

Phénylalanine - - - - 4-Coumaroyl-CoA

Cha.Icone synthêmse

4 :2' :4' ~6'-tétrahydmxychakope

Chalcooe isomérase

t•lavanone

FLAVONE

CllALCONE

0

FLA V ANONE

0

FLAVONOL

Les flaronoïdes

AcétylCoA

i

MalonylCoA

_J

Ch.aloone synlhétasc + reductasc

4 ;2' ;4'-trihydroxychnlcoge

Chalcone isomérase

5-désoxyflavanone

ISOFLAVONE

0

3 ;4 dihydroxyOavane et 3 hydroxytla anc (PROA NTl IOCY AN ID INES) (CATECI IOLS)

l l

AN rJ-IOCYANES TANINS CONDENSES

Figure 11 : La biosynthèse des flavonoïdes (Remesy et al., 1996).

- 13 -

Chapitre ^{III :}

Propriétés physico-

chimiques des flavonoïdes

'

Chapitre III Propriétés physico-chimiques des flavonoïdes

L'étude physico- chimique des flavonoïdes a émergé comme celle de la plupart des produits naturels, leur importance relative dépend d'une meilleure connaissance des différentes modifications structurales de ces composés, sous l'effet de l'acidité du milieu, de température, de la lumière, de leur solubilité, de leur complexation métallique, et complexation avec les protéines. Généralement cette connaissance est déterminée par les méthodes spectrales, RMN ... etc. Mais avant d'élaborer cette étude l'extraction et la séparation phytochimiques sont indispensables.

ill-1-Solubilité et extraction

L'extraction des flavonoïdes est basée sur le degré de solubilité dans les solvants organiques, les aglycones moins polaires comme les isoflavones, les flavanones et les flavones hautement méthoxylés, sont plus solubles dans les solvants tels que l'éther et le chloroforme (Verykokidou-Vistaropoulou et Vagias., 1986) et les autres qui possèdent un nombre insubstitue de groupements hydroxyles ou de sucres sont des composés polaires, généralement solubles dans les solvants polaires (Benkrief et al., 1990).

Les hétérosides peuvent être extraits,· 1e plus souvent à chaud par de l'acétone ou par des alcools (éthanol, méthanol) additionnés d'eau. Il est possible de procéder à une vaporisation sous vide et, lorsque le milieu ne contient plus que de l'eau, on mettre en œuvre une série d'extraction liquide-liquide par des solvants non miscibles :

• Par l'éther de pétrole qui élimine la chlorophylle et les lipides.

• Par du diéthyléther qui extrait les genines libres.

• Par de l'acétate d'éthyle qui entraîne la majorité des hétérosides.

Les sucres libres reste dans la phase aqueuse avec le cas échéant les hétérosides les plus polaires. Alors que les flavonoïdes lipophiles des tissus superficiels des feuilles sont directement extraits par les solvants moyennement polaires ( dichlorométane) ; il faut ensuite les séparer des cires et des graisses qui sont extraites simultanément (Bruneton,

1993).

Et le protocole suivant (figure12) résume les étapes d'extraction des flavonoïdes commencent par le broyage de matériel végétal sèche, macération dans le méthanol puis filtration. Le mélange filtré soumis à une évaporation suivis par une reprise d'eau .et enfin une cascade d'extraction utilisant des solvants non méxibles.

- 14 -

-

1

'

₁

Chapitre III Propriétés physico-chimiques des flavonoïdes

Séchage Broyage

Phase éther de ··---~

pétrole

Evaporation à sec

Reprise par l'eau distillée

Extrait brut des différentes phases

Matériel végétal

i

Macération 72 heures

i

Filtration

•

Evaporation à sec

~ Reprise par l'eau

1

Décantation

i

Filtration et obtention de la phase aqueuse.

i

Affrontement par l'éther de pétrole.

Phase queuse

î

Affrontement

'\ ' - - - 4 par l'acétate d'éthyle

Phase aqueuse.

Affrontement par le n-butanol

Phase aqueuse

Figure 12: Protocole expérimental d'extraction des flavonoïdes (Bruneton ,1993).

Chapitre III Propriétés physico-chimiques des flavonoïdes

ID-2- Identification et dosage

La séparation et la purification des différents constituant sont fondées sur les méthodes chromatographique habituelles (chromatographie sur couche mince, ou sur papier). La chromatographie sur colonne est utile et simple pour l'isolement. La chromatographie liquide à haute performance (CLHP) permet des séparations efficaces de tels produits polaires. Les adsorbants les plus utilisés sont : le polyamide, la cellulose, la silice et les solvants d' élution (Bruneton , 1993).

ID-2-1 Chromatographie sur couche mince

La séparation par chromatographie sur couche mince de l'échantillon est réalisée sur une fine couche (100-200 µm) de phase stationnaire, généralement à base de gel de silice, déposée sur une plaque rectangulaire de verre, de plastique ou d'aluminium, et de phase mobile qui migre par capillarité à travers la phase stationnaire sèche, entraînant à des vitesses différentes les constituants à séparer. La localisation des composés après migration se fait sur la plaque débarrassée de l' éluant, chaque composé est défini par son Rr (abréviation de < < retardation factor > >) qui correspond à sa migration relative par rapport au solvant : (Rouessac, 2006)

Distance parcourue par le soluté R = ~~~~~~~~~~~~~

f Distance parcourue par le soh-ant

a-Relation Rrstructure

Le comportement chromatographie des flavonoïdes en fonction de leur structure dans un solvant alcoolique ou aqueux, nous permet de mentionner les premiers indicateurs concernant la substitution du squelette de la molécule flavonique.

Quelques exemples de la relation Rrstructure sont illustrés dans le tableau 3.

Tableau 3 : relation Rr structure (Markham, 1989)

Structure Oavonique Rr

Augmentation des groupements Diminution du Rr hydroxyles

Glycosylation Rr augmente dans un solvant aqueux.

Rr diminue dans un solvant alcoolique. Hydroxyle méthyles Augmentation du Rr dans un solvant

alcoolique.

Méthylation d'un hydroxyle en C5 Rr diminue en solvant alcoolique Hétérosides des flavonols avec 3-0H Rr nul dans l'eau

libre.

- 16 -

Chapitre III Propriétés physico-chimiques des flavonoïdes b-Relation fluorescence-structure

L'examen des pigments flavoniques en lumière ultraviolette est certainement l'un des procèdes les plus utilisés pour la détermination de la structure, il fournit des informations très importantes sur la configuration structurale des molécules isolées. En dehors des isoflavones tous les composés flavoniques apparaissent en UV sous formes de spots colorés dont certains sont fluorescente (tableau 4) (Lahoual, 2005).

Tableau 4 : La relation entre la fluorescence sous UV et structure des flavonoïdes (Markham, 1989).

Spot coloré Type des flavonoïdes

Flavonols 5, 6,7 tri-OH libres

Noir, marron Flavonols 5, 7,8 tri-OH libres

Flavones 5-0H et 4'-0H.

Flavones 3-0H et 5-0H, 4'-0H.

Flavones ou flavonols 5-0H avec 4' -OH

Violet absent ou substitué en 3.

Flavones 6 ou 8-0H.

Chalcones, isoflavones, dihydroflavonols, flavanones.

Brun- noir 3-0H absent ou 3-0H substitué.

Flavones sans 5-0H libres.

Bleu Clair (fluorescent) Flavonols sans 5-0H libres avec 3-0H substitué.

Flavonols 3-0H libres avec ou sans 5-0H Jaune terne, fluorescence orangée

substitué.

Jaune, vert brillant 5-0H libres ou 5-0H substitué

Jaune fluorescent Flavonols avec 3-0Hlibre

Jaune pale Dihydroflavonols

Chapitre III Propriétés physico-chimiques des flavonoïdes ill-2-2- La séparation par Chromatographie liquide à haute performance

CLHP et par électrophorèse capillaire

La séparation des flavonoïdes est basée sur les polarités respectives des phases stationnaires utilisées, du solvant d' élution et de ces composés, en particulier leur degré d'hydroxylation, de glycosylation et de méthylation. A partir de ces principes généraux, deux approches analytique sont possibles : d'une part la chromatographie de composés peu polaires sur une phase stationnaire de silice avec élution par un solvant apolaire de composition constante (par exemple un mélange heptane -éthanol), d'autre part ce qui est le plus utilisé dans le monde des flavonoïdes, la fixation de ces composés sur une phase dite inverse (par exemple de la silice sur laquelle on a préalablement greffé de chaînes aliphatiques apolaires) suivie de leur élution par un mélange de solvants (fréquemment eau/acide acétique/acétonitrile ou eau méthanol ) dont on fait varier la composition , donc la polarité avec le temps de l'analyse. Les composés élués sont généralement repérés à la sortie de la colonne par leur absorption en lumière visible pour les anthocyanes (vers 520nm), chalcones, aurones ... et en ultraviolet pour les autres (280, 325ou 360). La surface de chacun des pics et proportionnelle à la concentration du composé qui est alors dosé à la longueur d'onde choisie pour l'analyse par référence à des composés témoins (Macheix et al., 2005)

A côté de la CLHP, une autre technique de séparation performante est l'électrophorèse capillaire (EC) développée depuis une dizaine d'années pour ce type de molécule (Tomas-Barberan, 1995). La séparation est dans ce cas influencée par de nombreux paramètres dont la taille de la molécule, le nombre, la position et le pk des groupements hydroxyles, le degré et la nature des glycosylation, le pH et la concentration du tampon d' élution, etc. Elle conduit donc à des séparations différentes de celles obtenues par CLHP et trouve de très belles applications dans la séparation des nombreux glycosides des flavonoïdes (Macheix et al., 2005).

ill-2-3 Analyse spectrale UV-visible

C'est une technique qui permet de compléter les informations apport par le comportement chromatographique et la fluorescence du produit à identifier (Markham,

1989).

2-3-1 Absorption en milieu mèthanolique neutre

a. Flavonoïdes possédant de carbonyle dans leur hétérocycle

Il est reconnu que Le spectre des flavones et flavonols présent deux bandes d'absorption dans la région ultraviolet-visible :

- Bande 1: entre 230 à 385 nm, attribuée au chromophore cinnamoyle résultant de la conjugaison du noyau B avec le carbonyle (figure 13a).

- Bande II : située entre 240 à 280 nm, attribuée au chromophore benzoyle résultant de la conjugaison du noyau A avec le carbonyle (figure 13b).

- 18 -

Chapitre Ill Propriétés physico-chimiques des jlavonoides

b.benzoyle a. cinnamoyle

Figure 13: Les chromophores cinnamoyle et benzoyle.

Pour les flavonols , une augmentation dans le nombre de groupe hydroxyles sur le cycle B induit un déplacement de la bande 1 de 3 nm à 10 nm,par exemple, la longueur d'onde d'absorption de la galangine (aucun groupe OH sur le cycle B), de kaempférol (un groupe OH en position 4'), et de la quercétine (deux groupes OH en position 3' et 4') sont respectivement 3S9nm, 364nm, 367nm, Le tableau S représenté des spectres UV- visible des différent classe flavoniques.

La position de la bande 1, permet de distinguer la structure flavonol de la structure flavone, toute augmentation du nombre de OH sur le noyau B, s'accompagne d'un effet bathochrome (figure 14) de la bande 1; d'autre part, la bande Il, pic unique vers 270 nm pour un noyau B monosubstitué ou non substitué se transforme en pic vers 2S6 nm, et un épaulement vers 272 nm pour le noyau B di ou tri substitué (Markham, 1989).

En ce qui concerne le noyau A, en général dihydroxylé en CS et en C7, dans le cas des flavonols:

• L'introduction d'un OH en CS, produit un effet bathochrome de 13 à 16 nm de la bande 1, avec apparition d'un pic d'absorption supplémentaire à 330 nm.

• L'introduction d'un OH en C6, produit un effet hypsochrome (figure 14) d'environ 8 à 10 nm, effet annulé si ce même carbone est méthylé.

• La substitution de OH en C7 n'a aucune incidence sur le spectre UV, par contre celle de OH en CS s'accompagne d'un effet hypsochrome de 6 à 7 nm de la bande 1 .

• La perte de OH en CS, entrâme un effet hypsochrome de 6 nm de la bande I, la diminution de la bande Il, et l'apparition d'un maximum secondaire aux environs de 320 nm (Markham, 1982).

b. Flavonoîdes ne possédant pas de carbonyle dans leur hétérocycle

L'analyse structurale des anthocyanes par spectrophotométrie UV-visible est certainement la plus répondue, deux bandes d'absorption distingues: une bande dans la région des UV 260-280 nm, et une autre dans la région du visible 490-520 nm. La longueur d'onde maximale dans le visible est liée de prés aux groupements hydroxyles des anthocyanes et leurs monoglucosides montrent donc des longueurs d'ondes maximales plus basses d'environ 10 à 15 nm.

La nature de sucre substitué n'affecte pas le spectre. Toute fois, des informations sur le groupement substitué par glycosylation de l'anthocyane peuvent aussi être obtenues grâce aux données spectrales. Un 3-glycoside et 3,5-diglycoside possèdent un maximum

-

Chapitre III Propriétés physico-chimiques des flavonoïdes

d'absorption similaire, mais montrent des différences dans la région 400-460 nm (Pascale et Véronique ,2006).

Tableau 5 : Les principales caractéristiques des UV-visibles des classes flavoniques (Markham, 1982).

Bande II (nm) Bande 1 (nm)

250-280 304-350

250-280 330-360

250-280 350-385

245-270 310-330

(Epaulement pic à 230)

275-295 300-330

230-270 Epaulement

(faible intensité) 340-390 230-270

270-280

t

380-430 465-560

•ffet hyperchrome

effet hyp-sochrome (se déplace vern le bleu, UV)

t

Type de flavonoïdes Flavones

Flavonols substitués en 3 Flavonols

Isoflavones

Isoflavones ( 5-désoxy 6-7- di-oxygénes)

Flavanones et dihydro- flavonols

Chalcones Aurones Anthocyanes

ffe:t bathochrome

(se déplace vers le ro09e. IR•

-

AE ...--1---1---~ i. (nm>

, .

^{AE. éoer0te} déaoissa te

Figure 14: Différents déplacements possibles des flavonoïdes en présences des différents réactifs (Markham, 1982).

- 20 -

Chapitre III Propriétés physico-chimiques des flavonoïdes

ID-2- 3-2 Spectre en présence d'acétate de sodium anhydre

L'acétate de sodium, base faible ionise les hydroxyles les plus acides, situés en C3, C7 et C4' (Jurd, 1962). D'après l'étude de Mehibel sur les extraits de Rosmarinus officinalis.L et quecus suber.L, un déplacement bathochrome de la bande II des flavones et des flavonols de 8 à 20 nm traduit la présence d'un OH en C7 (Mehibel,2006).

ID-2-3-3 Spectre en présence d'acétate de sodium et d'acide borique

En présence d'acétate de sodium, l'acide borique forme des complexes chélatés avec les composés ortho -hydroxyles sur le noyau B (figure 15), de se fait, on remarque un, déplacement bathochrome de 12 à 20 nm de la bande I par rapport au spectre méthanolique (Markham, 1982).

OH

0 ₀

Figure 15: Sites de chélation de l'acide borique avec les flavonoïdes (Markham , 1982)

ID-2-3-4-Spectre en présence d' Al Ch/ HCI

Les flavonoïdes avec cette propriété chélatantes, peut former des complexes stables (carbonyle en C4, OH enC5 ou/et en C3), ou labiles (deux OH en position ortho) (figurel6) (Mabry,1970).

On compare dans un 1er temps le spectre enregistré en présence de A1Cl3 puis en présence d' AIC13 + HCl : un déplacement hypsochrome de la bande I provoqué par l'addition d'acide est significatif d'un système orthohydroxylé dans la molécule.

Dans un 2eme temps, on compare le spectre relevé en présence de AlCh + HCI à ce lui dans la solution méthanolique : un déplacement bathochrome de 40 à 50 nm de la bande I, traduit la présence d'OH libre en CS, et témoigne d'une structure de type flavone ou de méthyl-3-flavonol, dans le cas des méthyl-3-flavonols, un substitution (par OH ou O- CH3) en C6 limite l'effet bathochrome à 20 nm, cette règle ne s'applique pas aux substitution en C8 (Markham, 1982).

Chapitre III Propriétés physico-chimiques des flavonoïdes

~OH

OH

( ^/-~ _I) ^_oy·V

y

⁰

°'

^{' Af '}

:'

Cl/' ., Cl

Figure 16: Sites de chélation de chlorure d' Aluminium avec les flavonoïdes (Markham, 1982)

ill-2-3-5-Spectre en présence de soude

C'est une base forte qui provoque l'ionisation de tous les OH du squelette flavonique.

Les flavonoïdes très hydroxylées, sont instables en présence de cette base, les informations structurales qu'il fournit sont les suivants :

• Un effet bathochrome de 45 à 65 nm de la bande I sans diminution de son intensité par rapport au spectre méthanolique, est en faveur d'un OH libre en C4'sur un squelette flavone ou flavonol (Markham, 1982).

• Un déplacement de l'ordre de 50 nm accompagné d'un effet hypsochrome pour les flavonols présentes un OH substitué en C4'.

• Les flavonols dont les OH en C3 et en C4' sont libres, présentent une instabilité rapide ou lente, la vitesse de décomposition est d'autant plus croissante que les

composés sont plus substitués (Mehibel, 2006).

- 22 -

1

Chapitre III Propriétés physico-chimiques des flavonoïdes

Tableau 6: Les principales caractéristiques des spectres UV-visible des flavonoïdes en présence des différents réactifs (Markham, 1982).

Réactif

MeOH

NaOH

AICh+MeOH

AICh+HCl/MeOH

NaOAc/MeOH

NaOAc + H₃B03' MeOH

Déplacement en nm Interprétation Bande 1 Bande II

310-350 330-360 350-380

250-280 Flavones

250-280 Flavonols (3-0H substitué) 250-280 Flavonols (3-0H libre) +45 à60 BI avec stabilité 4'-0H Markham (1982) d'intensé

+50 à60 avec diminution 3,4'-di OH d'intense

Faible déplacement avec 4'-0Me diminution d'intensité

Absence de pic entre 320- 7-0R 335

Apparition d'un pic entre 7-0H BI et BII

Transformation de BI en 5-0H (seul hydroxyl libre) une inflexion

+20 à 45 +60 -30 à45 -10 -20 +35 à 55 +17 à 20 +20 à 80

Déplacement très faible Diminution d'intensité avec le temps.

Spectre se décompose avec le temps

+12 à 36 +5à10

5-0H 3-0H 3',4'-di OH 3',4'-0H, OMe 3',4',5'-tri OH 5-0H

5-0H 7-0H 7-0R

6,7; 7,8 ou 3',4'-di OH 5,6,7 ; 5,7,8

Ou 3,3', 4'- tri OH 3',4'-di OH

6,7 ou 7,8- di OH

Chapitre III Propriétés physico-chimiques des flavonoïdes

ill-2-4- Dosage colorométrique

Le taux des flavonoïdes à été déterminé par la méthode de réactivité avec l' AlCh comme décrit par (Bahorum et al, 1996).

En solution étanollique, le chlorure d'aluminium forme un complexe avec les composé flavoniques qui peut être stable (carbonyle en C4, OH en CS et / ou en C3), ou labile (20H libre en position ortho) (figure 17).

cççO

^Al+3

eççO

q ¹ +2

0 OH

'Al

çyO

^Al+3

wo

\ / :2

OH 0

A1

Figure 17: Sites de chélation d'aluminium avec les flavonoïdes.

Ce dosage utilise le spectre d'absorption de ces composés, soit dans le visible pour les anthocyanes, soit dans l 'UV pour la plupart des autres composés. La concentration de ces composés en solution est déduite en utilisant la loi de Beer-Lambert qui lie cette concentration C en mol/Là la densité optique DO mesurée sur le spectre d'absorption:

DO= ECd

Où E est le coefficient d'extinction molaire du composée considéré à la longueur d'onde utilisée pour la mesure et où d représente la largeur de la cuve de mesure (en cm) .A titre d'exemple en solution éthanolique, E est égal à 24500 pour la quercétine à 364nm (Macheix, 2005).

ill-3-Lumière

Les rayonnements solaires stimulent la réaction de fabrication de flavonoïdes plus l'ensoleillement augmente, plus les teneurs en flavonoïdes augmentent, surtout dans les parties les plus exposées. La lumière porte sur l'induction de la synthèse de plusieurs enzymes du métabolisme des flavonoïdes (Macheix et al, 2005).

Elle agit directement, par l'intermédiaires des radiations rouges, bleues, et UV. Généralement les flavonoïdes absorbent en UV et certains d'entre eux absorbent

- 24 -