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Identification de protéines impliquées dans la dynamique des corps lipidiques chez S. cerevisiae

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Academic year: 2021

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HAL Id: hal-02752193

https://hal.inrae.fr/hal-02752193

Submitted on 3 Jun 2020

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Identification de protéines impliquées dans la dynamique des corps lipidiques chez S. cerevisiae

Marie Pouteaux, Michel Canonge, Thierry Chardot, Marine Froissard

To cite this version:

Marie Pouteaux, Michel Canonge, Thierry Chardot, Marine Froissard. Identification de protéines impliquées dans la dynamique des corps lipidiques chez S. cerevisiae. Levures, Modèles et Outils IX, 2010, Strasbourg, France. 2010. �hal-02752193�

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Identification de protéines impliquées dans la dynamique des corps lipidiques chez S. cerevisiae

Marie Pouteaux, Michel Canonge, Thierry Chardot, Marine Froissard

Équipe Dynamique et Structure des Corps Lipidiques, UMR 1318 Institut Jean-Pierre Bourgin, INRA AgroParisTech, 78 850 Thiverval-Grignon

Étude de la dynamique des corps lipidiques (CL) chez Saccharomyces cerevisiae

Corps lipidiques

Au sein de la cellule les lipides ont à la fois un rôle structural, un rôle dans la signalisation et un rôle énergétique. Ils peuvent être stockés dans des granules de réserve, les corps lipidiques qui sont constitués d’un cœur de lipides neutres (triglycérides) (1), entourés par une monocouche de phospholipides (2) et par des protéines (3). Ces réserves peuvent être mobilisés en cas de besoins nutritionnels. Le corps

lipidique apparaît aujourd’hui comme un organite complexe et dynamique, présentant des statuts métaboliques variés.

BY4741

Nomarski Lumière visible BODIPY 493/503 épifluorescence

INTRODUCTION

RESULTATS

Protéomique du CL de S. cerevisiae

Sélection de 2 gènes

Analyse de la teneur en acides gras des mutants délétants et sur-expresseurs par

Chromatographie en Phase Gazeuse

Localisation de Ypt7p

Création de mutants de délétion, de sur-expression et étiqueté par recombinaison au locus

191 97 64 51

28

14

6

Cassage des cellules par broyeur de

cellules (one shot)

• Fractionnement cellulaire

Gradient de saccharose

Ultracentr i-fugation

Culture Ypt7-RFP

Western Blot anti-RFP

• Microscopie

CL

Après l’ultracentrifugation, les CLs sont récupérés. On délipide les protéines associées aux CLs, on les précipite et on les concentre. On analyse ensuite ces protéines par SDS-PAGE puis on détecte notre protéine d’intérêt par Western-Blot.

YPT7-RFP

Profils protéiques des CLs en fonction du stade de croissance des levures

*

* ° °

WT YPT7-TEF

191 97

64 51

28

14 19 39 kDa

kDa

La carence azotée favorise l’accumulation des lipides de réserve

Le mutant TEF-YPT7 présente la plus forte augmentation en acides gras totaux (proche des mutants de lipase)

Des modifications des profils protéiques importantes apparaissent entre la phase exponentielle de

croissance et la phase stationnaire chez la souche le sauvage. Ces modifications n’existent pas chez le

mutant qui ressemble dans les deux cas au témoin en phase stationnaire.

*

° Culture en phase stationnaire

Culture en phase exponentielle de croissance

Un gène bien connu, codant pour la lipase majoritaire du CL, TGL3, qui nous servira de témoin positif pour notre gène d’intérêt YPT7 codant une protéine de type Rab.

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

La protéine de trafic de type GTPaseYpt7p est associé aux CLs en phase stationnaire en carence azotée chez S.

cerevisiae.

La délétion et plus encore la sur-expression de YPT7 permet l’augmentation de la teneur en acides gras totaux des levures.

Vérification de l’augmentation de lipide neutre par Chromatographie sur Couche Mince en cours

La sur-expression de cette protéine influe sur le profil protéique des CL et ceux-ci quelque soit le stade de croissance des levures.

Induit une perte de la dynamique des CLs?

S. cerevisiae Y. lipolytica

60 protéines (b) 80 protéines (c) Pas de protéines de structure identifiées

Nombreuses enzymes (voie Kennedy)

Gène cible

souche Teneur en acides gras totaux Carence carbonée

Relatif à la souche de référence

Teneur en acides gras totaux Carence azotée

Relatif à la souche de référence

Modificatio n profil acides gras

TGL3 TGL3 1.18 1.64 oui

TEF- TGL3

1.13 Pas de croissance oui

GPD- TGL3

1.09 1.42 non

YPT7 YPT7 1.19 1.35 oui

TEF- YPT7

1.30 1.41 oui

GPD- YPT7

1.15 1.01 non

Extraction des protéines de la fraction flottante Cellules +

saccharose 1,08M saccharose 0,27M saccharose

0,185M

Tampon seul

Les observations microscopiques sont réalisées sur des cultures en milieu carencé en azote de Ypt7-RFP en phase stationnaire. A noter la fragmentation des vacuoles observée indiquant le disfonctionnement du cycles des GTPases.

On retrouve du signal RFP aux mêmes localisations que le Bodipy 493/503 par microscopie à

fluorescence. On observe également un signal RFP en Western Blot sur la fraction flottante contenant les CLs. On en conclue donc que la protéine Ypt7p est associée dans ces conditions au CL.

Microscopie électronique à transmission

Formation des CLs par bourgeonnement

YPT7 INDEPENDAN

T

Échanges entre compartiments cellulaires par

contact membranaire

YPT7 DEPENDANT RE

Proposition d’un modèle de la perte de la dynamique des CLs (2) & (3)

(1)

Remerciements au projet LIPICAERO de l’ANR PNRB

(a)

Bibliographie: (a) Buchanan et al. 2000 (c) Athenstaedt et al. 2006 (b) DSCL IJPB non publié

2µm

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