Inhibition des biofilms à Candida albicans : recherche de nouvelles approches thérapeutiques

Texte intégral

(1)Université Abou Bekr Belkaïd - Tlemcen, Algérie Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie et Sciences de la Terre et de l’Univers Département de Biologie Université Libre de Bruxelles, Belgique Faculté de Médecine. Inhibition des biofilms à Candida albicans : recherche de nouvelles approches thérapeutiques. THESE DE DOCTORAT EN COTUTELLE présentée par. Sarra SEBAA En vue de l’obtention du grade de Docteur en : Biologie (Université Abou Bekr Belkaïd - Tlemcen) Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques (Université Libre de Bruxelles). Promoteurs Pr. Zahia BOUCHERIT-OTMANI. Pr. Philippe COURTOIS. Laboratoire Antibiotiques, Antifongiques : Physico-chimie, Synthèse et Activités Biologiques (UABBT). Laboratoire de Physiologie et Pharmacologie (ULB). Année académique 2016-2017 1.

(2) Inhibition des biofilms à Candida albicans : recherche de nouvelles approches thérapeutiques. THESE DE DOCTORAT EN COTUTELLE présentée par. Sarra SEBAA En vue de l’obtention du grade de Docteur en : Biologie (Université Abou Bekr Belkaïd - Tlemcen) Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques (Université Libre de Bruxelles). Composition du Jury Pr. Hafida HASSAINE. Pr. Dominique PARENT. Université Abou Bekr Belkaïd - Tlemcen. Université Libre de Bruxelles. Pr. Lamia SARI-BELKHERROUBI. Pr. Astrid VANDEN ABBEELE. Université Abou Bekr Belkaïd - Tlemcen. Université Libre de Bruxelles. Pr. Zahia BOUCHERIT-OTMANI. Pr. Philippe COURTOIS. Université Abou Bekr Belkaïd - Tlemcen. Université Libre de Bruxelles. Pr. Kebir BOUCHERIT. Pr. Jean-Pierre VAN NIEUWENHUYSEN. Centre Universitaire Belhadj Bouchaib-Ain Témouchent. Université Catholique de Louvain. Année académique 2016-2017 2.

(3) REMERCIEMENTS Le travail présenté dans cette thèse de doctorat a été réalisé en cotutelle entre deux Laboratoires appartenant à des Universités différentes: le Laboratoire Antibiotiques, Antifongiques : Physico-chimie, Synthèse et Activités Biologique à la Faculté des Sciences de la Nature, de la Vie, de la Terre et de l’Univers de l’Université Abou Bekr Belkaïd - Tlemcen, Algérie et le Laboratoire de Physiologie et Pharmacologie à la Faculté de Médecine de l’Université Libre de Bruxelles, Belgique. J’adresse mes remerciements aux Professeurs Zahia Boucherit-Otmani et Kathleen Mc Entee, les deux directrices des Laboratoires respectifs de m’avoir accueillie au sein de leurs équipes. J’exprime aussi mes remerciements au Professeur Zahia Boucherit-Otmani d’avoir accepté de diriger mon travail de thèse. Je suis reconnaissante de son aide, de ses conseils pertinents et de ses qualités scientifiques. Je lui dois la thématique intéressante sur les biofilms à Candida albicans qu’elle m’a proposée et que j’ai eu beaucoup de plaisir à étudier. Je lui exprime aussi ma gratitude pour la confiance qu’elle m’a accordée en acceptant de s’engager dans cette cotutelle. Je tiens à exprimer mes remerciements et ma gratitude au Professeur Philippe Courtois de m’avoir accueilli dans son laboratoire et d’avoir encadré ce travail avec beaucoup de passion et d’enthousiasme. Je lui dois le thème sur la régulation des biofilms à Candida par les molécules du quorum sensing et sur l’utilisation des protéines salivaires en hygiène bucco-dentaire, des voies de recherche prometteuses contre les biofilms fongiques. Je suis très reconnaissante de sa disponibilité, de sa rigueur et de ses compétences scientifiques. Toutes ces qualités m’ont permis de réaliser cette thèse dans de bonnes conditions. L’aboutissement de cette collaboration a nécessité une année de démarches administratives, merci pour votre soutien et votre efficacité tout au long du cheminement de ce projet très exigeant. Je remercie la Commission de Classement des Crédits Internationaux (CCCI) de l’Université Libre de Bruxelles (anciennement Bureau des Relations Internationales et de la Coopération - BRIC - de l’ULB) de m’avoir accordée une bourse de doctorat du Fonds Xénophilia pour venir à Bruxelles six mois par an pendant 4 ans. Je remercie le fondateur du Fonds Xénophilia, Monsieur Thierry Lepage, qui a, de plus, manifesté i.

(4) beaucoup d’intérêt à la thématique des biofilms fongiques en nous rendant visite au Laboratoire. Je remercie aussi l’ARES (Académie de Recherche et d’Enseignement Supérieur) qui m’a attribué une bourse pour soutenir la finalisation de cette thèse. Je remercie le Docteur Zakia Oussadit, Chef de Service de Prothèses dentaires au CHU de Tlemcen, de m’avoir autorisée à effectuer les prélèvements de souches cliniques au sein de son Service. Je remercie les étudiants en dentisterie et les patients qui ont participé à cette étude. Je remercie Monsieur Keyzer, Assistant au Laboratoire de Prothèse à la Faculté de Médecine de l’ULB, pour la fabrication de languettes de résine qui ont permis à un étudiant en dentisterie de tester avec moi certaines hypothèses sur la décontamination des prothèses amovibles. Je remercie la firme belge TaradonTM de nous avoir fourni de la lactoperoxydase adsorbée sur un support inerte, un système original pour l’utilisation des peroxydases. Je remercie les étudiantes de la Haute Ecole Francisco Ferrer à Bruxelles, Assia Hamouda, Ilham Dardour, Charlotte Hauet, et Lina Malashkina, pour leur aide dans le cadre de leur travail de fin d’études. Leur compagnie m’a été très enrichissante. Je remercie aussi les étudiants en dentisterie à l’ULB, Nicolas Hizette et Maxime Faltot, qui m’ont permis dans le cadre de leur travail de fin d’études de passer de l’expérimentation in vitro à l’expérimentation ex vivo sur des prothèses dentaires. Je remercie tous les membres du Laboratoire Antibiotiques, Antifongiques : Physicochimie, Synthèse et Activités Biologique ainsi que tous les membres du Laboratoire de Physiologie et Pharmacologie, plus particulièrement Monsieur Grégory Vegh pour son aide dans les mises au point des microscopes et dans la résolution des soucis informatiques. Je remercie les membres de mon Comité d’accompagnement de l’ULB, le Professeur Laurence Ladrière, le Professeur Carine Truyens et le Professeur Olivier Vandenberg de m’avoir accompagnée durant ma thèse ainsi que d’avoir formulé des remarques et des conseils très précieux. Je remercie très chaleureusement Madame Courtois pour les relectures de mes travaux. Je tiens également à la remercier, ainsi que Claire Courtois, d’avoir facilité mon adaptation à Bruxelles et aussi de m’avoir fait découvrir la Belgique. Grâce à elles, je garde de très bons souvenirs. Qu'elles soient assurées de ma sincère et profonde reconnaissance. ii.

(5) Je remercie les Membres du Jury les Professeurs Hafida HASSAINE, Dominique PARENT,. Lamia. SARI-BELKHERROUBI,. Astrid. VANDEN. ABBEELE,. Kebir. BOUCHERIT (Centre Universitaire Belhadj Bouchaib-Ain Témouchent) et Jean-Pierre VAN. NIEUWENHUYSEN. (Université. Catholique. de. Louvain). d’avoir. accepté. d’examiner ce manuscrit.. iii.

(6) DEDICACE. Je dédie cette thèse. à mes très chers parents, avec tous mes remerciements et ma gratitude pour leur amour et leur soutien,. à mes chers frères Mohammed, Nadhir et Yassine, avec mes remerciements pour leur complicité et leur affection,. à ma chère belle-sœur Fadia, en la remerciant pour ses encouragements,. à ma grand-mère paternelle,. à toute ma famille.. Enfin, j’adresse une pensée à la mémoire de ma grand-mère maternelle.. iv.

(7) TABLE DES MATIERES ABREVIATIONS. i. GLOSSAIRE. ii. RESUME. v. CONTEXTE GENERAL INTRODUCTION I. Candida albicans I.1. Morphologie I.2. Facteurs de virulence I.2.1. Dimorphisme I.2.2. Adhésion I.2.3. Formation du biofilm I.2.4. Sécrétion des aspartyl-protéinases (SAP) II. Les biofilms dans la cavité buccale II.1. Généralités II.2. Biofilms prothétiques à C. albicans III. Biofilms à C. albicans et quorum sensing III.1. Définition du quorum sensing III.2. Molécules du quorum sensing chez C. albicans III.2.1. Tyrosol III.2.2. Farnésol IV. Biofilms à C. albicans et protéines exocrines salivaires IV.1. Lysozyme IV.2. Système peroxydase. 3 3 4 4 6 6 8 9 9 10 13 13 14 15 16 18 18 20. OBJECTIFS DE LA THESE MATERIEL ET METHODES I. Matériel I.1. Matériel biologique : Candida albicans I.1.1. Cultures de Candida I.1.2. Souches de levures I.1.3. Comptage des levures I.1.4. Caractéristiques des patients appareillés I.1.5. Données mycologiques I.2. Analyses microscopiques I.3. Molécules du quorum sensing I.3.1. Tyrosol I.3.2. Farnésol I.4. Molécules exocrines salivaires I.4.1. Lysozyme I.4.2. Système peroxydase I.4.3. Préparation d’une solution d’oxydants OSCN-/OII.5. Matériaux II. Méthodes II.1. Evaluation de la croissance dans des plaques 96-puits II.2. Evaluation des biofilms par coloration au cristal violet II.3. Effet des molécules du quorum sensing II.4. Effet du lysozyme II.5. Effet de la solution d’oxydants OSCN-/OI-. 26 26 26 26 28 31 33 34 35 35 36 37 37 38 38 45 45 46 47 48 48 51. i.

(8) II.6. Effet antibiofilm d’un surnageant de culture de C. albicans II.7. Dosage de H2O2 II.8. Evaluation de l’effet candidacide des oxydants OSCN-/OIII.9. Analyse de la toxicité cellulaire III. Etude clinique ex vivo IV. Analyses statistiques. 52 52 54 55 56 57. RESULTATS I. Etudes in vitro I.1. Molécules du quorum sensing I.1.1. Effet du tyrosol sur la formation du biofilm I.1.2. Effet du farnésol sur la formation du biofilm I.1.3. Effet des QSM sur un biofilm déjà formé I.1.4. Production de facteurs anti-biofilms par C. albicans I.2. Protéines exocrines salivaires I.2.1. Effet du lysozyme sur la formation du biofilm I.2.2. Effet du lysozyme sur des biofilms formés sur résine I.2.3. Effet des hypohalogéneux sur la formation du biofilm II. Etude ex vivo II.1. Caractéristiques de l’essai clinique II.2. Données socio-anthropométriques II.3. Données cliniques II.4. Données mycologiques II.5. Effet candidacide de la solution d’oxydants III. Toxicité sur les cellules épithéliales buccales. 58 59 59 65 69 70 73 73 80 83 97 97 97 97 99 100 102. DISCUSSION I. Former des biofilms in vitro II. Réguler les biofilms à C. albicans II.1. Effet antibiofilm du tyrosol II.2. Effet probiofilm du tyrosol II.3. Effet antibiofilm du farnésol II.4. Effet probiofilm du farnésol III. Contrôler les biofilms à C. albicans III.1. Effet antibiofilm du lysozyme III.2. Effet probiofilm du lysozyme III.3. Effet antibiofilm de la lactoperoxydase IV. Mimer les mécanismes biologiques anti-Candida V. Prévenir ou traiter ?. 104 108 109 109 110 110 111 112 115 116 119 123. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES BIBLIOGRAPHIE ANNEXES. ii.

(9) ABREVIATIONS %: : °C : µl : µM : µm : Amp B : ANOVA : ATCC : bl : BSA : C. albicans : C: CE : CEB : CFU : CMI : CML : CN : CP : CV : DMSO : DO : DTNB : FPP : Fsol : g: G: GlcNAc : GOD : h: IUPAC : J: kDa : Lf : ln : LPO : Lz : M:. pourcent différence entre deux mesures degrés Celsius microlitre micromole par litre micromètre amphotéricine B analyse of variance American Type Culture Collection blastoconidie bovine serum albumin Candida albicans contrôle coefficient d’exactitude cellules épithéliales buccales colony forming unit concentration minimale inhibitrice concentration minimale létale contrôle négatif contrôle positif coefficient de variation diméthylsulfoxyde densité optique acide 5,5’-dithio-bis-2-nitrobenzoïque farnésyl pyrophosphate farnésol force attraction terrestre glucose acétylglucosamine glucose-oxydase heure International Union of Pure and Applied Chemistry jour de l’expérience kiloDalton lactoferrine logarithme népérien lactoperoxydase lysozyme molaire. MARS : MCE : McF : mg : min : ml : mm : mM : MPO : N: nm : NS : p: PBS : PEA : pH : PM : PMMA : psi : QS : QSM : R: r: r2 : Rn : rpm : S: Sap : SCMI : SD : SEM : sp. : SPO : t: TG : TMB : TNB : Tsol :. morphogenic autoregulatory substance mercaptoéthanol MacFarland milligramme minute millilitre millimètre millimolaire myéloperoxydase nombre de cas nanomètre non significatif probabilité phosphate buffer saline pellicule exogène acquise potentiel d’hydrogène poids moléculaire poly(methyl methacrylate) pound per square inch quorum sensing quorum sensing molecule rugueux (rough) coefficient de corrélation coefficient de dispersion énième repiquage rotation par minute lisse (smooth) secreted aspartyl proteinase concentration minimale inhibitrice des cellules sessiles standard deviation standard erreur of mean species sialoperoxydase temps tube germinatif tétraméthylbenzidine acide 5-thio-2-nitrobenzoïque tyrosol. i.

(10) GLOSSAIRE Adhérence :. force nécessaire pour séparer deux surfaces attachées.. Adhésion :. ensemble des mécanismes menant à l’adhérence.. Biofilm :. agrégats de micro-organismes adhérant sur un support immergé dans un liquide.. Blastoconidie :. cellule fongique de la reproduction asexuée formée par bourgeonnement d’une autre blastoconidie ou d’un filament.. Bourgeonnement :. mécanisme de reproduction asexuée de certains mycètes, notamment les levures.. Catalase :. enzyme transformant le peroxyde d’hydrogène en eau et oxygène.. CFU :. colonie microbienne visible macroscopiquement issue d’un seul microorganisme étalé sur milieu solide (Colony Forming Unit en anglais ou Unité Formatrice de Colonie en français).. Commensal :. micro-organisme vivant attaché sur les surfaces externes d’un organisme sans lui causer de dommage.. Défensine. peptide cationique antimicrobien présent dans la salive.. Dimorphisme :. propriété des mycètes de se présenter sous deux morphologies différentes, tantôt des petites cellules (rondes, ovales), tantôt des filaments.. Farnésol :. molécule du quorum sensing, qui empêche la transition de C. albicans de la forme levure à la forme filament dans certaines conditions environnementales.. Filamentation :. production de filaments par des cellules mycétales.. Formulation galénique :. liste des constituants d’une préparation pharmaceutique.. Glucose-oxydase :. enzyme qui transforme le glucose en gluconate avec production de peroxyde d’hydrogène (H2O2).. Histatine :. protéine antimicrobienne salivaire riche en histidine.. Lactoferrine :. protéine chélatrice de Fe3+.. Lactoperoxydase :. enzyme catalysant l’oxydation du thiocyanate / iodure en présence de peroxyde d’hydrogène (H2O2) pour donner de l’hypothiocyanite / hypoiodite.. ii.

(11) Levure :. champignon unicellulaire se reproduisant par bourgeonnement.. Lysosome :. organite intracellulaire renfermant des enzymes qui sont responsables de la lyse cellulaire et qui interviennent dans la digestion des bactéries phagocytées par les neutrophiles.. Lysozyme :. protéine, sécrétée par les glandes exocrines et les phagocytes, qui présente une action muramidase connue pour inhiber les bactéries à Gram positif et un effet inhibiteur non encore élucidé sur les levures du genre Candida.. Normaliser :. transformer une série de valeurs pour les rendre comparables avec un point de référence spécifique.. Peptone :. extrait préparé par protéolyse de lait bovin ou de viandes animales.. Pseudohalogénure :. molécule réagissant de la même façon que les halogénures lors de l’oxydation par le peroxyde d’hydrogène en présence de peroxydase.. Quorum sensing :. modification de l’expression phénotypique des micro-organismes en fonction de leur nombre dans l’environnement, permettant ainsi une adaptation à un environnement favorable ou défavorable.. Résine :. ou poly(methyl methacrylate), matériau utilisé dans la confection de prothèses dentaires, obtenu par polymérisation de composés organiques.. Sabouraud :. nom d’un milieu de culture - en l’honneur de Raymond Sabouraud - qui permet la croissance des levures et des moisissures.. Saprophyte :. micro-organisme capable de se nourrir de matière organique non vivante.. Sessile :. fixé à un support, s’oppose à planctonique (dans le cadre des biofilms).. Subculture :. repiquage d’une culture microbienne dans / sur un milieu frais.. Test ANOVA :. test statistique pour comparer plus de deux groupes de données qui présentent une distribution gaussienne.. Test de Bonferroni :. test complémentaire à un test ANOVA pour analyser la différence statistique entre deux groupes de données (quels qu’ils soient) lors de comparaisons multiples.. Test de Dunnett :. test complémentaire à un test ANOVA pour analyser la différence statistique entre un groupe de données et le groupe contrôle lors de comparaisons multiples.. iii.

(12) Tube germinatif :. ébauche de filament à partir d’une blastoconidie de C. albicans dans certaines conditions expérimentales.. Tyrosol :. molécule du quorum sensing, dérivée de la tyrosine avec une fonction alcool ; cette molécule favorise la transition de C. albicans de la forme levure à la forme filament dans certaines conditions environnementales.. Unités McFarland :. unités de turbidité à partir d’étalons de concentration croissante en sulfate de baryum, permettant une comparaison visuelle avec une suspension microbienne.. iv.

(13) RESUME Les biomatériaux insérés dans la cavité orale, tout particulièrement les prothèses dentaires amovibles en résine, constituent des surfaces propices à la formation de biofilms incorporant des levures du genre Candida, à l’origine de candidose. Les levures,. comme. d’autres. micro-organismes,. adaptent. leur. prolifération. à. l’environnement par des molécules dites du quorum sensing. D’autre part, la contamination du milieu oral est contrôlée par de nombreuses protéines sécrétées par les glandes salivaires, mais leur utilisation en hygiène est peu documentée. Le but de ce travail est d’étudier l’effet anti-biofilm de molécules du quorum sensing et de protéines exocrines, le lysozyme et la lactoperoxydase, dans la perspective de réduire la colonisation des surfaces de prothèses dentaires par des levures du genre Candida et par conséquent de prévenir une stomatite prothétique. A cette fin, des biofilms à Candida ont été produits dans des plaques multi-puits à fond plat en polystyrène et quantifiés par coloration au cristal violet. L’effet de deux molécules du quorum sensing tyrosol et farnésol - sur la formation des biofilms à Candida a été investigué in vitro sur la souche de référence ATCC 10231 et sur des souches cliniques isolées à partir de prothèses dentaires. Le tyrosol et le farnésol à hautes concentrations (> 6 mM et > 1 mM respectivement) entraînent une limitation de la formation de biofilms sans altérer la croissance fongique tandis que des concentrations plus faibles (~ 1 mM et ~ 1 µM respectivement) favorisent la formation de biofilms. Le lysozyme présente aussi un effet dépendant de la dose sur la formation de biofilms par Candida: promoteur de la formation de biofilms à une concentration de 1000 µg/ml et inhibiteur de la formation de biofilms à des concentrations plus faibles (3 et 10 µg/ml). Les composés hypohalogéneux (> 500 µM) produits par un système peroxydase limitent la croissance des levures et par conséquent leur capacité à former des biofilms in vitro. Un seul trempage ex vivo de prothèses amovibles pendant 5 minutes dans une solution d’ions hypohalogéneux (2000 µM) entraîne une diminution d’au moins 1 unité logarithmique du nombre de Candida dans 58,3 % des cas (N = 23) alors qu’un trempage dans de l’eau n’a aucun effet sur la colonisation de la prothèse : cet effet est statistiquement significatif (Chi carré, p = 0,0006, test de Fisher, p = 0,0009).. v.

(14) ‫ملخص‬ ‫المواد الحيوية (‪ ) biomaterials‬المدخلة في تجويف الفم‪ ،‬خاصة أطقم األسنان االصطناعية المتحركة من مادة الراتنج‪،‬‬ ‫تشكل مساحات تسهل تشكيل أغشية حيوية )‪ (biofilms‬تندمج فيها الخمائر من نوع 'كانديدا' )‪ (Candida‬التي تتسبب في‬ ‫فطار (‪ ،) candidiasis‬ذلك أن الخمائر‪ ،‬مثلها مثل بقية الكائنات المجهرية‪ ،‬تالئم عملية تكاثرها مع المحيط بواسطة‬ ‫جزئيات تسمى 'جزئيات نصاب االستشعار' (‪ .)quorum sensing molecules‬كما أن تلوث وسط الفم تتم مراقبته‬ ‫بالعديد من البروتينات التي تفرزها الغدد اللعابية‪ ،‬إال أن استعمالها في النظافة قليل التوثيق‪ .‬إن الغرض من هذا العمل هو‬ ‫دراسة التأثير المضاد لألغشية الحيوية (‪ )anti-biofilm‬لجزئيات نصاب االستشعار و البروتينات الخارجية (‪،)exocrine‬‬ ‫الليسوزيم (‪ )lysozyme‬و الالكتوبيروكسيداز (‪ ،)lactoperoxydase‬باتجاه تقليص استيطان الخمائر من نوع 'كانديدا'‬ ‫لمساحات أطقم األسنان االصطناعية‪ ،‬وبالتالي منع حصول التهاب غشاء الفم‪ .‬لهذا الغرض‪ ،‬تم إنتاج أغشية حيوية من نوع‬ ‫'كانديدا' في صفائح متعددة التجاويف على قاعدة سطحية من لدائن البوليستيران وتحديد كميتها بواسطة تلوينها بالبنفسجي‬ ‫البلوري (‪ .)crystal violet‬وقد جرى فحص تأثير جزئيين من نصاب االستشعار (التيروسول والفارنيسول‪-‬‬ ‫‪ )tyrosol and farnesol‬على تشكيل األغشية الحيوية من نوع 'كانديدا' في بيئة مصطنعة )‪ ،(in vitro‬على ساللة‬ ‫مرجعية (‪ )ATCC 10231‬وعلى سالالت سريرية (اكلينيكية) معزولة‪ ،‬انطالقا من أطقم أسنان اصطناعية‪ .‬و قد تبين بأن‬ ‫التيروسول والفارنيسول ذوي التركيز العالي )‪ > 6 mM‬و ‪ (> 1 mM‬على التوالي‪ ،‬يتسببان في تقليص تشكل األغشية‬ ‫الحيوية من دون اإلضرار بنمو الفطر‪ .‬بينما التركيز األقل )‪  1 mM‬و ‪ ( 1 µM‬على التوالي‪ ،‬يسهل تشكل األغشية‬ ‫الحيوية‪ .‬كما أن لليسوزيم تأثير بحسب مقدار الجرعة على تشكيل األغشية الحيوية من فئة 'كانديدا' ‪ :‬يؤدي إلى تشكيل هذه‬ ‫األغشية الحيوية بتركيز يساوي ‪ µg/ml 1000‬و كابح لتشكل األغشية الحيوية على تركيز أقل (‪ 3‬و ‪.)µg/ml 10‬‬ ‫المركبات ‪ (> 500 µM) hypohalous‬التي ينتجها نظام البيروكسيداز )‪ (peroxidase system‬تحد من نمو الخمائر‬ ‫وبالتالي من قدرتها على تشكيل األغشية الحيوية في بيئة مصطنعة‪ .‬ويكفي وضع أطقم األسنان المصطنعة خارج البيئة‬ ‫الحيوية )‪ (ex vivo‬لمدة ‪ 5‬دقائق في محلول من أيونات ‪ )µM 2000( hypohalous‬لتقليص عدد خمائر 'كانديدا' بنسبة‬ ‫وحدة لوغاريتمية على األقل في ‪ 58,3‬حاالت في ‪ ،)N = 23( %‬بينما وضعها في الماء ال يؤدي إلى أي تأثير على‬ ‫استيطان الطاقم االصطناعي ‪ :‬ما يعني أن هذا التأثير معتبر من الناحية اإلحصائية ‪:‬‬ ‫(‪.)Chi square, p = 0.0006, Fisher's exact test, p = 0.0009‬‬. ‫‪vi‬‬.

(15) ABSTRACT Biomaterials inserted into the oral cavity, especially removable dentures in resin, are surfaces leading to the formation of biofilms incorporating Candida yeasts, source of candidiasis. Yeasts, like other microorganisms, adapt their proliferation to the environment through molecules called quorum sensing molecules. On the other hand, contamination of the oral environment is controlled by numerous proteins secreted by salivary glands, but their use in hygiene is poorly documented. The aim of this work is to study the anti-biofilm effect of quorum sensing molecules and exocrine proteins, lysozyme and lactoperoxidase, with a view to reduce the colonization of denture surfaces by Candida yeasts and consequently to prevent denture stomatitis. To this end, Candida biofilms were produced in multi-well polystyrene plates with a flat bottom and quantified by staining with crystal violet. The effect of two quorum sensing molecules - tyrosol and farnesol - on the formation of biofilms in Candida was investigated in vitro on the reference strain ATCC 10231 and isolated clinical strains from dentures. Tyrosol and farnesol at high concentrations (> 6 mM and > 1 mM respectively) result in a decrease of the biofilm formation without affecting fungal growth while lower concentrations (~ 1 mM and ~ 1 µM respectively) promote biofilm formation. Lysozyme also provided a dose-dependent effect on biofilm formation by Candida: biofilm promotor at a concentration of 1000 µg/ml and biofilm inhibitor at lower concentrations (3 and 10 µg/ml). Hypohalous compounds (> 500 µM) produced by a peroxidase system limit yeast growth and therefore the ability to form biofilms in vitro. Ex vivo denture immersion for 5 minutes in a hypohalous compounds solution (2000 µM) causes a decrease of at least 1 log unit in the Candida count in 58.3% of cases (N = 23) and immersion in water has no effect on the colonization of the prosthesis : this effect is statistically significant (Chi square, p = 0.0006, Fisher's exact test, p = 0.0009).. vii.

(16) CONTEXTE GENERAL.

(17) Contexte général Les candidoses (Dignani et al., 2009) sont des infections de la peau, des muqueuses ou des tissus profonds, provoquées par la prolifération de levures du genre Candida, la plus fréquemment isolée étant Candida albicans. Les candidoses sont fréquentes chez les individus médicalement- ou immuno-compromis. D’après la littérature (Cannon & Chaffin, 1999), C. albicans a la capacité d’adhérer à différentes surfaces qu’elles soient biologiques (par exemple les muqueuses de la cavité orale) ou inertes (biomatériaux utilisés pour les tubulures de cathéters, biomatériaux pour la fabrication des implants ou des prothèses dentaires) et de former sur ces surfaces avec d’autres. espèces. microbiennes. des. communautés. appelées. "biofilms".. Les. mécanismes d’adhésion diffèrent selon la nature de la surface : l’adhésion aux surfaces biologiques dépend de liaisons ligands / récepteurs (Olsen, 1990), l’adhésion aux surfaces inertes est sous le contrôle d’interactions hydrophobes versus électrostatiques (Klotz, 1994 ; Yoshijima et al., 2010). De nombreux rapports (Boucherit-Atmani et al., 2011) ont montré la capacité de souches de C. albicans isolées de dispositifs médicaux d’accès veineux à former des biofilms. Des études in vivo et in vitro (Courtois, 2011) ont aussi montré l’intégration des Candida dans des biofilms couvrant différents biomatériaux utilisés dans la cavité buccale pour la fabrication des prothèses dentaires, des appareils orthodontiques et autres dispositifs placés en bouche. Les Candida agrégés en biofilms sont plus résistants aux traitements antifongiques que leurs homologues planctoniques en suspension (Chandra et al., 2001b). C. albicans (Odds, 1988) est une levure polymorphe tantôt sous forme de cellules bourgeonnantes (blastoconidies),. tantôt. sous. forme. de. cellules. filamenteuses. (hyphes. ou. pseudohyphes). Cette capacité d’adapter la morphologie à l’habitat, y compris dans des biofilms, constitue un mécanisme qui module la survie ainsi que la virulence de la levure dans divers environnements. La prolifération de C. albicans et son passage d’une forme. 1.

(18) Contexte général à l’autre est sous le contrôle de molécules (farnésol, tyrosol, …) dites du quorum sensing (Kruppa, 2009) : on appelle quorum sensing un ensemble de mécanismes biochimiques qui modifient le comportement des micro-organismes en fonction de leur nombre. In vivo, C. albicans est une levure commensale présente sur les muqueuses de la cavité orale et du tube digestif (Cannon & Chaffin, 1999 ; Powderly, 2009 ; Neville et al., 2015). Les biomatériaux insérés dans la cavité orale, tout particulièrement les prothèses dentaires amovibles en résine, constituent des surfaces propices à l’adsorption de Candida. Les micro-organismes ne se fixent jamais directement sur les surfaces orales, étant donné que ces surfaces sont toujours recouvertes d’une pellicule salivaire (Hannig & Joiner, 2006). L’invasion pathogène des muqueuses s’accompagne d’un passage de la forme bourgeonnante à la forme filamenteuse. Dans la cavité buccale, la prolifération de la levure et le passage au parasitisme sont sous le contrôle des sécrétions exocrines salivaires qui contiennent des facteurs antimicrobiens tels le lysozyme, les peroxydases, les histatines et les défensines, … (Salvatori et al., 2016).. 2.

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