HAL Id: hal-02954901
https://hal.inrae.fr/hal-02954901
Submitted on 1 Oct 2020
HAL is a multi-disciplinary open access
archive for the deposit and dissemination of sci-entific research documents, whether they are pub-lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.
L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.
Rôle des modifications post-traductionnelles de la
stomatine dans sa fonction biologique
Christelle Cebo, Amélie Esteffe
To cite this version:
Christelle Cebo, Amélie Esteffe. Rôle des modifications post-traductionnelles de la stomatine dans sa fonction biologique. Biochimie [q-bio.BM]. 2016. �hal-02954901�
1
Partie 1 : Introduction
I) Contexte de l’équipe de recherche
Dans le cadre de ma deuxième année de licence de biologie, j’ai effectué un stage de recherches scientifiques au sein de l’Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) dans l’équipe Génomique Fonctionnelle et Physiologie de la Glande Mammaire (GFP-GM). Cette équipe, dirigée par Fabienne Le Provost, fait partie de l’unité Génomique Animale et Biologie Intégrative (GABI),dirigée par Claire Rogel-Gaillard.
Il existe plusieurs centres INRA en France. C’est dans celui de Jouy-en-Josas que mon stage s’est déroulé. Ce centre se situe dans les Yvelines, dans le domaine de Vilvert et accueille environ 1440 employés (agents titulaires de l’INRA, agents non titulaires de l’INRA, doctorants, post-doctorants, enseignants-chercheurs).
Dans cet institut, les domaines concernés par la recherche sont l’agronomie, la nutrition et la santé. Les recherches effectuées sont axées sur la génétique et la physiologie animale, la microbiologie, la biologie intégrative et les mathématiques appliquées.
L’unité GABI est une unité mixte de recherche ayant pour but d’étudier la variabilité génétique dans le but d’avoir un élevage performant et durable. Elle est composée de huit équipes de recherches et une équipe plateforme.
C’est avec l’équipe GFP-GM que j’ai effectué mon stage de recherches.
Dans cette équipe, les chercheurs s’intéressent tout particulièrement à la glande mammaire. On peut distinguer plusieurs axes de recherches au sein de cette équipe. Certains chercheurs s’intéressent aux mécanismes biologiques impliqués lors du développement de la glande mammaire et du fonctionnement des cellules épithéliales mammaires (CEM). D’autres étudient les impacts environnementaux pouvant affecter la glande mammaire (nutrition, pollution, conditions d’élevage) ainsi que les modifications épigénétiques induites dans divers contextes. Enfin, une autre partie de l’équipe effectue des recherches plus approfondies sur les gènes d’intérêt codants et non-codants. Afin d’effectuer toutes ces recherches, plusieurs modèle animaux sont utilisés : souris, lapins, ruminants.
Lors de ce stage, j’ai travaillé avec Christelle Cébo, qui étudie les mécanismes de biosynthèse des lipides dans les cellules épithéliales mammaires (CEM). Nous nous sommes intéressés plus précisément à la stomatine, protéine associée aux lipides du lait. L’objectif du projet est d’étudier le rôle de la stomatine dans la biosynthèse des lipides du lait.
II) La glande mammaires et son rôle dans la production du lait
La glande mammaire est un organe sécréteur présent chez les mammifères permettant la production de lait, élément indispensable dans la nutrition des nouveaux nés. Les cellules épithéliales, le stroma (contenant des adipocytes), les fibroblastes, les terminaisons nerveuses, le tissu conjonctif et les nombreux vaisseaux sanguins sont les éléments constituants cet organe complexe. La glande mammaire est dite exocrine car en effet, les cellules épithéliales mammaires (CEM) sécrètent le lait vers le milieu extérieur.
Les cellules épithéliales mammaires sont responsables de la production ainsi que de la sécrétion du lait. Ce sont des cellules différenciées et polarisées, organisées en acini (ces acini sont groupés en lobules formant des lobes).
2
Figure 1 : Glande mammaire, acinus et cellule en lactation chez la femme
Le pôle basal des CEM repose sur la matrice extracellulaire, c’est à cet endroit qu’ont lieu les échanges avec le milieu intérieur (sang, lymphe), mais c’est aussi un lieu de contact entre les cellules épithéliales et les cellules myoépithéliales (entourant les CEM). Le lait est sécrété dans la lumière de l’acinus, partie supérieure du pôle apical. Ce dernier présente des microvillosités. Les jonctions serrées situées entre les CEM permettent une excellente étanchéité de l’épithélium. Les échanges entre le milieu intérieur et la lumière de l’acinus ne sont plus possibles dès lors que l’épithélium est complètement différencié.
C’est à partir d’acides aminés, apportés par les vaisseaux sanguins, que la cellule épithéliale synthétise les protéines du lait. La synthèse de ces protéines commence par la traduction des ARN messagers, codants des protéines au niveau du réticulum endoplasmique. Suite à ça, le polypeptide d’acides aminés subira plusieurs modifications comme la N-glycolysation ou encore le clivage du peptide signal. Ces protéines sont transportées par la suite dans l’appareil de Golgi où elles subiront différentes autres modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation. Les protéines matures sont triées dans différentes vésicules via le réseau trans-Golgien. Ces vésicules migrent vers le pôle apical via les microtubules ou filaments d’actine afin de secréter les protéines du lait dans la lumière de l’acinus. La membrane des vésicules vont alors entrer en contact et fusionner avec la membrane des CEM dans le but de libérer les protéines du lait. Ce processus est appelé exocytose.
Les gouttelettes lipidiques sont synthétisées par accumulation de lipides neutres entre les deux feuillets de la membrane du réticulum endoplasmique. Elles sont ensuite transportées jusqu’au pôle apical, entourées d’une monocouche de phospholipides. Ces gouttelettes lipidiques sont ensuite secrétées dans la lumière de l’acinus par bourgeonnement. Elles se retrouvent alors entourées par une membrane plasmique.
3
Figure 2 : Sécrétion du lait et des globules gras
Sécrétion des
globules gras Sécrétion des protéines du lait
4
Partie 2-Présentation du projet
I) Objectifs à long terme
Le but du projet est de comprendre la fonction d’une protéine, la stomatine, dans la biosynthèse des lipides du lait.
Les protéines des gouttelettes lipidiques peuvent subir des modifications post-traductionnelles, comme la phosphorylation. La stomatine présente d’ailleurs quatre sites de phosphorylation chez le bovin : Ser2, Thr10, Ser244 et Thr177. Lorsqu’on aligne les séquences primaires de la stomatine de l’homme, du bovin et de la souris, on remarque que deux sites sont conservés : Ser244 et Thr177. Cette conservation induit l’hypothèse de l’existence d’une fonction biologique associée.
Figure 3 : Séquence en acides aminés de la stomatine bovine alignée avec celle de la souris et de l’Homme
II) Objectifs du stage
Le projet de recherche vise à étudier le rôle de la Ser244 dans la fonction biologique de la stomatine. Pour cela, nous nous proposons de muter la Ser244 en alanine, et l’effet de cette mutation sera évalué in vitro dans un modèle cellulaire.
Dans le cadre de ce projet, l’objectif de mon stage a été d’amplifier un plasmide contenant le gène de la stomatine, et de vérifier que la séquence clonée était identique à la séquence de référence de la stomatine. Séquences non conservées Séquences conservées
5
Partie 3-Matériel et méthodes
I) Création d’un vecteur plasmidique a) Description du vecteur
Le vecteur utilisé, pEGFP-C1, est un plasmide qui possède un promoteur, nécessaire à l’expression de la protéine dans les cellules de mammifères (pCMV), et des gènes de résistance à la kanamycine et la néomycine, deux antibiotiques. Il est également composé d’une cassette GFP (Green Fluorescent Protein), qui, associée à la stomatine, permet de suivre son déplacement dans les cellules lors de la transfection in vitro. Le site multiple de clonage (MCS) qui le compose nous permettra d’y ajouter l’insert.
Figure 4 : Carte de restriction du vecteur pEGFP-C1
b) Amplification du vecteur plasmidique
Le clonage de la stomatine dans le vecteur pEGFPC1 avait été réalisé avant mon arrivée au laboratoire.
6 Préparation de la préculture bactérienne
Pour réaliser la pré-culture, nous utilisons un milieu LB (Luria-Bertani) avec un antibiotique, la kanamycine. Les bactéries ayant ingéré le plasmide sont résistantes à l’antibiotique et peuvent être sélectionnées sur boîtes de Pétri. Pour amplifier la colonie bactérienne, nous piquons avec un cure-dent dans la colonie préalablement préparée. Nous trempons ensuite les clones dans le milieu de préculture composé de 5 ml de LB et 5 µl de kanamycine 1000X, puis nous plaçons la pré-culture sous agitation (250 rpm) à 37°c pendant 1h.
Amplification de la pré-culture
Ces 5 ml de pré-culture sont versés dans un erlenmeyer contenant 250 ml de LB et 250 µl de Kanamycine, et nous plaçons cet erlenmeyer à 37°C sous agitation (250 rpm) pendant une nuit. Cette étape permet d’obtenir beaucoup de bactéries. Le lendemain, nous récupérons l’erlenmeyer et son contenu que nous divisons en 6 aliquots de 40 ml dans des tubes Falcon, puis nous les plaçons en centrifugeuse (4500 rpm) pendant 15 min à 4°.
II) Midipréparation
Afin de récupérer le plasmide en grande quantité, nous effectuons une midipréparation.
Nous récupérons les 6 tubes dans lesquels nous observons 2 phases : le culot contenant les bactéries et le liquide du LB. Nous évacuons le LB des 6 tubes pour ne conserver que le culot de bactéries. 8 ml de Buffer S1 sont ajoutés dans le premier tube afin de resuspendre les bactéries. Cette étape permet de catalyser la dégradation des ARN et de resuspendre le culot bactérien.
Nous ajoutons ensuite 8 ml de tampon de lyse (S2) dans le tube conservé. Cela permet d’éclater les bactéries et donc de libérer le plasmide. Un autre tampon est aussi utilisé afin de faire précipiter les sels. Nous ajoutons ensuite 8 ml de S3 (inhibiteur du S2), puis nous homogénéisons par inversement 6 à 8 fois jusqu’à ce que la solution précipite. Le tube est incubé dans la glace 5 min. Avant d’utiliser la colonne, nous la plaçons au dessus d’un tube Falcon et nous l’équilibrons en ajoutant 2,5 ml de Buffer N2. La colonne se vide. Nous clarifions ensuite le lysat en le faisant passer à travers un filtre sous Sorbonne. Ensuite, nous récupérons le liquide filtré pour le verser dans la colonne, puis nous le laissons s’écouler. Une fois le liquide écoulé, un lavage de la colonne est effectué avec 12 ml de Buffer N3 (wash buffer). Suite à ça, nous effectuons une élution de l’ADN plasmidique avec 5 ml de Buffer N5 à température ambiante au dessus d’un nouveau tube propre. Le filtrat est récupéré, puis quantifié au spectrophotomètre (Nanodrop).
III) Validation du plasmide
Afin de valider notre plasmide, une PCR ainsi qu’une électrophorèse sur gel d’agarose sont réalisées.
La PCR (polymerase chain reaction) est une technique permettant d’amplifier l’ADN in vitro afin d’obtenir un grand nombre de copies d’une séquence d’ADN. Elle se fait en trois étapes ; une dénaturation de l’ADN (chauffage pour séparer les doubles brins d’ADN), une hybridation des amorces puis une élongation avec de l’ADN polymérase.
Mix PCR
Le mix de PCR se compose de :
-H2O ultrapure : 30,25µL -Buffer colorless 5X : 10µL -dNTP 10mM : 0,5µL -MgCL2 25mM : 3µL -Forward primer : 2,5µL (ici on utilise l’amorce EGFP-F)
-Reverse primer : 2,5µL, (ici on utilise Stom Bov R) -GoTaq : 0,25µL - l’ADN à amplifier (1 µL)
7 Paramètres PCR
Figure 4 : Paramètres du cycle PCR
Le cycle PCR commence d’abord par une dénaturation initiale à 95°C durant 5 minutes, puis une seconde dénaturation à 95°C pendant 30 secondes. Il effectue ensuite une phase d’hybridation des amorces à 65°C en 30 secondes, puis une élongation à 72°C pendant 1 minute. Ce cycle sera répété 40 fois et on termine par une élongation finale à 72°C durant 5 minutes.
Électrophorèse sur gel d’agarose
Afin d’observer la migration du produit de PCR, il est nécessaire de réaliser un gel.
Faire un gel à 1% d’agarose, avec donc 1g d’agarose + 100mL de tampon TBE à 0,5X. Mettre ce mélange aux micro-ondes 1min environ Une fois le mélange tiède, ajouter 2µL de BET, un agent intercalent de l’ADN (cancérigène). Verser le tout dans la cuve préalablement préparée avec les peignes, et attendre que le gel polymérise. Dès que le gel est prêt, retirer les peignes et le placer dans la grande cuve, puis recouvrir le gel avec du tampon BET (les puits doivent être bien recouverts par le liquide).
Dans le premier puits, mettre 5µL de ladder (marqueur de poids moléculaires). Dans les autres puits, mettre 5µL d’échantillon + 2µL de bleu de dépôt 6X
Une fois tous les puits remplis avec nos échantillons, lancer l’électrophorèse (100 volts) et attendre que l’ADN migre, soit environ 30min.
L’étape suivante consiste à observer les bandes sous UV.
IV) Séquençage
8
Partie 4 : Résultats et discussion
Suite à la midipréparation, nous avons quantifié notre produit au spectrophotomètre (Nanodrop) et nous avons obtenu les résultats suivants :
Sample ID ng/µL A260 260/230 260/280 Const.
C11-(E) MIDIPREP 488,4 9,768 2,33 2,12 50
EAU 0,39 0,008 -0,88 -6,05 50
Nous avons obtenu 488.4 ng/µL d’ADN dans notre tube. Etant donné que l’élution finale a été réalisé par 5 ml de tampon, nous avons donc obtenu environ 489 x 5000 (µl)= 2 445 000 ng soit 2.45 mg de plasmide pEGFPC11E.
On observe également que la préparation est de bonne qualité étant donné que les ratios sont tous supérieurs à 2.
Pour la PCR, voici ce que la migration sur gel a donné :
La PCR a bien fonctionné car nous pouvons observer une bande à 855 pb, ce qui est la taille du produit attendue.
Nous avons ensuite envoyé notre produit de PCR en séquençage avec l’oligo Bov Reverse, et nous avons obtenu la séquence suivante :
>C11-EF_EGFPC-F -- 18..900 of sequence CATGGACGAGCTGTACAGTCCGGACTCAGATCTCGAGCTATGTCTGACAAGCGGCCAGCA GTGGACACCCAAGCTCGGCGGCTTCCTGACTCCTTCAAGGATAGCCCCAGTACAGGCCTC GGTGTCTGTGGATGGATTTTGGTGGCTGTGTCGTTCTTGTTCACGGTTATAACTTTCCCA ATGTCAATATGGATGTGCATAAAGATCATAAAAGAATATGAAAGAGCTATCATCTTTAGA CTGGGTCGCATCTTACAAGGAGGAGCGAAAGGACCTGGCTTGTTTTTTATTCTGCCGTGC ACTGACAGCTTCATCAAAGTGGACATGAGGACTATTTCATTTGATATTCCTCCTCAGGAG ATCCTCACTAAGGACTCGGTCACCATCAGCGTGGACGGCGTGGTCTATTACCGTGTGCAG AACGCTACTCTGGCCGTGGCAAACATCACCAACGCTGACTCAGCAACCCGTCTCTTGGCA CAAACGACCCTGAGGAACGTCCTGGGCACCAAGAACCTTTCCCAGATCCTCTCTGACAGG GAGGAAATCGCACACAACATGCAGTGTACCCTGGATGATGCCACTGATGACTGGGGAATA Ladder | (+) | C11-E
9 AAGGTGGAGCGCGTGGAAATCAAGGACGTGAAGCTGCCAGTGCAGTTGCAGAGAGCCATG GCTGCAGAGGCAGAGGCGTCCCGGGAGGCCCGAGCCAAGGTCATTGCGGCTGAGGGAGAA ATGAACGCGTCCAGGGCTCTGAAAGAGGCCTCCATGGTCATCACCGAGTCTCCCGCCGCC CTCCAGCTGCGGTACCTGCAGACGCTGACCACCATTGCTGCTGAGAAAAACTCGACCATC ATCTTCCCTCTGCCCATAGACATGCTGCAGGCTATCTGGCCCC
A l’aide du logiciel Expasy translate tool, nous avons pu obtenir la séquence en protéines. Cette séquence en pro-téines à été alignée avec la séquence de référence F1N2R1 récupérée via le logiciel UniprotKB, puis après avoir récupéré la séquence FASTA (séquence en acides aminés), nous avons réalisé l’alignement avec le logiciel Clustal Omega. Voici ce que nous avons obtenu :
D’après l’alignement, on observe 100% d’homologie avec la séquence de référence de la stomatine bovine.Notre plasmide contient bien la stomatine.
Conclusion
Les différents objectifs que nous souhaitions atteindre ont été validés durant ce stage. Nous avons en effet obtenu une bonne quantité d’ADN plasmidique suite à l’amplification, ce qui nous a permis par la suite d’obtenir de bons résultats pour la PCR et le séquençage. La séquence qui nous avons clonée est bien identique à la séquence de référence. Ce plasmide pourra être utilisé par la suite pour étudier le rôle biologique de la stomatine in vitro dans un modèle cellulaire.
Ce stage de six semaines au sein de l’INRA était ma première expérience en laboratoire. Il m’a permis de découvrir un peu plus le monde du travail et m’a fait comprendre qu’il existait une différence entre ce qu’on apprenait en cours et ce qui se passait réellement en laboratoire. Sur le plan pratique, j’ai pu mettre en œuvre ce que j’avais appris en cours, et j’ai pu découvrir énormément de choses notamment lors des manipulations. Il m’a également montré que c’était un domaine dans lequel le travail en équipe était indispensable et que la patiente était le mot maître. Ce stage aura été pour moi très enrichissant et m’aura apporté beaucoup de nouvelles connaissances.
10
Bibliographie
Umlauf E, Csaszar E, Moertelmaier M, Schuetz GJ, Parton RG, Prohaska R (2004) Association of
stomatin with lipid bodies. J Biol Chem. 279(22):23699-709 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15024010
Hue-Beauvais C, Chavatte-Palmer P, Aujean E, Dahirel M, Laigre P, Péchoux C, Bouet S, Devinoy E, Charlier M. (2011) An obesogenic diet started before puberty leads to abnormal mammary
gland development during pregnancy in the rabbit. Dev Dyn. 240(2):347-56 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21246651
Cebo C, Lopez C, Henry C, Beauvallet C, Ménard O, Bevilacqua C, Bouvier F, Caillat H, Martin P. (2012) Goat α (s1)-casein genotype affects milk fat globule physicochemical properties and the
composition of the milk fat globule membrane. J Dairy Sci. 95(11):6215-29. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pumed/22921619
