Polymères aux interfaces : études par microscopie à force atomique

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force atomique

Frederic Dubreuil

To cite this version:

Frederic Dubreuil. Polymères aux interfaces : études par microscopie à force atomique. Polymères.

Université Grenoble Alpes, 2016. �tel-01729170�

Polymères aux interfaces :

études par microscopie à force atomique

présentée par Frédéric DUBREUIL

Présentation prévue le 30 Juin 2016

J URY

Luc P ICTON Professeur des Universités, Rouen Rapporteur Laurent D AVID Professeur des Universités, Lyon Rapporteur Mounir M AALOUM Professeur des Universités, Strasbourg Rapporteur Claude V ERDIER Directeur de Recherches CNRS, Grenoble Examinateur

Frédéric C HANDEZON Ingénieur CEA, Grenoble Examinateur

1 Curriculum Vitae 4

2 Production scientifique 8

3 Synthèse des travaux de recherche 13

3.1 Propriétés mécaniques de microcapsules de polyÉlectrolytes . . . . 18

3.2 Imagerie des assemblages de polysaccharides : organisation, propriétés . . . . 23

3.2.1 Caractérisation des nanocristaux de cellulose . . . . 23

3.2.2 Assemblages de nanocristaux de cellulose et de polysaccharides . . . . 24

3.2.3 Observation et dégradation d’une hémicellulose . . . . 27

3.2.4 Assemblages lectines-sucres . . . . 30

3.3 Caractérisation des Interactions par Spectroscopie de Force . . . . 32

3.3.1 Propriétés mécaniques de vésicules recouvertes de chitosane . . . . 32

3.3.2 Interactions Hôte-invité entres polysaccharides modifiés . . . . 34

3.3.3 Interactions entre oligo-alginates par complexation des ions calcium . . . . 36

4 Recherches actuelles et perspectives 41

5 Annexes 48

3

F RÉDÉRIC DUBREUIL

Né le 22 avril 1973 Adresse personnelle

Nationalité Française 10 rue des Teinturiers, 69003 Lyon.

Marié Tel : 06.25.97.09.65

Adresse professionnelle

Centre de Recherches sur les Macromolécules Végétales CERMAV, BP 53 38041 Grenoble cedex 9.

Tel : 04.76.03.76.72

Courriel : frederic.dubreuil@cermav.cnrs.fr

E XPÉRIENCES EN RECHERCHE

2004 - présent Centre de Recherches sur les Macromolécules Végétales (CNRS UPR 5301) - Maître de Conférences à l’Université Joseph Fourier, section 33 du CNU.

Analyse conformationnelle des polysaccharides en solution et aux interfaces, Etudes par microscopie à force atomique.

2001 - 2003 Max-Planck Institut für Kolloid und Grenzflächenforschung (MPI-KG Potsdam, Allemagne) - Stage Post-Doctoral dans le groupe du Pr. Möhwald.

Sujet : Etude des propriétés d’adhésion et de déformation de capsules de po- lyélectrolytes.

1998 - 2001 Service de Physique de l’Etat Condensé (CEA/Saclay) - Thèse de doctorat sous la direction de P. Guenoun.

Sujet : Structure et déformation des films de Langmuir : application aux co- polymères diblocs neutres-chargés.

1997 - 1998 CEA/DAM/Le Ripault (37) - Scientifique du contingent.

1996 - 1997 Institut Curie (75) - Stage de DEA au Laboratoire de Physico-Chimie de l’Institut Curie dans l’équipe de F. Rondelez.

F ORMATION

1998 - 2001 Doctorat de l’Université Paris VI. Spécialité : Physique des Liquides. sous la direction de P. Guenoun au CEA Saclay. Mention très honorable.

Sujet : Structure et déformation des films de Langmuir : application aux co- polymères diblocs neutres-chargés.

1996 - 1997 DEA de Physique des Liquides, de l’Université Paris VI. Mention Bien.

1993 - 1997 Diplôme d’ingénieur de l’Ecole Supérieure de Physique et de Chimie In- dustrielles de la ville de Paris, ESPCI (10 rue Vauquelin, 75231 Paris cedex 05). Option Physique.

1991 - 1993 Classes Préparatoires aux Grandes Ecoles au lycée Jeanson de Sailly (75016

Paris). Option P*.

D OMAINES DE COMPÉTENCES T ECHNIQUES DE CHAMP PROCHE

• Microscopie à force atomique (AFM).

Opérations à l’air.

Opérations en milieu liquide.

• Spectroscopie de Force par AFM.

P HYSICO - CHIMIE DE LA MATIÈRE MOLLE

• Rhéologie de polymères hydrosolubles.

• Thermodynamique des copolymères à blocs.

• Propriétés des brosses de polyélectrolytes.

• Multicouches de polyélectrolytes.

• Modifications chimiques de surfaces.

T ECHNIQUES OPTIQUES

• Microscopie de fluorescence.

• Microinterférométrie (RICM).

• Diffusion de la lumière.

L ANGUES ÉTRANGÈRES

Anglais Bonne maîtrise à l’oral et à l’écrit.

Allemand Compréhension orale et écrite. Séjour de plus de 2 ans à Potsdam (Allemagne).

Japonais Débutant.

A ^{CTIVITÉS D} ’ ENCADREMENT

P OST -D OCTORATS

• Brigitte Manship Post-doctorat co-encadré avec Raphael Passas (LGP2 Grenoble INP) avec un financement du Carnot Polynat (projet CellAdher 2014-2015). Titre du projet : Analyse multi-échelle des interactions entre fibres cellulosiques.

T HÈSES

• Anna Wolnick (Université Joseph Fourier, Grenoble). Thèse co-encadrée avec Karim Mazeau

avec un financement de l’ANR (projet Algimat 2009-2013). Titre de la thèse : Association de

copolymères à séquences (1-4)-α-L-guluronane en présence d’ions calcium. Thèse soutenue

le 5 Février 2014 (2 publications dont 1 publication en 1

auteur). Anna Wolnick est actuel-

lement en stage post-doctoral à Montpellier.

• Ilham Mkedder (Université Joseph Fourier, Grenoble). Thèse co-encadrée avec Redouane Borsali avec un financement du gouvernement Algérien (2008-2012). Titre de la thèse : Modi- fication et Dégradation Enzymatique de Polysaccharides : Investigation par Imagerie et Dif- fusion de Rayonnement, Thèse soutenue le 15 Novembre 2012 (1 publication en 1

auteur).

Ilham Mkedder est maintenant maître de conférences à l’université de Tlemsen (Algérie).

• Öznur Kaftan (Cotutelle Université Joseph Fourier, Grenoble/Bayreuth Universität). Thèse co-encadrée avec R. Auzély-Velty et A. Fery. (1/2 financement Marie-Curie 2007-2008). Titre de la thèse : Assemblages de Polysaccharides Hôtes et Invités en Surface : Synthèse et Rôle des Interactions Multivalentes. Thèse soutenue le 20 Mai 2011 (3 publications dont 1 publication en 1

auteur). Öznur Kaftan est actuellement employée chez Siemens.

S TAGES

• 2015-2016 Marc Neyens co-encadrement du DRI avec Sonia Molina-Boisseau et Philippe Garnier, DRI effectué dans l’entreprise ST-Microelectronique pendant 18 mois et soutenu le 30/04/2016.

• 2016 Carine Roux stage Master 1 Chimie et Vivant (Université Grenoble-Alpes) de 4 mois.

Roubiol Daniel stage Master 1 Chimie et Nanosciences (Université Grenoble-Alpes), 2 mois, co-encadré avec J. Dejeu.

• 2015 Cherine Harbouche stage Master 1 Génie des Procédés (Université Joseph Fourier) de 3 mois.

Paul Tuiller Master 1 Chimie et Nanosciences (Université Joseph Fourier) de 2 mois co- encadré avec J. Dejeu.

• 2014 Antoine Baudry stage Master 1 Chimie et Nanosciences (Université Joseph Fourier), 4 mois, co-encadré avec J. Dejeu.

• 2013 Sophie Brenet stage Licence 3 chimie-biologie (Université Joseph Fourier) de 2 mois.

• 2011 Chiara Bertolina stage Master 2 polymères pour technologies avancées (Université Joseph Fourier) de 6 mois, co-encadrée avec B. Jean.

• 2009 Oussama El Baradeï stage Master 2 physique (Université Joseph Fourier) de 6 mois, étudiant Erasmus.

• 2008 Bailo Diallo, stage Master 1 chimie et vivant (Université Joseph Fourier), 4 mois, co- encadré avec B. Jean.

• 2007 Barbara Viljetic stage de Thèse, Strossmayer University, (République slovaque), Stage Marie-Curie de 3 mois.

• 2006 Rick Reekers stage Licence, Hogeschool Zeeland, Pays-bas stage de 4 mois.

Jean-Sebastien Siviero, stage Master 1 chimie et vivant (Université Joseph Fourier) de 4 mois.

• 2005 Golnoush Abbasi, stage Master 1 chimie et vivant (Université Joseph Fourier) de 3 mois.

Bruno Lions, stage Master 1 chimie et vivant (Université Joseph Fourier) de 4 mois.

Linda Ferez, stage Master 2 polymères pour technologies avancées (Université Joseph Fou-

rier) de 6 mois.

E NSEIGNEMENTS ET RESPONSABILITÉS PÉDAGOGIQUES E NSEIGNEMENTS RÉALISÉS EN MASTER :

• Master 2 Nanosciences Nanotechnologies

depuis 2007 "UE Caractérisation des interfaces et interactions moléculaires" cours Introduc- tion to Scanning Probe Microscopy (6h)

• Master 2 Génie des Procédés option Formulation

depuis 2012 "UE Caractérisation de Surfaces" cours et TD Techniques de Caractérisation de Surfaces (20h)

• Master 2 Polymères pour Technologies Avancées (PTA) TP de polymères (48h puis 24h) (2005-2007/2009-2011)

• Master 1 de Physique

TP du cours Microscopie de champ proche (20h) 2007-2009

• Master Chimie et procédés majeure M 1 Formation enseignants 2010-2013 UE Nano, cours Nanochimie

• Master Chimie et procédés majeure M1 Génie des Systèmes Industriels (GSI) depuis 2006, UE Polymère, Cours (14h) TD (7h) et TP (16h), responsable de l’UE Responsable de la Majeure M1 GSI de 2007 à 2010

• Master Chimie et procédés majeure M1 Chimie et Vivant :

2007-2010 UE Physico-chimie des polymères Cours (30h) TD (9h) et TP (12h), responsable de l’UE

Master Chimie et procédés majeure M1 Chimie et Vivant :

Depuis 2010 UE Physico-chimie des polymères I et II Cours (45h), TD(25h), parcours français et internationaux, responsable de l’UE PolyII

E NSEIGNEMENTS RÉALISÉS EN LICENCE :

• UE Thermodynamique et cinétique chimique

2007-2012 cours (15h), TD (25h) et responsabilité de l’UE depuis 2012 TD (25h) et TP (12h)

• UE Structure de la matière 2005-2006 TD et TP

• UE Chimie organique et inorganique

2013-2014 TD et TP de chimie organique (25h)

A UTRES E NSEIGNEMENTS :

• Depuis 2008 participation à l’encadrement des TP Microscopie de champ proche à l’ESONN (European School on Nanosciences and Nanotechnologies).

• En 2012 participation à l’encadrement du programme Nano@school.

II. P RODUCTION SCIENTIFIQUE

B IBLIOMÉTRIE

23 publications dans des journaux internationaux à comité de lecture, 877 citations, facteur H = 13 (source ISI Mars 2016)

P UBLICATIONS

1. Mechanical characterization of micrometric chitosan-coated vesicles by Atomic Force Micro- scopy,

M. Rinaudo, F. Quemeneur, F. Dubreuil, A. Fery and B. Pépin-Donat, International Journal of Polymer Analysis and Characterization 18(8), 617-626, (2013)

2. Amphiphilic copolymers based on polyoxazoline and grape seed vegetable oil derivatives : self- assemblies and dynamic light scattering,

C. Travelet, M. Stemmelen, V. Lapinte, F. Dubreuil, J J. Robin and R. Borsali, Journal of Nanoparticle Research 15, 1626, (2013)

3. Preparation and enzymatic hydrolysis of nanoparticles made from single xyloglucan polysaccha- ride chain ,

I. Mkedder, C. Travelet, A. Durand-Terrasson, S. Halila, F. Dubreuil, and R. Borsali, Carbohydrate Polymers 94, 934-939, (2013)

4. Physicochemical and morphological characterization of glyceryl tristearate/castor oil nanocar- riers prepared by the solvent diffusion method,

C.L. Dora, J-L. Putaux, I. Pignot-Paintrand, F. Dubreuil, V. Soldi, R. Borsali, and E. Lemos-Senna, Journal of the Brazilian Chemical Society 23, 1972-1981, (2012)

5. Aqueous RAFT Polymerization of N-Acryloylmorpholine, Synthesis of an ABA Triblock Glyco- polymer and Study of its Self-Association Behavior ,

L. Albertin , A. Wolnik , A. Ghadban and F. Dubreuil, Macromolecular Chemistry and Physics 213, 1768-1782, (2012)

6. Probing multivalent interaction by host guest interactions,

O. Kaftan, S. Tumbiolo, B. Senger, F. Dubreuil, R. Auzely-Velty, A. Fery and G. Papastavrou, J. Phys.

Chem. B 115, 7726-7735, (2011)

7. Designing hyaluronic acid-based layer-by-layer capsules as a carrier for intracellular drug deli- very,

A. Szarpak, D. Cui, F. Dubreuil, B.G. De Geest, L.J. De Cock, C. Picart and R. Auzely-Velty, Bioma- cromolecules 11, 713-720, (2010)

8. Structural basis of the affinity for oligomannosides and analogs displayed by BC2L-A, a Burkhol- deria cenocepacia soluble lectin ,

E. Lamegnière, T.C. Shiao, R. Roy, M. Wimmerova, F. Dubreuil, A. Varrot and A. Imberty, Glycobio- logy 20, 87-98, (2010)

9. Non-electrostatic building of biomimetic cellulose xyloglucan multilayers,

B. Jean, L. Heux, F. Dubreuil, G. Chambat and F. Cousin , Langmuir 25, 3920-3923, (2009)

10. The shape and size distribution of crystalline nanoparticles prepared by acid hydrolysis of native cellulose ,

S. Elazzouzi Hafraoui, Y. Nishiyama, J.L. Putaux, L. Heux, F. Dubreuil and C. Rochas, Biomacromo- lecules 9, 57-65, (2008)

11. Structural details of cellulose nanocrystals/polyelectrolytes multilayers probed by neutron reflec- tivity and AFM,

B. Jean, F. Dubreuil, L. Heux and F. Cousin, Langmuir 24, 3452-3458, (2008)

12. Measuring mechanical properties of polyelectrolyte multilayer thin films : Novel methods based on AFM and optical techniques ,

C. Picart, B. Senger, K Sengrupta, F. Dubreuil and A. Fery, Colloids and Surfaces A 303, 30-36, (2007)

13. Mechanical properties of freestanding polyelectrolyte capsules : a quantitative approach based on shell theory,

N. Elsner, F. Dubreuil and A. Fery, Progress in Colloid and polymer Science 132, 117-123, (2006)

14. Buckling of charged diblock copolymer monolayers at the air water interface,

F. Dubreuil, P. Fontaine, M. Alba, J. Daillant, J.W. Mays, G. Zalczer and P. Guenoun, Europhysics Letters 70, 1-7, (2005)

15. Interactions between silica surfaces coated by polyelectrolyte multilayers in aqueous environ- ment : comparison between precursor and multilayer regime,

V. Bosio, F. Dubreuil, G. Bogdanovic and A. Fery, Colloids and Surfaces A 243, 1078-1081, (2004)

16. Tuning of microcapsule adhesion by varying the capsule wall thickness, N. Elsner, F. Dubreuil and A. Fery, Physical Review E 69, 031802, (2004)

17. Mechanics of Artificial Microcapsules,

A. Fery, F. Dubreuil and H. Möhwald, New Journal of Physics 6, 18, (2004)

18. Polyelectrolyte Capsules Modified with YF

Nanoparticles : An AFM Study,

F. Dubreuil, D. G. Shchukin, G. B. Sukhorukov and A. Fery, Macromolecules Rapid Communication 25, 1078-1081, (2004)

19. Effect of shear stress on adhering polyelectrolyte capsules,

A.L. Cordeiro, M. Coelho, G.B. Sukhorukov, F. Dubreuil and H. Möwald, Journal of Colloid and Interface Science 280, 68-75, (2004)

20. Direct Topographic Measurements of Multilayers on Water by Atomic Force Microscopy, F. Dubreuil, J. Daillant and P. Guenoun, Langmuir 19, 8409-8415 (2003)

21. Elastic properties of polyelectrolyte capsules studied by atomic force microscopy and RICM, F. Dubreuil, N. Elsner and A. Fery, The European Physical Journal E 12, 215-221, (2003)

22. Polyelectrolytes tethered to a free surface,

F. Dubreuil and P. Guenoun, The European Physical Journal E 5, 59-64 (2001)

23. Structure and buckling of charged diblock copolymer films at liquid interfaces,

F. Dubreuil, G. Romet-Lemonne, P. Guenoun, J. Yang, J.W. Mays and J. Daillant, Advances in Colloid

and Interface Science 94, 151-165 (2001)

24. Formation initiale des Enseignants de Physique-Chimie : l’Ouverture aux Nanosciences & Na- notechnologies,

F. Dubreuil, A. Baudrant, Ch. Rambaud and F. Marchi, J3eA : Journal sur l’enseignement des sciences et technologies de l’information et des systèmes 13 (2014)

C OLLOQUES SANS ACTES

Contributions orales

Mechanical properties of hollow capsules,

F. Dubreuil, A. Fery, H. Möhwald, EC network "Nanocapsules", Ringberg (Allemagne), 24-27 novembre 2002.

Adhesion and mechanics of hollow capsules,

F. Dubreuil, A. Fery, Polyelectrolytes 2002, Lund (Suède), 15-19 juin 2002.

Atomic Force Microscopy on Gaz/Liquid Interfaces,

F. Dubreuil, P. Guenoun, J. Daillant, GDR franco-allemand "Fluides complexes en dimension deux et demi", Montpellier (34), 11-12 octobre 2001.

Déformation de monocouches sous compression,

F. Dubreuil, Rencontre de Physique Statistique, Paris, 25-26 janvier 2001.

Deformation of polyelectrolyte monolayers under pressure,

F. Dubreuil, J. Daillant, P. Guenoun, J.W. Mays, P. Fontaine, O. Konovalov, GDR franco-allemand "Fluides complexes en dimension deux et demi", Berlin (Allemagne), 3-6 décembre 2000.

Flambage de brosses de polyélectrolytes,

F. Dubreuil, J. Daillant, P. Guenoun, GDR "Films Moléculaires Bidimensionnels", Obernai (67), 26-30 juin 2000.

Posters

Probing alginates gelation process by SPM,

F. Dubreuil, A. Wolnik, K. Mazeau, A. Heyraud, L. Albertin, Ecole du Labex Arcane, La Londe les Maures (France), 23-30 Juin 2015.

Probing alginates gelation process by SPM,

F. Dubreuil, A. Wolnik, K. Mazeau, A. Heyraud, L. Albertin, Forum des Microscopies à sonde locale, Troyes (France), 23-30 Mars 2015.

Etude de la gélification d’alginates par AFM,

F. Dubreuil, A. Wolnik , K. Mazeau, A. Heyraud, L. Albertin, GFP 2012, Grenoble (France), 12-22 Novembre 2012.

Probing alginates gelation process by SPM,

F. Dubreuil, A. Wolnik, K. Mazeau, A. Heyraud, L. Albertin, SPM on SPM 2012, Kerkrade (Pays-Bas), 23-30 septembre 2012.

Preparation and Enzymatic Hydrolysis of Polysaccharide Based Nanoparticles,

I. Mkedder, C. Travelet, A. Durand-Terrasson, F. Dubreuil, R. Borsali, ICBMC 2012, Marrakesh (Maroc), 22-24 février 2012.

Innovative hybrid polymeri materizals from oligoalginates,

A. Wolnik, A. Ghabdan, L. Albertin, M. Rinaudo, A. Heyraud, F. Dubreuil, K. Mazeau, Plant and Seaweed Polysaccharides Workshop 2012, Nantes (France), 17- 20 juillet 2012.

Etude par AFM des propriétés élastiques de vésicules lipidiques décorées par du chitosane,

F. Dubreuil, F. Quemeneur, M. Rinaudo, B. Pépin-Donat, GFP 2008, Lyon (France), 25-28 octobre 2008.

Structural details of cellulose nanocrystals/polyelectrolytes multilayers probed by neutron reflectivity and AFM ,

B. Jean, F. Dubreuil, L. Heux et F. Cousin, International Conference on Surface X-ray and Neutron Scattering, Paris (France), 02-05 juillet 2008.

Structural details of cellulose nanocrystals/polyelectrolytes multilayers probed by neutron reflectivity and AFM ,

B. Jean, F. Dubreuil, L. Heux et F. Cousin, Surfaces and Interfaces in Soft Matter and Biology, Grenoble (France), 22-23 mai 2008.

Cellulose nanocrystals based multilayers,

B. Jean, F. Dubreuil, L. Heux et F. Cousin, ECIS, Genève (Suisse), 10-14 septembre 2007.

Layer-by-layer assembly of cellulose nanocrystals,

B. Jean, F. Dubreuil, L. Heux et F. Cousin, ILL Soft Matter User Meeting, Grenoble (France), 22-24 novembre 2006.

Morphology and structure of short-chain starch crystals,

J.-L. Putaux, N. Montesanti, G. Potocki-Veronese, D. Dupeyre, A. Buléon, F. Dubreuil, 16th International Microscopy Congress (IMC16), Sapporo (Japon), 2006.

Mechanical properties of hollow capsules,

F. Dubreuil, N. Elsner, A. Fery, H. Möhwald, Soft Matter 2003 Bilateral Symposium LRSM(Philadelphie)/MPIKG, Golm (Allemagne), 12-13 mai 2003.

Mechanical properties of hollow capsules,

F. Dubreuil, N. Elsner, A. Fery, H. Möhwald, DPG-Frühjahrstagung, Dresden (Allemagne), 24-28 mars 2003.

Buckling of charged diblock copolymer films at air/water interface,

F. Dubreuil, J.W. Mays, P. Fontaine, O. Konovalov, J. Daillant, P. Guenoun, Chains@Interfaces 2001, Evora (Portugal), 14-19 janvier 2001.

Flambage de polyélectrolytes à l’interface eau/air,

F. Dubreuil, J.W. Mays, P. Fontaine, O. Konovalov, J. Daillant, P. Guenoun, 7

Journées de la Matière Condensée, Poitiers (86), 29-31 août 2000.

Flambage de brosses de polyélectrolytes à l’interface eau/air,

F. Dubreuil, J. Daillant, P. Guenoun, GDR "Films Moléculaires Bidimensionnels", Carcans-Maubuisson (33), 21-24 septembre 1999.

AFM study of liquid interfaces flows,

F. Dubreuil, J. Daillant, P. Guenoun, NC-AFM’99, Pontrezina (Suisse), 1-4 septembre 1999.

Etude par AFM de défauts à des interfaces liquides,

F. Dubreuil, J. Daillant, P. Guenoun, Forum des microscopies à sonde locale, Autrans (38), 29-31 mars 1999.

III. S YNTHÈSE DES TRAVAUX DE RECHERCHE

Le fil conducteur de mon parcours scientifique repose sur l’étude des propriétés d’association aux interfaces de polymères chargés et leur investigation par les techniques de microscopie de champ proche. Mes travaux de thèse au CEA (Saclay) ont porté sur l’étude de systèmes de monocouches de copolymères à blocs neutres/chargés à l’interface eau/air et sur le développement d’un montage expé- rimental permettant l’observation de ces monocouches par microscopie à force atomique (AFM). Les films de Langmuir formés par ces systèmes ont été caractérisés par microscopie optique (contraste de phase), microscopie à l’angle de Brewster et diffusion de rayonnement X. Nous avons pu mettre en évidence le flambage de ces couches sous compression et la dépendence de ce phénomène avec les conditions de dépôt des polymères à la surface. En parallèle à ces mesures, un montage expérimental a été réalisé pour observer directement ce phénomène en concevant une cuve de Langmuir pour la po- sitionner sur un microscope à force atomique. Un système limitant l’amplitude des ondes de surface dues aux vibrations du système a permis l’observation directe d’une monocouche modèle à l’inter- face eau-air. Désirant approfondir l’usage de cette technique en tant que capteur de force local, j’ai ensuite entrepris un séjour post-doctoral en Allemagne (MPIKG-Potsdam) pour étudier les proprié- tés mécaniques de capsules de polyélectrolytes auto-assemblées par la technique couche par couche (LbL). J’ai développé un montage expérimental combinant la microscopie de contraste interférentiel (RICM) et la microscopie de champ proche pour décrire le comportement mécanique de ces objets pour de petites déformations. Depuis mon arrivée au CERMAV, j’ai utilisé la microscopie à force ato- mique comme moyen d’investigation des objets d’étude des différentes équipes : les polysaccharides et leurs assemblages sur une surface, que ce soit dans les domaines de l’imagerie pure, des mesures mécaniques ou de la reconnaissance moléculaire.

Dans ce manuscrit par soucis de clarté, les publications pour lesquelles j’ai contribué apparaîtront en bleu.

L A MICROSCOPIE À FORCE ATOMIQUE

La microscopie à force atomique étant mon outil privilégié d’investigation, je vais dans un premier temps rappeler le principe de cette technique et ses deux modes principaux d’utilisation : l’imagerie et les mesures de force locale.

L’AFM ou microscopie à force atomique est une technique de microscopie de champ proche qui a été développée dans les laboratoires d’IBM à Zurich dans les années 1985 par Binnig, Quates et Gerber

à partir de travaux antérieurs sur le STM (scanning tunneling microscope,

prix Nobel 1986). Cette technique a connu un engouement assez rapide car le premier appareil commercial date de 1989 et des développements sont toujours en cours pour en étendre l’usage dans des domaines d’applications variés allant de la physique du solide à la biologie cellulaire. L’AFM utilise une sonde locale (une pointe fine au bout d’un levier souple généralement en silicium) qui se déplace au-dessus de la surface à étudier et qui est soumise aux interactions locales avec celle-ci, induisant une déflection

1. B

, G. et al. Phys. Rev. Lett. 1986, 56, 930–933.

2. B

, G. et al. Phys. Rev. Lett. 1982, 49, 57–61.

du levier et donc un suivi local de la topographie (cf Figure 1). Suivant le type de sonde utilisée et la nature des interactions entre la pointe et l’échantillon, on pourra distinguer différents types de forces d’interaction : force de contact, forces de Van der Waals, force electrostatique, force magnétique, etc ...

F IGURE 1 – Principe de fonctionnement de l’AFM

La force de cette technique réside dans le fait qu’il est possible de réaliser des images topogra- phiques de surfaces qui ne subissent aucun traitement préalable (pas de besoin de surface conductrice) dans n’importe quel milieu : air, eau, huile (pas de besoin de faire le vide). Les principales applica- tions de l’AFM sont l’utilisation en tant que profilomètre à l’échelle nanométrique ou comme sonde locale de force (le levier peut être considéré comme un ressort).

• La réalisation d’images

La microscopie à force atomique est aujourd’hui principalement utilisée pour enregistrer des images topographiques de différentes surfaces. 3 modes standards sont couremment employés pour réaliser ces études :

— Le mode contact. Comme son nom l’indique, la pointe est en contact avec l’échantillon et ce sont les forces de répulsions atomique à courte portée qui sont responsables de la déflection du levier. Une boucle d’asservissement permet alors de maintenir constante la déflection du levier pendant le balayage de l’échantillon et de reproduire ainsi la topographie de la surface.

Ce mode est simple et permet d’enregistrer rapidement des images à condition toutefois que

la surface de l’échantillon ne soit pas trop fragile : en effet la pointe étant très fine (rayon de

courbure moyen de 10 nm) la force de pression qui est exercée à son extrémité est très impor- tante (de l’ordre du GPa) ce qui peut déformer/dégrader la surface analysée. Un avantage est la possibilité de suivre en parallèle la friction de la pointe sur la surface et d’obtenir ainsi des in- formations complémentaires sur l’adhésion de la pointe avec la surface. En pratique l’usage de ce mode d’imagerie sera utilisé pour des surfaces dures relativement planes (de faible rugosité) qu’il est possible d’observer sous vide. Pour l’étude de la "matière molle" (objets biologiques, polymères) la présence d’une couche d’eau contaminante sur les objets à étudier conduit à la formation d’un ménisque et des forces capillaires pouvant limiter les observations. Une façon de se débarasser de ce problème sera de réaliser des images directement dans l’eau (voir par exemple les images obtenues par S.Scheuring sur des cristaux de protéines dans l’eau

) ou d’utiliser les autres modes d’imagerie.

— Le mode non-contact. Ce mode est dit dynamique car on fait vibrer le levier supportant la pointe à une fréquence supérieure ou égale à sa fréquence de résonance à une faible amplitude (typiquement moins de 10 nm) sans jamais toucher la surface de l’échantillon. Les interac- tions de van der Waals près de la surface (quelques nanomètres) induisent une diminution de la fréquence de résonance du levier. La boucle d’assservissement permet d’ajuster la position du levier de façon à maintenir soit la fréquence (frequency modulation) soit l’amplitude (am- plitude modulation) d’oscillation constante. La possiblité de suivre de façon très précise la fré- quence de d’oscillation du levier permet d’utiliser des leviers rigides et de suivre de façon très stable la surface. C’est par ce moyen qu’ont été obtenues les premières images de résolution atomique par AFM

. En modulation d’amplitude le suivi de la phase du signal d’oscillation (dépendant de la dissipation d’énergie du système) permet d’avoir des informations sur les différents types de matériaux à la surface

. C’est aussi ce mode d’asservissement que j’ai du utiliser durant mes travaux de thèse afin d’imager des films de Langmuir à l’interface eau/air

.

— Le mode tapping. C’est également un mode dynamique où la pointe vibre à une fréquence légèrement inférieure à la fréquence de résonance avec une amplitude pouvant aller jusque 200 nm. Ce mode a été introduit pour palier aux problèmes de stabilité dans le maintien de la distance pointe/échantillon dans le mode non-contact. Dans ce mode, la pointe vient briè- vement en contact avec le susbtrat à chaque oscillation. Ce mode est extrèmement populaire pour l’imagerie des "surfaces molles" car il ne perturbe quaisment pas les surfaces et permet de réaliser des mesures dans des environnements variés (air, eau etc...). Un très gros travail de synthèse les mesures en mode dynamique a été réalisé par R. Garcia,

qui est très actif no- temment dans le développement de nouveaux modes d’imagerie en AFM dynamique. Comme pour le mode non-contact, il est possible, à partir du signal de phase du levier, d’obtenir des informations sur la dissipation locale d’énergie du levier et de remonter ainsi à des variations

3. S

, S. et al. The EMBO journal 1999, 18, 4981–7.

4. G

, F. J. Reviews of Modern Physics 2003, 75, 949–983.

5. M

, N. F./G

, R. Nanotechnology 2006, 17, S167–72.

6. D

, F

Langmuir 2003, 157, 8409–8415.

7. G

, R. Surface Science Reports 2002, 47, 197–301.

locales d’adhésion ou de module élastique non détectables sur l’image de topographie.

• La spectroscopie de force

L’autre grande voie d’utilisation parfois méconnue de l’AFM est la mesure directe des forces d’in- teractions pointe/substrat en fonction de la distance entre la pointe et l’échantillon (on réalise alors des courbes de force). Pour ce faire, on suit la déflection du levier en fonction du déplacement de la cale piezoélectrique supportant la pointe.

Pour obtenir des informations quantitatives, il est nécessaire de relier les valeurs de déflection du levier (mesurées sur la photodiode de détection cf Figure 1) à la force réellement perçue par la pointe. Il nous faut donc connaitre la sensibilité optique et la raideur du levier utilisé et donc effectuer une calibration. Pour réaliser cette dernière, différentes méthodes

existent et permettent d’obtenir une précision courante de l’ordre de 10 %. Une méthode communément implantée dans les AFM récents utilise la mesure de l’amplitude d’oscillation du levier engendrée par son excitation thermique

. Il convient de noter que les valeurs de constante de raideur données par les fabricants sont des valeurs moyennes parfois très éloignées des valeurs réelles mesurées et peuvent varier d’un levier à un autre au sein d’une même boite ou il n’est ainsi pas rare d’avoir plus de 20 % de variation ces constantes de raideur. Une fois cette calibration effectuée il est alors possible de convertir notre courbe déflection/déplacement en une réelle courbe force/distance. Une courbe de force typique sur un matériau mou et adhésif est représentée sur la Figure 2.

F IGURE 2 – Courbe force/distance typique entre une pointe AFM et un susbtrat défor- mable.

Comme on peut le voir sur cette figure, il est possible d’obtenir beaucoup d’informations diffé-

8. Te R

, J. et al. Ultramicroscopy 2011, 111, 1659–1669.

9. H

, J. L./B

, J. Rev. Sci. Instrum. 1993, 64, 1868.

rentes à partir de cette courbe : la force d’adhésion pointe/susbtrat, le module élastique du substrat, l’énergie dissipée lors du contact ainsi que la déformation maximale de l’échantillon. Suivant le type d’interactions entre la pointe et la surface, il est aussi possible d’enregistrer d’autres allures de courbes notamment lors de l’interaction entre une chaîne unique et la pointe. Pour une présentation plus ex- haustive de la mesure de force par AFM, j’invite le lecteur à se référer aux deux excellentes revues de B. Capella sur le sujet

.

10. C

, B./D

, G. Surface Science Reports 1999, 34, 1–104.

11. B

, H.-J. et al. Surface Science Reports 2005, 59, 1–152.

S TAGE P OST -D OCTORAL AU M AX -P LANCK -I NSTITUT FÜR K OL -

LOID UND G RENZFLÄSHENFORSCHUNG (MPI-KG) (2001-2004).

III.1 Propriétés mécaniques de microcapsules de polyélectrolytes.

Les capsules de polyélectrolytes sont considérées depuis leur invention au MPIKG

comme un système très prometteur pour la réalisation de systèmes biocompatibles ainsi que pour le transport et le relargage contrôlé de médicaments. Ces capsules sont en effet produites par la technique d’assem- blage couche par couche (Layer by Layer ou LbL) popularisée par G. Decher

et il est possible de faire varier de nombreux paramètres gourvernant leurs propriétés physico-chimiques. Ainsi, en jouant sur la nature du coeur sacrificiel servant de support aux polyélectrolytes, en modulant le nombre de couches de polymère ou en changeant la nature des polymères auto-assemblés, il est possible de faire varier les propriétés mécaniques des capsules sur une large gamme. La compréhension des relations entre l’architecture et les propriétés mécaniques des capsules est donc fondamentale pour dédier ces capsules à des tâches spécifiques. Par ailleurs, grâce à leur mode de production il est possible de faire varier les propriétés de la surface des capsules (choix de la charge de surface, inclusion ou greffage chimique de molécules d’intérêt) et ainsi de modifier leurs propriétés d’adhésion.

Les travaux que j’ai réalisés au MPI-KG ont porté sur l’étude des propriétés mécaniques d’un sys- tème modèle de multicouches utilisant le couple polyallylamine hydrochloride (PAH) / polystyrène sulfonate (PSS) comme polyélectrolytes constituant la paroi et le polystyrène comme coeur sacrificiel.

Parmi les différents substrats utilisés pour faire l’assemblage des parois de polymère, il est possible de recourir à des billes de mélamine formaldéhyde qui permettent d’avoir une bonne polydispersité mais pour lesquelles la dissolution complète du coeur reste problématique. L’utilisation du carbonate de calcium est, de plus en plus, en vogue grâce à sa biodégradabilité et sa biocompatibilité. Toutefois il présente une grande polydispersité associée à une forte tendance à s’aggréger durant l’assemblage

. Les billes de silice sont très monodisperses mais le principal frein à leur utilisation est la nécessité de dissoudre le coeur à l’acide fluorhydrique

. Le polystyrène permet d’obtenir des capsules très monodisperses mais il faut prendre garde à la bonne dissolution du coeur.

Un très grand nombre de polymères a été utilisé pour construire des multicouches, polyélectro- lytes faibles ou forts, synthétiques ou naturels, charges minérales etc... Le choix guide la structure finale du film ainsi que ses propriétés physico-chimiques. Ainsi, le polydimethyldiallylammonium chloride (PDADMAC) associé au PSS permet d’obtenir des capsules sensibles à la température

tandis que l’association du PAH avec l’acide polymethacrylique (PMA) conduit à la formation de capsules sensibles au pH.

Le choix de la force ionique du milieu, du contre-ion ainsi que la nature des polyélectrolytes permet de faire varier la croissance de l’épaisseur de la multicouche d’un régime

12. D

, E. et al. Angewandte Chemie 1998, 2202–2205.

13. D

, G. et al. Thin Solid Films 1992, 210-211, 831–835.

14. V

, D. V. et al. Langmuir 2004, 20, 3398–3406.

15. S

, P./C

, F. Advanced Functional Materials 2003, 13, 929–937.

16. L

, S. et al. The European Physical Journal E 2001, 20, 13–20.

17. M

, T. et al. Macromolecular Rapid Communications 2004, 25, 1781–1785.

linéaire à un régime quasi exponentiel. Le couple PAH/PSS est un système qui, en conditions stan- dards (pH=5,5, 0,1 M NaCl) assure une croissance linaire de l’épaisseur

.

En préambule à l’étude mécanique des capsules, une étude a été réalisée en collaboration avec V.

Bosio

sur les interactions entre des surfaces de silice recouvertes par la technique LbL. Ce travail préliminaire a permis de caractériser la façon dont s’organise la construction du sytème de multi- couche. Le suivi du potentiel et de la charge de surface a montré l’existence d’un régime "précurseur"

de quelques bicouches pour lequel la surface est peu homogène et présente une rugosité (à l’échelle du micromètre) marquée. Cependant, un suivi du potentiel zeta et de l’épaisseur de la couche des particules indique une bonne couverture globale et un régime parfaitement linéaire de la croissance de l’épaisseur de la couche. L’utilisation d’un primaire d’accroche constitué de polyéthylène imine ne change en rien le mécanisme de croissance de la multicouche mais permet de supprimer ce régime précurseur de s’assurer de l’homogénéité de la couverture de la surface. Aujourd’hui la plupart des personnes utilisent en effet le PEI comme couche primaire d’accroche du système sur la silice ou le silicium car le PAH ne s’y dépose pas avec une bonne homogénéité.

Pour caractériser la déformation des capsules sur des lames de verre, nous avons choisi de combi- ner la spectroscopie de force et l’imagerie RICM (reflection interference contrast microscopy). Cette technique d’interférométrie a été développée dans les années 80

dans le groupe du Professeur Sackmann à Munich dans le but d’étudier l’adhésion de systèmes modèles (vésicules, membranes) sur des substrats plans. La mesure de l’intensité lumineuse permet, moyennant un traitement numé- rique adapté, de retrouver dans des cas simples, la distance entre l’objet et la surface. Si la résolution latérale des images reste limitée par le critère de Rayleigh (cela reste une technique optique), il est en revanche possible d’obtenir une résolution de l’ordre de quelques nanomètres sur les mesures de distance au substrat. Nous avons donc mesuré (cf Figure 3) l’aire d’adhésion de la capsule sur le sub- strat ainsi que la distance entre la paroi de la capsule et la surface de verre à partir de la position des franges d’interférence observées autours de la zone de contact.

Nous pouvons ainsi constater sur la Figure 3 que les capsules ne sont pas déformées en dehors de la zone de contact, elles conservent une forme de sphère tronquée. De plus l’aire de la surface d’adhésion dépend de l’épaisseur des capsules

(Figure 4). Plus on augmente le nombre de couches, plus on rigidifie le système ce qui diminue l’adhésion des objets. Ce résultat est important pour permettre la mise au point de systèmes à relargage contrôlé d’un vecteur ou d’un principe actif

Nous avons mis au point un dispositif couplant l’imagerie RICM à des mesures de force par sonde colloïdale en AFM, permettant de suivre, à la fois la déformation de la zone de contact et la déformation globale des capsules en fonction de la force appliquée par la sonde, nous donnant ainsi accès à des mesures quantitatives des propriétés mécaniques des capsules (cf Figure 6A).

Pour de faibles déformations (de l’ordre de l’épaisseur de la paroi), les capsules se comportent

18. K

, W. Curr. Opin. Colloid Inferface Sci. 1996, 1, 137–143.

19. B

, V

Colloids and Surfaces A 2004, 243, 147–155.

20. R

, J./S

, E. Journal de Physique II 1993, 3, 727–748.

21. Z

, A. et al. Journal de Physique 1987, 48, 2139–2151.

22. E

, N

Phys. Rev. E 2003, 69, 031802.

F IGURE 3 – Images RICM d’une capsule de 20 µm de diamètre composée de multi- couches de PSS et PAH adhérant sur du verre. Profil de la capsule obtenu en dehors de la zone d’adhésion et l’ajustement par une forme de sphère tronquée du même dia- mètre.

F IGURE 4 – Images RICM de capsule de 20 µm de diamètre composée de multicouches de PSS et PAH adhérant sur du verre A) 8 couches. B) 10 couches apparition d’une instabilité de flambage dans la zone d’adhésion. C) 14 couches la surface d’adhésion est quasi nulle.

F IGURE 5 – Dispositif expérimental. Mesure de la force de réponse d’une capsule de

PSS/PAH de 10 microns aux faibles déformations

comme des objets élastiques et nous avons mis en évidence la dépendance de leur élasticité avec l’épaisseur de leur paroi (h), leur taille (R) et leur composition

. Pour déterminer le module élastique des capsules, nous avons utilisé le modèle de Reissner sur la réponse d’une coque élastique (homogène, de module d’Young E et coefficient de Poisson ν) sous une déformation () ponctuelle il permet de décrire la réponse élastique (F) de la capsule comme suit :

F = 4Eh

R ^q 3(1 − ν

)

Ce modèle s’ajuste parfaitement aux données obtenues et rend bien compte des variations de l’élasticité avec le rayon et l’épaisseur des capsules (cf figure 5A). Des calculs de déformation de ces systèmes par la méthode des éléments finis, en utilisant les données obtenues par ce modèle, donnent exactement la réponse expérimentale sans aucun ajustement

. Finalement, le module d’Young me- suré pour des capsules composées de multicouches de PSS et de PAH de 290 MPa confirme les résul- tats obtenus par d’autres méthodes (nanoindentation ou flambage) sur des films de même nature

.

F IGURE 6 – A)Variations de l’élasticité des capsules avec leur rayon et l’épaisseur des parois. B) Suivi de la réponse élastique d’une capsule aux grandes déformations on note l’augmentation de la surface d’adhésion (1-2) et les instabilités liées au flambage (3, 5, 6).

Des travaux similaires ont été conduits par O. Vinogradova

à Mayence en suivant la forme des capsules par microscopie confocale et la force par spectroscopie AFM. Le modèle utilisé pour décrire la réponse élastique des capsules (en supposant un volume constant) ne semble pas adapté à

23. D

, F

The European Physical Journal E 2003, 221, 215–221.

24. F

, A

New Journal of Physics 2004, 6, 18–38.

25. E

, N

Progr. Colloid Polymer Sci. 2006, 132, 117–123.

26. N

, A. J. et al. Macromolecules 2005, 38, 5367–5370.

27. P

, C

Colloids and Surfaces A 2007, 303, 30–36.

28. L

, V. V. et al. The Journal of chemical physics 2004, 120, 3822–6.

l’amplitude des déformations imposées (70 % de taux de compression) et leur mode de production (coeur de mélamine) les rends poreuses. C’est pourquoi de faibles valeurs de rigidité sont obtenues.

Des meilleurs résultats semblent être mesurés par des expériences de gonflement osmotique

. Pour de fortes contraintes appliquées, la déformation de la capsule ne peut plus être décrite par ce modèle de coque élastique. En effet, des instabilités de flambage apparaissent (cf Figure 6B) mo- difiant énormément la réponse de la capsule, la déformation pouvant rester élastique ou au contraire plastique.

Les capsules de polyélectrolyte ont un intérêt certain en tant que véhicule de transport de susb- tances ou micro-réacteurs, nous avons donc étudié la précipitation à l’intérieur d’une capsule d’un complexe YF3. Nous avons montré que le système modifie considérablement les propriétés méca- niques des capsules en les rendant à la fois plus resistantes à la compression par la sonde AFM mais aussi en supprimant partiellement l’instabilité de flambage sous forte compression et en diminuant le seuil de déformation plastique de notre objet

. Nous avons de plus noté l’inhomogénéité de la paroi des capsules rendant une quantification des propriétés mécaniques irréaliste.

De nombreux autres travaux ont été conduits depuis cette période sur les capsules de polyélectro- lytes portant à la fois sur les modes de production, d’encapsulation de principes actifs dans la parois ou dans le coeur, les moyens de ciblage et de relargages ainsi que les applications potentielles des cap- sules que ce soit dans le vivant (traitements anticancéreux, etc ...) ou dans la chimie (nanoréacteurs, catalyse, etc ...).

29. H

, J. et al. Langmuir 2005, 21, 3165–71.

30. L

, V. V. et al. Macromolecules 2003, 36, 2832.

31. D

, F

Macromolecular Rapid Communications 2004, 25, 1078–1081.

M AITRE DE CONFÉRENCE AU CERMAV (2004-).

Depuis mon arrivée au CERMAV, mon activité de recherche s’est articulée autour de deux thèmes principaux : d’une part démontrer les possiblités d’utilisation de l’imagerie par microscopie à force atomique dans un environnement pluridisciplinaire dans le domaine des sucres, de la physique des matériaux à base de polysaccharides au suivi in situ de systèmes en interactions, et d’autre part j’ai souhaité développer une activité propre portant sur les études d’interactions entre les polysaccharides et d’autres systèmes (polysaccharides, protéines) par des mesures de spectroscopie de force. L’AFM offre ainsi la possiblité de comprendre/caractériser à l’échelle moléculaire les interactions entre mo- lécules. Les sucres jouant un rôle important dans les phénomènes de reconnaissance moléculaire, la spectroscopie de force ouvre un lien entre les modélisations moléculaires et les mesures expérimen- tales.

III.2. Imagerie des assemblages de polysaccharides : organisation, propriétés

Une part importante de mon activité au CERMAV a été d’introduire les différentes possibilités d’utilisation de la microscopie à force atomique dans les études conduites au sein des différentes équipes. Pour lancer cette activité au sein du CERMAV et de l’ICMG, j’ai tout d’abord dû faire l’ac- quisition d’un AFM sur le plateau de caractérisation PCI de l’ICMG grâce aux crédits de l’opération

"Nanobio", AFM dont je suis toujours le responsable scientifique.

C ARACTÉRISATION DES NANOCRISTAUX DE CELLULOSE

L’équipe "Structure et Propriétes des Glycomatériaux" a ainsi très vite saisi le potentiel de l’AFM pour les caractérisations de leurs objets d’études principaux : les nanocristaux (les whiskers) de cellu- lose et de leurs assemblages. L’étude réalisée avec S. Elazzouzi, J.L. Putaux et Y. Nishiyama

illustre parfaitement la complémentarité de l’imagerie AFM avec la microscopie électronique en transmis- sion (MET) et la diffraction des rayons X pour la caractérisation des morphologies de nanocristaux de cellulose en fonction de leur origine végétale et des conditions utilisées pour leur préparation par hydrolyse acide de microfibrilles de cellulose native. Ces objets sont fortement anisotropes et se pré- sentent sous la forme de bâtonnnets. Leur observation par microscopie électronique est délicate car ce sont des objets fragiles qui sont très rapidement endomagés par le faisceau électronique. Le contraste de ces objets étant faible, les observations en MET se font après coloration négative et mettent en évidence des particules composées de quelques sous-unités associées parallèlement malgré un fort traitement préalable par sonication. Il n’est pas possible d’observer conjointement l’épaisseur et la largeur des objets par MET et l’acétate d’uranyle ajouté pour la coloration peut induire la formation d’agrégats indésirables.

32. E

-H

, S

Biomacromolecules 2008, 9, 57–65.

J’ai donc proposé d’utiliser l’AFM pour observer des cristaux non agrégés déposés sur du mica et en mesurer les sections. J’ai réalisé ces mesures sur des nanocristaux de coton et de tunicine (cf Figure 7). Les nanocristaux de coton sont des batonnets courts (100-200 nm) de section rectangulaire (26x6 nm

) alors que les nanocristaux issus du tunicier sont de long rubans (quelques microns) de section rectangulaire (12x9 nm

). Ces rubans subissent une torsion régulière de leur structure (probablement liée à l’hélicité de la cellulose). On peut constater que par AFM nous ne pouvons les cristallistes élémentaires de coton (de section carrée 6x6nm

) Par diffraction des rayons X, en utilisant la largeur des pics de diffraction correspondant aux différents plans cristallins, les dimensions des cristallites élementaires ont aussi pu être déterminées et confirment les résultats obtenus par AFM et MET.

F IGURE 7 – Images AFM en topographie de whiskers tuniciers sur wafer de silicium (A) Agrégats (B) Nanocristal unique.

A SSEMBLAGES DE NANOCRISTAUX DE CELLULOSE ET DE POLYSACCHARIDES

Comme nous avons pu le voir pour la fabrication des capsules de polyélectrolytes, la technique d’assemblage couche par couche est une méthode très versatile qui offre la possiblité de réaliser des films de polymères à façon en variant la nature chimique et le nombre de couches déposées. On peut alors envisager de réaliser des films possédant des propriétés optiques ou des propriétés barrières in- téressantes par exemple. Bien qu’initialement dévelopée pour des polyélectrolytes, cette méthode a été très rapidement étendue à divers constituants comme des biomolécules et des colloides (nanotubes de carbones, argiles). Les forces d’interactions assurant la construction et l’intégrité du film sont de type électrostatique, mais aussi liaisons hydrogène, interactions de Van der Waals en milieu acqueux ou solvaté sur tout type de surface. La préparation des nanocristaux de cellulose se fait par hydro- lyse acide de microfibrilles qui conduit à la dégradation de la partie amorphe de la cellulose et à au remplacement d’une partie des groupements hydroxyl de surface des cristaux par des esters sulfates.

Les cristaux acquièrent donc une charge négative de surface ce qui assure leur stabilité colloidale en

solution dans l’eau et permet leur auto-organisation en phases liquides cristallines.

Des nanocristaux de coton, de dimensions typiques (130x26x6 nm

) ont ainsi été utilisés pour réaliser des assemblages couche par couche avec un polymère de charge opposée classique : la po- lyallylamine (PAH). Ce système a été étudié avec Bruno Jean

en combinant les techniques de ré- flectivité des neutrons et l’AFM pour caractériser les assemblages. Afin de s’affranchir des problèmes d’homogénéité des premières couches de polymères, une précouche assemblée à base de PSS et PAH a été déposée avant le système whiskers de coton/PAH. On peut constater sur l’image A de la Figure 8 que la densité de cristaux déposés est très importante beaucoup plus que les expériences similaires réalisées avec des nanotubes de carbone par exemple

. On peut montrer que cette densité de cris- taux déposés reste très importante lors de la construction de l’assemblée multicouche même pour un nombre important de couches (10).

F IGURE 8 – A) Image AFM 4x4 µm

sur wafer de silicium en topographie de multi- couches de whiskers de coton (B) Courbes de réflectivité de neutrons de multicouches du type (PSS/PAH)

(PAH/whisker)

.

On observe une croissance linéaire de l’épaisseur du film mesurée par AFM. L’épaisseur d’une couche de PAH (de l’ordre de 2 nm) étant très faible comparée à l’épaisseur des whiskers de cellulose (7 nm) les épaisseurs mesurées (15nm) ne correspondent alors pas à une seule couche de cristaux mais à deux couches de densités différentes. L’adsorption des cristaux est isotrope mais irrégulière et non planaire ce qui nous a conduit à modéliser cette surface par l’association d’une couche dense et une autre de densité sensiblement inférieure. L’image B de la Figure 8 reporte les données de réflec- tivité de neutrons pour différentes épaisseurs de films et leur ajustements par ce modèle de dépôt. Le déplacement des franges de Kissieg vers de faibles valeurs du vecteur d’onde de transfert Q montre bien l’augmentation de l’épaisseur du film et les épaisseurs calculées sont en très bon accord avec celles mesurées par AFM. Les oscillations à grand Q sont liées à la structure de chaque bicouche et les minima restant invariants, cela est bien compatible avec une structure régulière d’assemblage de ces multicouches. Cependant, on voit qu’il est plus difficile de les distinguer lorsque l’on augmente

33. J

, B

Langmuir 2008, 24, 3452–8.

34. R

, J. H./L

, P. T. Nano 2003, 3, 59–62.

le nombre de couche la rugosité de l’échantillon augmentant avec l’épaisseur du film.

Les parois des végétaux sont constituées d’un assemblage de microfibrilles de cellulose, d’hé- micellulose et dans une moindre mesure de pectines et lignines. Les hémicelluloses forment un ré- seau qui assure la cohésion et le maintien des fibres cellulosiques. Pour se rapprocher des conditions naturelles des parois végétales, il a par la suite été choisi de tester la possibilité de construire des multicouches en ne faisant pas appel aux interactions électrostatiques mais aux forces de Van der Waals et liaisons hydrogène qui sont présentes naturellement dans les systèmes polysaccharidiques.

Notre choix s’est porté sur des assemblages de nanocristaux de cellulose et de xyloglucane de tama- rin qui est une hemicellulose disponible commercialement. Cette étude a montré la faisabilité de la réalisation d’un dépôt couche par couche de nanocristaux de cellulose

. Comme précédemment, les épaisseurs des films ont été mesurées par réflectivité de neutrons et AFM. Nous avons pu déduire une dépendance linéaire de l’épaisseur du film avec le nombre de couches et une épaisseur moyenne de couche correspondant au dépôt d’une seule couche de nanocristaux. De plus, une analyse de la rugosité moyenne des échantillons révèle une rugosité constante quel que soit le nombre de couches déposées. Il apparait clairement que le mécanisme gouvernant la croissance des couches n’est pas le même que dans la première étude.

D’autres études ont montré que la construction des couches dépend aussi des conditions salines lors des dépôts successifs : en présence de sel (0,1 M NaCl) le PAH va adopter une conformation plu- tôt globulaire favorisant l’existence de portions de chaînes interpénétrées avec la première couche de nanocristaux et rendant des charges cationiques accessibles pour l’adsorption d’une seconde couche de nanocristaux. Dans le cas de dépots réalisés sans sel, le PAH adoptant une conformation plus plane lors de son adsorption, seule une couche de nanocristaux est déposée

. L’influence d’autres para- mètres sur la construction des multicouches (charge, concentration des nanocristaux, méthodes de dépôt, séchage) a été aussi largement étudiée (voir

pour une revue plus exhaustive) de même que leur propriétés mécanique, optique et barrière.

Dans le prolongement de cette étude, j’ai collaboré avec Anna Szarpak et Rachel Auzely-Velty

sur la caractérisation de capsules de polysaccharides obtenues par adsoption couche par couche sur un substrat sacrificiel. Ces capsules ont été étudiées afin de construire un système d’encapsulation de principe actif qui soit biodégradable et biocompatible. Ces capsules ont été réalisées par l’adsorption successive d’acide hyaluronique et de poly-lysine sur un coeur de carbonate de calcium. Il est connu que la croissance de l’épaisseur lors du dépôt de ces films varie avec les conditions de dépôt entre une variation exponentielle (premières couches) et une loi linéaire (pour des épaisseurs plus importantes), aussi nous nous sommes attachés à la mesure de l’épaisseur de la paroi des capsules (cf Figure 9).

Par la suite, pour améliorer la résistance des capsules lors de la dissolution du coeur une étape de réticulation des couche a été ajoutée limitant aussi la perméabilité de la paroi de la membrane.

35. J

, B

Langmuir 2009, 25, 3920–3923.

36. M

, C. et al. Langmuir 2012, 28, 10425–10436.

37. M

, C./J

, B. Nordic Pulp & Paper Research Journal 2014, 29, 19–30.

38. S

, A

Biomacromolecules 2010, 11, 713–20.

F IGURE 9 – B) Image de microscopie électronique à balayage des capsules réticulées (D) Topographie AFM de capsules réticulées.

Toutefois les capsules ainsi obtenues restent dégradables par l’action d’une enzyme tissulaire : la hyaluronidase. Il a même été montré dans des tests in vitro que ces capsules étaient rapidement in- ternalisées et détruites dans les macrophages sans stimulus extérieur. Ces résultats sont prometteurs pour des applications de délivrance contrôlée de médicaments.

O BSERVATION ET DÉGRADATION D ’ UNE HÉMICELLULOSE

La majorité des observations précédentes ont été réalisées à l’air ambiant. Cependant, la grande force de cette technique est la possibilité de réaliser des expériences dans virtuellement n’importe quel environement, moyennant l’usage d’une cellule de mesure adaptée et résistante aux conditions de travail. Il est ainsi possible de réaliser des images AFM dans l’eau (avec différents sels et à des pH variés) mais aussi dans d’autres liquides (huiles, acides, etc ...).

La thèse d’Ilham Mkedder avait ainsi pour but de caractériser en solution aqueuse par imagerie AFM directe la dégradation d’un polysaccharide par une enzyme. Le polysaccharide choisi, le xylo- glucane, est une hemicellulose jouant un rôle important dans l’assemblage de la paroi végétale car il contribue au maintien du réseau de fibres de cellulose (cf Figure 10). Le xyloglucane de tamarin est un bon candidat à l’étude des hémicelluloses car il est le composé très largement majoritaire des graines de tamarin ce qui rend son extraction relativement aisée. L’enzyme retenue a déja été utilisée au CERMAV

pour produire des oligomères de xyloglucane.

Pour cette étude il a été nécessaire de trouver un bon solvant du xyloglucane de façon à pouvoir essayer de suivre la façon dont l’enzyme s’accroche et coupe la chaîne de polysaccharide. Contraire- ment à d’autres travaux

il n’a pas été possible d’obtenir de bonnes conditions de solubilisation dans l’eau à 80ˇrC, les études de diffusion dynamique de la lumière (DLS) ayant montré la présence forte d’aggrégats suite à l’autoassociation des chaînes par le biais de multiples liaisons hydrogène. Cette recherche d’un bon solvant par des expériences de diffusion de la lumière nous a permis de mettre en évidence l’existence, sous certaines conditions de salinité, de nanoparticules en solution. Ces nano-

39. L

, M. et al. Biomacromolecules 2009, 11, 1417–1428.

40. M

, F. et al. Biomacromolecules 2011, 12, 3330–3336.

F IGURE 10 – Structure de l’unité de répétition du xyloglucane, le nombre de substituants xylose et galactose dépend de l’origine végétale et de la période d’extraction.

particules sont stables et résistent bien au séchage : elles ont ainsi pu être observées par AFM et MET (cf Figure 11).

F IGURE 11 – Images de nanoparticules de xyloglucane obtenues par MET (en utilisant un agent de contraste) et AFM (topographie sur mica).

Ilham s’est ensuite interessée à la dégradation de ce polysaccharide par une protéine endogluca- nase de Tricoderma resei. Elle a pu suivre la cinétique de dégradation de ces nanoparticules par la protéine en solution diluée par diffusion statique et dynamique de la lumière (cf Figure 12 A) et sur un substrat (wafer de silicium, cf Figure 12 B). La baisse d’intensité diffusée en mesure statique montre que la réaction est très rapide en solution (1/2 heure). Les mesures dynamiques, permettant d’obtenir le rayon hydrodynamique (Rh) des particules, indiquent de plus une libération de la protéine après son action et une aggrégation des produits de dégradation (le rayon hydrodynamique augmente en fin de dégradation).

Dans le cas de dépôts de films ou de nanoparticules, l’action de l’enzyme est moins rapide du fait de la présence du substrat. L’action de l’enzyme conduit à un dépliement des nanoparticules déposées (cf Figure 12 B) puis à leur coupure

.

L’observation in situ de l’action de la protéine reste toutefois un défi. En effet s’il nous a été possible d’observer le film de xyloglucane dans l’eau (Figure 13 A), nos différentes tentatives d’ob-

41. M

, I

Carbohydrate Polymers 2013, 94, 934–9.

F IGURE 12 – (A) Mesure de l’intensité diffusée par les nanoparticules en fonction du temps d’incubation avec la protéine (le rayon hydrodynamique est donné en plus) (B) Topographie par AFM d’une surface couverte de nanoparticules après 30 minutes d’in- cubation avec la protéine.

servation en présence des protéines ont permis de constater la contamination rapide des pointes AFM (pointes silicium ou nitrure de silicium). Le dépot à la surface des pointes d’une couche protectrice de PEG

a permis d’éviter cette déterioration et la réalisation d’images en mode tapping sur une longue durée. Cependant l’interaction entre la pointe fonctionalisée et le film de xyloglucane est suffisante pour entrainer une desorption partielle des chaines de xyloglucane de la surface comme montré sur la Figure 13 B. Après une première série d’images enregistrées dans une même zone, nous avons réalisé un décalage dans le champ imagé. On voit très nettement la frontière entre ces deux zones et le fait que la zone initiale semble présenter une structure "chevelue" sur sa surface.

F IGURE 13 – Images AFM en topographie en mode tapping (A) d’un film de xyloglucane dans l’eau (B) d’une surface de xyloglucane dans l’eau en présence de la protéine, à l’aide d’une pointe fonctionnalisée.

42. T

, E. et al. Biomaterials 2000, 21, 511–520.

O BSERVATION D ’ ASSEMBLAGES LECTINES - SUCRES

Les expériences qui ont été réalisées dans le cadre de cette étude visent à étudier la possibilité d’observer les assemblages qui peuvent être réalisés par l’interaction d’une lectine divalente avec des structures mannosylées.

Ces travaux interviennent en complément des travaux de la thèse d’Emilie Lamegnière portant sur l’étude d’une lectine spécifique des mannoses. Les lectines sont des protéines qui reconnaissent spécifiquement des sucres et jouent un rôle majeur dans la régulation de l’adhésion cellulaire. Les lectines qui ont été étudiées sont exprimées dans les bactéries du type Burkholderia cepacia qui sont des agents pathogènes problématiques (car résistants aux antibiotiques et potentiellement létaux) pour les patients atteints de mucoviscidose. Il est donc important de connaitre les lectines exprimées dans ces systèmes afin de développer des composés anti-adhésion.

Par des expériences de microcalorimétrie de titration Emilie a pu mesurer l’affinité de cette pro- téine envers différents substrats modèles qu’elle a, au préalable, synthétisés ainsi que la stoechiométrie des assemblages.

F IGURE 14 – Modélisation moléculaire des interactions entre la lectine (dimère) et A) un ligand trimanoside et B) un ligand rigide porteur de deux mannoses.

Cette expérience de microcalorimétrie nous montre que le ligand B dimannoside se lie de façon systématique avec deux lectines avec une constante d’association dix fois plus grande que celle obte- nue pour les autres ligands se qui semble induire la possibilité de réaliser des agrégats en solution. Il a donc été suggéré la possibilité de former des fils ou des clusters en solution par ces structures. Mon objectif a donc porté sur la possiblité d’observer ces structures déposées sur un substrat par microsco- pie AFM. La question primordiale est de réaliser un dépots de ces objets sur une surface plane sans en altérer la structure.

Pour la réalisation de ces associations, les protéines étaient dispersées dans un tampon Tris/HCl à

100 mM, pH=7,5 et 3 µM de CaCl

. La solution retenue a consisté à déposer une petite quantité de

solution (20 µL) sur une surface de mica fraichement clivée et de sécher rapidement ce dépot dans

un désiccateur afin de prévenir la cristallisation du sel présent en solution. Avec le ligand trimannose

F IGURE 15 – Image AFM 1x1 µm

sur wafer de silicium en topographie d’un dépôt de filaments d’assemblages lectine/sucre. Section le long de la ligne montrant des varia- tions de hauteurs de l’ordre de 1,5 nm.

rigide nous avons pu observer

sur le Figure 15 des structures de type fil à la surface du mica.

Les profils réalisés montrent des variations de hauteur (typiquement 1,5 nm) compatibles avec les dimensions des lectines sèches, les longueurs des brins (20-200 nm) correspondant à des assemblages pouvant compter jusque 40 dimères de lectines associés. Pour l’autre ligand étudié il se forme au contraire des aggrégats de grande taille.

Cette étude s’est poursuivie dans le cadre d’une collaboration entre l’équipe de glycobiologie et l’équipe de Magali Phaner-Goutorbe de l’Institut des Nanotechnologie de l’Ecole Centrale de Lyon qui a permis d’observer

d’autres structures interagissant avec d’autres lectines produites et isolées au sein du laboratoire (cf Figure 16) en utilisant le même protocole de dépôt des nano-objets.

F IGURE 16 – a) Image AFM 0,8x0,8 µm

sur mica d’un dépôt de filaments d’assemblages lectine/sucre. b) Section le long de la ligne montrant la hauteur du filament. c) Modèle moléculaire de l’assemblage.

43. L

, E

Glycobiology 2010, 20, 87–98.

44. S

, D. et al. Chem. Commun. 2011, 47, 9483–9485.

III.3. Caractérisation des Interactions par Spectroscopie de Force

P ROPRIÉTÉS MÉCANIQUES DE VÉSICULES RECOUVERTES DE CHITOSANE .

En partenaria avec Marguerite Rinaudo, François Quemeneur et Brigitte Pepin-Donat

du CEA/Grenoble, je me suis intéressé à la mesure des propriétés mécaniques de systèmes plus fragiles que les capsules

de polyélectrolytes : des vésicules lipidiques stabilisées par une couche de polysaccharide. Les condi- tions d’obtention de ces vésicules composées de lipides zwitterioniques, leur recouvrement par le chitosane (polysaccharide cationique issu de la déacétylation partielle de la chitine) ont été largement étudiés par François Quemeneur dans sa thèse

.

Ces mesures ont été réalisées sur des vésicules géantes (quelques microns) nues ou recouvertes de chitosane (par interactions électrostatiques). Ces mesures ont été réalisées sur un dispositif similaire (couplage RICM/AFM) à celui que j’ai utilisé lors de mon séjour post-doctoral au MPIKG (cf Figure 17).

F IGURE 17 – Schéma du dispositif expérimental de mesure de la déformation de vésicules lipidiques. Courbe de réponse élastique des vésicules nues (uncoated) et recouvertes de chitosane (coated) ainsi que leur ajustement en suivant le modèle présenté

Un soin particulier a été porté à l’utilisation de conditions où la couverture des vésicules par le chitosane était complète (les vésicules étant alors légèrement chargées positivement) et où leur adhésion au substrat et à la sonde colloidale était réduite au minimum. Les surfaces silicées ont été couvertes par une couche protectrice de PEG pour limiter les interactions électrostatiques entre les vésicules et les différentes surfaces pointe et substrat). Afin de permettre la sédimentation des objets, les vésicules ont été electroformées dans une solution de sucrose. La concentration en sucrose lors de la mesure a été ajustée après la sédimentation afin de réduire le stress osmotique et donc la tension sur

45. R

, M

International Journal of Polymer Analysis and Characterization 2013, 18, 617–626.

46. Q

, F. et al. Biomacromolecules 2008, 9, 396–402.

47. Q

, F. et al. Soft Matter 2010, 6, 4471.