Correction juin 2002
Pour répondre à ce sujet, il fallait connaître un peu le cycle de Toxoplasma gondii.
Pour le clonage du gène, il fallait élaborer des amorces recouvrant des régions conservées de cet enzyme. Pour ceci, il suffit de comparer les séquences protéiques des carbamoyl phosphate synthétases connues chez des organismes proches et choisir les régions les plus conservées. Une autre méthode plus lourde (mais nécessaire si on ne connaît pas de séquence proche) consistait dans la purification de l'enzyme, l'établissement de sa séquence en acide aminé et l'élaboration d'amorces à partir de cette séquence. Ensuite des amplifications par PCR permettent d'obtenir un fragment de ce gène qui peut être utilisé comme sonde sur une banque d'ADN génomique afin de cloner le gène complet. La séquence peut ensuite être établie. Ceci clairement expliqué 4 points.
Pour la délétion, il faut construire un gène chimère composé des régions amont et aval du gène entourant un marqueur de sélection qui vient remplacer la séquence codante de l'enzyme. Notez que les régions codantes doivent avoir une taille suffisante car chez T.
gondii comme chez la majorité des eucaryotes 50 nucléotides en amont et en aval sont insuffisants. Ensuite, il faut transformer des cellules de T. gondii avec cette construction portée par un fragment d'ADN linéaire. Les transformants sont sélectionnés grâce au marqueur. Ceux, pour lequel la construction est allée remplacer le gène endogène, sont criblés directement soit par PCR avec des amorces appropriées soit par Southern blot.
Comme Toxoplasma est diploïde une bonne partie de son cycle, il est préférable de répéter l'opération afin de de déléter les deux allèles. Ceci clairement expliqué 4 points.
Notez que l'approche génétique classique en théorie réalisable est en pratique difficile à mettre en oeuvre : comment sélectionner simplement des mutants déficients dans la carbamoyl phosphate synthétase d'un parasite intracellulaire obligatoire ?
Ensuite, l'absence de virulence se mesure en injectant des T. gondii sauvage comme témoin et des T. gondii délétés dans des souris sauvages ou délétées pour le gène de l'interféron. Les premiers sont capables d'infecter les souris (on peut le voir en mesurant le taux de T. gondii dans les cellules d'un tissu choisi) alors que les seconds ne peuvent pas infecter. Pour voir la protection à long terme, il faut d'abord injecter des T. gondii délétés puis après quelques jours injecter des T. gondii sauvages. Ceux-ci ne peuvent plus infecter l'hôte. En parallèle, on peut suivre par elisa les anticorps anti-toxoplasma.
Ceux-ci doivent se maintenir à un taux élevé au cours du temps. Ceci clairement expliqué 2 points.
Les conclusions que l'on peut tirer de ceci, c'est que :
- soit la carbamoyl phosphate synthétase a deux rôles, incluant un rôle spécifique au cours de l'infection et un rôle en tant qu'enzyme, soit la synthèse de pyrimidine est nécessaire pour un métabolisme efficace lors de l'infection (par exemple, malgré la présence des enzymes nécessaires, T. gondii ne peut pas importer suffisamment de pyrimidines pour ses synthèses d'acides nucléiques). Ceci clairement expliqué 4 points (deux points par hypothèse).
- la carbamoyl phosphate synthétase est une cible potentielle de molécules qui pourrait permettre de guérir les sujets atteints. C'est particulièrement important dans le cas des malades immunodéprimés puisse qu'il est probable que le traitement marche aussi chez ces patients. On peut aussi essayer d'appliquer le même traitement lors d'infections parasitaires avec des organismes proches (plasmodium, cryptosporidium chez l'homme, Theleria chez le bétail). Ceci clairement expliqué 3 points.
- les souches délétées pourrait servir de vaccin afin de mettre en place un traitement préventif, en particulier pour les femmes enceintes. On peut aussi envisager un traitement en utilisant des anticorps générés à l'aide de ces souches délétées. Ceci clairement expliqué 3 points.
