T
HÈSE
Pour l’obtention du Grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE POITIERS
FACULTÉ DES SCIENCES FONDAMENTALES ET APPLIQUÉES (Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006)
Ecole Doctorale : Sciences pour l’Environnement Gay Lussac
Secteur de Recherche :
Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
Présentée par :
Julien VERDON
CARACTÉRISATION ET MODE D’ACTION DE LA
WARNÉRICINE RK, UN PEPTIDE ANTI-LEGIONELLA
Directeur de Thèse : Yann HÉCHARD
Soutenue le 25 Novembre 2009, devant la Commission d’Examen :
Rapporteurs : Mme Sylvie REBUFFAT M. Erick DUFOURC
Professeur, Muséum National d'Histoire Naturelle, Paris Directeur de Recherche, CNRS, Université de Bordeaux Examinateurs : Mme Carmen BUCHRIESER
M. François VANDENESCH M. Thierry BERGÈS
M. Jean-Marc BERJEAUD M. Yann HÉCHARD
Directeur de Recherche, Institut Pasteur, Paris Professeur, Faculté de Médecine Laennec, Lyon Professeur, Université de Poitiers
Maître de Conférences, Université de Poitiers Maître de Conférences, Université de Poitiers
T
HÈSE
Pour l’obtention du Grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE POITIERS
FACULTÉ DES SCIENCES FONDAMENTALES ET APPLIQUÉES (Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006)
Ecole Doctorale : Sciences pour l’Environnement Gay Lussac
Secteur de Recherche :
Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
Présentée par :
Julien VERDON
CARACTÉRISATION ET MODE D’ACTION DE LA
WARNÉRICINE RK, UN PEPTIDE ANTI-LEGIONELLA
Directeur de Thèse : Yann HÉCHARD
Soutenue le 25 Novembre 2009, devant la Commission d’Examen :
Rapporteurs : Mme Sylvie REBUFFAT M. Erick DUFOURC
Professeur, Muséum National d'Histoire Naturelle, Paris Directeur de Recherche, CNRS, Université de Bordeaux Examinateurs : Mme Carmen BUCHRIESER
M. François VANDENESCH M. Thierry BERGÈS
M. Jean-Marc BERJEAUD M. Yann HÉCHARD
Directeur de Recherche, Institut Pasteur, Paris Professeur, Faculté de Médecine Laennec, Lyon Professeur, Université de Poitiers
Maître de Conférences, Université de Poitiers Maître de Conférences, Université de Poitiers
« Cherchons comme cherchent ceux qui doivent trouver et trouvons comme trouvent ceux qui doivent chercher encore. Car il est écrit : celui qui est arrivé au terme ne fait que commencer. »
Remerciements
Cette étude a été effectuée dans l’équipe de Microbiologie de l’Eau du laboratoire de Chimie et Microbiologie de l’Eau, UMR CNRS 6008, dirigée par Monsieur le Professeur
Bernard Legube. Je tiens à lui adresser mes sincères remerciements pour m’avoir permis de
réaliser ces travaux au sein de son laboratoire. Merci également à Monsieur le Professeur
Jacques Frère de m’avoir accueilli dans son équipe.
J’adresse tous mes remerciements à Madame Sylvie Rebuffat, Professeur au MNHN dans l’Unité de Chimie et Biochimie des Substances Naturelles et Monsieur Erick Dufourc, Directeur de Recherche CNRS à l’Université de Bordeaux, de m’avoir fait l’honneur d’être rapporteurs de ce travail. Qu’ils trouvent ici l’expression de ma profonde gratitude.
Je remercie également très chaleureusement Madame Carmen Buchrieser, Directeur de Recherche à l’Institut Pasteur de Paris, Monsieur François Vandenesch, Professeur à l’Université de Lyon et Monsieur Thierry Bergès, Professeur à l’Université de Poitiers, d’avoir accepté participer à ce jury de thèse et d’évaluer ce travail.
Je tiens à remercier tout particulièrement mon directeur de thèse, Yann Héchard, pour m’avoir guidé et soutenu dans mon apprentissage. Merci pour toutes ces discussions enrichissantes, pour la confiance qu’il m’a accordée et pour sa franchise. Qu’il trouve ici l’expression de ma reconnaissance.
Je ne sais comment remercier Jean-Marc Berjeaud, alias “JMB”, pour sa disponibilité, sa patience et son aide. Il m’a appris toutes ses recettes et astuces de biochimie et m’a transmis ses connaissances notamment en pédagogie. Merci pour son savoir-faire, sa présence et tous nos échanges scientifiques et personnels (Dieu seul sait s’il y en a eu...). Si j’en suis là aujourd’hui, c’est en grande partie grâce à lui.
Un grand merci à Christian Lacombe dit Cricri, mon binôme d’enseignement, pour nos longues discussions scientifiques et pédagogiques. J’espère avoir un jour l’occasion de lui rendre ce qu’il m’a apporté.
Mes remerciements vont également à toutes les personnes avec lesquelles j’ai eu la chance de pouvoir collaborer au cours de cette étude, et en particulier Michael Steinert pour m’avoir mis en contact avec tous les autres collaborateurs, Roland Benz et Elke Maier pour
m’avoir permis d’apprendre la technique des black lipids, Cornélius Faber et Mirjam Falge pour leur travail sur la RMN ainsi que Heike Bruhn pour m’avoir enseignée la techniques des liposomes. Je remercie également Tobias Sahr pour avoir pris le temps de faire les microarrays ainsi qu’à toute l’équipe de Carmen Buchrieser pour leur accueil et leur gentillesse. Merci également à Thierry Ferreira pour m’avoir lancé sur le chemin des phospholipides et à Franck Morel pour son aide en cytométrie en flux.
J’exprime mes remerciements à tous les membres du laboratoire de Chimie et Microbiologie de l’Eau et plus particulièrement à certaines personnes. Merci à Nico, mon (trop) tardif collègue de bureau. Je ne compte plus tout ce que l’on a pu échanger durant ces années de thèse et quel bonheur ça a été. Nous avons évolué, “vieilli” ensemble et je pense qu’on s’en est plutôt bien tiré. Merci à Didi mon jeune padawan. Petit à petit du rang de maître “Jedi” tu te rapproches et moi, Yoda, de veiller sur toi je continuerai. Que la force soit avec toi ! Merci à Nono, coéquipier dans la vie et au foot. J’ai beaucoup apprécié ta franchise légendaire mais aussi tout ce que l’on a partagé ensemble. Merci à Mathieu, le râleur du labo. Merci pour ces bons moments partagés, au foot ou au labo. Merci à Titi, ma grande sœur au labo, qui m’a montré pleins d’astuces pour survivre dans cet environnement hostile. Merci à Jérôme dit « le chimiste » pour nos longues discussions tant scientifiques que personnelles et les heures passées devant la GC-MS. Reste comme ça, t’es un mec génial !
Je tiens à exprimer mes remerciements à Marie-Claude pour son aide précieuse au laboratoire, à Karine sans qui je serai toujours enchevêtré dans les problèmes administratifs, à Christophe pour son aide à la préparation des milieux de culture, à Stéphanie pour ces bons moments en TP, à Daniel pour le travail en spectrométrie de masse et pour ses imitations de Véro. Merci également pour le partage de votre bonne humeur dans les moments difficiles.
Un grand merci aux stagiaires que j’ai encadré et qui ont du me supporter pendant leur passage au labo, Didi (encore !!!), Vanessa (ma gothique préférée), Mathieu (la curiosité incarnée), Céline (le pessimisme incarnée), Romain (dit « le boulet ») et tous les étudiant(e)s avec qui j’ai partagé souvent plus que des heures de cours.
Merci à tous les moniteurs de ma promo qui restera de loin la meilleure promo du CIES centre. Marc, Adeline, Fred & Arnaud, Romain, Soizic, EG, Marie, Marie-laure, Alex et tous les autres, merci pour toutes ces soirées et ces bons moments qui représentent quelque chose d’inestimable à mes yeux.
Merci également aux thésards (ou récents docteurs !) qui m'ont accompagnés depuis 3 ans, surtout au sein de notre regrettée ADBEP. Merci à Domi (courage, c’est presque la fin),
Ludi, Fred, Manu (et sa petite famille) et tous les autres
Mention particulière à Sylvain et lulu (dit bibou et mimou) qui, au fil des galères, sont devenus des gens très important à mes yeux et avec qui j’ai partagé beaucoup de choses dont un goût prononcé pour le pédalo. Merci à vous deux pour ce que vous êtes.
Je tiens également à remercier Karline, mon doudou, et ma famille, notamment mes parents, mes sœurs, qui ont supporté mes “sautes d’humeur”, ainsi que mes ami(e)s, Flo,
Manu, Sylvain et tous les autres en particulier pour leur présence et leur soutien durant ces 3
années. Merci à tous les membres du club de foot de Savigny (jeunes et anciens) pour les bons moments passés ensemble et les efforts fournis tous les weekends.
Enfin, j’adresse mes remerciements à l’AFSSET et au Ministère de l’Enseignement supérieur et de la Recherche pour leur soutien financier sans lequel cette thèse n’aurait pu se faire ainsi qu’au CIES centre pour leurs formations enrichissantes dans le cadre de mon monitorat.
1
Sommaire
Liste des abréviations... 1 Liste des Figures ... 3 Liste des Tableaux ... 5INTRODUCTION GENERALE
... 7Partie 1. Etude bibliographique
... 11 Chapitre I. Peptides Antimicrobiens... 13 I.1 Généralités... 13 I.2 Peptides antimicrobiens produits par les invertébrés et les vertébrés ... 14 I.2.1 Les peptides en hélice α amphiphile ... 15 I.2.2 Les peptides en feuillet β stabilisés par des ponts disulfures ... 17 I.2.3 Les peptides riches en acides aminés particuliers... 17 I.2.4 Les peptides dérivés de larges protéines ... 17 I.3 Peptides antimicrobiens produits par les bactéries ... 18 I.3.1 Peptides antimicrobiens produits par les bactéries à Gram négatif ... 18 I.3.2 Peptides antimicrobiens produits par les bactéries à Gram positif... 19 I.3.3 Classe I : Lantibiotiques ... 20 I.3.3.1 Classe II : Peptides thermiquement stables et non modifiés... 21 I.3.3.2 Classe III : Protéines thermosensibles... 21 I.3.3.3 Classe IV: Bactériocines cycliques ... 22 I.3.4 Peptides antimicrobiens produits par les bactéries du genre Staphylococcus ... 22 ♦ Publication 1 : δ‐hemolysin, an uptade on a membrane‐interacting peptide... 22 I.3.4.1 Peptides antimicrobiens produits par les staphylocoques coagulase positif ... 29 I.3.4.2 Peptides antimicrobiens produits par les staphylocoques coagulase négatif ... 302 I.3.4.2.1 Peptides antimicrobiens produits par S. warneri ... 30 I.3.4.2.2 Peptides antimicrobiens produits par S. epidermidis ... 32 Chapitre II. Mécanismes d’action et résistance... 35 II.1 Généralités... 35 II.2 Bases structurales de l’activité des peptides antimicrobiens ... 35 II.2.1 Hélicité (α) ... 36 II.2.2 Charge (Q)... 37 II.2.3 Hydrophobicité (H) ... 38 II.2.4 Amphiphilie et moment hydrophobe (µ) ... 39 II.2.5 Angle polaire (Ф) ... 40 II.3 Mécanismes d’actions des peptides antimicrobiens... 41 II.3.1 Interactions initiales peptide/enveloppe ... 41 II.3.1.1 Interactions non spécifiques ... 41 II.3.1.2 Interactions spécifiques ... 45 II.3.2 Perturbation de la membrane cytoplasmique ... 45 II.3.2.1 Modèle du tonneau (barrel‐stave model)... 47 II.3.2.2 Modèle du pore torique (toroïdal pore) ... 47 II.3.2.3 Modèle du tapis (carpet model)... 49 II.3.2.4 Modèle detergent‐like ... 51 II.3.3 Perturbation du fonctionnement de la cellule ... 52 II.3.3.1 Inhibition de la synthèse du peptidoglycane ... 53 II.3.3.2 Inhibition de fonctions intracellulaires ... 54 II.4 Mécanismes de résistances... 55 II.4.1 Dégradation protéolytique des peptides antimicrobiens... 56 II.4.2 Mécanismes de piégeage ... 57 II.4.3 Transport actif des peptides antimicrobiens... 57 II.4.4 Modifications des propriétés de surface... 58
3 Chapitre III. Legionella... 61 III.1 Généralités... 61 III.1.1 Historique ... 61 III.1.2 Taxonomie ... 61 III.1.3 Morphologie et caractères biochimiques... 62 III.1.4 Analyse génomique ... 63 III.2 Écologie... 64 III.2.1 Interaction avec un biofilm... 64 III.2.2 Interaction avec des protozoaires ... 66 III.3 La légionellose... 69 III.3.1 Sources de contaminations ... 69 III.3.2 Symptômes... 70 III.3.3 Épidémiologie... 70 III.3.4 Traitements ... 72 III.4 Enveloppe de Legionella ... 73 III.4.1 Lipopolysaccharide ... 73 III.4.2 Peptidoglycane ... 74 III.4.3 Phospholipides membranaires ... 75 III.4.3.1 Structure ... 75 III.4.3.2 Biosynthèse... 77 III.4.4 Acides Gras ... 79 III.4.4.1 Structure ... 79 III.4.4.2 Biosynthèse... 82 III.4.5 Quinones isoprénoïdes... 85 III.4.5.1 Structure ... 85 III.4.5.2 Quinones bactériennes ... 87
4 III.5 Molécules à activité anti‐Legionella... 87 III.5.1 Agents de désinfection ... 88 III.5.1.1 Agents oxydants... 88 III.5.1.2 Agents non oxydants... 89 III.5.2 Molécules biologiques anti‐Legionella ... 89
Partie 2. Matériel et Méthodes
... 91 Chapitre I. Techniques de microbiologie ... 93 I.1 Souches bactériennes ... 93 I.2 Milieux de culture ... 94 I.2.1 Culture de Legionella... 94 I.2.2 Culture de S. warneri RK... 94 I.2.3 Culture des autres souches bactériennes... 95 I.2.4 Culture d’amibes ... 95 I.2.5 Culture de cellules THP‐1... 95 I.3 Evaluation de l’activité antimicrobienne et hémolytique ... 95 I.3.1 Détermination de la concentration minimale inhibitrice ... 95 I.3.2 Détermination de la perméabilisation membranaire... 96 I.3.3 Détermination du pouvoir hémolytique... 96 Chapitre II. Techniques séparatives et analytiques ... 99 II.1 Étude des protéines... 99 II.1.1 Préparation d’extrait brut du surnageant de S. warneri RK ... 99 II.1.2 Chromatographie d’affinité pour l’hydroxyapatite ... 99 II.1.3 Chromatographie en phase liquide ... 100 II.1.3.1 Chromatographie d’interaction hydrophobe... 100 II.1.3.2 Chromatographie liquide haute performance en phase inverse ... 100 II.1.4 Spectrométrie de masse ESI‐MS... 1005 II.1.5 Dosage des peptides... 100 II.2 Étude des lipides ... 101 II.2.1 Extraction des lipides totaux ... 101 II.2.2 Analyse des acides gras par GC‐MS ... 102 II.2.3 Analyse des phospholipides par chromatographie sur couche mince ... 102 II.2.4 Dosage des phospholipides ... 103 Chapitre III. Techniques de biologie moléculaire...105 III.1 Extraction plasmidique ... 105 III.2 Bactéries compétentes ... 105 III.3 Électroporation ... 106 III.4 Extraction d’ARN ... 106 III.5 Microarrays ... 107 Chapitre IV. Techniques de biophysique...109 IV.1 Technique des black lipids ... 109 IV.2 Dichroïsme circulaire et RMN ... 110
Partie 3. Résultats
... 111 Chapitre I. Purification et activités biologiques de la warnéricine RK...113 I.1 Publication 2 : Characterization of anti‐Legionella activity of warnericin RK and delta‐ lysin I from Staphylococcus warneri... 113 I.2 Résultats complémentaires ... 117 I.2.1 Suivi de croissance de L. pneumophila ... 117 I.2.2 Suivi de production de la warnéricine RK... 117 I.2.3 Activité inhibitrice de la warnéricine RK... 121 I.2.4 Activité cytotoxique de la warnéricine RK... 1226 Chapitre II. Mode d’action de la warnéricine RK ...125 II.1 Publication 3 : Detergent‐like activity and α helical structure of warnericin RK, an anti‐ Legionella peptide... 125 II.2 Résultats complémentaires ... 129 II.2.1 Relation entre perméabilisation et viabilité ... 129 II.2.2 Activité inhibitrice de la mélittine ... 131 II.2.3 Action de la warnéricine RK et de la δ‐hémolysine I sur des cellules adhérées ... 132 Chapitre III. Analyse de l’enveloppe de L. pneumophila...135 III.1 Publication 4 : Fatty acid composition relationships with resistance to warnericin RK, an anti‐Legionella peptide... 135 III.2 Résultats complémentaires ... 139 III.2.1 Activité de perméabilisation de détergents sur la souche adaptée ... 139 III.2.2 Activité hémolytique de la warnéricine RK en présence de phospholipides... 141 III.2.3 Analyse de la composition en phospholipides de L. pneumophila... 143 III.2.4 Modifications de la composition de l’enveloppe ... 144 III.2.4.1 Résistance de mutants de L. pneumophila à la warnéricine RK... 145 III.2.4.2 Inhibition de la biosynthèse des acides gras à longue chaîne... 147 III.2.4.2.1 Analyse des effets de la cérulénine sur la composition en acide gras de L. pneumophila ... 148 III.2.4.2.2 Activité de la warnéricine RK en présence de cérulénine ... 150
Partie 4. Discussion
... 153CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
... 161 Références bibliographiques... 167 Annexes ... 195 Curriculum Vitae... 2151
Liste des abréviations
aa : Acides aminés
agr : « Accessory gene regulator » ACN : Acétonitrile
BCA : Acide bicinchoninique
BCYE : « Buffered charcoal yeast extract » BHI « Brain heart infusion »
BYE « Buffered yeast extract »
CCM : Chromatographie sur couche mince CL : Cardiolipide
CMI Concentration minimale inhibitrice Da : Dalton DCM : Dichlorométhane DO600nm : Densité optique à 600 nm DMPC : « Dimyristoylphosphatidylcholine » DPPC : « Dipalmitoylphosphatidylcholine » DPhPC : « Diphytanoylphosphatidylcholine » EB : Extrait brut
EDTA : Acide éthylène diamine tétra acétique EGCG : Épigallocatechine gallate
ESI-MS : Spectrométrie de masse en électrospray FAS : « Fatty acid synthase »
GC-MS : Chromatographie gazeuse couplée à un spéctromètre de masse GFP : « Green fluorescent protein »
INH : Isoniazide
IP : Iodure de propidium
IP50 : Indice de perméabilisation à 50%
HPLC : Chromatographie liquide haute performance LLAP : « Legionella-like amoebal pathogens »
LCME : Laboratoire de Chimie et de Microbiologie de l'Eau LPS : Lipopolysaccharide
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella 2 NAM : Acide N-acétyl-muramique
PA : Acide phosphatidique pb : Paires de bases
PBS : « Phosphate buffer saline » PC : Phosphatidylcholine
PE : Phosphatidyléthanolamine PEG : Polyéthylène glycol PG : Phosphatidylglycérol
PMA : « Phorbol 12-myristate 13-acetate » PI : Phosphatidylinositol
POPC : « 1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholine » PS : Phosphatidylsérine
P/L : Peptide/lipide
RMN : Résonnance magnétique nucléaire rpm : Rotation par minute
RT-PCR « Reverse transcription-polymerase chain reaction » SARM : Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline SCN : Staphylocoque coagulase négatif
SCP : Staphylocoque coagulase positif SDS : « Sodium dodecyl sulfate » SM : Sphingomyéline
TAR : Tours aéroéfrigérante TBE : Tris-Borate-EDTA TFA : Acide trifluoroacétique TLM : Thiolactomycine UFC : Unité formant colonie v/v : volume/volume
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella 3
Liste des Figures
Figure 1 : Rôles biologiques des peptides antimicrobiens impliqués dans la défense immunitaire de
l’hôte ... 15
Figure 2 : Structures tertiaires de peptides antimicrobiens ... 16
Figure 3 : Hélicité et répartition des régions hydrophobes et hydrophiles dans la structure des peptides antimicrobiens ... 36
Figure 4 : Représentation en hélice α de peptides antimicrobiens indiquant le moment hydrophobe et l’angle polaire ... 39
Figure 5 : Enveloppe des bactéries à Gram positif ... 42
Figure 6 : Enveloppe des bactéries à Gram négatif ... 43
Figure 7 : Structure du LPS bactérien ... 44
Figure 8 : La voie de translocation auto-induite des peptides antimicrobiens à travers la membrane externe des bactéries à Gram négatif ... 44
Figure 9 : Modèles de perméabilisation de la membrane par des peptides antimicrobiens... 46
Figure 10 : Modèle du pore torique désordonné ... 48
Figure 11: Modèle du tapis ... 50
Figure 12 : Modèle detergent-like ... 51
Figure 13 : Cibles des peptides antimicrobiens ... 53
Figure 14 : Mécanismes de résistance des bactéries aux peptides antimicrobiens ... 56
Figure 15 : Voie d’aminoacylation ARNt-dépendante du phosphatidylglycérol membranaire chez S. aureus ... 59
Figure 16 : Développement et relarguage de Legionella dans un système de distribution d’eau ... 65
Figure 17 : Cycle de vie et d’infection de L. pneumophila ... 67
Figure 18 : Evolution du nombre de cas de la légionellose en France entre 1988 et 2008 ... 71
Figure 19 : Structure des principaux phospholipides bactériens ... 76
Figure 20 : Voie de biosynthèse des phospholipides chez E. coli ... 78
Figure 21 : Structures des acides gras au sein des phospholipides membranaires et leur rôle dans la fluidité membranaire ... 80
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella 4
Figure 23 : Structures des principaux groupes de quinones isoprénoïdes ... 86
Figure 24 : Courbes étalons des standards de phospholipides ... 103
Figure 25 : Carte du plasmide pLAW330 et du transposon Tn903dIIlacZ ... 105
Figure 26 : Principe de la technique des black lipids ... 109
Figure 27 : Croissance de L. pneumophila Lens ... 117
Figure 28 : Croissance de S. warneri RK à 37°C ... 118
Figure 29 : Cinétique de production de la warnéricine RK suivie par chromatographie HPLC/UV en phase inverse ... 119
Figure 30 : Activité de la warnéricine RK sur des cellules THP-1 différenciées ... 123
Figure 31 : Activité de la warnéricine RK sur des trophozoïtes d’Acanthamoeba sp. ... 124
Figure 32 : Corrélation entre le pourcentage de cellules IP- et le nombre d’UFC/ml ... 130
Figure 33 : Action de la warnéricine RK et de la δ-hémolysine I sur des cellules de L. pneumophila GFP adhérées ... 133
Figure 34 : Perméabilisation induite par différents détergents sur L. pneumpohila Lens WT et adaptée ... 140
Figure 35 : Analyse des phospholipides par chromatographie sur couche mince monodimensionnelle ... 143
Figure 36 : Activité inhibitrice de la warnéricine RK contre L. pneumophila Corby ... 145
Figure 37: Activité inhibitrice de la warnéricine RK contre L. pneumophila Philadelphia ... 146
Figure 38 : Structure de la cérulénine et action sur FabB ... 147
Figure 39 : Croissance de L. pneumophila Lens en présence de différentes concentrations de cérulénine ... 148
Figure 40 : Activité inhibitrice de la warnéricine RK contre L. pneumophila en présence de cérulénine ... 151
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella 5
Liste des Tableaux
Tableau 1 : Classification des bactériocines produites par les bactéries à Gram positif ... 20 Tableau 2 : Peptides antimicrobiens produits par Staphylococcus et leur spectre d’activité ... 28 Tableau 3 : Composition en acides gras de L. pneumophila dans différentes conditions de culture .... 82 Tableau 4 : Enzymes identifiées du système FAS de type II ... 84 Tableau 5 : Composition en ubiquinone de 23 espèces de Legionella ... 85 Tableau 6 : Souches bactériennes utilisées au cours de l’étude ... 93 Tableau 7 : Concentration des peptides purifiés dans le surnageant de culture de S. warneri RK ... 120 Tableau 8 : Activité inhibitrice de la warnéricine RK ... 122 Tableau 9 : Activité inhibitrice de la mélittine ... 132 Tableau 10 : Activité hémolytique de la warnéricine RK en présence de phospholipides ... 142 Tableau 11 : Pourcentage relatif des phospholipides des souches sauvage et adaptée de L. pneumophila ... 144 Tableau 12 : Influence de la cérulénine sur la composition en acides gras de L. pneumophila Lens . 149
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella 7
INTRODUCTION GENERALE
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella 9 Au laboratoire de Chimie et de Microbiologie de l’Eau (LCME), l’une des thématiques de recherche est axée sur l’étude de composés actifs contre Legionella, l’agent responsable de la légionellose. C’est une bactérie d’origine hydrotellurique retrouvée aussi bien dans les environnements naturels (lacs, rivières) que dans les environnements artificiels (tours aéroréfrigérantes, réseaux d’eau chaude sanitaire…). Elle possède un mode de vie parasitaire, se développant au sein de protozoaires tels que les amibes et, de manière opportuniste, à l’intérieur des macrophages alvéolaires. L’inhalation d’aérosols contaminés par ce germe est la voie de contamination humaine avérée. Depuis la première épidémie de légionellose référencée à Philadelphie en 1976, de nombreuses autres épidémies se sont déclarées partout dans le monde. Cependant, la mise en place de meilleurs outils de détection et de diagnostic a permis de limiter le nombre de cas et d’améliorer le taux de survie des patients. Malgré tout, la légionellose reste un problème de santé publique d’actualité avec, chaque année en France, environ 1400 cas et un peu plus d’une centaine de décés.
En 2005, une souche bactérienne possédant une activité inhibitrice contre Legionella a été isolée au LCME. Il s’agit d’un Staphylococcus warneri qui a été nommé Staphylococcus warneri RK. L’une des molécules responsable de cette activité est un peptide de 22 acides aminés qui ne possède aucune homologie de séquence avec des peptides déjà décrits dans la littérature. Ce peptide antimicrobien, nommé warnéricine RK, possède une activité spécifiquement orientée contre Legionella qui a été brevetée en 2006. Deux autres peptides, possédant la même activité, ont également été isolés ; il s’agit de deux homologues d’une exotoxine produite par Staphylococcus, nommée δ-hémolysine. Cette toxine est très étudiée puisqu’il s’agit d’un peptide hémolytique dépourvue d’activité antimicrobienne. Cette particularité a conduit les chercheurs à étudier son mode d’action et à le comparer à celui d’autres peptides à activité antimicrobienne connue tels que la mélittine. C’est la première fois que des peptides avec une activité spécifique anti-Legionella sont décrits dans la littérature.
Au regard de l’ensemble de ces données, il nous est apparu que l’étude du mode d’action de la warnéricine RK, en comparaison de celui de la δ-hémolysine, constituait un axe de recherche intéressant qui permettrait de comprendre la spécificité d’action de ces peptides. Cette étude se replace dans un contexte de santé publique. En effet, l’intérêt pour les peptides antimicrobiens ne cesse de croître dans la mesure où beaucoup pensent qu’ils pourraient constituer une nouvelle gamme de composés thérapeutiques et ainsi offrir une solution
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella 10 alternative aux traitements antibiotiques qui engendrent des phénomènes de résistance chez les microorganismes.
Ainsi, les objectifs de notre étude sont, dans un premier temps, de caractériser les activités biologiques de la warnéricine RK et, dans un deuxième temps, d’analyser son mode d’action. Pour cela, la comparaison avec les données bibliographiques sur la δ-hémolysine devrait permettre de comprendre l’activité spécifique anti-Legionella de ces peptides.
Pour réaliser ces objectifs, nous avons développé trois grands axes de recherche au cours de cette étude :
♦ Le premier axe a été consacré à la purification de la warnéricine RK et à la caractérisation de ses activités biologiques. Les résultats obtenus ont permis de déterminer l’étendue de son spectre d’action contre des souches bactériennes sélectionnées et également d’évaluer son activité contre L. pneumophila. Les prédictions de structure secondaire réalisées à partir de la séquence primaire de la warnéricine RK ont orienté les recherches sur un mode d’action similaire à celui de la δ-hémolysine.
♦ La deuxième axe a consisté à étudier le mode d’action de la warnéricine RK. La majorité des expériences menées ont été réalisées en collaboration avec trois laboratoires allemands possédant une expertise dans le domaine de l’intéraction peptide/membrane et dans lesquels j’ai pu effectuer un stage. Ainsi, l’action de la warnéricine RK a été mesurée sur des membranes artificielles et sur des membranes naturelles. La structure du peptide dans un environnement mimant la membrane a été analysée par dïchroïsme circulaire et résonnance magnétique nucléaire (RMN).
♦ Le troisième axe a été orienté vers l’analyse de l’enveloppe de L. pneumophila et plus particulièrement vers l’analyse des lipides membranaires. Les outils mis en place au laboratoire ont permis d’étudier et de modifier la composition en lipides de L. pneumophila tout en mesurant l’impact de ces changements sur l’action de la warnéricine RK.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella 11
Partie 1. Etude bibliographique
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella 13 Mon travail de thèse a porté sur la caractérisation et l’étude du mode d’action d’un peptide antimicrobien produit par Staphylococcus warneri et actif contre les bactéries du genre Legionella. Ainsi, l’étude bibliographique décrira les peptides antimicrobiens et plus particulièrement ceux produits par les bactéries du genre Staphylococcus dans un premier chapitre, le mode d’action des peptides antimicrobiens ainsi que les mécanismes de résistance mis en place dans un deuxième chapitre et finalement, les bactéries du genre Legionella dans un troisième chapitre.
Chapitre I. Peptides Antimicrobiens
I.1
Généralités
La plupart des organismes vivants sont constamment exposés à des pathogènes potentiellement très dangereux par contact, ingestion ou inhalation. Leur survie dépend d’un réseau de mécanismes de défense de l’hôte qui comprend plusieurs composantes regroupées sous le terme d’immunité (Reddy et al., 2004). Durant l’invasion de pathogènes, la première ligne de défense inclut les mécanismes de la réponse immunitaire innée qui est suivie, chez les vertébrés, par la réponse immunitaire acquise avec l’activation spécifique des cellules T et B par des antigènes (Fearon & Locksley, 1996). La réponse immunitaire innée est notamment basée sur l’action de peptides endogènes, appelé peptides antimicrobiens. Ces molécules sont universellement distribuées (mammifères, oiseaux, amphibiens, insectes, plantes et microorganismes) (Nissen-Meyer & Nes, 1997). Les peptides antimicrobiens constituent une première ligne de défense idéale car leur production est jusqu'à 100 fois plus rapide que celle des protéines du système immunitaire et leur diffusion est également plus rapide que celle des protéines et des cellules de l’immunité. Dans la suite de ce chapitre, le terme peptide antimicrobien fera référence aux composés protéiques de masse moléculaire inférieure à 10 kDa et possédant une activité antimicrobienne reconnue.
Les bactéries produisent également des peptides dont le rôle principal est probablement de détruire les bactéries en compétition nutritionnelle avec la souche productrice (Boman, 1996). Le premier peptide antimicrobien découvert est la colicine V, identifiée par Gratia en 1925, lorsqu’il a démonté l’existence d’une substance inhibitrice pour E. coli Ф dans le dialysat de milieu de culture d'E. coli V (Cascales et al., 2007). Peu après, la nisine fût isolée à partir d’une autre bactérie, Lactococcus lactis subsp. lactis (Rogers, 1928).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella 14 Il a fallu ensuite attendre un peu moins de soixante années avant la description d’un peptide antimicrobien produit par un organisme supérieur. Ce fut la cécropine, isolée d’un insecte : le lépidoptère Hyalophora cecropia (Steiner et al., 1981). Actuellement, plusieurs centaines de peptides antimicrobiens ont été décrits dans la littérature (Hancock & Chapple, 1999; Reddy et al., 2004). Le champ d’investigation des peptides antimicrobiens grandit rapidement et, afin d’améliorer la recherche et l’échange d’informations, plusieurs bases de données ont vu le jour. Actuellement, il en existe 11 (http://aps.unmc.edu/AP/links.php). Par exemple, l’APD2 (Antimicrobial Peptide Database 2) regroupait, en juin 2009, 1459 séquences relatives à des peptides antimicrobiens d’organismes supérieurs et de bactéries (Wang et al., 2009) (http://aps.unmc.edu/AP/main.php). Une autre base de données, l’AMSDb, rassemble la plupart des séquences de peptides antimicrobiens eucaryotes connues avec 895 séquences enregistrées (http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/pag1.htm) (Tossi & Sandri, 2002).
Les cinquante dernières années ont vu l’utilisation massive des antibiotiques naturels, semi-synthétiques ou synthétiques aux propriétés antimicrobiennes, dans le traitement d’infections graves. Cependant, cette ère pourrait arriver à son terme suite à l’augmentation de la résistance des microoragnismes aux antibiotiques (Hancock, 1997). En 1994, l’Organisation Mondiale de la Santé a décrété que cette résistance croissante aux antibiotiques était devenue un problème majeur de santé publique. Ce danger potentiel a amené les scientifiques à revoir la façon d’utiliser les antibiotiques et à chercher d’autres agents antimicrobiens dont la structure et le mode d’action, différents de ceux des antibiotiques, permettraient de pallier à ces phénomènes de résistance. Ainsi, l’intérêt pour les peptides antimicrobiens n’a cessé de croître depuis quelques années dans la mesure où beaucoup pensent qu’ils pourraient constituer une nouvelle gamme de composés thérapeutiques (Hancock & Chapple, 1999).
I.2
Peptides antimicrobiens produits par les invertébrés et les vertébrés
Chez les organismes supérieurs (plantes, insectes, amphibiens, crustacés, oiseaux, poissons et mammifères), les peptides antimicrobiens font partie de la réponse immunitaire innée (Zasloff, 2002). Ils jouent un rôle important dans la réponse immunitaire, d’une part en agissant directement sur les microorganismes pathogènes afin de les éliminer et, d’autre part, en modulant la réponse, en recrutant et en activant des cellules immunitaires telles que les monocytes ou les lymphocytes (Figure 1) (Hancock & Sahl, 2006).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella 15 Figure 1 : Rôles biologiques des peptides antimicrobiens impliqués dans la défense immunitaire de l’hôte (Hancock & Sahl, 2006)
La diversité des peptides antimicrobiens est telle qu’il est difficile de les classer (Zasloff, 2002). Néanmoins, ils sont souvent répartis en quatre grands groupes : les peptides en hélice α amphiphile, les peptides en feuillet stabilisé par un ou plusieurs ponts disulfures, les peptides linéaires riches en acides aminés particuliers et les peptides dérivés de larges protéines (Boman, 1995; Bulet et al., 2004; Hancock & Sahl, 2006; Tang et al., 1999).
I.2.1 Les peptides en hélice α amphiphile
C’est le groupe de peptides antimicrobiens le plus étudié avec environ 290 peptides décrits. Ces peptides sont généralement cationiques et possèdent 40% à 60% de résidus hydrophobes (Tossi et al., 2000). Ils sont de petite taille (inférieure à 40 résidus), ne possèdent pas de résidu cystéine et possèdent parfois un coude au milieu de la molécule. Ils ne sont généralement pas structurés en milieu aqueux mais ces peptides adoptent une structure secondaire caractérisée par la présence d’une ou plusieurs hélices α amphiphiles au contact de la membrane ou dans un environnement mimant la membrane (en présence de TFE, de liposomes ou de micelles de SDS par exemple) (Figure 2A) (Brogden, 2005).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella 16 Figure 2 : Structures tertiaires de peptides antimicrobiens (d’après (Bulet et al., 2004; Hancock & Sahl, 2006; Tang et al., 1999)). Structure en hélice α de la magainine 1 (A), structure en feuillet de la défensine RK1 du lapin (B), structure en épingle à cheveux de la thanatine d’insecte (C), structure mixte en hélice α et en feuillet de la défensine 1 de la moule (D), structure cyclique de la rhésus θ défensine 1 de primate (E), structure désorganisée de l’indolicine bovine (F). Les ponts disulfures sont représentés en jaune.
Cette catégorie regroupe des peptides retrouvés chez divers organismes tels que l’Homme (cathélicidine LL-37), les insectes (cécropines, mélittine), les nématodes (cécropine P1), les amphibiens (magainines) ou encore les champignons (alaméthicine) (Andersson et al., 2003; Payne et al., 1970; Raghuraman & Chattopadhyay, 2007; Zanetti, 2004; Zasloff, 1987). Parmi les peptides antimicrobiens cationiques et amphiphiles les plus étudiés, on note les peptides antimicrobiens isolés d’amphibiens et d’insectes tels que les magainines, les cécropines, et la mélittine. Ainsi, la mélittine, le composant toxique principal du venin de l'abeille de miel européenne, Apis mellifera, est un peptide cationique de 26 acides aminés (aa) qui possède un effet lytique aussi bien sur les cellules procaryotes que sur les cellules eucaryotes. La région C-terminale (résidus 21-26) est hydrophile en raison de la présence d'acides aminés chargés positivement tandis que le reste de la molécule (résidus 1-20) est principalement hydrophobe (Habermann, 1972; Raghuraman & Chattopadhyay, 2007).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella 17
I.2.2 Les peptides en feuillet stabilisés par des ponts disulfures
Dans ce groupe sont retrouvés des peptides cationiques et anioniques (environ 380 peptides) qui contiennent des paires de résidus cystéines qui sont oxydés pour former des ponts disulfures internes. Les défensines forment les principaux représentants de cette classe (Brogden, 2005). Le nombre de résidus cystéines est variable (entre 2 et 8) ainsi que leur appariement ce qui donne naissance à plusieurs types de structures. Il y a les peptides ayant une conformation en feuillet avec trois ponts disulfures (la plupart des défensines de vertébrés) (Figure 2B), ceux qui possèdent une conformation en épingle à cheveux (par exemple, les brévinines des amphibiens et l’androctonine du scorpion) (Figure 2C) ou encore les peptides qui adoptent une conformation mélangeant hélice α et feuillet comme c’est le cas pour les défensines d’invertébrés et de plantes (Figure 2D) (Bulet et al., 2004). Un peptide cyclique contenant 3 ponts disulfures (6 cystéines) a été découvert dans les leucocytes de primate et nommé rhésus θ défensine 1 (RTD-1) (Figure 2E) (Tang et al., 1999).
I.2.3 Les peptides riches en acides aminés particuliers
Une petite famille de peptides linéaires (plus de 40) est caractérisée par la prédominance d’un ou deux acides aminés. Il y a les peptides riches en tryptophane comme l’indolicidine isolée de neutrophiles bovins (Figure 2F) (Selsted et al., 1992), les peptides riches en proline principalement isolés d’insectes (drosocine, pyrrhocoricine) (Otvos, 2002), les peptides riches en glycine (diptéricine) mais aussi des peptides riches en proline et arginine comme Bac 5, Bac 7 et les apidaecines (Boman, 1995). Il existe aussi de petits peptides riches en histidine, les histatines (3-4 kDa) qui sont retrouvés dans les sécrétions salivaires humaines et de primates (De Smet & Contreras, 2005). La plupart de ces peptides sont cationiques (Boman, 1995) mais certains sont anioniques à pH neutre comme la maximine H5 isolée d’amphibiens qui est riche en acides aminés hydrophobes et en acide aspartique (Lai et al., 2002).
I.2.4 Les peptides dérivés de larges protéines
Ces peptides sont issus du clivage de plus larges protéines et possèdent une activité antimicrobienne (Brogden, 2005). La buforine I, par exemple, isolée de l’estomac d’une grenouille asiatique Bufo bufo gargarizans résulte du clivage de la liaison Tyr39-Ala40 de l’histone 2A par des pepsines (Kim et al., 2000). Un autre exemple est la lactoferricine
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella 18 bovine, un peptide antimicrobien cationique produit après le clivage de la lactoferrine par une pepsine gastrique (Ulvatne & Vorland, 2001).
I.3
Peptides antimicrobiens produits par les bactéries
Les peptides antimicrobiens synthétisés par voie ribosomique chez les bactéries sont des molécules de nature protéique ou partiellement protéique, douées d’une activité antagoniste vis-à-vis de souches phylogénétiquement proches des souches productrices, ou occupant les mêmes niches écologiques. Leur synthèse, par voie ribosomique, les différencie des antibiotiques qui résultent d’un assemblage enzymatique. Deux grands groupes de peptides antimicrobiens sont distingués avec, d’une part, les peptides antimicrobiens produits par les bactéries à Gram négatif, représentés par les microcines, et d’autre part, les peptides antimicrobiens produits par les bactéries à Gram positif, et notamment les peptides antimicrobiens de bactéries lactiques (Nissen-Meyer & Nes, 1997). La plupart de ces peptides antimicrobiens sont nommés bactériocines. Le terme bactériocine a été introduit en 1953 par Jacob et al. lorsqu’ils ont constaté que l’activité inhibitrice décrite en 1925 par Gratia n’était pas limitée aux Enterobacteriaceae (Cascales et al., 2007).
Dans la suite de l’étude, le terme bactériocine fera référence aux peptides antimicrobiens produits par les bactéries à Gram positif, lesquelles possédent un gène d’immunité pour se protéger de l’action antimicrobienne de leur propre peptide (Jack et al., 1995).
I.3.1 Peptides antimicrobiens produits par les bactéries à Gram négatif
Les peptides antimicrobiens produits par les bactéries à Gram négatif sont représenté par les microcines (taille inférieure à 10 kDa) produites par des bactéries appartenant à la famille des Enterobacteriaceae et surtout E. coli (Dirix et al., 2004). Le terme microcine a été conçu pour distinguer une nouvelle classe de peptides antibactériens des colicines qui sont des protéines à activité antimicrobienne produites par E. coli (Duquesne et al., 2007).
Les microcines regroupent actuellement 10 peptides qui se répartissent en deux classes, les microcines de classe I et les microcines de classe II, qui diffèrent l’une de l’autre de part leur mode d'action (Pons et al., 2002). Les microcines de classe I ciblent des enzymes intervenant dans la structuration et la synthèse d’ADN/ARN tandis que celles de classe II interagissent avec les membranes bactériennes.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella 19 Les microcines de classe I ont une masse moléculaire comprise entre 1 et 3 kDa et arborent de nombreuses modifications post-traductionnelles. Elles sont codées par plusieurs gènes (4 à 7) portés par un plasmide. Le gène d’immunité n’est cependant pas localisé à côté du gène de structure. Les membres de cette famille sont MccB17, MccC7/C51 et MccJ25 (Duquesne et al., 2007).
Les microcines de classe II nécessitent la présence du gène chromosomique tolC (codant pour un transporteur membranaire de la membrane externe) pour être fonctionnelles (Pons et al., 2004). Elles se subdivisent en deux sous groupes, les microcines de classe IIa et IIb, selon la localisation des gènes. Les microcines de classe IIa (MccV originellement nommé ColV, MccL et Mcc24) sont codées par 4 gènes plasmidiques ayant une organisation conservée entre les différentes microcines. Les microcines de classe IIb (MccE492, MccH47, MccI47 et MccM) sont codées par des gènes chromosomiques, contrairement aux autres microcines précédemment décrites (Duquesne et al., 2007).
I.3.2 Peptides antimicrobiens produits par les bactéries à Gram positif
La production de peptides antimicrobiens par les bactéries à Gram positif a été largement étudiée et en particulier les bactériocines produites par les bactéries lactiques. En effet, au cours des 20 dernières années, les travaux sur ces bactériocines ont été conduits, avec pour objectif, de développer de nouvelles techniques de protection alimentaire pouvant limiter la détérioration des aliments et les risques d’infections alimentaires. C’est par exemple le cas de la nisine qui est le seul peptide antimicrobien autorisé en tant que conservateur alimentaire (Galvez et al., 2007).
Afin de regrouper les peptides antimicrobiens des bactéries à Gram positif, plusieurs classifications ont été proposées dans différentes revues (Cotter et al., 2005; Daw & Falkiner, 1996; Diep & Nes, 2002; Hechard & Sahl, 2002; Héchard & Sahl, 2002; Heng & Tagg, 2006; McAuliffe et al., 2001), toutes inspirées de la classification établie en 1993 par Klaenhammer pour les bactériocines de bactéries lactiques (Klaenhammer, 1993).
La classification suivante (Tableau 1) est proposée par Bastos et al. (Bastos et al., 2009) d’après les classifications de Klaenhammer en 1993 et de Heng en 2006 (Heng & Tagg, 2006).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella 20 Tableau 1 : Classification des bactériocines produites par les bactéries à Gram positif (Bastos et al., 2009)
Classification Caractéristiques Sous-classe Exemples
Classe I (lantibiotiques)
Peptides contenant des acides aminés modifiés
Type A (linéaire) Type B (globulaire) Type C (multicomposant)
Pep5, Epidermine, Nukacine ISK-1 Mersacidine Staphylococcine C55
Classe II Peptides contenant des acides
aminés non modifiés
IIa (pediocin-like) IIb (multicomposant)
IIc (divers)
Pédiocine PA-1 Auréocine A70, Lactacine F Auréocine A53, Lactococcine A,
Divergicine A
Classe III Protéines sensible à la chaleur Type IIIa (bactériolysines) Type IIIb (non lytique)
Lysostaphine Helvéticine J
Classe IV Peptides cycliques - Entérocine AS-48
I.3.3 Classe I : Lantibiotiques
Il s'agit de peptides (entre 19 et 38 acides aminés, de masse inférieure à 5 kDa) contenant des acides aminés inhabituels obtenus par modifications post-traductionnelles. Ces modifications sont réalisées par déshydratation de la sérine et de la thréonine respectivement en déshydroalanine et déshydrobutyrine, qui peuvent ensuite former une liaison thioéther avec la cystéine afin de générer, respectivement, la lanthionine et la β-méthyl-lanthionine. Ces modifications couvrent entre 24% et 58% du peptide (Willey & van der Donk, 2007). Pour souligner la présence de ce type inhabituel d'acides aminés, les bactériocines de classe I ont été nommées lantibiotiques pour lanthionine containing antibiotics (Schnell et al., 1988). La structure des lantibiotiques varie essentiellement en fonction de la localisation des ponts établis entre les acides aminés modifiés, ce qui permet de distinguer deux sous-classes. La sous-classe A est constituée par les lantibiotiques linéaires, et la sous-classe B, par les lantibiotiques globulaires. En plus de ces deux catégories, des lantibiotiques à deux composants ont également été identifiés (McAuliffe et al., 2001) et regroupés dans une troisième sous classe, la sous-classe C (Bastos et al., 2009).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella 21 I.3.3.1 Classe II : Peptides thermiquement stables et non modifiés
Cette classe est constituée de peptides (entre 20 et 60 acides aminés) de masse inférieure à 10 kDa, thermostables et sans modifications post-traductionnelles. Ils sont généralement synthétisés sous forme de prépeptides. Cette catégorie est la plus largement représentée et son étude a conduit à la création de trois sous-classes :
♦ Sous-classe IIa : les bactériocines de sous-classe IIa présentent une activité
anti-Listeria et sont caractérisées par une séquence conservée, surnommée motif anti-anti-Listeria, YGNGVxC (x représentant un acide aminé quelconque) (Ennahar et al., 2000).
♦ Sous-classe IIb : la classe IIb correspond aux bactériocines dont l’activité dépend de l’action conjuguée de deux peptides non-modifiés. L’un des peptides peut avoir une faible activité, l’ajout du second permettant une forte augmentation ainsi qu’un élargissement du spectre d’activité (Nes et al., 1996).
♦ Sous-classe IIc : la sous-classe IIc a d’abord été proposée pour les bactériocines activées par réduction de groupements thiols (Klaenhammer, 1993) puis elle a été dédiée aux bactériocines de classe II dont l'export est sous la dépendance du système général de sécrétion (système Sec). Cependant, il a été montré depuis que les bactériocines activées par réduction de groupements thiols pouvaient agir avec leur résidu cystéine oxydé et, d’autre part, une bactériocine de classe IIa, sécrétée selon un mécanisme sec-dépendant a été découverte. Il s’agit de l’entérocine P (Ennahar et al., 2000). Ceci remet fortement en question la pertinence de cette classe. Héchard et Sahl (2002) ont proposé de réserver la sous-classe IIc à toutes les bactériocines différentes des bactériocines de sous-classes IIa et IIb (Hechard & Sahl, 2002). Cette proposition a été reprise en 2005 par Cotter et al. (Cotter et al., 2005).
I.3.3.2 Classe III : Protéines thermosensibles
Les bactériocines de classe III sont des protéines thermosensibles. Ces bactériocines sont subdivisées en deux sous-classes selon leur activité : la classe IIIa qui correspond aux bactériolysines telles que la lysostaphine (Bastos et al., 2009) et la classe IIIb qui correspond aux bactériocines non lytiques telles que l’helvéticine J (Joerger & Klaenhammer, 1990).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella 22 I.3.3.3 Classe IV: Bactériocines cycliques
En 2002, les bactériocines de classe IV correspondaient à des molécules peptidiques portant une (ou plusieurs) composantes non-protéique, lipidique et/ou oligosaccharidique, nécessaires à leur activité biologique. Cependant, de telles bactériocines n’ont pas encore été purifiées avec leur partie glucidique ou lipidique ce qui laisse penser qu’elles n’existent pas (Riley & Wertz, 2002). Cette quatrième classe regroupe désormais des bactériocines cycliques telles que l’entérocine AS-48 produite par Enterococcus faecalis subsp. liquefaciens (Bastos et al., 2009).
I.3.4 Peptides antimicrobiens produits par les bactéries du genre
Staphylococcus
Dans notre équipe, une souche de S. warneri a été isolée sur un critère d’inhibition de la croissance de la bactérie pathogène Legionella pneumophila (Héchard et al., 2005). Cette activité antimicrobienne est médiée par au moins une molécule de nature peptidique dont le spectre d’activité apparaît comme spécifique des bactéries du genre Legionella. La fraction active contient deux peptides de masse moléculaire respective 2613,8 Da et 2449,4 Da. Une comparaison avec les masses moléculaires de peptides antimicrobiens déjà décrits dans les bases de données suggère qu’il s’agit de nouvelles molécules (Hechard et al., 2005; Héchard et al., 2005). La warnéricine RK a été brevetée en 2006 pour son activité anti-Legionella, sous la référence WO/2007/077316. De plus, ce brevet fait mention de deux autres peptides à activité anti-Legionella produits par S. warneri RK : les δ-hémolysine I et II (Héchard & Berjeaud, 2006).
Les hémolysines (α, , δ et γ) sont des molécules qui possèdent une activité cytotoxiques sur différentes cellules eucaryotes (Dinges et al., 2000). Elles font parties d’un ensemble de molécules complétant l’arsenal de virulence des bactéries du genre Staphylococcus, en plus des facteurs antimicrobiens sécrétés. La δ-hémolysine est un petit peptide qui se structure en une hélice α amphiphile et qui ne posséde pas ou peu d’activité antimicrobienne contrairement à d’autres molécules adoptant la même structuration secondaire telle que la mélittine par exemple (Dhople & Nagaraj, 1993; Kreger et al., 1971). ♦ Publication 1 : δ-hemolysin, an uptade on a membrane-interacting peptide
La revue ci-après regroupe les données récentes concernant la structure, les activités biologiques et le mode d’action de la δ-hémolysine. Les travaux menés au laboratoire durant
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella 23 ma thèse ont permis de confirmer la très faible activité antimicrobienne du peptide contre les bactéries déjà testées dans la littérature mais également de lui découvrir une forte activité spécifique dirigée contre les bactéries du genre Legionella (voir publication 1 : Characterization of anti-Legionella activity of warnericin RK and delta-lysin I from
Staphylococcus warneri). La synthèse des données concernant le mode d’action de la
δ-hémolysine s’intègre parfaitement à la compréhension du mode d’action de la warnéricine RK.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella 25
PUBLICATION 1
Revue
δ-hemolysin, an update on a membrane-interacting
peptide
PEPTIDES
2009
Review
d
-hemolysin, an update on a membrane-interacting peptide
Julien Verdon, Nicolas Girardin, Christian Lacombe, Jean-Marc Berjeaud, Yann He´chard*
Universite´ de Poitiers, Laboratoire de Chimie et Microbiologie de l’Eau, CNRS UMR 6008, 40 avenue du recteur Pineau, 86022 Poitiers Cedex, France
Contents 1. Introduction . . . 817 2. Expression . . . 818 3. Physicochemical properties . . . 818 4. Structure . . . 819 4.1. Structure in solution . . . 819 4.2. Structure in membrane mimetic environment . . . 819 4.3. Three-dimensional structure . . . 819 5. Biological activities . . . 820 5.1. Hemolytic and other lytic activities . . . 820 5.2. Antimicrobial activity. . . 820 6. Mode of action . . . 820 6.1. Action below the threshold concentration . . . 820 6.2. Action above the threshold concentration . . . 820 6.3. Influence of membrane lipid composition . . . 821 7. Structure/function relationship studies ofd-hemolysin. . . 822 Acknowledgements. . . 823 References . . . 823
1. Introduction
d-hemolysin, also namedd-toxin ord-lysin, is a well-known
peptide produced by various Staphylococcus strains. It was originally reported in 1947 in strains of Staphylococcus aureus
grown on sheep blood agar [54]. Several d-hemolysin variants
Peptides 30 (2009) 817–823
A R T I C L E I N F O Article history:
Received 15 October 2008
Received in revised form 17 December 2008 Accepted 18 December 2008
Available online 27 December 2008 Keywords: Antimicrobial Pore Hemolysis Staphylococcus Bacteria Erythrocyte Detergent Curvature strain A B S T R A C T
d-hemolysin is a hemolytic peptide produced by Staphylococcus, and it has been studied for nearly 50 years. Therefore, it has become a model in the study of peptides interacting with membranes. In this review, we report some recent findings and compare them with previous works.d-hemolysin is a 26 amino acid peptide, somewhat hydrophobic and presenting a zero net charge. Study of its structure has shown that d-hemolysin isa-helical and amphipathic, such as many antimicrobial peptides (e.g. magainin and melittin). However,d-hemolysin had not displayed any reported antimicrobial activity until a recent publication showed its high potency against Legionella. Its mode of action is based on direct interaction with target membranes. In accordance with its concentration,d-hemolysin may slightly perturb a membrane or lead to cell lysis. Peptide charge plays an important role in its interaction with membranes, as is shown in the study of peptide variants. Some positively charged variants become highly hemolytic and even active against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Finally, it has recently been demonstrated that peptide preferentially binds to lipid-disordered domains. It has been postulated that as a result, enrichment in lipid-ordered domains might increase peptide concentration in lipid-disordered domains and thereby improve its activity.
ß2008 Elsevier Inc. All rights reserved.
* Corresponding author. Tel.: +33 5 49 45 40 07; fax: +33 5 49 45 35 03. E-mail address:yann.hechard@univ-poitiers.fr(Y. He´chard).
Contents lists available atScienceDirect
Peptides
j o u r n a l h o m e p a g e : w w w . e l s e v i e r . c o m / l o c a t e / p e p t i d e s
0196-9781/$ – see front matter ß 2008 Elsevier Inc. All rights reserved. doi:10.1016/j.peptides.2008.12.017
were later described as being produced by different Staphylococcus
species (e.g. S. epidermis, S. intermedius).d-hemolysin belongs to
the hemolysin family. This family of peptides was discovered in the late 19th century in a culture of Staphylococcus that showed
hemolytic activity. The latter was initially attributed to a
-hemolysin but, through neutralization of this peptide, it was shown that hemolysis is also due to other peptides. Three other
hemolysins, produced by Staphylococcus, were nameda-,b- andg
-hemolysins in the order of their discovery (see Ref.[55]for an early
review).a-hemolysin acts by creating pores in a target membrane;
b-hemolysin presents shingomyelinase C activity; d-hemolysin
permeabilizes the target membrane andg-hemolysin, which is a
two-component toxin, also acts by creating pores[13]. As proteins,
these hemolysins (MW ranging from 26 to 34 kDa) share no
structural similarities withd-hemolysin, which is a 26 amino acid
peptide[16]. This peptide is responsible for erythrocyte lysis and is
likewise active against a wide range of cells and organelles[50].
Unlike many hemolytic peptides, d-hemolysin is poorly active
against bacteria[11]. However, a recent study has shown thatd
-hemolysin does present an anti-Legionella activity[53].
This review is focused ond-hemolysin, as a model peptide in the
study of membrane interactions. 2. Expression
The gene encoding d-hemolysin (hld) is part of the agr
(accessory gene regulator) locus in S. aureus. Interestingly, the agr locus regulates many virulence genes and has been extensively studied. The locus consists in five genes (agrBDCA and hld) in two divergent transcripts, RNA II and RNA III. RNA II encodes agrBDCA
and RNA III encodes hld, the d-hemolysin gene (Fig. 1). AgrC
encodes the histidine kinase and agrA the response regulator of a two-component regulatory system. AgrD encodes a peptide, which is maturated and secreted through AgrB. The resulting peptide is an auto-inducing one, which in turn activates AgrC and AgrA. Once activated, the response regulator AgrA enhances RNA II and RNA III expression through their cognate promoter P2 and P3. RNA III not only encodes hld but also acts as the effector of the agr system. RNA III regulates expression of various genes at both the transcriptional and the translational level. RNA III even regulates its own
expression. The translation of RNA III intod-hemolysin is delayed
(1 h) following the appearance of RNA III in mid-exponential
phase. This delay may be due to interaction of the 30-end of RNA III
with the ribosome binding site, consequently blocking access to
ribosomes [3]. In recently published work, inhibition of the rot
transcription factor translation was proposed as a key feature of
agr function[19].
Expression of RNA III and, as a result, ofd-hemolysin depends
on bacteria concentration. Accordingly, the agr system is a quorum-sensing system. The auto-inducing peptide (AgrD) induces agr locus expression in a cell-density dependent manner.
Thus,d-hemolysin is produced in the late-exponential phase.
3. Physicochemical properties
The firstd-hemolysin sequence was obtained by amino acid
sequencing from human isolate of S. aureus[16], and 4 years later,
the first variant of thed-hemolysin family was described[17]. To
date, different d-hemolysins have been described in various
Staphylococcus strains, with slight differences in their sequences
(Table 1). The S. aureusd-hemolysin is a 26 amino acid peptide of
2.9 kDa. Early studies suggested thatd-hemolysin was a protein
ranging from 68,000 to 200,000 Da and consisted in at least five subunits. The molecular weight of the subunit was initially estimated at approximately 21,000 Da, as determined after dissociation in nonionic detergents and assayed by sucrose gradient ultracentrifugation. However, through gel permeation under denaturating conditions, it came to appear that the minimum molecular weight for the peptide subunit was
<6000 Da[21].
d-hemolysin does not contain histidine, arginine, proline,
tyrosine or cysteine[16,17,21,24]. The same amino acid
composi-tion is also encountered in alld-hemolysin natural homologues
isolated from various species. Only three residues (Ile, Thr and Lys) account together for about 45% of the total amino acids. The Lys-Table 1
Naturald-hemolysin variants produced by different Staphylococcus strains.
Peptide name Species Sequencea
Ref.
d-hemolysin S. intermedius MAGDIISTIVDFIKLIAETVKKFTK [20]
d-lysin S. simulans MAGDIVGTIGEFVKLIIETVQKFTQK [49]
d-toxin S. epidermidis MAADIISTIGDLVKWIIDTVNKFKK [29]
d-lysin-I S. warneri MAADIISTIGDLVKLIINTVKKFQK [49]
d-lysin-II S. warneri MTADIISTIGDFVKWILDTVKKFTK [49]
d-hemolysin S. aureus MAQDIISTIGDLVKWIIDTVNKFTKK [16]
a
Sequences deduced from genes are in italics.
Fig. 1. Schematic representation of the staphylococcal two-component regulatory system agr.d-hemolysin gene, hld, is encoded by RNA III, of which the expression is regulated by the response regulator AgrA.
J. Verdon et al. / Peptides 30 (2009) 817–823 818
