Valorisation des ressources biologiques végétales par le développement d’un projet de centre de ressources biologiques (CRB) plantes tropicales en Guadeloupe : mise en place de l’assurance qualité et assainissement d’accessions d’ignames américaines

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développement d’un projet de centre de ressources

biologiques (CRB) plantes tropicales en Guadeloupe :

mise en place de l’assurance qualité et assainissement

d’accessions d’ignames américaines

Claude Pavis

To cite this version:

Claude Pavis. Valorisation des ressources biologiques végétales par le développement d’un pro-jet de centre de ressources biologiques (CRB) plantes tropicales en Guadeloupe : mise en place de l’assurance qualité et assainissement d’accessions d’ignames américaines. [Contrat] CRB QUAS, Cen-tre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement (CIRAD). 2009. �hal-02823680�

Antilles-Guyane

UR 979

Guadeloupe

UPR 75 & 103

Valorisation des ressources biologiques végétales par le développement d’un projet de

Centre de Ressources Biologiques (CRB) Plantes Tropicales en Guadeloupe : mise en place de l’assurance qualité et assainissement d’accessions d’ignames américaines.

Rapport final d’exécution

Projet financé par la Région Guadeloupe. Convention n° CR/08-01

Petit-Bourg, le 4 décembre 2009

SOMMAIRE

Résumé ... 2

Rappel du contexte et des objectifs du projet... 3

Réalisations ... 4

1. Démarche qualité sur la gestion des collections de plantes tropicales... 4

2. Assainissement de la collection d’ignames... 6

Indicateurs de résultats... 8

Annexes... 9

1. Exemple de fiche processus... 9

Résumé

Le CRB Plantes Tropicales est un outil commun CIRAD INRA, qui sert de support aux études visant à améliorer les systèmes de culture aux Antilles. Le matériel végétal détenu doit être disponible, de bonne qualité sanitaire, et correctement documenté. Au-delà des équipes scientifiques qui peuvent solliciter ce matériel, les organisations professionnelles ou les entreprises qui souhaiteraient l’utiliser pour le développement en sont également bénéficiaires. Dans sa phase actuelle de mise en place, nous avons identifié deux objectifs prioritaires pour le CRB : i) asseoir une démarche qualité, permettant d’assurer l’authenticité des ressources et la traçabilité des échanges, ii) assainir une partie de la collection d’ignames, qui présente de nombreux virus qui rendent difficile l’évaluation et la diffusion de matériel.

Grâce à ce financement de la Région Guadeloupe, nous avons pu recruter deux ingénieurs en CDD de 5 mois. Ils nous ont appuyé pour développer les thèmes qualité et assainissement.

Qualité - Un Système de management de la qualité commun CRB Plantes a été élaboré, en

distinguant :

- les processus de réalisation (recevoir, conserver, fournir des accessions et des informations liées au matériel, caractériser les accessions, conduire des actions de recherche-développement),

- les processus de management (gestion des ressources humaines, planification de la qualité), - les processus supports (achats, gestion des serres et des ateliers).

Une partie des documents qualité reliés à ces processus a été rédigée. Nous avons en

perspective immédiate la poursuite de la rédaction de la documentation. Puis nous passerons à une phase d’audits à blanc, pour préparer la certification du CRB.

Assainissement - Des techniques de détection moléculaire ont été utilisées pour identifier les

différentes espèces virales présentes dans la collection. Le processus d’assainissement a été mis en œuvre sur une cinquantaine d’accessions, à partir d’extrémités de bourgeons apicaux repiqués sur milieux de culture in vitro, ceci étant couplé à de la thermothérapie. Les plants issus de ces bourgeons apicaux ont à nouveau été analysés, pour vérifier le succès de l’élimination de virus. Au total, seulement une douzaine de variétés ont pu être assainies complètement des deux principaux virus, qui sont les potyvirus. Le rendement de la méthode utilisée est assez faible, et sur une période de 6 mois, il est possible de conduire seulement un cycle d’assainissement. En perspective immédiate, nous poursuivons ce travail de longue haleine

qu’est l’assainissement, et projetons d’optimiser la méthode pour obtenir un meilleur taux d’assainissement.

Rappel du contexte et des objectifs du projet

Ce projet s’inscrit dans l’esprit de la convention sur la diversité biologique relative à sa conservation, son utilisation durable et au partage équitable des ressources.

Au niveau des végétaux, les préconisations spécifiques en matière de conservation et diffusion de ressources ne sont pas encore définies par l’OCDE. Malgré cela, il est nécessaire pour ces différentes collections maintenues au CIRAD et à l’INRA de rationaliser et professionnaliser leurs méthodes de gestion en mettant en place un système de management de la qualité et en améliorant leur état sanitaire.

Les collections de plantes cultivées de Guadeloupe doivent évoluer progressivement vers une accréditation CRB. Cette démarche a déjà commencé, et dans le même temps un portail commun « Plantes tropicales des Antilles Française » a été réalisé

http://collections.antilles.inra.fr

Le CRB Plantes tropicales participe au réseau CAPGERNet, dont l’objectif est de mettre en place une stratégie pour la conservation à long terme des ressources phytogénétiques des Amériques, et donc au financement pérenne des collections par un fonds en cours de constitution (Global Crop Diversity Trust, sous l’égide de la FAO et de l’IPGRI).

Au niveau national et local, le projet CRB Plantes Tropicales a bénéficié d’un financement ministériel et régional sur la période 2005-2007. Au niveau local, deux fiches ont été déposées dans le cadre du PO 2007-2013, l’une concernant directement les activités de type CRB (caractérisation et maintien des ressources biologiques végétales en vue de leur diffusion auprès des professionnels de l’agriculture : CARAMBA), l’autre davantage axée sur les recherches qui y sont liées (valorisation et exploitation de la biodiversité des espèces cultivées tropicales pour l’agriculture : VALEXBIOTROP).

Un financement CPER qui fait l’objet d’une convention avec la Région Guadeloupe (CR-06-218) nous a permis de mettre en place les outils de détection, et d’assainir quelques clones. Il nous faut maintenant développer cette approche à plus grande échelle.

Les travaux engagés sur la qualité ont permis dans un premier temps de sensibiliser les acteurs à la démarche qualité (gestionnaires de collections, personnel technique chargé des manipulations liées à la conservation, l’assainissement, la caractérisation morpho-agronomique et moléculaire), et à réaliser une ébauche d’un socle de processus communs aux différentes collections.

Il restait à définir plus finement auprès des acteurs les processus spécifiques à chaque collection, et à rédiger la documentation associée à ces processus. Pour que le système puisse évoluer (amélioration continue), il fallait également poursuivre la sensibilisation des gestionnaires, afin qu’ils soient autonomes pour la mise à jour de leur documentation, et pour la mise en place de revues et audits réguliers.

Pour cela, le recrutement de deux CDD (l’un sur le volet qualité et l’autre sur l’assainissement) sur une durée de 5 mois avait été prévu pour consolider le projet et assurer la transition avec le PO.

Réalisations

1. Démarche qualité sur la gestion des collections de plantes tropicales

Contexte

L’OCDE impose que les Ressources Biologiques soient gérées dans des CRB selon de bonnes pratiques qui ont fait, pour certaines collections (microbes et produits humains), l’objet d’une norme française (NF S 96-600). Cette norme n’existe pas encore pour le matériel végétal. C’est pourquoi le CRB Plantes Tropicales a choisi de mettre en œuvre un système de management de la Qualité selon le référentiel ISO 9001.

Les objectifs dans ce domaine, étaient de poursuivre la démarche qualité entreprise sur les 5 collections 1présentes en Guadeloupe, en i) établissant les processus impliqués dans l’acquisition, l’assainissement, la caractérisation et la diffusion des ressources et ii) rédigeant la documentation qualité liée à ces processus.

Approche choisie

Travailler collection par collection

Pour cela, le travail a été mené du 18 février 2008 au 6 août 2008 par groupes de travail composés des gestionnaires des collections et /ou des agents travaillant sur celles-ci, en raisonnant collection par collection, de façon complémentaire à l’approche plus globale envisagée au début du projet (2005-2007).

Ce travail d’appropriation de façon plus concrète par les gestionnaires a permis de définir le périmètre à prendre en considération pour chacune des collections. La norme ISO 9001 impose de définir le périmètre de l’entité auditée de ses activités et des ressources, de la manière la plus précise possible.

Par exemple, au niveau de la collection de canne à sucre, sur les 1 500 génotypes de la collection de travail, 200 d’entre eux ont été choisis pour entrer dans le CRB, du fait de leur représentativité en terme de diversité génétique.

Recentrage sur processus vitaux

Dans le cadre de l’approche processus prévue par l’ISO 9001, les processus de réalisations (aussi appelés processus centraux) les plus importants ont été établis et rédigés pour les collections du CIRAD suivantes : canne à sucre, banane, orchidées. Parallèlement, les processus spécifiques à la gestion de la collection d’ignames de l’INRA, qui avaient fait l’objet d’une première documentation en 2007, ont été révisés. Ceux-ci l’on été de façon suffisamment fouillée pour étudier les activités pouvant nécessiter la définition et la rédaction soit de sous processus, soit de procédures ou de modes opératoires.

Le périmètre d’activités a été défini au cas pas cas selon les collections. Le périmètre minimum des processus de réalisation est « Recevoir, Conserver, Fournir des accessions et Fournir des informations liées à ces accessions »

1

Stabiliser une cartographie

Aussi pour mettre en œuvre une démarche cohérente entre les 2 instituts concernés, intégrative, tout en garantissant une certaine souplesse, la cartographie suivante a été formalisée : Planification de la qualité Elaboration de la stratégie Gestion RHumaines E x ig e n c e s d e s c lie n ts , d e s p a rt e n a ir e s e t d e s t u te lle s Gérer la qualité Maîtrise des documents

et des enregistrements

Achats Gestion

serres

Gestion locaux et équipements Processus de Management des CRB

S a tis fa c tio n d e s c lie n ts ,d e s p a rte n a ire s e t d e s tu te lle s

Processus de réalisation des autre CRB Manguiers, Ananas,Orchidées…

Gestion R financières

Processus support des CRB

Communication interne Processus de réalisation des CRB

PS Recevoir

Processus de réalisation pour la Canne à Sucre

PS Conserver PS Fournir du matériel biologique PS Diffuser des informations

Processus de réalisation pour I’Igname

PS Recevoir

PS Conserver PS Fournir des VP sains PS Diffuser des informations PS Participer à la recherche et D. PS Produire info basique

Processus de réalisation pour le Bananier

PS Recevoir

PS Conserver PS Fournir du matériel biologique PS Diffuser des informations PS Caractérisation agromorphologique

Cette construction permet d’aboutir à un système de management de la qualité commun CRB Plantes Tropicales dans la logique du rapprochement entre l’INRA et le CIRAD.

Dans ce champ d’application, on distingue :

- les processus de réalisation qui déclinent les activités de chacune des collections : le périmètre minimum des processus de réalisation est « Recevoir, conserver, fournir des accessions et des informations liées à ce matériel» et dans certains cas, la caractérisation et la recherche-développement font partie du périmètre.

- les processus de management qui pourront dans certains cas faire l’objet de procédures distinctes (ex : gestion des ressources humaines) ou au contraire communes (ex : planification de la qualité).

- les processus supports qui pourront eux aussi dans certains cas faire l’objet de procédures distinctes (ex : achats) ou au contraire communes (ex : maîtrise des documents et des enregistrements pour l’INRA et le CIRAD. On peut également imaginer que certains des processus ne s’appliquent qu’à l’une ou l’autre des collections (ex : gestion des serres).

Perspectives

Ce financement nous a permis de poursuivre la démarche qualité engagée, et ainsi les responsables de collections ont eu la possibilité de mieux s’approprier cette démarche et de son utilité dans la réalisation de ce projet CRB et de son objectif.

Il est nécessaire de poursuivre cette démarche qualité, comme un projet à moyen terme pour aller vers une certification.

La rédaction des documents qualité doit se poursuivre surtout au niveau des processus support. Des revues de processus sont envisagées avant d’organiser des audits à blanc.

Un plan d’action sera élaboré pour avancer dans la démarche ISO 9001, et envisager la certification pour une ou plusieurs des entités du CRB.

Les participants du volet qualité

Olivier Boinot, Ingénieur qualité en CDD.

Danièle Roques, CIRAD, gestionnaire de la collection de cannes à sucre. Christophe Jenny, CIRAD, gestionnaire de la collection de bananiers. Jean-Marie Delos, CIRAD, technicien collection des orchidées. Saturnin Bruyère, CIRAD, technicien collections.

Marc Boisseau, CIRAD, responsable qualité CRB.

Franciane Gamiette, INRA, gestionnaire de la collection d’ignames. Claudie Pavis, INRA, directrice de l’URPV et responsable du projet. Pascale Bade, INRA, animatrice qualité de l’URPV.

Suzia Rubens, INRA, technicienne collection Ignames. David Lange, INRA, technicien collection d’Ignames. Eric Francius, INRA, technicien collection d’Ignames.

Rose-Marie Gomez, INRA, technicienne collection d’Ignames.

2. Assainissement de la collection d’ignames

Ce travail fait suite à l’indexage de la collection in vitro d’ignames de l’INRA, qui a permis d’établir les niveaux de prévalence des différents virus connus sur les 3 espèces d’ignames (Dioscorea alata, D. cayenensis-rotundata, D. trifida). La grande majorité des accessions présente des infections mixtes par au moins deux de ces virus. Le CMV n’a jamais été détecté mais a très peu été recherché. Selon les techniques de détection utilisées auparavant, 80% des infections étaient dues au potyvirus, seules 25% étaient dues aux badnavirus.

Les techniques de détection pratiquées ont été :

• Pour les potyvirus (YMV et YMMV) : le direct binding reverse transcription multiplex (DB-RT-M) PCR, avec les amorces développées par Munford & Seal (1997) pour le YMMV (YMMV VTR & YMMV CP 2F) et les amorces développées par Bousalem et al. (2000) pour le YMV (YM1 & YM2)

• Pour les potexvirus : la RT-PCR avec les amorces dégénérées développées Van der Vlugt et al. (2002) aboutit à des bandes aspécifiques

• Pour les badnavirus une PCR utilisant des amorces dégénérées issues de séquence du génome des badnavirus.

La procédure d’assainissement (thermothérapie associée à la culture de la zone apicale a été initiée sur une cinquantaine d’accessions. Un cycle d’assainissement dure au moins 6 mois le plus souvent 9 mois. Environ 15 accessions ont été placées simultanément dans l’enceinte de thermothérapie réglée à 35°C, pendant 2 mois.

Des problèmes de répétabilité des résultats sur les badnavirus nous ont amené à améliorer les tests de détection de cette famille de virus. La sensibilité et la reproductibilité des tests de détection des badnavirus sur vitroplants ont été améliorés. Le taux de contamination par les badnavirus, estimé sur une cinquantaine de variétés, a été de 80% contre 25% avec la précédente méthode.

A ce jour, 52 accessions ont subi au moins un cycle complet d’assainissement et environ 400 mériplantes ont été testées. Le taux d’assainissement des accessions (au moins un mériplant assaini) est de 83% pour YMV, de 76% pour YMMV pour les test faits sur vitroplants. Concernant les potexvirus, notamment pour D. trifida, des bandes aspécifiques apparaissent, faisant douter de l’interprétation du résultat. Nous n’avons retenu comme assaini que les profils présentant une absence totale de bandes (autre espèce que D. trifida). Concernant les badnavirus, au stade vitroplant, la méthode de détection se fait à partir d’ADN viral, le taux d’assainissement est de 32%. Dans l’attente d’un test plus fiable, la détection des potexvirus a été suspendue notamment sur D. trifida.

La confirmation de l’assainissement se fait sur des plantes, provenant de mériplantes et sevrées en chambre climatique. Dans un premier temps, seules les plantes qui au stade in vitro semblaient avoir été assainis pour tous les virus testés ont été sevrées et les tests de détection effectués. Le taux d’assainissement pour YMV est de 42%, pour YMMV de 30%. Concernant les potexvirus, le taux d’assainissement serait de 13% .

Concernant les badnavirus, sur des plantes sevrées, même les plantes infectées n’ont pas été détectées positives à partir du protocole d’extraction de l’ADN viral. Aussi a-t-on du procéder à une extraction d’ADN total (plante + virus) par la méthode CTAB. Avec ce mode d’extraction, aucun assainissement pour les badnavirus n’a pu être mis en évidence, tous les plants testés se sont révélés positifs.

A ce jour, 12 variétés d’ignames ont été assainies pour les potyvirus YMV et YMMV.

Les participants du volet assainissement Marie Umber, Ingénieur biologiste en CDD.

Franciane Gamiette, INRA, gestionnaire de la collection d’ignames. Suzia Rubens, INRA, technicienne collection Ignames.

Rose-Marie Gomez, INRA, technicienne collection d’Ignames.

Perspectives

Ce financement nous a permis d’assainir 12 variétés d’ignames pour les principaux virus, sur les 90 prévues. Le processus d’assainissement s’est avéré plus complexe que prévu, car un cycle d’assainissement peut aboutir à l’élimination d’un seul virus de la plante, et il faut donc la répéter pour l’autre ou les autres virus. Les méthodes de détection ont parfois également posé des problèmes de fiabilité.

Nous allons poursuivre l’effort d’assainissement, en optimisant les techniques de détection, ainsi que la méthode de prélèvement des bourgeons apicaux, pour obtenir des taux d’assainissement plus élevés.

Indicateurs de résultats

REALISE PREVISIONNEL

% Justification Finalisation de la démarche Qualité

- Etablissement des processus impliqués dans l’acquisition, la caractérisation et diffusion des ressources

- Rédaction de la documentation qualité

100

50 Pour certaines collections, la rédaction des documents a été plus complexe que prévue, et n’est donc pas totalement aboutie.

Assainissement de 90 accessions 15 Le matériel végétal s’est avéré contenir plusieurs espèces virales, le processus d’assainissement a donc été allongé, plusieurs cycles d’assainissement étant nécessaires.

Annexes

1. Exemple de fiche processus

BANANE Neufchateau FICHE de DESCRIPTION du PROCESSUS « RECEVOIR » V060508 Page 9 sur 1

Nom du processus : «RECEVOIR ET INSTALLER DES ACCESSIONS » Pilote du processus : Technicien

Finalité du processus : Installer plants sains in vivo en collection de routine

Domaine d’application : CRB PT

Processus en entrée / amont / fournisseur :

Néant

Processus en sortie / aval / client :

conserver

Entrants / Données d’entrée :

vitroplant

demande d’introduction de matériel dans le CRB (par client ou par CRB)

Résultats attendus / Données de sortie / (Enjeux) :

-3 pieds par accession installés en parcelle de routine

Documents d’entrée :

MTA, documents phytosanitaires du SPV et

indexation, passeport, certificat d’origine (douane), liste des accessions

Documents de sortie :

Plan collection au champ, BDD, Dossier rassemblant les documents d’entrée (scannage à prévoir ?)

Ressources nécessaires : Personnel :

- responsable CRB Banane

- 1 technicien expérimentation agronomique

- collaborateurs internes sensibilisés

- responsable virologue

- 1 technicien en pathologie

Matériel et installations :

Serres d’acclimatation insect proof et de croissance avec brumisation, parcelles adaptées, Labo virologie

Matériau/ accession/ information Néant

Activités :

- définir les conditions de transfert - contrôler le matériel - enregistrer dans BDD (identification unique, caractérisation d’origine) - installer le matériel - effectuer suivi virologique (1 an)

Risque principal identifié :

- Perte d’identification des VP - Perte de matériel biologique

- Contamination virale des autres accessions - informations incomplètes (cf. PS

caractérisation)

Moyen de prévention/contrôle du risque :

- Marquage de chaque individu avant manipulation (cf. PR correspondante) - Technicité

- Serre insect proof et contrôles virologiques - Envoi préalable d’une check list au

« client/détenteur »

Documents de maîtrise interne du processus :

- Procédure d’installation VP

- Dossier d’indexation locale

- Cahier d’introduction de matériel biologique en serre

Surveillance de l’efficacité (ex : indicateurs)

2. Liste des documents qualité rédigés

Bananier Canne à sucre Igname Manguier Orchidée

Processus de réalisations

Recevoir du Matériel Biologique (MB)

X X X X

Conserver du MB X X X X

Fournir du MB X X X X

Diffuser de l’information relative aux M.B X X X X Caractérisation agromorphologique X Participer à la recherche et au développement Documents liés

Procédure : Assainir une accession d’Igname conservée in vitro

X

Mode opératoire : Conserver une accession in vitro

X

Processus de management

Mode opératoire : Réaliser la revue de direction

X

Plan action suite à un disfonctionnement

X