Étude de l'interaction de la transitine et du déterminant de l'identité cellulaire Numb durant la myogenèse

Etude de l'interaction de la transitine et du déterminant

de l'identité cellulaire Numb durant la myogenèse

Mémoire présenté

à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval

dans le cadre du programme de maitrise en biologie cellulaire et moléculaire pour l'obtention du grade de maître es sciences (M.Sc.)

FACULTE DE MEDECINE UNIVERSITÉ LAVAL

QUÉBEC

2010

RESUME

La transitine est une protéine cytosquelettique de la famille des filaments intermédiaires (FI) exprimée pendant la différenciation musculaire, lors du remplacement de la vimentine par la desmine. L'expression transitoire de cette protéine a permis de conclure qu'elle est impliquée dans la réorganisation du réseau des Fis pendant la différenciation des cellules musculaire. En plus de son rôle structural dans les cellules myogéniques, la transitine joue un rôle crucial dans la régulation de la neurogenèse en agissant comme plateforme d'ancrage du déterminant d'identité cellulaire Numb et assurant la distribution asymétrique de cette protéine dans les cellules neuroépithéliales aviaires en mitose (Wakamatsu et al., 2007). La transitine est également impliquée dans la formation des muscles durant des étapes précoces de la myogenèse et peut jouer un rôle dans la distribution asymétrique du déterminant de l'identité cellulaire Numb dans les cellules myogéniques. Son rôle dans la distribution asymétrique de Numb a été vérifié par l'étude de la localisation fine de ces deux protéines dans le somite en différenciation. Nos résultats ont montré que ces deux protéines colocalisent dans le coté basai des cellules mitotiques de la lèvre dorsale de dermomyotome. D'autre part, l'implication directe de la transitine durant la formation des muscles a été déterminée par l'analyse de l'effet de l'atténuation de l'expression de la transitine par RNAi sur la différenciation myogénique dans un modèle cellulaire, la lignée QM7. L'atténuation de l'expression de la transitine altère la morphologie cellulaire et la capacité des cellules de se différencier et d'exprimer les facteurs myogéniques et les marqueurs de la différenciation. En effet, nos résultats montrent bien qu'en absence de la transitine, les cellules ne se différencient pas et gardent le caractère des cellules précurseurs myogéniques malgré leur incubation dans un milieu de différenciation. De même, cette protéine peut être impliquée dans la régulation de la synthèse/stabilité de Numb. Nos résultats ont montré une augmentation de niveau d'expression de Numb dans les cellules dont l'expression de la transitine est diminuée, par rapport aux cellules contrôles. Ces études ont donc démontré que la transitine joue un role clé dans la myogenèse en tant qu'une protéine importante pour la transition myoblaste-m yotube.

IV

À mon père À ma mère À chaque membre de ma famille élargie Et à tous ceux que j'aime et qui m'aiment

J'aimerais en tout premier lieu exprimer mes remerciements les plus sincères à mon directeur de recherche Michel Vincent, pour sa supervision, pour son regard critique et pour son intérêt pour ce mémoire.

Je remercie et j'exprime ma gratitude à Louis Lapierre, Karine Biais, Dominique Guerette et Guillaume Ruel qui m'ont aidé à accomplir ce travail par leurs conseils, par leurs encouragements et par leurs critiques. Merci également à mes collègues de laboratoire Céline Bruelle, Maikeal Bédard et Martin Gauthier pour leurs encouragements et leur soutien moral tout au long de ma maitrise.

D'autre part, je tiens à remercier tous les professeurs et le personnel de la Faculté de Medicine pour leur disponibilité et leur accueil.

J'exprime aussi toute ma gratitude à mes professeurs de la faculté des sciences de Gafsa, en particulier M. Sami Souid et M. Halim Harrath pour leurs conseils si précieux.

Mes remerciements s'adressent aussi au Ministère de l'enseignement supérieur de la Tunisie et à la Mission Universitaire de Tunisie à Montréal pour m'avoir accordé la bourse me permettant de poursuivre mes études, de développer mes connaissances et de découvrir un nouveau monde.

Enfin, et surtout, j'adresse toute ma gratitude et mes sentiments d'amour à ma mère Farida, mon père Mouldi, mes sœurs Manel, Mouna et Safa et mon beau frère Hassine pour leur amour et leur patience. Je sais que je pourrai toujours compter sur vous tous. Je ne manque pas de remercier tous mes amies et amis.

VI

TABLE DES MATIÈRES

RÉSUMÉ III AVANT-PROPOS V

TABLE DES MATIÈRES VI LISTE DES TABLEAUX IX LISTE DES FIGURES X LISTE DES ABRÉVIATIONS XII

CHAPITRE L... 1 INTRODUCTION GÉNÉRALE 1

1.1. La myogenèse et la régénération des cellules musculaires 2

1.1.1. La myogenèse 2 1.1.1.1. Effet des facteurs environnants sur la myogenèse 3

1.1.1.2. Mécanisme de régulation des différentes étapes de la myogenèse 4

1.1.1.2.1. La détermination 6 1.1.1.2.2. La différenciation et la maturation 10

1.1.2. La régénération des cellules musculaires 11

1.1.2.1. Les cellules satellites 11 1.2. Les filaments intermédiaires 13

1.2.1. Le cytosquelette des cellules eucaryotes 13 1.2.2. Rôles des filaments intermédiaires 16 1.2.3. Les protéines des filaments intermédiaires impliquées dans la myogenèse 19

1.2.3.1. La vimentine 19 1.2.3.2. La desmine 21

1.2.3.3. La nestine 22 1.2.3.4. La transitine 23 1.3. Hypothèse et objectifs de recherche 24

CHAPITRE II 25 MATÉRIEL ET MÉTHODES 25

2.1. Culture cellulaire 26 2.1.1. Transfection des cellules Qm7 26

2.1.2. Cinétique de croissance cellulaire 26 2.1.3. Traitement des cellules avec le DAPT 27 2.1.4. Traitment des cellules avec le BrdU 27

2.2. Immunofluorescence indirecte 27 2.2.1. Marquage de cellules pour .'immunofluorescence 27

2.2.2. Immunofluorescence indirecte surcoupes d'embryons de poulets 28

2.2.3. Anticorps 28 2.3.3.1. Anticorps primaires 28 2.3.3.2. Anticorps secondaire 29 2.3. Western blot .- 29 2.3.1. Description de la méthode 29 2.3.2. Anticorps 30 2.4.2.1. Anticorps primaires 30 2.4.2.2. Anticorps secondaires 30 2.4. RT-PCR 30 2.4.1. Extraction de l'ARN 30 2.4.2. Synthèse de l'ADNc 30 2.4.3. Réaction en chaîne de la polymerase (PCR) 31

vin

CHAPITRE III 33 RÉSULTATS 33 3.1. Étude de la localisation de la transitine et du déterminant de l'identité cellulaire

Numb durant la myogenèse 34 3.2. Étude de l'effet de l'atténuation de l'expression de la transitine par interférence a

l'ARN sur la différenciation myogénique dans un modèle cellulaire, la lignée QM7 38

3.2.1. La différenciation myogénique des cellules QM7 38 3.2.2. Atténuation de l'expression de la transitine par interférence à l'ARN 40

3.2.3. Étude de l'effet de l'atténuation de l'expression de la transitine sur l'expression des marqueurs des précurseurs myogéniques et sur la morphologie cellulaire et sur la

prolifération 42 3.2.4. Étude de l'effet de l'atténuation de l'expression de la transitine sur la

différenciation cellulaire 46 3.2.4.1. Analyses de l'expression des marqueurs de la différenciation 46

3.2.4.2. Analyses du potentiel de division et de l'expression du marqueur des cellules précurseurs myogéniques Pax7 dans les cellules TrSil et les cellules TrSi2

après leur privation en sérum 49 3.2.4.3. Analyses de l'expression des gènes myogéniques 56

3.3. Étude de l'implication de Numb dans l'inhibition de la différenciation myogénique 58

CHAPITRE IV 63

DISCUSSION 63

CONCLUSION GÉNÉRALE 76

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1.1 : Classification des différentes protéines des Fis 15 Tableau 1.2 : Les groupes d'assemblage des protéines des Fis 16

Tableau 2.1 : Séquence des amorces utilisées pour amplifier les ARNm des gènes aviaires. 32

X

LISTE DES FIGURES

Figure 1.1 : Représentation schématique de la somitogenèse 2 Figure 1.2: Représentation schématique des facteurs environnants régulant la myogenèse.

3 Figure 1.3 : Représentation schématique des facteurs de transcription de la famille bHLH

régulant les différentes étapes de la myogenèse 5 Figure 1.4 : Représentation schématique de la différenciation et le renouvellement des

cellules satellites 12

Figure 3.1: Numb et transitine colocalisent dans le côté basai des cellules de la lèvre

dorsale de dermomyotome 37

Figure 3.2 : Différenciation myogénique dans un modèle cellulaire, la lignée QM7 39

Figure 3.3: Atténuation de l'expression de la transitine par interférence à l'ARN dans le

modèle cellulaire QM7 41

Figure 3.4 : Altération mophologique des cellules TrSil et des cellules TrSi2 43

Figure 3.5 : Effet de l'atténuation de l'expression de la transitine sur la croissance

cellulaire 44

Figure 3.6 : Effet de l'atténuation de l'expression de la transitine sur l'expression de la

vimentine et de Pax7 45

Figure 3.7 : Effet de l'atténuation de l'expression de la transitine sur l'expression de la

Figure 3.8 : Effet de l'atténuation de l'expression de la transitine sur l'expression de la

myosine (MHC) 48 Figure 3.9 : Les cellules TrSil et les cellules TrSi2 gardent leur potentiel prolifératif

après leur privation en sérum 52

Figure 3.10 : Cinétique de croissance des cellules TrSil et des cellules TrSi2 53

Figure 3.11 : Les cellules de la lignée TrSil et de la lignée TrSi2 gardent leur caractère de

cellules précurseurs myogénique après la privation de sérum 55

Figure 3.12 : Expression de divers gènes myogéniques dans les différentes lignées

cellulaires et leur évolution dans le temps 57

Figure 3.13 : Les cellules dont l'expression de la transitine est diminuée ne se fusionnent

pas et ne se différencient pas même en présence de DAPT 59

Figure 3.14 : Augmentation du niveau d'expression de Numb dans les cellules dont

l'expression de la transitine est diminuée 61

Figure 3.15 : Régulation de la synthèse/stabilité de l'expression de Numb dans les cellules

xn

LISTE DES ABREVIATIONS

ADNc ARNi ARNm bHLH BR BSA CDKs CNS DAPT DEDD DISC FBS Fis GAM GAR MEF2 MFs MRF MTs NICD PCR PDGF TNFR2 TP TRADD UV ADN complémentaire ARN interférence ARN messager

Facteurs de transcription hélice-boucle-hélice Blocking Reagent

Albumine de sérum de bœuf Cyclin-Dependant Kinase Système nerveux central

Dipeptide g-secretase inhibitor N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L- alanylj-Sphenylglycin et-butyl ester

Death effector domain containg DNA binding protein Death inducing signaling complex

Fœtal serum bovin Filaments intermédiaires Goat a-mouse

Goat a-rabbit

Myocyte enhancer factor Microfilaments

Facteurs de régulation myogénique Microtubules

Domaine intracellulaire de Notch Réaction en chaine de la polymerase Platelet-perived-growth factor Tumor necrosis factor receptor 2 Tryptose phosphate

Tumor-necrosis-factor-receptor-1- associated death domain protein

1.1. La myogenèse et la régénération des cellules musculaires

1.1.1. La myogenèse

Les muscles squelettiques sont d'origine mésodermique. Ces muscles dérivent des cellules des somites épithéliaux qui se forment suite à la segmentation du mésoderme paraxial (Christ et Ordahl, 1995). Au cours du développement embryonnaire, les somites subissent des changements morphologiques conduisant à la formation d'une variété de tissus : Les vertèbres dérivent de la partie ventrale des somites, le sclerotome, tandis que la partie dorsale des somites, le dermomyotome, est à l'origine du derme et du muscle squelettique du tronc et des membres (Keynes et Stem, 1988) (Figure 1.1). Plus précisément, les cellules de la partie médiale des somites donnent naissance aux muscles du tronc alors que les cellules de la partie latérale sont à l'origine des muscles des membres (Ordahl et Douarin, 1992).

Ganglion de la racine dorsale

Dermomytome epaxial (D.e) D.e intercalé Tube neural Surface de l'ectoderme Mesoderme paraxial présomitique Somite epithelial Dorsale Notochorde f ~ t . ^ Dermomyotome hypaxial Antérieure

Sclerotome My °, 0 m e (rostal> \

Postérieure (caudale)

Ventrale

Figure 1.1 : Représentation schématique de la somitogenèse (adapté de Buckingham, 2001)

migrent a partir de la lèvre dorsomédiale et de la lèvre ventrolatérale du dermomyotome pour former le myotome, à l'origine du muscle squelettique du tronc (Denetclaw et Ordahl, 2000), alors que d'autres migrent du dermomyotome hypaxial vers les sites de bourgeonnement des membres. Le programme myogénique des cellules situées dans le dermomyotome se déclenche suite à la réception des signaux environnants.

1.1.1.1. Effet des facteurs environnants sur la myogenèse

Les premières étapes de la myogenèse sont sous le contrôle des tissus environnants (Figure 1.2). De nombreuses études indiquent que l'acquisition de l'identité myogénique des cellules multipotentes situées dans la partie dorsale des somites résulte de l'interaction de ces cellules somitiques avec les tissus adjacents (Aoyama et Asamoto; 1988 et Ordahl et Le Douarin, 1992).

urface de l'ectoderme

Notochorde

Mésoderme latéral

Figure 1.2 : Représentation schématique des facteurs environnants régulant la myogenèse (adapté de Perry et Rudnicki, 2000).

La myogenèse se déclenche sous l'action des facteurs environnants qui activent l'expression des gènes impliqués dans la détermination myogéniques, MyoD et Myf5 (Tajbakhsh et al., 1998). La protéine Wnt, produite par le tube neural et la surface de l'ectoderme, ainsi que la protéine Shh (Sonic hedgehog), sécrétée par la notochorde et la partie ventrale du tube neural, sont des effecteurs positifs de la myogenèse (Tajbakhsh et Buckingham, 2000). La molécule Shh assure la survie et l'expansion des cellules précurseurs du muscle squelettique (Duprez et al., 1998; Teillet et al., 1998; Marcelle et al., 1999; Kruger et al., 2001) et est nécessaire pour l'activation et le maintien de l'expression des gènes qui codent pour le facteur de transcription bHLH, Myf5 (Kruger et al., 2001). Les molécules Wnts (Wntl, Wnt3a et Wnt4), pour leur part, sont responsables de l'activation des gènes régulateurs de la myogenèse Pax3 et MyoD (Wagner et al., 2000). De plus, ces molécules peuvent être impliquées dans la régulation des facteurs de transcription Gli, qui sont des effecteurs de la voie signalisation Shh (Borycki et al., 2000). Donc, les tissus environnants jouent un rôle crucial dans la spécification, l'expansion et la survie des cellules qui sont à l'origine de muscle squelettique.

Il est à noter que d'autres facteurs environnants tel que le BMP peuvent avoir des effets négatifs sur la myogenèse. Ce facteur est lui-même régulé négativement par Noggin qui est exprimée dans la lèvre dorsale du dermomyotome (Tajbakhsh et Buckingham, 2000).

1.1.1.2. Mécanisme de régulation des différentes étapes de la myogenèse

Au cours de développement embryonnaire, la formation des tissus musculaires se fait en plusieurs étapes. Dans un premier temps, les cellules souches somitiques se déterminent en myoblastes sous l'action des facteurs de détermination myogénique. Par la suite ces myoblastes s'alignent, se fusionnent et se différencient en myotubes qui se transforment en myofibres lors d'une étape de différenciation tardive, la maturation (Figure 1.3).

Les différentes étapes de la myogenèse sont hautement régulées par des facteurs de régulation myogénique (MRF) appartenant à la famille des facteurs de transcription hélice-boucle-hélice (bHLH): Myf5 (Braun et al., 1989), myogenine (Wright et al.,

et Konbeczny, 1989). Ces facteurs possèdent un domaine HLH impliqué dans la formation d'homodimères ou d'hétérodimères et un domaine basique nécessaire pour la liaison à l'ADN. L'expression de ces facteurs est régulée de façon spatiotemporelle en fonction de leur action dans la détermination et/ou la différenciation des myoblastes (Buckingham, 1992; Emerson, 1993). Il a été démontré que les protéines MyoD et Myf5 interviennent dans la détermination des myoblastes (Rudnicki et al., 1993) et que la protéine myogenine a un rôle crucial dans la différenciation terminale (Hastry et al., 1993; Nabeshima et al., 1993). La protéine Mrf4, quant à elle, est impliquée dans la maturation des fibres musculaires. Ces facteurs de transcription forment des hétérodimères avec d'autres protéines de la famille bHLH, les protéines E (E47-E12), et se lient par la suite à la boite E présente dans les régions régulatrices de plusieurs gènes musculaires tel que le gène de la desmine, la creatine kinase, la troponine I et l'actine a (Lassar et al., 1994; Weintraub et al., 1993), induisant ainsi leur activation.

A

M-

A

y

Figure 1.3 : Représentation schématique des facteurs de transcription de la famille bHLH régulant les différentes étapes de la myogenèse

(adapté de Perry et Rudnicki, 2000).

En plus des MRFs, les facteurs de transcription MEF2 (myocyte enhancer factor) jouent également un rôle clé dans la régulation de la myogenèse et précisément dans la

différenciation musculaire (Black et Oison, 1998; Naya et Oison, 1999). Ces facteurs de transcription sont nécessaires à l'expression des gènes MRF, la myogenine et Mrf4 (Cheng et al., 1993; Naidu et al., 1995). En effet, leurs sites de liaison à l'ADN sont retrouvés non seulement dans les régions régulatrices des gènes de structure musculaire et mais aussi dans les régions régulatrices des gènes MRF. Malgré que les protéines MRFs ont un effet puissant dans la modulation du programme myogénique puisqu'elles sont capables d'induire la myogenèse dans une variété des cellules non musculaires (Oison, 1990; Wilson Rowls, 1999), cette conversion myogénique ne peut se faire qu'à la suite de l'action des protéines MEF2 qui sont à elles seules insuffisantes pour induire la myogenèse (Black et Oison, 1998; Ornatsky et al., 1997). Cela suggère que la coopération entre les hétérodimères MRF/protéine E et les protéines MEF2 est nécessaire pour l'activation de l'expression génique et la stimulation de la myogenèse.

1.1.1.2.1. La détermination

La transformation des cellules souches somitiques en myoblaste est assurée par les facteurs de transcription de la famille bHLH MyoD et Myf5 qui sont exprimés uniquement dans les cellules à l'origine de muscle squelettique (Ott et al., 1991; Pownall et Emerson, 1992) sous l'influence des facteurs environnants (Tajbakhsh et al., 1998). Les protéines MyoD et Myf5 jouent un rôle crucial dans l'activation de l'expression des gènes spécifiques des cellules musculaires et elles ont une forte potentialité à induire la myogenèse. La surexpression de MyoD et de Myf5 peut induire la différenciation musculaire d'une variété des cellules non musculaires (Weintraub et al., 1989) alors qu'en absence de ces protéines, les cellules somitiques qui deviendront un muscle squelettique adoptent une autre destination cellulaire (Tajbakhsh et al., 1996). De plus, la double mutation de MyoD et Myf5 entraine l'inhibition de la formation des muscles à cause de l'absence des cellules précurseurs (Rudnicki et al., 1993).

Il est à noter qu'avant la phase de détermination, les cellules souches à l'origine des cellules musculaires squelettiques (les cellules du dermoyotome) expriment les facteurs de spécification Pax3 et Pax7 (Goulding et al., 1991; Jostes et al., 1991) qui sont des membres de la famille des facteurs de transcription à homéodomaine et domaine paired.

cellules. L'expression des ces protéines diminue lorsque les cellules commencent à exprimer les MRFs (Sassoon et al., 1989; Hirsinger et al., 2001; Kiefer et Hauschka, 2001). Donc, les protéines Pax3/7 sont des régulateurs myogéniques importants qui interviennent pendant une phase qui précède l'activation des MRFs.

La myogenèse est un phénomène hautement régulé par des nombreux facteurs qui ont des effets négatifs ou positifs. Ce phénomène peut être régulé négativement par les protéines Id, Twist, MyoR, proliferine, Mdfi, les protéines de la famille Hes, les facteurs de croissance TGF-P et FGF, par l'activation des oncogenes (c-myc, c-jun et junB) ainsi que par l'activation de certaines voies de signalisation telles que la voie de signalisation régulatrices de la prolifération cellulaire qui fait intervenir ras et/ou fos et la voie de signalisation Notch. Ces facteurs interviennent en ciblant une de plusieurs étapes nécessaires pour l'entrée des cellules dans la voie de différenciation musculaire telle que la transcription et la traduction des gènes myogéniques bHLH, le transport des protéines myogéniques vers le noyau, la formation des dimères et des oligodimères avec d'autres protéines bHLH, la liaison à l'ADN etc.

Dans un premier temps, les protéines Id, Twist et MyoR sont impliquées dans la régulation négative de l'activité des protéines E via la formation d'hétérodimères avec ces derniers ce qui a pour effet la séquestration de ces protéines et par conséquence l'inhibition de leur liaison aux MRFs (Benezra et al., 1990; Kophengnavong et al., 2000 et Lu et al., 1999). Pour sa part, la protéine Id, qui possède le motif HLH mais qui est dépourvue de domaine basique nécessaire à la liaison à la boite E, peut également inhiber l'activité des MRFs via la formation d'hétero-oligomères inactifs (Langlands et al., 1997). Contrairement à la protéine Id qui agit uniquement en séquestrant les facteurs de transcription bHLH, Twist et MyoR, en s'associant avec les protéines E, se lient à boite E et agissent comme répresseur transcriptionnel des gènes induits par MyoD. En plus de son rôle dans la séquestration de la protéine E, la protéine Twist est également impliquée dans l'inhibition de l'activité des protéines MEF2 (Spicer et al., 1996).

8

En plus de Twist, Id et MyoR, la protéine Mdfi/I-mfa peut agir comme régulateur négatif de la différenciation en séquestrant les protéines myogéniques bHLH et empêchant leur translocation vers le noyau (Chen et al., 1996; Snider et al., 2001). D'autre part, les protéines MDM 2 peuvent intervenir en assurant la suppression de la transcription dépendante de MyoD (Fiddler et al., 1996).

L'activation des oncogenes est aussi impliquée dans la régulation négative de la différenciation musculaire. Les protéines c-jun et junB peuvent, quant à elles, influencer l'activité de MyoD et cela par l'interaction directe avec ce facteur de détermination myogénique (Bengal et al., 1992; Li et al., 1992). Contrairement à C-jun et junB, C-myc inhibe la différenciation myogénique en exerçant un effet sur le niveau et/ou l'activité de plusieurs régulateurs de cycle cellulaire tels que les cyclines, les CDKs (Cyclin-Dependant Kinase), la protéine Rb et le facteur de transcription E2F (Steiner et al., 1995; Galaktionov et al., 1996). La surexpression de cycline DI, qui est importante dans la progression dans Gl-S de cycle cellulaire ainsi que l'augmentation de l'activité de cycline/CDK inhibe la myogenèse via la phosphorylation et la déstabilisation de MyoD (Rao et al., 1994; Skapek et al., 1996).

L'inhibition de la différenciation peut également s'effectuer par la réduction de l'expression des gènes MyoD suite à l'activation de ras, un excès de fos ou sous l'action de la proliférine ((Konieczny et al., 1989; Lassar et al., 1989; Wilder et al., 1989) cité par (Miner et Wold, 1991)).

Les facteurs de croissance FGF et TGF-P peuvent aussi inhiber l'expression de gènes MyoDl (Vaidya et al., 1989). Rios et ses collaborateurs ont montré qu'une surexpression de la protéine myostatine (MSTN), qui est un membre la famille TGF-P, entraine une diminution de niveau des régulateurs musculaires MyoD et myogenin et par conséquence l'inhibition de processus myogénique (Rios et al., 2002).

Il est à noter que la deacétylation des histones joue également un rôle clé dans la modulation de programme myogénique. En effet, l'interaction entre MyoD et HDAC I

division (Mal et al., 2001). De même, l'interaction de MEF2 avec HDAC IV et HDAC V inhibe la différenciation musculaire (Miska et al., 1999; Lu et al., 2000).

La voie de signalisation Notch est impliquée également dans la régulation de la myogenèse en tant que signal répressif pour la différenciation cellulaire. De nombreuses études tendent à montrer que l'activation de la voie de signalisation Notch entraine l'inhibition de la différenciation musculaire des cellules myogéniques en culture (Kopan et al., 1994; Shawber et al., 1996; Luo et al., 1997; Nofiger et al., 1999; Kuroda et al., 1999). L'activation de la voie de signalisation Notch se déclenche à la suite de la liaison d'un de leurs ligands Delta ou Serrate/Jagged, qui sont présents à la surface des cellules avoisinantes, au récepteur transmembranaire Notch (Mumm et Kopan, 2000). Cette liaison entraîne un clivage protéolytique intracellulaire du récepteur Notch et par conséquent, la libération d'un domaine intracellulaire (NICD) dans le cytoplasme. Ce NICD migre par la suite vers le noyau où il s'associe à un membre de la famille CSL, RBP-J, en modulant son activité d'un répresseur transcriptionnel vers celle d'un activateur transcriptionnel ce qui a pour effet la stimulation de la transcription des gènes cibles comme ceux de la famille Hes, Hesl et Hes2, qui ont un effet négatif sur la différenciation musculaire. Les protéines Hesl et Hes2 peuvent affecter l'activité de MyoD via l'inhibition de l'activité de E47 (Sasai et al., 1992; Ordentlich et al., 1998). De plus, Hesl peut aussi inhiber l'expression de MyoD (Kuroda et al., 1999). Il est à noter que l'activation de la voie Notch peut également inhiber la myogenèse via un mécanisme indépendant de CSL. En effet, le NICD a la capacité d'inhiber l'activité de E47 ainsi que l'activité MyoD (Ordentlich et al., 1998). De même, plusieurs études ont montré que la forme active de Notch peut empêcher la liaison de MEF2C à l'ADN et la coopération de ces facteurs avec les facteurs myogéniques BHLH (Wilson Rowls et al., 1999). Le sentier de signalisation Notch est à son tour régulé négativement par Numb qui joue un rôle crucial dans l'acquisition du destin cellulaire. Plusieurs études tendent à montrer que Numb est responsable de l'ubiquitination (Me Gill et al., 2003, Wakamatsu et al., 1999; Zhong et al., 1996 et Guo et al.„ 1996) ainsi que l'endocytose du récepteur Notch (Santolini et al., 2000). De plus, il a été démontré que Numb inhibe la voie de

10 signalisation Notch en s'associant à NICD ce qu'a pour effet l'empêchement de sa translocation vers le noyau (Guo et al., 1996; Wakamatsu et al., 1999).

La myogenèse est aussi régulée par des facteurs qui ont un effet positif sur la différenciation musculaire. Par exemple la protéine Hes6 qui intervient pour inhiber la formation des hétérodimères Hes2-Hesl/E47 (Luo et al., 2005) et de MLM1 qui interagit avec le dimère MRF/protéine E pour augmenter l'activation des gènes dépendants MRF/protéine E et par conséquence stimuler la différenciation (Kong et al., 1999).

1.1.1.2.2. La différenciation et la maturation

La différenciation des myoblastes en myotubes est le résultat de l'arrêt irréversible du cycle cellulaire en premier lieu et de l'activation de l'expression du facteur de transcription la myogenine. En effet, plusieurs études tendent à montrer que les souris fonction nulle pour p21 et p57 qui sont des régulateurs négatifs du cycle cellulaire (Zhang et al, 1999) ainsi que des souris fonction nulle pour la myogenine (Hastry et al., 1993; Nabeshima et al., 1993) forment des myoblastes mais sont dépourvues des tissus musculaires squelettiques.

L'expression de p21 ou de p57 permet d'inhiber la progression des cellules dans le cycle cellulaire. Les protéines Rb sont également nécessaires pour induire la différenciation via leur effet dans l'inhibition de l'expression des gènes impliqués dans la progression des cellules dans la phase S du cycle cellulaire. Les protéines MyoD, tant qu'à elles, jouent un role primordial dans l'arrêt du cycle cellulaire en assurant l'activation de p21 (Guo et al., 1995) et l'inhibition de cyclin/cdk4 (Zhang et al., 1999).

L'expression de la myogenine entraine l'activation des gènes musculaires et la fusion des myoblastes pour former les myotubes. Cette protéine active les gènes cibles en se liant, après avoir formé un hétérodimère avec la protéine E, à la boite E présente dans les régions régulatrices des ces gènes cibles.

Il est à noter que la protéine HuR joue un role clé dans la différenciation via la régulation de l'expression et/ou de transport nucléaire des ARNm de MyoD, de la myogenine et de la p21 (Van der Giessen et al., 2003).

La protéine Mrf4 est un autre facteur de transcription de la famille bHLH qui est impliqué dans la régulation de la myogenèse. Durant la différenciation terminale, l'expression de ce facteur entraîne la formation et la maturation des fibres musculaires. Cependant, cette protéine est également impliquée dans la régulation de la détermination (Kassar-Duchossoy et al., 2004). Les protéines Mrf4 peuvent induire, avec les protéines MyoD, l'activation de l'expression de la myogenine. En effet, plusieurs études montrent que les souris de fonction nulle pour Mrf4 et MyoD ont le même phénotype que les souris de fonction nulle pour la myogenine (Rawls et al., 1998). Tout comme les autres protéines MyoD, Myf5 et myogenine, les protéines Mrf4 forment des hétérodimères avec les protéines E et se lient par la suite à la boite E située dans les régions régulatrices des gènes cibles.

1.1.2. La régénération des cellules musculaires 1.1.2.1. Les cellules satellites

Les cellules satellites sont une population des cellules mononuclées qui se trouvent au niveau de muscle mature (Maure, 1961). Ces cellules constituent un réservoir de cellules précurseurs musculaires non différenciées. Elles sont activées suite à un dommage musculaire assurant ainsi la réparation et la régénération des tissus musculaires (Seale et Rundnicki, 2000). Ces cellules sont présentes dans le muscle mature en état de quiescence et elles expriment la protéine myostatine (MSTN) qui joue un rôle clé dans l'inhibition de la progression des cellules dans le cycle cellulaire et de la différenciation et la protéine Msxl qui est impliquée dans la régulation négative de la myogenèse (Houzelstein et al., 1999).

Les cellules satellites peuvent avoir plusieurs origines. En effet, plusieurs études ont permis de montrer que ces cellules sont d'origine somitique ((Armand et al., 1983) cité par (Perry et Rudnicki, 2000)) alors que d'autres suggèrent qu'elles sont issues des

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cellules endothéliales puisqu'elles expriment, en plus des marqueurs myogéniques, des marqueurs spécifiques des cellules endothéliales (De Angelis et al., 1999).

En plus de leur capacité à se différencier, les cellules satellites sont capables de se renouveler. En effet, lors de la prolifération cellulaire, certaines cellules retournent à l'état de quiescence en servant de réserve (Zammit et al., 2004). Donc, les cellules satellites en prolifération peuvent soit entrer dans la voie de la différenciation et participer par conséquence à la régénération musculaire ou bien retourner à l'état de quiescence et servir comme une cellule de réserve (Figure 1.4).

Cellule

satellite MyoD ou - ► Myoblaste _MyoD - ♦ Différenciation _et activée MyfS et

Myl5

renouvellement des cellules

satellites

Figure 1.4 : Représentation schématique de la différenciation et le renouvellement des cellules satellites (adapté de Perry et Rudnicki, 2000).

Le mécanisme moléculaire qui contrôle l'activation des cellules satellites, leur prolifération, leur fusion ainsi que leur différenciation fait intervenir plusieurs régulateurs qui sont impliqués dans la formation de muscle squelettique lors de développement embryonnaire. Le sentier Notch est impliqué dans l'induction de la prolifération des cellules satellites et par conséquence l'augmentation de leur nombre (Conboy et Rando,

2002). La fusion des myoblastes est facilitée par l'action de Numb qui est régulateur négatif de Notch (Conboy et Rando, 2002). Les protéines Shh et les protéines Wnt interviennent également pour assurer la différenciation de ces cellules. Les protéines MyoD et les protéines Myf5, tant qu'à elles, sont aussi exprimées par cette population cellulaire mais, contrairement à la situation lors de la différenciation des cellules musculaires chez l'embryon, ces deux protéines ont des rôles distincts lors de la régénération musculaire. En effet, Myf5 est hautement exprimée en amont de la phase S de cycle cellulaire afin d'inhiber la progression des cellules dans le cycle cellulaire et par conséquent assurer leur renouvellement (Day et al., 2009) tandis que MyoD est nécessaire pour la différenciation finale des ces cellules (Figure 1.4). D'autre part, la protéine Pax7 semble jouer un rôle clé dans la spécification des cellules satellites. En effet, il a été démontré que les cellules satellites sont absentes chez des souris de fonction nulle pour Pax7 (Seale et al., 2000).

1.2. Les filaments intermédiaires

1.2.1. Le cytosquelette des cellules eucaryotes

Le cytosquelette est un réseau de fibres intracellulaires qui joue un rôle majeur dans le maintien de l'intégrité et de la structure de la cellule et dans la régulation de plusieurs processus cellulaires tels que la division et la migration cellulaire. Il est composé de trois systèmes majeurs de filaments qui diffèrent entre eux : les microtubules (MT), les microfilaments (MF) et les filaments intermédiaires (FI) ((Schliwa, 1986; Fuchs et Weber, 1994; Aebi et al., 1988) cité par (Strelkov et al., 2003)).

Les MFs sont des filaments d'actine (7 nm de diamètre). Ces filaments sont impliqués dans la régulation de plusieurs mouvements cellulaires y compris la contraction cellulaire, la migration cellulaire et la formation des pseudopodes.

Les MTs sont des filaments de tubuline (25 nm de diamètre) et sont nécessaires pour le transport axonal dans la cellule nerveuse, la formation des fuseaux mitotiques lors de la division cellulaire ainsi que dans le transport intracellulaire des molécules. Ce transport est assuré par deux protéines de transport, la kinésine et la dynéine. La kinésine

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transporte les organites vers l'extrémité + de microtubules alors que la denyeine les transporte vers l'extrémité - de ces filaments.

Les Fis, comme leur nom indique, sont des filaments de diamètre moyen (8-10 nm) par comparaison aux MTs et MFs. Ces filaments jouent plusieurs rôles au sein de la cellule (la section 1.2.2 traite plus en détails de leurs rôles). Ils ont plusieurs propriétés qui les distinguent des MTs et des MFs. D'abord, les MFs et les MTs sont constitués d'une seule protéine globulaire, l'actine et la tubuline respectivement, et ils sont présents dans toutes les cellules tandis que les Fis sont hétérogènes, formés d'une variété des protéines qui différent selon le type cellulaire ainsi que le stade du développement. Par exemple, les périphérines sont des protéines des cellules neurales alors que la desmine est présente dans les cellules musculaires. En plus, contrairement aux MTs et aux MFs, les Fis n'ont pas une structure polarisée. En outre, les Fis se distinguent des MTs et des MFs par leur mode d'assemblage et de renouvellement. En effet, le processus de la dissociation-association des Fis peut se faire, non seulement, aux bouts des filaments, comme les MTs et les MFs, mais aussi tout au long des filaments. De même, contrairement aux MFs et aux MTs, les protéines des Fis peuvent s'assembler et former des filaments en absence d'ATP et de GTP (Strelkov et al., 2003). Dans le même contexte, les protéines des Fis, une fois qu'elles se polymérisent et s'assemblent, deviennent insolubles dans des conditions qui peuvent favoriser la solubilité des MTs et des MFs (Zackroff et Goldman,

1979).

Les protéines des Fis sont codées par une grande famille de gènes composée de plus de 65 gènes différents. Tous les gènes de cette famille codent pour des protéines cytoplasmiques à l'exception des lamines Bl, B2 et A/C qui sont des protéines nucléaires. Les protéines cytoplasmiques des Fis sont groupées, selon la similarité de leurs séquences, en cinq classes tel que décrit dans le tableau 1.1.

Tableau 1.1 : Classification des différentes protéines des Fis (Coulombe et Wong, 2004 et Kim et Coulombe, 2007).

Classe des Nom de la protéine Taille en Distribution cellulaire et tissulaire

Fis KD

I Kératines (acides) 40-64 K9-K28 (Cellules épithéliales) K31-K40 (Ongle/Cheveux) K1-K8, K71-K74 (Cellules II Kératines (basiques) 52-68 épithéliales)

K81-K86 (Cheveux) Vimentine 55 Cellules mésenchymateuses

Desmine 53 Cellules musculaires III GFAP 52 Astrocytes/Glie

Périphérine 54 Cellules neurales Syncoiline 54 Cellules musculaires

NF-L

IV NF-M

NF-H a-internéxine

61-110 Cellules neurales (SNC)

V Lamine A/C 62-78 Tissus différenciés V

Lamines Bl, B2 66-68 Ubiquitaires (noyau) Cellules myogéniques et Nestine 177 neurogéniques

VI Celules myogéniques et

Transitine >216 neurogéniques Synémine 182 Cellules musculaires

16 La plupart des Fis s'assemblent en homodimères. Cependant, les kératines sont des hétérodimères obligatoires formés d'une chaîne basique (cytokératine de type II) et d'une chaîne acide (cytokératine de type I). De même, les autres protéines cytoplasmiques des Fis peuvent former des hétérodimères et spécialement les protéines de type VI, incapables de former des homodimères par elles-mêmes mais qui forment des hétérodimères avec d'autres protéines des Fis, surtout de type III. Donc, en se basant sur le mode d'assemblage des Fis, les protéines des Fis peuvent être divisées en trois groupes d'assemblage tel que décrit dans le tableau 1.2. Le premier groupe comporte les protéines de type I et les protéines de type II, le deuxième de toutes les autres protéines cytoplasmiques : les protéines de type III, les protéines de types IV et les protéines de type VI et le troisième est formé des protéines de type V.

Tableau 1.2 : Les groupes d'assemblage des protéines des Fis (Strelkov et al., 2003).

Localisation Groupe d'assemblage

Classe des Fis

Exemples des protéines

Cytoplasme 1 I II Kératines acides Kératines basiques Cytoplasme 2 III IV VI

Vimentine, desmine, GFAP, périphérine

Neurofilaments (NF-L, NF-M, NF-H), a-internéxine Transitine, nestine, synémine

Noyau 3 V Lamines

1.2.2. Rôles des filaments intermédiaires

De nombreuses études ont montré que la mutation de protéines des Fis est à l'origine de plusieurs maladies (Omary et al., 2004). Cela suggère que les Fis sont d'une part essentiels pour la santé des tissus et d'autre part qu'ils jouent plusieurs rôles clés au sein de la cellule. Les Fis assurent le maintien de l'intégrité des cellules et des tissus en les protégeant du stress mécanique. En effet, il a été démontré que plusieurs protéines des Fis peuvent interagir avec plusieurs protéines impliquées dans la réponse des cellules à ce

stress tels que hsp 70 (Liao et al., 1995), Mrj 4 (Izawa et al., 2000), hsp 27 et ot/p -crystallines (Perng et al., 1999), PKC-e (Omary et al., 1992) et C-jun (He et al., 2002).

De plus, les Fis jouent un rôle pendant l'apoptose. En effet, ils peuvent atténuer et moduler la signalisation apoptotique par plusieurs mécanismes. Premièrement, les Fis peuvent influencer la densité et l'activité des récepteurs de la mort cellulaire présents à la surface des cellules. Il a été démontré que les kératines K8 / Kl8 inhibent l'activation de TNFR2 (tumor necrosis factor receptor 2) en interagissant avec son domaine cytoplasmique. De même, ces protéines sont impliquées dans la régulation de la densité des récepteurs Fas à la surface des cellules (Gilbert et al., 2001). Deuxièmement, les Fis peuvent réguler négativement l'apoptose en empêchant la formation du complexe DISC (Death inducing signaling complex) suite à l'activation des récepteurs apoptotiques. Inada et ses collaborateurs (2001) ont montré que Kl8 peut assurer la séquestration de l'adaptateur TRADD (tumor-necrosis-factor-receptor-1- associated death domain protein) empêchant ainsi son recrutement par le TNFR1 et inhibant par conséquent la formation du complexe DISC. En plus de réguler la densité et l'activité des récepteurs et d'empêcher la formation du complexe DISC, les Fis peuvent moduler la signalisation apoptotique en interagissant avec des protéines kinases impliquées dans l'induction de l'apoptose (Ku et Omary, 2006; Sahlgren et al., 2006). D'autre part, le clivage des Fis est un processus important pour l'exécution de la mort cellulaire. Plusieurs effecteurs apoptotiques, comme le DEDD (death effector domain containg DNA binding protein) et la caspase 3, peuvent s'associer aux Fis et assurer leur clivage (Lee et al., 2002; Schutte et al., 2006). Il a été montré que la protéine caspase permet le clivage de la lamine A/C (Rao et al., 1996; Ruchaud et al., 2002), la vimentine (Byun et al., 2001) et la desmine (Chen et al., 2003).

Par ailleurs, les Fis sont impliqués dans la régulation de l'adhésion cellule-cellule et cellule-biomatrice ainsi que dans le maintien de la stucture du noyau et de la cellule d'une manière générale. En effet, l'interaction des Fis avec les microtubules, les filaments d'actine et les complexes d'adhésion transmembranaire, leur permettent de jouer le rôle d'un support mécanique de la cellule.

En outre, les Fis peuvent contrôler la croissance cellulaire. Par leur capacité de s'associer et réguler l'activité de plusieurs régulateurs indispensables pour la division cellulaires tels que l'Akt et la protéine 14-3-3, les Fis peuvent réguler négativement la prolifération cellulaire. Il a été démontré que K10 peut séquestrer l'Akt impliquée dans l'induction de croissance cellulaire (Paramio et al., 2001). De même, l'activité de cdc25 qui est une phosphatase régulatrice du cycle cellulaire nécessaire pour l'entrée en mitose, peut être régulée négativement et indirectement par Kl8 qui interagit avec la protéine 14-3-3 essentielle pour la rétention cytoplasmique de cette phosphatase (Ku et al., 1998).

Les Fis interviennent aussi dans la régulation du trafic intracellulaire. De nombreuses études ont montré que les protéines des Fis comme la vimentine, la périphérine et l'a internexine peuvent se lier à l'adaptateur AP-3 et permettent par conséquent le transport des lysosomes au sein de la cellule (Styers et al., 2004, 2005 et 2006). De plus, les kératines sont aussi impliquées dans le transport et/ou la distribution des granules de mélanines dans les kératinocytes (Gu et Coulombe, 2007). Les protéines des Fis sont elles-mêmes transportées par les protéines du transport, la kinésine et la dyneine, tout au long des microtubules. Ce transport est nécessaire pour l'organisation et la formation du réseau des Fis au sein de la cellule ce qui influence divers processus cellulaires tels que la croissance des neurites et la migration cellulaire. En effet, il a été démontré que le changement de l'organisation des Fis est un phénomène primordial pour favoriser et faciliter la migration cellulaire qui peut se faire suite à la lésion des cellules (les cellules nerveuses ou les cellules de la peau) (Martin, 1997; Wong et Coulombe, 2003; Pekny et al., 1999).

D'autre part, les Fis peuvent jouer un rôle dans la régulation de l'expression génique et de la synthèse protéique. En plus de leur rôle dans le maintien de la structure du noyau et le positionnement des pores nucléaires, les lamines peuvent réguler l'expression génique en influençant l'organisation de la chromatine, la transcription des gènes ou bien les voies de signalisation qui induisent l'activation de l'expression génique (Hutchison, 2002; Worman et Courvalin, 2004; Zastrow et al., 2004). La kératine et d'autres protéines des

Fis peuvent interagir avec plusieurs composants de la machine de synthèse protéique y compris eEFIBa (Bousquet et al., 2001), eIF3 (Lin et al., 2001), TSCI (Haddad et al., 2002) et les ribosomes (Traub et al., 1998).

Enfin, il est important de signaler que les Fis sont aussi impliqués dans la distribution et la localisation des organelles, comme la mitochondrie et l'appareil de Golgi, au sein de la cellule et de protéines dans des sites bien déterminés dans les cellules polarisées (cité par Toivola et al., 2005).

1.2.3. Les protéines des filaments intermédiaires impliquées dans la myogenèse 1.2.3.1. La vimentine

La vimentine est une protéine des Fis de type III qui a un poids moléculaire de 55 KD. Cette protéine est exprimée dans les fibroblastes et les cellules mensenchymateuses et elle représente le constituant majeur des Fis des cellules musculaires et neurales non différenciées en formant un réseau qui s'étend du noyau vers la périphérie de la cellule. Lors de la différenciation de ces cellules, l'expression de vimentine diminue et elle est remplacée progressivement par la GFAP ou les neurofilaments et la desmine selon le type cellulaire ((Traub et al., 1985) cité par (Cossette et Vincent, 1991)), mais la vimentine coexiste avec ces marqueurs de différenciation durant une courte période.

La vimentine est impliquée dans la régulation de plusieurs processus cellulaires tels que le transport vésiculaire (les lysosomes) en interagissant avec AP-3 et la croissance cellulaire en s'associant avec la protéine 14-3-3 qui est un régulateur clé du cycle cellulaire. De même, la vimentine a un rôle à jouer lors de la mitose. De nombreuses études montrent que la vimentine est hautement phosphorylée lors de la mitose et qu'une telle phosphorylation est responsable du désassemblage des filaments de vimentine (Ando et al., 1989; Goto et al,. 1998). La phosphorylation mitotique de la vimentine par les protéines kinases est régulée d'une manière spatiotemporelle. En effet, la protéine kinase Cdkl assure la phosphorylation de la vimentine pendant la prophase et la métaphase (Tsujimura et al., 1994) tandis que la protéine kinase Aurora B (Goto et al., 2003) et Rho kinase (Goto et al., 1998) permettent la phosphorylation de la vimentine de

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l'anaphase jusqu'à la fin de la mitose. En plus de ces protéines kinases, la phosphorylation de vimentine fait intervenir deux autres protéines kinases mitotiques, la p 3 4cdc2 k j n a s e e t p 3 7 k i n a s e ^C h o u e t a, ,9 9 0. T s uji m u r a e t a| 5 1 9 9 4) E n o u t r e l e désassemblage des filaments de vimentine peut également résulter de Phyperphosphorylation par la protéine kinase PKA et la protéine kinase PKC. Le changement de l'organisation des Fis dépend fortement du type cellulaire. En effet, dans les cellules mitotiques BHK-21, les filaments de vimentine sont complètement dissociés (Rosevear et al., 1990) alors que ces filaments demeurent intacts durant la mitose dans les cellules épithéliales Ptk2 (Aubin et al., 1980) et dans les cellules Hela (Jones et al., 1985; Franke et al., 1982). La formation et l'assemblage des filaments de vimentine sont fortement dépendants de l'activité des phosphatases. En effet, Eriksson et ses collaborateurs ont montré que l'inhibition des phosphatases PP1 et PP2A a pour effet l'augmentation de la phosphorylation de la vimentine et par conséquence le désassemblement des filaments de vimentine (Eriksson et al., 2004). Ainsi, le processus de l'assemblage-désassemblage des filaments de vimentine est régulé par un équilibre entre les kinases et les phosphatases. La phosphorylation de la vimentine joue aussi un rôle dans la régulation des fonctions de cette protéine. En effet, l'association de la vimentine à la protéine 14-3-3 est régulée par la phosphorylation (Tzivion et al., 2000). De plus, la phosphorylation de la vimentine peut réguler l'activité de plusieurs protéines kinases. Il a été démontré que la phosphorylation de la vimentine par les protéines RhoA binding kinases a, entraine le relargage, l'activation et la relocalisation des protéines kinases séquestrées par les filaments de vimentine (Sin et al., 1998). L'activité de Rho binding kinase a elle-même est régulée par la phosphorylation de la vimentine (Sin et al., 1998). De même, la phosphorylation de la vimentine par la protéine Cdkl entraine l'activation de la protéine kinase mitotique Plkl (Yamaguchi et al., 2005). La phosphorylation de la vimentine est aussi impliquée dans la régulation de son transport par les kinésines et les dynéines tout au long des microtubules. En bref, la phosphorylation/déphosphorylation joue un rôle crucial dans la régulation de l'organisation, du fonctionnement et du transport de la vimentine.

1.2.3.2. La desmine

La desmine est une protéine des Fis du type III qui a un poids moléculaire de 53 KD. Cette protéine est exprimée dans toutes les cellules musculaires striées et lisses (Costa et al., 2004; Paulin et Li, 2004) et est classée parmi les premières protéines à être exprimée lors du développement de muscle squelettique et cardiaque (Herrmann et al., 1989; Schaart et al., 1989). En effet, cette protéine est présente non seulement dans les myofibres mais, en outre, dans les myoblastes en division. Au début, la desmine s'intègre progressivement dans les filaments de vimentine présents dans les myoblastes. Ensuite, pendant les étapes tardives de la différenciation, elle remplace complètement la vimentine et s'assemble avec d'autres protéines des Fis. L'expression de la desmine est accompagnée par un changement de l'organisation du réseau des filaments qui passe d'un réseau étendu à une structure plus spécialisé spécifique aux cellules musculaires matures. Dans les cellules musculaires striées matures, la desmine entoure les disques Z et assure la liaison de myofibrilles adjacentes au niveau de disque Z et la liaison des myofibrilles au sarcolemme au niveau des costamères (Granger et Lazarides, 1978). La desmine est aussi impliquée dans la distribution et la localisation de plusieurs organelles telles que la mitochondrie.

La desmine joue un rôle crucial dans la régulation de la myogenèse in vitro. En effet, plusieurs études tendent à démontrer que l'inhibition de l'expression de la desmine entraine l'inhibition de la fusion des myoblastes et la formation des myotubes (Capetanaki et al., 1997) et que le niveau des régulateurs transcriptionnels myogéniques diminue suite à la régulation négative de la desmine (Li et al., 1994). Cependant, cette protéine joue un rôle clé dans le maintien des myofibrilles et la structure des tissus musculaires et son absence n'a aucun effet sur la formation des muscles in vivo (Capetanaki et al., 1997).

Par ailleurs, plusieurs pathologies humaines peuvent être liées à une mutation de la desmine. En effet, une variété des myopathies congénitales humaines est caractérisée par l'accumulation anormale de la desmine. Ces desminopathies sont le résultat de la mutation de la desmine ou d'une protéine qui s'associe à elle (Paulin et al., 2004).

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1.2.33. La nestine

La nestine est une protéine des Fis de types VI. Elle a un poids moléculaire de 177 KD et fait partie du groupe d'assemblage 3. Ces protéines sont incapables de former des homopolymères à cause de leur court domaine N-terminal qui est essentiel pour l'assemblage des filaments. La nestine est exprimée dans les cellules souches et progénétrices neurales (Lendahl et al., 1990) et dans les cellules musculaires en développement (Sejersen et Lendahl, 1993), mais elle devient absente lors de la maturation de ces cellules. En effet, la nestine est exprimée avec la vimentine et la desmine dans les myoblastes mais elle est absente dans les cellules musculaires matures (Kachinsky et al., 1994). De même, la nestine est graduellement remplacée par les neurofilaments et la GFAP respectivement dans les neurones et les astrocytes (Lendahl et al., 1990). La nestine est également exprimée dans les cellules tumorales et elle peut servir comme un marqueur des cellules cancéreuses (Dahlstrand et al., 1992).

La nestine est impliquée dans la régulation de plusieurs processus cellulaires tels que la croissance, la survie et la régénération cellulaire. À cet égard, plusieurs études ont démontré que cette protéine assure le désassemblage des filaments de vimentine lors de la mitose dans quelques types cellulaires. L'expression d'un ARN antisens pour la nestine a mis en lumière qu'en absence de la nestine, les filaments de vimentine demeurent intacts (Chou et al., 2003). La réorganisation des filaments de vimentine peut être le résultat de désassemblage des filaments de nestine eux-mêmes. En effet, il a été démontré que dans les cellules souches neurales, les filaments de nestine sont désassemblés lors de la mitose et que la phosphorylation de la nestine est à l'origine de ce désassemblage (Sahlgren et al., 2001).

La nestine est aussi impliquée dans la régénération et la réparation du muscle squelettique (Vaittinen et al., 2001). De même, elle est impliquée dans la réparation et régénération du mesangium de glomérule rénal par l'induction de la prolifération des cellules mesangiales de réserve (Daniel et al., 2008).

D'autre part, la nestine assure la survie et la protection des cellules progénétrices neurales lors d'un stress oxydatif via sa capacité de s'associer et de réguler l'activité de cdk 5 (Sahlgren et al., 2003).

1.2.3.4. La transitine

La transitine est une protéine des Fis de types VI qui a un haut poids moléculaire. Le mot transitine vient du latin qui désigne « transitoire - de passage ». Cette protéine, nommée aussi IFAP-400 (Vincent et Lahaie, 1988) et EAP-300 (MacCabe et al., 1992), est l'homologue aviaire de la nestine des mammifères (Napier et al., 1999; Guerette et al., 2007). Tout comme la nestine, la transitine est exprimée transitoirement dans les cellules progénitrices des tissus nerveux et musculaires et elle a une région au niveau de son domaine en hélice alpha fortement similaire à celle présente dans le domaine en hélice alpha de la nestine (Herrmann et Aebi, 2000). Cependant, elle contient un domaine répété C-terminale qui est totalement différent de celui de la nestine.

La transitine est exprimée conjointement avec la vimentine dans les cellules précurseurs neurales et myogéniques puis elle devient absente lors de la maturation de ces cellules à l'exception de l'aorte proximale et l'artère pulmonaire proximale où la transitine et la vimentine persistent possiblement afin de maintenir l'élasticité de ces structures (Vincent et al., 1991). Lors de la myogenèse, la transitine est exprimée conjointement avec la vimentine dans les myoblastes et coexiste avec la desmine pendant une courte période de la différenciation puis elle devient absente dans les myotubes matures (Cossette et Vincent, 1991). L'expression transitoire de la transitine lors du remplacement de la vimentine par la desmine a permis de proposer que cette protéine est impliquée dans la réorganisation du réseau des Fis pendant la différenciation des cellules musculaires (Cossette et Vincent, 1991). De plus, la paranémine, qui est dérivée d'un produit d'épissage alternatif de l'ARN pré-messager de la transitine (Hemken et al al., 1997), a également un rôle important dans la formation d'un réseau étendu de desmine. En effet, contrairement à la surexpression de la desmine dans les cellules SW13/cl.2 dépourvues des Fis qui a pour effet la formation d'agrégats de desmine, la surexpression de la paranémine et de la desmine permet la formation d'un réseau étendu de desmine

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(Schweitzer et al., 2001). D'autre part, la transitine est aussi impliquée dans la régulation de la neurogenèse. Des études récentes montrent que la transitine est importante pour la localisation intracellulaire de Numb, l'antagoniste de l'action de Notch, dans les cellules neuroépithéliales aviaires lors de la mitose. L'expression d'un ARN antisens pour Numb dans les cellules neuroépithéliales aviaires a mis en lumière que la transitine séquestre Numb dans le cortex basai de ces cellules lors de la mitose assurant ainsi l'accumulation de cette protéine dans une des deux cellules filles et par conséquence l'entrée de cette cellule dans la voie de la différenciation (Wakamatsu et al., 2007).

1.3. Hypothèse et objectifs de recherche

La fonction précise de la transitine dans les cellules myogéniques demeure inconnue jusqu'à ce jour. Basé sur l'étude publiée récemment par l'équipe de Wakamatsu qui a

montré que la transitine est importante dans la régulation de la neurogenèse en agissant comme plateforme d'ancrage du déterminant d'identité cellulaire Numb et assurant la distribution asymétrique de cette protéine dans les cellules neuroépithéliales aviaires en mitose (Wakamatsu et al., 2007) et sur l'étude faite par l'équipe de Holowacz qui montre que Numb est aussi distribuée de façon asymétrique dans les cellules myogéniques aviaires (Holowacz et al., 2006), nous avons émis l'hypothèse que la transitine peut également être responsable de la distribution asymétrique de Numb dans les cellules progénitrices du tissu musculaire. Dans le présent projet de maitrise, nous nous proposons d'étudier la localisation fine des deux protéines dans le somite en différenciation et d'analyser l'atténuation de l'expression de la transitine par interférence à l'ARN (RNAi) sur la différenciation myogénique dans un modèle cellulaire, la lignée QM7. Ce projet vise ainsi à mettre en évidence le rôle de la transitine dans la distribution asymétrique de Numb dans les cellules myogéniques et son implication directe durant la formation des muscles.

Chapitre II

26 2.1. Culture cellulaire

Les cellules de la lignée QM7 (Q pour quail et M pour muscle) sont des cellules de fibrosarcome de caille. Cette lignée dérive de la lignée QTM6 qui provient, elle-même, de la lignée QT6. Notons que les cellules de la lignée QTM6 ont été sélectionnées et isolées grâce à leur propriété myogénique (Antin et Ordahl, 1991).

Les cellules QM7 ont été cultivées à 37°C dans un milieu de prolifération composé du milieu M199 (Gibco), de 10% FBS (fœtal serum bovin) (HyClone) et 10% TP (tryptose phosphate) (BD). Afin d'induire la différenciation de ces cellules, la concentration de sérum a été diminuée à 0.5% lorsque la confluence des cellules atteint 80% (Antin et Ordahl, 1991). Le milieu de différenciation a été changé tous les deux jours.

2.1.1. Transfection des cellules Qm7

Les lignées TrSil et TrSi2, dont l'expression de la transitine est diminuée, ainsi que la lignée S, utilisée en tant que contrôle négatif, ont été préparées dans le laboratoire de Michel Vincent par Dominique Guerette, Karine Biais et Guillaume Ruel. Ces lignées ont été obtenues par transfection des cellules QM7 avec le plasmide pSilencer T1338-Transitin (TrSil et TrSi2) ou le plasmide pSilencer T1338-scramble (lignée S) en utilisant 2 mg/ml de Lipofectamine (Invitrogen). La sélection des transfectants stables a été faite après 72 heures par la généticine (0.5 mg/ml) (Gibco).

T1338 désigne la partie ciblée de l'ARNm de la transitine (T pour transitine et 1338 pour le nuclétides 1338 dans la séquence x80877 sur le site du NCBI). Nous avons reçu les constructions T1338 du Dr. Lee du laboratoire de Dr. Greg Cole. Dans note laboratoire, ces constructions ont été clonées dans le plasmide pSilencer 2.1U6 neo d'Ambion qui a un promoteur U6 et un gène de sélection avec la néomycine.

2.1.2. Cinétique de croissance cellulaire

Afin d'évaluer leur vitesse de prolifération, les cellules transfectées et les cellules QM7 cultivées dans un milieu de prolifération ont été comptées en triplicat chaque deux jours pendant une période de six jours.

Une deuxième expérience de comptage des cellules TrSil et des cellules TrSi2 cultivées dans un milieu de différenciation a été effectuée pour vérifier l'hypothèse selon laquelle la capacité de ces cellules à se fusionner et à se différencier est réduite. Un contrôle de prolifération a été fait pour la même durée. Il est important de noter que le milieu de culture a été remplacé tous les 2 jours dans les deux expériences et que les trois décomptes sont d'une même expérience.

2.1.3. Traitement des cellules avec le DAPT

À une confluence cellulaire d'environ 80%, 20 uM de DAPT (dipeptide g-secretase inhibitor N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-Sphenylglycinet-butyl ester) (Sigma Aldrich) a été additionné dans le milieu de différenciation pour une période de 48 heures. Puisque le DAPT a été dissous dans le DMSO (Sigma Aldrich), un contrôle de DMSO a été fait pour la même durée et avec un volume équivalent à celui de DAPT. Le DAPT est un agent chimique qui inhibe la voie de signalisation Notch en inhibant l'activité de la y-secrétase responsable de la libération de NICD (Dovey et al., 2001; Cheng et al., 2003).

2.1.4. Traitment des cellules avec le BrdU

Après culture des cellules QM7 et des cellules transfectées dans un milieu de différenciation ou de prolifération pendant 4 jours et 6 jours, du BrdU (Sigma Aldrich) a été ajouté à une dose de 5 uM pour une période de 3 heures. Après fixation, les cellules sont soumises à un traitement destiné à rendre le BrdU accessible aux anticorps : Elles ont été incubées avec 0.5% de Triton 100X (Sigma Aldrich) durant 10 minutes suivies d'une incubation avec HC1 à 4N pendant 7 min (Day et al., 2009). Les cellules ont été par la suite lavées avec PBS IX pour une période de 5 minutes. Le BrdU est utilisé comme marqueur des cellules en cours de synthèse d'ADN grâce à sa capacité de s'incorporer dans l'ADN à la place de la thymine.

2.2. Immunofluorescence indirecte

2.2.1. Marquage de cellules pour ('immunofluorescence

Des lamelles de verre rondes ont été déposées au fond des boites de Pétri de 35 mm. Après 3 lavages avec le PBS IX (137 mM NaCl, 8 mM Na2HPO_ . 7 H20, 3 mM KC1 et

28 1.5 mM KH2PO4), les lamelles ont été fixées dans le methanol 100% durant 20 minutes à -20°C. Elles ont été par la suite lavées 3 fois avec le PBS IX et bloquées avec le tampon PBS IX-O.5% BSA (albumine de sérum de bœuf) pendant 30 minutes à température pièce. Après 2 lavages au PBS IX, les anticorps primaires ont été ajoutés et incubés durant une heure à température pièce. Les lamelles ont été par la suite lavées avec le PBS

IX et les anticorps secondaires et le DAPI (4'6-diamidino-2-phenylindole), qui permet la coloration du noyau, ont été ajoutés pour une période de 45 minutes dans les mêmes conditions. Après 3 lavages avec le PBS IX, les lamelles ont été couvertes de milieu de montage contenant 1 mg/ml p-phenylenediamine-PBS pH 7.4 dans le glycerol. Ces lamelles ont été observées avec un microscope DAS Leitz muni d'optiques d'épifluorescence.

2.2.2. Immunofluorescence indirecte sur coupes d'embryons de poulets

Des embryons de poulet de 52-64 heures et de 3 V_ jours d'incubation ont été prélevés dans le PBS IX et fixés dans 3% formaldehyde (Sigma Aldrich) durant 2 heures à la température ambiante. Après 3 lavages au PBS IX, les embryons ont été incubés à température ambiante avec PBS IX contenant 15% de sucrose puis ils ont été traités avec l'O.C.T (Tissue-Tek). Des coupes congelées d'épaisseur 20 pm ont été par la suite faites perpendiculairement à l'axe de l'embryon a partir des bourgeons des ailes. Ces coupes ont été recueillies directement sur des lames en verre et elles ont été traitées et marquées de la manière décrite dans la section 2.3.1.

2.2.3. Anticorps

23.3.1. Anticorps primaires

Le surnageant d'hybridome VAP-5, dirigé contre la protéine transitine, a été fabriqué dans notre laboratoire et utilisé pur. L'anticorps monoclonal de souris MF20 (Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), Université de Iowa), dirigé contre la protéine myosine, a été utilisé à une dilution 1/15. Les anticorps monoclonaux de souris a-Pax7 (DSHB) et a-BrdU (DSHB) ont été utilisés à une dilution de 1/12 et 1/200 respectivement. L'anticorps polyclonal de lapin a-desmine (Cossette et Vincent, 1991) et l'anticorps monoclonal de souris a-vimentine (Abcam) ont été utilisé à une dilution de

1/100. L'anticorps polyclonal de lapin a-Numb (Abcam, ab 14140; Upstate biotechnology) a été utilisé à une dilution de 1/50.

2.3.3.2. Anticorps secondaire

L'anticorps secondaire GAR (goat a-rabbit) couplé au fluorochrome Alexa Fluor 594 (Molecular Probes) a été utilisé à une dilution de 1/200 contre les anticorps polyclonaux a-desmine et a-Numb. L'anticorps secondaire GAM (goat a-mouse) couplé au fluorochrome Alexa 488 (Molecular Probes) a été utilisé à une dilution de 1/200 contre les anticorps monoclonaux VAP-5 et vimentine. L'anticorps secondaire GAM (goat a-mouse) couplé au fluorochrome Alexa 594 (Molecular Probes) a été utilisé à une dilution de 1/200 contre les anticorps monoclonaux MF20, a-Pax7 et a-BrdU.

2.3. W e s t e r n blot

2.3.1. Description de la méthode

Après le rinçage des cellules QM7 et des cellules transfectées avec du PBS, une lyse sur glace a été effectuée par addition du tampon de lyse doux (PBS IX contenant 0.5% Triton X-100 et Complete IX (Roche Diagnostics)). Les extraits protéiques ont été par la suite vortexés durant 10 secondes et passés à plusieurs reprises à travers une aiguille 27G . La concentration des protéines a été déterminée par l'utilisation du réactif « protein Assay Bio-Rad ». L'extrait protéique total a été incubé, à un volume équivalent, avec le text IX (50 mM Tris-HCL pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol et 5% 2-mercaptoethanol) coloré avec le Bromophenol blue (Sigma Aldrich). Après incubation des échantillons à 95°C pendant 10 minutes, les protéines ont été séparées sur gel d'acrylamide de 7.5% à voltage constant de 150 V. Les protéines ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose à voltage constant de 100 V pendant une heure. Les membranes ont été incubées dans la solution de blocage BR (Blocking Reagent) (Roche Diagnostics) durant une heure à la température ambiante puis elles ont été incubées avec l'anticorps primaire dans les mêmes conditions. Après lavage avec du tampon TBS-Tween 0.05% (10 Mm Tris pH 7.6, 0.15 M NaCL et 0.05% TBS-Tween) durant 15 minutes, les membranes ont été incubées pendant 45 minutes à la température ambiante avec l'anticorps secondaire puis elles ont été lavées trois fois avec le TBS-Tween durant 30

30

minutes. La révélation des protéines a été faite par chemiluminescence (Roche Diagnostics).

23.2. Anticorps

2.4.2.1. Anticorps primaires

L'anticorps monoclonal de souris MF20 (DSHB) dirigé contre la protéine myosine et l'anticorps monoclonal de souris a-Pax7 (DSHB) ont été utilisés à une dilution de 1/100. L'anticorps polyclonal de lapin a-desmine (Cossette et Vincent, 1991) et l'anticorps monoclonal de souris a-tubuline (Neo Markers) ont été utilisés à une dilution de 1/500. L'anticorps polyclonal de lapin a-Numb (Abcam, ab 14140) a été utilisé à une dilution de 1/250. L'anticorps monoclonal de souris VAP-5 (Ma et al., 1998) dirigé contre la protéine transitine a été utilisé à une dilution de 1/5000.

2.4.2.2. Anticorps secondaires

Les anticorps secondaires GAM (Jackson Laboratories) et GAR (Jackson Laboratories) couplés à la horseradish peroxydase ont été utilisés à une dilution de 1/2500.

2.4. RT-PCR

2.4.1. Extraction de l'ARN

L'extraction de l'ARN des cellules QM7 et des cellules transfectées a été effectuée par l'utilisation d'un « RNA mini kit » (Invitrogen). Selon ce kit, la lyse des cellules et l'homogénéisation se fait par une solution d'isothiocynate de guanidinium contenant du beta2-mércaptoéthanol. Le lysat cellulaire a été par la suite incubé avec 70% éthanol. Après lavage, l'élution des acides nucléiques retenus par la membrane de silice du filtre a été réalisée à l'aide de l'eau sans ARNase. La qualité d'ARN a été évaluée par électrophorèse sur gel d'agarose (Invitogen) de 1% et la concentration de chaque échantillon en ARN a été déterminée en utilisant un spectophotomètre.

2.4.2. Synthèse de l'ADNc

À 10 pi d'eau sans ARNase contenant 2 pg d'ARN a été ajouté 2 pi de l'amorce oligo-dt (Roche Diagnostics; Ambion). Après une brève agitation et centrifugation, les tubes ont

été incubés à 70-85°C pendant 3 minutes puis ils ont été mis sur la glace. 2 pi de tampon 5X (250 mM Tris HC1 pH 8.3, 375 mM KC1, 15 mM MgCl2 et 50 mM DTT) (Promega),

lpl de solution mixte des dNTPs (10 mM) (Invitogen), 1 pl d'ARNase out (Invitogen), 14 pi d'eau sans ARNase et 2 pi de MMLV-RT (Murine Moloney Leukemia virus Reverse Transcriptase) (Promega) ont été ajoutés à chaque tube. Les tubes ont été vortexés et centrifugés rapidement puis incubés à 44°C pendant une heure. Un tube sans MMLV-RT a été utilisé comme un contrôle négatif.

2.4.3. Réaction en chaîne de la polymerase (PCR)

Les réactions de-PCR ont été réalisées dans un volume final de 20 pi contenant 11.9 pi d'eau bidistillée stérile, 2 pi de tampon 10X (200 mM Tris HC1 pH 8.4, 500 mM KC1) (Invitogen), 0.4 pi de solution mixte des dNTPs (10 Mm) (Invitogen), 1.2 pi de chacune des deux amorces décrites dans le tableau 2.1, 0.6 pi de MgCl2 (50 mM) (Invitogen), 2.5

pi d'ADNc et 0.2 pi de l'enzyme de polymérisation Taq-DNA polymerase) (Invitogen). L'amplification a été effectuée dans un thermocycleur en utilisant le programme suivant: 1 cycle à 95°C pendant 2 minutes (dénaturation), 34 cycles à 95°C pendant 1 minute (dénaturation), X°C pendant 1 minute (hybridation), 72°C pendant 1 minute 30 secondes (synthèse), enfin un cycle à 72°C pendant 10 min (synthèse finale). X définit la température d'hybridation spécifique pour chaque couple des amorces tel que décrit dans le tableau 2.1. La GAPDH (glycéraldéhyde 3 phosphate déshydrogénase) a été utilisée comme contrôle négatif.