Étude de la variabilité d'expression et de la régulation post-transcriptionnelle des uridine-diphospho-glucuronosyltransferases

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2015

iii

Résumé

Le métabolisme de phaseII est assuré parles UDP-glucuronosyltransférases (UGT), qui sont des enzymes régulant l'inactivation de nombreux médicaments et molécules endogènes. Cette voie métabolique est caractérisée par une variabilité interindividuelle significative, tant au niveau de l’expression génique qu’au niveau de l’activité de glucuronidation. La mesure des capacités de glucuronidation etla compréhension des mécanismes participant à cette variabilité danslestissus humains sont un enjeuimportant. Cependant,le manque de spécificité des substrats des UGT,la grande similarité des séquences protéiques etle manque de corrélation entrel’expression en ARNm et en protéine, rendla mesure dela voie de glucuronidation difficile et complexe. Enréponse à ces problèmes, destechniques de quantification des UGT par spectrométrie de masse ont étérécemment développées.Il est alors possible de déterminer siles profils d’expression protéique des UGT ainsi obtenus par ces quantifications permettent de prédirele potentiel de glucuronidation danslestissus humains. En plus d’une grande variabilité interindividuelle, mes travaux montrent que les profils d’expression protéique des UGT destissus hépatiques etrénaux sont corrélés avecles activités de glucuronidation de quatre enzymes UGT pourlesquelles des substrats spécifiques sont connus. Par ailleurs, nous avons également démontré quela capacité de glucuronidation destissus rénaux est fortement diminuée danslestumeurs comparativement auxtissus normaux. Bien que de nombreux mécanismes de régulation des UGT aient été décrits, une fraction significative de la variabilité d’expression des ARNm, des protéines et del’activité des UGT demeureinexpliquée et peutimpliquer des mécanismes épigénétiques,tels quelarégulation par microARN. Ainsi, nous avonsidentifié quatre microARN (miR-331, miR-376c, miR-409, et miR-494) comme des régulateurs potentiels des UGT2B15/2B17. Parmi ces microARN, nous avons mis en évidencel’implication de miR-376c dansla régulation de ces deux UGT, et déterminé que ces microARN pourraientinfluencerla biodisponibilité dela dihydrotestostérone(DHT) dansles cellules de cancer dela prostate in vitro et danslestumeurs prostatiques de patients.

v

Abstract

Phase II metabolism is conveyed by UDP-glucuronosyltransferases (UGT), which are enzymes regulating the inactivation of many drugs and endogenous molecules. This metabolic pathway is characterized by a significantinterindividual variability atthelevel of gene expression and activity. The measurement of glucuronidation capacity and understanding of the mechanisms involved in this variabilityin humantissues are animportantissue. However,thelack of substrate specificityfor most UGT enzymes,the high similarity oftheir protein sequences andthelack of correlation between mRNA and protein expression complexifies accurate measurements of glucuronidation capacitiesin human tissues. To circumventtheseissues, UGT quantificationtechniques by mass spectrometry have been recently developed. This allow usto determine whether expression patterns of UGT proteins,thus obtained bythese quantifications, predictthe potential of glucuronidationin humantissues. Theresults of our studies show a wideinterindividual variability, butthatthe protein expression profiles offour UGT inliver and kidneytissues correlate with glucuronidation activities oftheirrespective probe substrates. Furthermore, we also demonstratedthatthe glucuronidation capacityintumor kidneytissuesis greatly diminishedrelativeto normal kidneytissues. Although many UGTregulatory mechanisms have been described, a significant part of their variability in mRNA, protein expression and activity remains unexplained and mayinvolve epigenetic mechanisms, such as aregulation by microRNAs. Thus, we identified four microRNAs (miR-331, miR-376c, miR-409 and miR-494) as potential regulators of UGT2B15/ 2B17. Amongthese microRNAs, we have demonstratedtheinvolvement of miR-376cin the regulation of UGT2B15 / 2B17, and determined that microRNAs could thus influence the bioavailability of dihydrotestosterone(DHT)in prostate cancer cells in vitro and prostatictumorsin vivo.

vii

Tab

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des

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ières

Résumé...iii

Abstract... v

Table des matières... vii Liste des Tableaux...ix

Liste des Figures... xi Liste des abréviations et des sigles... xiii Remerciements... xvii Avant-Propos... xix INTRODUCTION... 1

1 Complexité dela famille UGT... 1

1.1 Famille UGT1... 2

1.2 Famille UGT2... 2

1.3 Autres familles UGT... 4

2 Structure protéique des UGT... 4

3 Rôle et expression des UGT... 6

3.1 Réaction de glucuronidation... 6

3.2 Rôles pharmacologiques etimplications pathologiques des UGT... 8

3.3 Diversité d’expression des UGT... 11

4 Mécanismes de régulation génique des UGT... 14

4.1 Polymorphismes génétiques... 14

4.2 Variation du nombre de copies des gènes... 15

4.3 Méthylation del’ADN... 16

4.4 Facteurs detranscription... 16

4.5 Épissage alternatif (EA)... 19

4.6 microARN... 20

4.6.1 Biogénèse des microARN... 21

4.6.2 Mécanisme d’action des microARN... 23

4.6.3 Régulation des microRNA... 27

4.6.4 Rôles physiologique, pathologique et pharmacologique des microARN 29 4.7 Modifications post-traductionnelles... 33

4.8 Interactions protéine-protéine... 34

viii

Hypothèses de recherche, objectifs et méthodologies expérimentales... 39

Chapitre I : Étude dela relation entrel’expression protéique etl’activité enzymatique des UGT dansles tissus hépatiques humains... 45

Chapitre II : Étude dela relation entrel’expression etl’activité enzymatique des UGT dansles tissus sains et tumoraux du rein... 67

Chapitre III : Régulation des UGT parles microARN... 103

Discussion... 139

1 Quantification des UGT par spectrométrie de masse et relation avec l’expression en ARNm etl’activité enzymatique au foie et au rein... 139

1.1 Relation entrel’expression etl’activité enzymatique des UGT... 139

1.2 Comparaison entrelestissus de reins normaux ettumoraux... 141

2 Régulation dela voie de UGT2B15/17 par miR-376c... 143

Conclusion... 151

ix

L

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Tab

leaux

Tableau 1. Liste desfacteurs detranscription et desligandsrégulantl’expression des UGT...18 Tableau 2. Liste des microARN validés et prédits pour cibler des enzymes du métabolisme de

biotransformation des médicaments...32 Tableau 3. Comparaison des avantages etinconvénients entreles méthodes de quantification protéiques basées surl’utilisation d’anticorps etles méthodes basées surla spectrométrie de masse...38 Tableau 4. Peptides utilisés pourla détection des 14 UGT quantifiés par nanoUPLC-MS/MS et des substrats spécifiques utilisés pour mesurerl’activité de glucuronidation destissus hépatiques etrénaux...40

xi

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Figure 1. Représentation schématique desloci contenantles gènes codant pourles protéines UGT1 et UGT2.

...3

Figure 2. Représentation schématique delaréaction de glucuronidation...8

Figure 3. Représentation graphique dela contribution des différentes enzymes dansle métabolisme de phase I etII des médicaments...9

Figure 4. Profil d’expression des UGT1A et 2B dansles différentstissus du métabolisme des médicaments. 13 Figure 5. Exemple de diversité destranscrits etisoformesissus d’évènements d'épissages alternatifs(Cas de l’UGT2B7)...20

Figure 6. La voie de biogénèse des microARN...23

Figure 7. Représentation schématique del’hybridation standard des microARN avecleur ARNm cible...25

Figure 8. Représentation schématique des mécanismes d’action des microRNA surles ARNm cibles...27

Figure 9. Représentation schématique dela stratégie expérimentaleréalisée pourla quantification des protéines UGT et pourla mesure des capacités de glucuronidation dansletissu hépatique...41

xiii

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ADH: Alcool dehydrogenase ALDH: Aldehyde déhydrogénase AR: Androgenreceptor

AhR: Aryl hydrocarbonreceptor Ago: Argonaute

AMFR: Autocrine motilityfactor ARE: AU Rich Element

ARN polII: ARN polyméraseII ARN polIII: ARN polyméraseIII AUBP: AU-rich binding protein

CAT1: Cationic Aminoacid Transporter 1 CAR: Constitutive androstanereceptor CBP: Cap binding protein

COPI: Coat protein complex

CRTH2: Chemoattractantreceptor-homologous molecule expressed on T-helpertype 2 cells CYP: Cytochrome P450

COMT: Catechol O-méthyltransférase DGCR8 : Di George Critical Region 8 DHT: Dihydrotestosterone

DPD: Dihydropyrimidine dehydrogenase EA: Épissage alternatif

eIF4F: Eukaryotictranslationinitiationfactor 4F EiF6F: Eukaryotictranslationinitiationfactor 6 Erα: Estrogenreceptor alpha

xiv

FDR: Farnesoid Xreceptor

FDA: US Food and Drug Administration GluA2: Glutamatereceptor subunit A2 GRB2: Receptor-bind protein 2 GST: Glutathion-S-transferases HNF: Hepatocyte nuclearfactor HIF1α: Hypoxiainduciblefactor 1 alpha HMT: Histamine méthyltransférase IGFR:Insuline growthfactorreceptor IVIVE:In vitro-in vivo extrapolation LXR: Liver Xreceptor

Klf4: Krupel-likefactor 4

MPT: Modification post-traductionnelle MPA: Acide Mycophénolique

MRA: Micro-region anchoring MRE: MiRNA-recognition element NAT: N-acetyltransférase

NRF2: Nuclearfactor(erythroid-derived 2)-like 2 NQO1: NADPH-quinone oxidoreductase 1 Pbx2: Pre-B-Cell Leukemia Homeobox 2 PACT: Protein Kinase R-activating protein PAZ: Piwi/Argonaute/Zwilli

PhIP: Phénylimidazopyridine

xv Pre-miRNA: MicroARN précurseur

Pri-miRNA: MicroARN primaire PXR: Pregnane Xreceptor RE: Réticulum endoplasmique

RISC: RNA-induced silencing complex RITS: RNA-inducedtranscriptional silencing RNP: Ribonucleoprotein

siARN :petit ARNinterférent SULT: Sulfotransférases

TPMT: Thiopurine méthyltransférase TGFα: Transforming growthfactor alpha

UGT: Uridine diphosphoglucuronosyltransférases UDPGA: Acide glucuronique(UDPGlca)

VDR: Vitamin Dreceptor UTR: Untranslatedregion XPO5: Exportine 5

xvii

Remerc

iements

J’aimerais d’abord remercierles membres dujury Dr Francine Durocher, Dr Patrick Provost et Dr Nicolas Picard pourletemps accordé àl’évaluation de mestravaux de doctorat.

J’aimerais remercier ma directrice de doctorat, Dre Chantal Guillemette de m’avoir offertla chance de réaliser mon doctorat au sein de sonlaboratoire et de m’avoir permis detravailler sur des projets variés. Merci également de m’avoir donnéla possibilité de présenter mestravaux dans des congrès aussi bien nationaux qu’internationaux. Et surtout, merci de m’avoir guidé et soutenu durant ces 3 années de doctorat. Merci également au Dr Éric Levesque pour sa participation et son aide dans mestravaux. Jeremercie aussi les Dr Philip Smith et John Fallon pour avoir eula chance de collaborer avec eux durant mon doctorat. J’aimerais aussiremercierles étudiants del’équipe du Dr Provost pourleurs aidestechniques etthéoriques tout aulong de mes projets.

Un grand merci aux nombreux membres dulaboratoire. Alan et Anaïs, avec qui ces 3 années ont commencé et avec qui elles seterminent également. Bonne chance àtousles deux pourla suite! Merci Anne-Marie pourta participation dans mes projets au cours deton stage et bonne chance pourlafin deta maitrise. Bonne continuation également à Camille, Sandra et Sylvie dans vos projets. Merci Lyne pourta bonne humeur,ta patience etton aidetout aulong de mon doctorat. Merci également à Patrick et Véronique pour votre participation dans mes projets et vos enseignements surla spectrométrie. Merci aussi à Andréa, qui prend soin de nos cellulestouslesjours avec bonne humeur. Merci Luciana pourta grande curiosité etl’optimisme quetu apportes dansles cubes. Un grand merci à Michèle, pour toustes conseils,les discussions, etta grandeimplication dans mestravaux. Yannick et Éric,je vous remercie et vous souhaite bonne chance maintenant que vous êtes bienlancé dans vos doctorats. Bonne chance àtoi aussi Adrien qui commencetoutjustel’aventure.

Un merci également aux anciens dulaboratoire pourleur accueil à mon arrivée. Merci Vincent pourle temps quetu as passé à partagerton expérience ettes connaissances. Merci à Mélanie, en espérant terecroiser au soccer pour un dernier match. Merci également àIsabelle, avec quij’ai pu visiter une des plus belles villes d’Europe. Merci à Sylvia pour avoir pu pratiquer mon anglais avectoi.

Merci également à Karine pour noslongs débats de qPCR et merci àla minorité culturellerousse du labo, Mandy. Merci àl’équipe du Dr. Olivier Barbier pourles discutions scientifiques et conseils

xviii

techniques. Puis,finalement un grand merci à Coraline, pourletemps passé ensemble, etle soutien mutuel au cours de ces dernières années.

xix

Avant-Propos

Ce document de thèse intitulé «Étude de la variabilité d’expression et de la régulation post -transcriptionnelle des UGT», et présenté àlafaculté des études supérieures del’Université Laval pour l’obtention du grade dePhilosophiae Doctor, estrédigé souslaforme d’insertion d’articles.

Le premier article, intitulé « Multiplexed Targeted Quantitative Proteomics Predicts Hepatic Glucuronidation Potential »(Margaillan et al. 2015), dontje suisle premier auteur, a été publié dansla revue « Drug Metabolism and Disposition » en septembre 2015. Cet article a été réalisé en collaboration avecle Dr. Phillip Smith et son assistant John Fallon, aveclesquels nous avonsréalisé les analyses quantitatives d’expression en protéines UGT par spectrométrie de masse. Les Drs Ulrich Zanger et Kathrin Klein ont permisl’accès auxtissus hépatiques humains. Patrick Caron aréaliséles mesures d’expressionrelative en protéine par spectrométrie de masse aulaboratoire du Dr Phil Smith. Lyne Villeneuve a réaliséles quantifications d’ARNm etles essais enzymatiques. Ma directrice de recherche, Dre Chantal Guillemette, a conceptualisél'étude, effectuél'analyse etl'interprétation des résultats,la rédaction etla révision du manuscrit. Dre Michèle Rouleau a contribué àl'analyse et l'interprétation desrésultats,larédaction etlarévision du manuscrit. Pour ma part,j’airéalisél’analyse de données ettests statistiques, participé àl’écriture del’ébauche del’article et àl’élaboration des figures, ainsi qu’auxrévisions del’article pour publication. J’estime avoir contribué à 40% del’article. Cet article,inséré dans cettethèse, estidentique àla version acceptée pour publication.

Le deuxième articleintitulé, « Quantitative profiling of humanrenal UDP-glucuronosyltransferases and glucuronidation activity: a comparison of normal andtumoral kidneytissues»(Margaillan et al. 2015), dontje suis premier auteur, a été publié danslarevue « Drug Metabolism and Disposition » en avril 2015. Comme pourl’article précédent, cette étude a étéréalisée en collaboration avecle Dr. Phillip Smith et son assistant John Fallon. Dre Mélanie Joy a permis l’accès aux tissus rénaux. Lyne Villeneuve aréaliséles quantifications d’ARNm etles essais enzymatiques. Patrick Caron aréaliséles mesures d’expressionrelative en protéine par spectrométrie de masse aulaboratoire du Dr Phil Smith. Véronique Turcotte a participé àl’analyse des données d’expression en protéine. Ma directrice de recherche, Dre Chantal Guillemette, a conceptualisél'étude, effectuél'analyse etl'interprétation des résultats,la rédaction etla révision du manuscrit. Dre Michèle Rouleau a contribué àl'analyse et l'interprétation desrésultats,larédaction etlarévision du manuscrit. Pour ma part,j’airéalisél’analyse de données ettests statistiques, participé àl’écriture del’ébauche del’article et àl’élaboration des

xx

figures, ainsi qu’auxrévisions del’article pour publication. J’estime avoir contribué à 40% del’article. Cet article,inséré dans cettethèse, estidentique àla version acceptée pour publication.

Le troisième article intitulé « Epigenetic Regulation of Steroid Inactivating UDP -Glucuronosyltransferases by microRNAsin Prostate Cancer » (Margaillan et al. 2015), dontje suis premier auteur, a été publié danslarevue « The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology » en septembre 2015. Dans cet article,j’airéalisél’ensemble des expériences et analyses portant sur les prédictions,les expériences d’essaisluciférase, ainsi queles expériences de validation par RT -qPCR, les immunobuvardages et les essais enzymatiques. J’ai également réalisé les analyses statistiques portant sur la banque de données publiques de Taylor. J’ai contribué à l’écriture de l’ébauche del’article et àl’élaboration desfigures et auxrévisions del’article. J’ai ainsi pu contribuer à 80% dans la réalisation de cet article. Ma directrice de recherche, Dre Chantal Guillemette a conceptualisél'étude, effectuél'analyse etl'interprétation des résultats, a effectuéla rédaction etla révision du manuscrit. Dr Éric Lévesque a également participé àl’écriture etlarévision du manuscrit. Cet articleinséré dans cettethèse estidentique àla version acceptée pour publication.

1

INTRODUCT

ION

La biotransformation de substanceslipophiles endogènes et exogènes est un processus complexe faisant appel à plusieurstypes de protéines et enzymes,telles que destransporteurs membranaires, les cytochromes P450, les uridine diphosphoglucuronosyltransférases (UGT), les glutathione-S -transférases(GST),les sulfotransférases(SULT) etles N-acétyltransférases(NAT). Parmi ces voies, laréaction de glucuronidation permetl’inactivation de 35% des médicamentsles plus utilisés,(Evans and Relling 1999, Guillemette et al. 2014). Les différences d’expression et d’activité des UGT ontle potentiel de modifierl’efficacité etlatoxicité de certains médicaments ou composés pharmacologiques. Par conséquent, la compréhension de l’action endogène et des mécanismes moléculaires de régulation del’expression des UGTreprésente un enjeu majeur pourle développement des nouveaux composésthérapeutiques etl’utilisation des drogues homologuées.

Au cours dela première partie de mestravaux de doctorat,je me suisintéressé à unetechnologie basée surla spectrométrie de masse permettant de mesurer avec précision et spécificitél’expression protéique des UGT danslestissus humains. J’ai ainsi pu déterminer si ces mesures permettaient de prédirela capacité de glucuronidation destissus hépatiques etrénaux. Dans une deuxième partie, mes travaux ont porté surlarégulation del’expression des UGT par des petits ARNinterférents endogènes (microARN).

C’est pourquoi, autravers de cetteintroduction,je vais présenterles différents éléments nécessaires àla compréhension durôle et des enjeuxliés aux UGT et aux microARN. Cetteintroduction permettra ainsi de mieux comprendrel’intérêt etlaréalisation de mon projet de doctorat.

1

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UGT

Chezles mammifères,le processus de glucuronidation estréalisé par une superfamille de protéines transmembranaires situées au niveau du réticulum endoplasmique (RE) et nommées uridine diphosphoglucuronosyltransférases ou UGT. Ces enzymes sontregroupées en 4familles, selonleur homologie de séquence(UGT1, UGT2, UGT3 et UGT8). Lesfamilles UGT1 et 2représententles plus connues etjouent unrôle primordial dansle métabolisme des médicaments(Figure 1)(Mackenzie et al. 2005, Guillemette et al. 2010, Guillemette et al. 2014). Les UGT1 etles UGT2 sont encodées par

2

deux régions génomiques organisées de manière distincte et assez conservées entreles espèces (Figure 1).

1

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UGT1

Les UGT1A sont encodées par un gène de 218 kilobases situé danslarégion q37 du chromosome 2 (2q37) et constitué de 13 exons 1 assemblés en série en 5’ du gène puis de 4 exons communs àtoutes lesUGT1A en 3’ du gène(Gong et al. 2001, Mackenzie et al. 2005). Un exon 1 est unique à chaque UGT1A et code pourle site de fixation au substrat, conférant ainsila spécificité del’enzyme. Ce processus conduit àla production des enzymesfonctionnelles UGT1A1, 1A3, 1A4, 1A5, 1A6, 1A7, 1A8, 1A9 et 1A10(Figure 1)(Harding et al. 1988, Ritter et al. 1992, Mojarrabi et al. 1996, Strassburg et al. 1997, Finel et al. 2005). Les 4 autres UGT sont considérées comme des pseudo-gènes, soitles UGT1A2p, UGT1A11p, UGT1A12p, UGT1A13p (Gong et al. 2001). Ces pseudo-gènes codent généralement pour des ARNm contenant des codons-stop précoces ne permettant pasla production d’une protéine(Turgeon et al. 2000, Gong et al. 2001). Les 4 exons communs(exon 2 à 5) sontinséré en 3’ del’un des exons 1 afin de produirelestranscrits pleinelongueur. Les exons communs codent pourle domaine deliaison du co-substrat etle domaine defixation àla membrane du RE(Meech and Mackenzie 1997, Patana et al. 2007). Par ailleurs, chacun de ces exons 1 est sousle contrôle d'une région régulatrice distincte, permettant de modulerl’expression de chacune des UGT1A de façon spécifique à chaquetissu ettype cellulaire.

1

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UGT2

Contrairement aux UGT1,les UGT2 sont encodées par plusieurs gènesregroupés dans unerégion de 1 500 kilobases,localisée surla partie q13 du chromosome 4 (4q13) (Monaghan et al. 1994, Beaulieu et al. 1997, Turgeon et al. 2000, Owens et al. 2005). Chacun de ces gènes est d’environ 30 kilobases et se compose de 6 exons, dontle premier code pourle site defixation au substrat, alors que les exons terminaux codent pour la partie de reconnaissance du co-substrat et le domaine transmembranaire(Figure 1). Lafamille desUGT2 est elle-même subdivisée en 2 sous-familles, soit lesUGT2A etlesUGT2B (Turgeon et al. 2000, Mackenzie et al. 2005, Court et al. 2008). Les 3 membres delafamille des UGT2A(UGT2A1, 2A2 et 2A3) sont moins étudiés, maisil a été déterminé qu’ils sont exprimés principalement au niveau dela muqueuse nasale, dansles poumons ou d’autres organes (trachée,larynx, côlon) (Sneitz et al. 2009, Bushey et al. 2011). Selonlalittérature, ces enzymes exerceraient un rôleimportant dansla glucuronidation de certains composés dutabac et

3 semblentliées àl’arrêt des signaux odorants et àla détoxification pulmonaire(Bushey et al. 2013). A l’image des UGT1A,les UGT2A1 et 2A2 sont produites à partir d’un gène unique composé de deux premiers exons alternatifs(Mackenzie et al. 2005, Bushey and Lazarus 2012). Al’inverse,l’UGT2A3 est codée par un gèneindépendant (Court et al. 2008). Les gènes UGT2B codent pour 7 protéines, soitles UGT2B4, 2B7, 2B10, 2B11, 2B15, 2B17, 2B28(Carrier et al. 2000, Mackenzie, 2005). Comme pourles UGT1A,il existe également des pseudo-gènes desUGT correspondants auxUGT2B24p, 2B25p, 2B26p, 2B27p, 2B29p ne codant pour aucune protéine(Figure 1).

Figure 1. Représentation schématique desloci contenantles gènes codant pourles protéines UGT1 et UGT2. La partie hautereprésentele gène unique codant pourles UGT1A et contenant 13 premiers exons,les 3 exons communs ainsi que les 2 exons terminaux. L’épissage alternatif de ces premiers exons et des exons terminaux permettront la production des différentesisoformes des UGT1A codées surle chromosome (chr) 2. La partie centrale représentela structure conservée des différentes protéines UGT(1A, 2A et 2B). Cettereprésentation montrel’ensemble des domaines participant àlafonction et àlalocalisation des enzymes UGT. La partie basse représentelelocus contenantles gènes codant pourles UGT2 ainsi qu’une vue détaillée del’ARNm del’UGT2B7. Surleslocis,les pseudo-gènes ou exons ne codant pas pour des protéinesfonctionnelles sontreprésentés en gris(Figuretirée de Guillemette, 2014).

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Autres

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UGT

En plus des UGT1 et desUGT2, deux autresfamilles de gènes ont étéidentifiées et partagent une similarité de séquences de 30% avec les autres UGT. La famille des UGT3 est composée de 2 membres (UGT3A1 et UGT3A2) et se localise sur la partie q13 du chromosome 5 (Meech and Mackenzie 2010). Ces gènes sont constitués de 7 exons possédant une séquence similaire à 80% entre eux.

La dernièrefamille UGT identifiée est celle desUGT8. Cettefamille est composée d’un gène unique, contenant 5 exons,localisé surla partie q26 du chromosome 4(Mackenzie et al. 2005). Néanmoins, l’enzyme UGT produite par ce gène est différente des autresUGT, caril s’agit d’une UDP-galactose céramide galactosyltransférase. Récemment, une étude a démontré quel’UGT8 semble être exprimée danslerein,letractus gastro-intestinal(intestin et colôn),lethymus etla moelle osseuse, et semble avoirla capacité de conjuguer différents acides biliaires et des sphyngolipides (Bosio et al. 1996, Meech et al. 2015). Cependant, malgréles quelquesinformations connues à cejour, que ce soit pour lesUGT3 oul’UGT8,leursrôles et expressionsrestent encore à être caractérisés. De plus,Il n’existe pas de donnéesimpliquant ces deuxfamilles d’UGT dansle métabolisme des médicaments.

2

Structure

proté

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UGT

Les UGT sont des protéinestransmembranaires detype 1localisées dansla membrane du RE et dans la membrane péri-nucléaire par continuité du RE(Vanstapel et al. 1989, Kinosaki et al. 1993, Anderson and Hetzer 2008). Les différentes données structurales de ces protéines montrent que 95% dela protéine UGT est exposée du cotéluminal du RE, alors que seulsles 5%restants sontlocalisés du coté cytoplasmique. Ces 5%forment une queue située en C-terminal dela protéine, composée de 25 acides aminés(Meech and Mackenzie 1998).

Les protéines UGT possèdent une structure composée de nombreux domaines protéiques conservés participant au déroulement delaréaction enzymatique et assurantleurlocalisation subcellulaire. En premierlieu, ces protéines sont synthétisées sousforme de précurseurs mesurant entre 529 et 534 acides aminés enfonction del’UGT(Meech and Mackenzie 1997). Ces protéines, dontla structure est similaire, sonttout d’abord composées d’unerégion N-terminaleimpliquée danslafixation au substrat, et dontla séquence estla plus variable entreles UGT(Figure 1)(Tukey and Strassburg 2000, Xiong et al. 2006, Fujiwara et al. 2009, Kerdpin et al. 2009). Elles se composent également d’unerégion C

-5 terminale, similaire entreles UGT, qui permet d’assurerlerecrutement du co-substrat donneur d’acide glucuronique(UDPGlcA) etla séquestration des protéines dansle RE(Figure 1)(Xiong et al. 2006, Patana et al. 2007).

Au niveau structural,la partie protéique qui assurelalocalisation etla séquestration des UGT dansla membrane du RE est divisée en plusieurs domaines(Figure 1). On note particulièrementla présence d’un peptide signal de 20 acides aminés conservés entreles UGT(Strassburg et al. 1997, Kerdpin et al. 2009). Ce peptide signal constitue unerégion hydrophobe de 10 à 15 acides aminés permettant l’insertion dela protéine UGT en cours de synthèse dansla membrane du RE, avant d’êtrefinalement clivélors dela maturation du peptide(Mackenzie and Owens 1984). L’importance de ce peptide signal restetoutefois controversée, car certaines études suggèrentl’implication d’autres domaines protéiques danslalocalisation des UGT. Ainsi, dans différentes UGT1A(UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A5 et UGT1A6),il a notamment étéidentifié unerégion située entreles acides aminés 159 et 172 quel’on appelle MRA(« micro-region anchoring ») (Ciotti et al. 1998). Cetterégion, composée d’acides aminés hydrophobes, assurel’ancrage des UGT dansla membrane du RE et sembleimportante pourla reconnaissance des substrats au niveau du site actif des enzymes (Ciotti et al. 1998). Du coté C -terminal, deuxrégions protéiques ont étéidentifiées. La première est composée de 17 acides aminés hydrophobesjouant unrôle de domainetransmembranaire etlocalisée entreles acides aminés 490 et 510,(Ouzzine et al. 2006). Cette séquence permet ainsi defairelajonction entrela partieluminale(N -terminale) etla partie cytoplasmique (C-terminale) del’UGT (Ouzzine et al. 2006). Àl’extrémité C -terminale, onretrouve une « queue cytoplasmique » composée de 19 à 25 acides aminés, enfonction des UGT(Nilsson et al. 1989, Jackson et al. 1990). Cette queue contient des motifs dylisine(KXKXX ou KKXX) conservés et est chargée positivement pour interagir avec la membrane chargée négativement(Nilsson et al. 1989). D’autre part,il semble que cette séquence puisse servir de signal pourl’adressage des UGT versle RE parles coat protein complex (COPI)(Barre et al. 2005).

De manière générale,lesloci UGT émanent dela duplication d’un gène ancestral pourlesUGT2B et d’un exon premier ancestral pour les UGT1A (Mackenzie et al. 2005, Guillemette et al. 2010, Guillemette et al. 2014). Ainsi, au niveau deleur séquence,les protéines commeles ARNm UGT partagent une grande similarité,(Tukey and Strassburg 2000, Gong et al. 2001, Tourancheau et al. 2015). Comme expliqué précédemment, on peut diviserla séquence de ces protéines en deux parties dontle niveau de similarité varie(Figure 1). La première partie en N-terminale est connue pour êtrela

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partie variable des UGT. En effet,les 280 premiers acides aminés présentent une variabilitéimportante permettant de donnerla spécificité de substrats à chaque UGT(Tukey and Strassburg 2000, Xiong et al. 2006, Fujiwara et al. 2009, Kerdpin et al. 2009). Al’inverse,la partie C-terminale composée des 250 derniers acides aminés démontre une similarité de séquence beaucoup plusforte entreles UGT (Xiong et al. 2006, Patana et al. 2007). Malgréla présence d’une partie variable dansleur séquence, on peutretrouverjusqu’à 41% de similarité de séquence entrel’ensemble des UGT. Cette similarité est encore plus grande au sein des sous-familles UGT, puisqu’elle est de 66% entreles UGT1A et 78% entreles UGT2B(Tukey and Strassburg 2000, Gong et al. 2001). Cetteimportante similarité pose de nombreux problèmes au niveau dela caractérisation des structures 3D de ces protéines et dans leur quantification par destechniques basées surl’utilisation d’anticorps.

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Laréaction de glucuronidation est un processus qui alieu de manière prépondérante danslefoie,les reins et le tractus gastro-intestinal, et implique une grande diversité de substrats endogènes et exogènes (Guillemette et al. 2014, Stingl et al. 2014). Cette réaction consiste enl’ajout d’un sucre glucuronique, issu du co-substrat appelé 5’-diphospho-α-D-glucuronique (UDPGlcA), sur le groupementfonctionnel du substrat, soit un hydroxyle(-OH), un carboxyle(-COOH), un amine(-NH2) ou unthiol(-SH) de petits substratslipophiles(aglycones)(Figure 2a, b, c).Il s’agit d’uneréaction de substitution nucléophile inversant la configuration chimique du groupement glucuronide (-G) et générant union H+_{, acidifiantle milieu environnant(Figure 2b). C’est pourquoile composéformé est}

appelé acide β-D-glucopyranosiduronique ou glucuronide (Radominska-Pandya et al. 1999, Guillemette et al. 2014).

A partir de ces différents groupements chimiques, les glucuronides les plus formés sont les O -glucuronides ester et étherrésultant dela glucuronidation d’un groupementfonctionnel carbonyle et phénol,respectivement. Onretrouve égalementles N-, C- et S-glucuronides,respectivement appelés amines, carboxyles, et sulfhydriles, en plus petites quantités(Figure 2c). Dansla majorité des cas,la glucuronidation augmentela polarité du substrat etfavorise son élimination danslesfluides corporels (urine, bile) en plus de provoquer un encombrement stérique empêchant la liaison ou la reconnaissance aux molécules cibles du substrat,tels que desrécepteurs(Radominska-Pandya et al.

7 1999, Guillemette et al. 2014). Cependant, il existe certaines exceptions pour lesquelles la glucuronidation augmentel’activité dela molécule mère, comme dansle cas del’ezetimibe, del’acide rétinoïque, et dela morphine. En effet,la morphine est activée par conjuguaison sur un hydroxyle en position 6 (morphine-6-OH-G), alors qu’elle est inactivée par glucuronidation en position 3-OH (morphine-3-OH-G)(Formelli et al. 1996, Coffman et al. 1998).

Cetteréaction de glucuronidation alieu au niveau dela surfaceluminale dela membrane du RE dans laquelle selocaliseles enzymes UGT(Figure 2a)(Meech and Mackenzie 1997). Afin d’alimenter cette réaction,le substrat etle co-substrat doiventtraverserla membrane du RE afin de setrouver au contact des enzymes UGT. Ainsi,letransfert del’UDPGlcA du cytosol versle RE est nécessaire et est assuré par untransporteur appelé SLC35D1(Muraoka et al. 2001). Les substrats glucuronidés sont ensuite acheminés en dehors dela cellule par différentstransporteurs,tels queles MRP etlestransporteurs ABCG, puis finalement éliminés dans la bile et l’urine (Zamek-Gliszczynski et al. 2006, Zamek -Gliszczynski, 2006).

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Figure 2. Représentation schématique dela réaction de glucuronidation.

(a) Représentation de la réaction de glucuronidation réalisée par une UGT dans le RE. Le co-substrat UDPGA est transporté dansle RE parla protéine SLC35D1.Il est ensuite pris en charge par une UGT qui vatransférerle groupement glucuronide del’UDPGA sur un groupementfonctionnel du substrat(R-OH ou R) pourformerle substrat-glucuronide(R -G). Ce R-G est ensuite relâché activement du RE puis éliminé dans la bile ou l’urine. (b) Réaction enzymatique de glucuronidation.(c) Liste des groupementsfonctionnels utilisés parles UGT pour effectuerla glucuronidation(Figuretirée de Guillemette, 2014).

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Parmiles voies métaboliques de biotransformation,la glucuronidation estl’une des plusimportantes dansla défense del’organisme(Williams et al. 2004, Guillemette et al. 2014).Il s’agit d’un mécanisme appartenant au métabolisme de phaseII destiné principalement àl’élimination d’une grande diversité

9 de petites molécules à la fois de sources endogènes (hormones stéroïdiennes ou thyroïdiennes, bilirubine, oules acides gras) et exogènes. Danslaliste des composés exogènes, ontrouve 35% de médicaments de toutes classes, dont 50% des 200 médicamentsles plus prescrits au États-Unis (Figure 3) (Evans and Relling 1999, Guillemette et al. 2014). D’autre part,les UGT contribuent àla protection del’organisme contre des produits chimiques carcinogènes et autrestoxinesliposolubles provenant del’alimentation (phénylimidazopyridine (PhIP), tabac) ou del’environnement (benzo-a -pyrène, bisphenol).(Bartsch et al. 1992, Nowell et al. 1999, Girard et al. 2005, Tang et al. 2012, Trdan Lusin et al. 2012, Zhang et al. 2013, Guillemette et al. 2014)

Figure 3. Représentation graphique dela contribution des différentes enzymes dansle métabolisme de phaseI et II des médicaments.

Les différents graphiques représentent la proportion relative des molécules pharmacologiques métabolisées par les différentes classes d'enzymes du métabolisme phaseI (à gauche) etII (à droite). ADH, alcool déhydrogénase; ALDH, aldéhyde déhydrogénase; CYP, cytochrome P450; DPD, dihydropyrimidine déhydrogénase; NQO1, NADPH:quinone oxidoréductase; COMT, catéchol O-méthyltransférase; GST, glutathione S-transférase; HMT, histamine méthyltransférase; NAT, N-acétyltransférase; STs, sulfotransférases; TPMT, thiopurine méthyltransférase; UGTs, uridine 5’-diphosphate glucuronosyltransférases(Figuretirée de Evans et al. 1999.).

Parmi ces médicaments, on retrouve des composés de toutes classes, tels que des anti -hypercholestérolémiants (i.e.: atorvastin), des analgésiques (i.e. acétaminophène), des composés psycho-actifs(i.e. oxazepam), et des médicaments utilisés dansletraitement d’infections virales(i.e. zidovudine). De plus,les variations del’expression et del’activité des UGT ont été associées aux différences de métabolisme de nombreux médicaments et molécules endogènes. Ces variations d’expression des UGT sontle plus souvent associées à des variations génétiques. Dansle cas de

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l’UGT1A1, celles-ci sont associées à une déficience partielle ou totale de glucuronidation de la bilirubine(syndromes de Gilbert et de Crigler-Najjar)(Servedio et al. 2005, Ehmer et al. 2012). D’autres altérations des UGT1A ont elles aussi été associées aux différences de réponse desindividus aux médicaments (Guillemette et al. 2014, Chen et al. 2015). Par exemple,les patients présentantle polymorphisme UGT1A1*28 ont un plus grandrisque de développer des neutropénies sévèreslors de l’utilisation detraitements avecl’agent anticancéreuxIrinotecan (Iyer et al. 2002, Chen et al. 2013, Levesque et al. 2013, Guillemette et al. 2014). Par ailleurs,l’importance de cette altération génétique est significative etfaitl’objet d’une recommandation dela US Food and Drug Administration (FDA) pourl’adaptation des doses d’irinotécan chezles personnes homozygotes(Barbarino et al. 2014). Un autre exemple del’importance des UGT dansle métabolisme des médicaments estle cas du polymorphisme UGT1A9*3, qui diminuele métabolisme du mycophénolate mofétil(MPA)(van Schaik et al. 2009). De plus,la méta-analyse des données portant sur ce polymorphisme suggère qu’une diminution de 30% des doses de cette molécule pourrait être bénéfique pourles patients hétérozygotes (Stingl et al. 2014). Àl’inverse del’UGT1A1*28 et del’UGT1A9*3, d’autres altérations génétiques peuvent augmenterl’élimination de certaines molécules,tel quele polymorphisme UGT1A6*2 qui est associé à une augmentation de deux fois del’élimination del’acétaminophène (Tankanitlert et al. 2007). Outre les UGT1A, certaines altérations des UGT2B sont associées à des différences du métabolisme des médicaments. L’UGT2B7 estl’UGT2Bla plusimpliquée dansle métabolisme de nombreux médicaments, en particulier, dans la glucuronidation de la morphine, la zidovudine, le naloxone et le naproxène. Dans le cas de la morphine, l’UGT2B7 joue un rôle particulièrement important, puisquele composé glucuronidé(morphine-6-glucuronide) a une activité analgésique de 2 à 5 fois plus importante que la molécule non-conjuguée chez l’humain et ce, via l’activation des récepteurs des opioïdes(Coffman et al. 1997). Comme pourl’UGT1A1, onretrouve ainsi un certain nombre de polymorphismes affectant l’expression et l’activité de cette enzyme, et modulant la conjugaison des médicaments précédemment cités. Par exemple,le polymorphisme UGT2B7*2 est associé à une augmentation de 3fois del’élimination dela morphine(Sawyer et al. 2003). Aufinal, on considère queles UGT1A1, 1A3, 1A4, 1A6, 1A9, 1A10, 2B7, 2B15 et 2B17 sontles UGTles plus impliquées dansle métabolisme des médicaments et vont ainsiinfluencerla pharmacocinétique des drogues dansl’organisme (Stingl et al. 2014). Par ailleurs,il est égalementimportant de noter que l’ensemble de ces médicaments sont conjugués par plusieurs UGT, suggérant qu’il est nécessaire de

11 mesurer et de considérerla voie de glucuronidation de manière globale, et non uniquement àtravers l’action d’une seule UGT.

En plus deleurrôle au niveau pharmacologique, certains polymorphismes etles niveaux d’expression de certaines UGT ont également été associés au risque et àla progression de nombreuxtypes de cancers(Guillemette et al. 2014). Àtitre d’exemple, onretrouvel’UGT2B17, pourlaquellela délétion du gène est associée à une augmentation durisque derécurrence du cancer dela prostate et à une diminution du risque de développer un cancer du côlon (Park et al. 2006, Karypidis et al. 2008). À l’inverse, une augmentation del’expression de cette même UGT dansleslymphocytes B est associée à un mauvais pronostic dans les leucémies lymphoïdes chroniques (Gruber et al. 2013). Plus récemment,l’augmentation del’expression del’UGT2B28 a étéidentifié danslestissus humains de cancers dela prostate de hauts grades(Belledant et al. 2015). D’autres études suggèrent également unrôle pourles UGT danslarésistance auxtraitements chimiothérapeutiques. Par exemple, dansles leucémies myéloïdes aigues,la protéine UGT1A1 estimpliquée danslarésistance àlaribavirine par la glucuronidation de cette molécule(Zahreddine et al. 2014, Zahreddine and Borden 2015).

Au niveau moléculaire, des études suggèrent queles UGT peuvent avoir d’autresrôles que ceuxliés àleur activité enzymatique. En effet,l’UGT2B17 peut avoir un effet anti-apoptotique, via son action sur l’équilibre d’expression des protéines MCL-1 et PUMA, qui sontrespectivement des protéines anti et pro-apoptotiques, dans des cellules de cancer de l’endomètre (Hirata et al. 2010). L’UGT2B17 a également étéidentifiée comme étant un antigène mineur suggérant unrôle des protéines UGT dans les mécanismes de reconnaissance des cellules parle systèmeimmunitaire(Terakura et al. 2007). D’autres études plusrécentes montrent également queles variants d’épissage alternatif des UGT1A (isoformesi2) peuventinfluencerle métabolisme oxydatif des cellules parinteraction directe avecles enzymes catalase etlaperoxiredoxine 1(Rouleau et al. 2014).

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Étant donnél’implication pharmacologique grandissante des UGT etla diversité d’expressiontissulaire qui a été observée, de nombreux groupes ont quantifié ces enzymes dansles différentstissus de l’organisme(Figure 4)(Rowland et al. 2013, Gundert-Remy et al. 2014). Assezlogiquement,les études se sont principalement tournées vers les tissus directement impliqués dans le métabolisme des médicaments (foie, rein,intestin) (Rowland et al. 2013, Gundert-Remy et al. 2014). Ces différentes

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quantifications ont ainsi démontré qu’il existe un profil d’expression des UGT spécifique à chaquetissu (Strassburg et al. 1997, Meech and Mackenzie 1998, Strassburg et al. 1998). Cependant,lefoiereste aujourd’huile tissu pourlequelle profil d’expression des UGT estle mieux caractérisé. D’ailleurs, l’ensemble des quantifications effectuées démontre quelefoie estl’organe exprimantla plus grande diversité(entre 12 et 16 UGT) etles niveauxles plus élevés d’UGT(Figure 4). En effet,l’ensemble des transcritsUGT semble être exprimé au niveau destissus hépatiques àl’exception des UGT1A5, 1A7, 1A8 et 1A10 (Izukawa et al. 2009, Ohno and Nakajin 2009, Court et al. 2012). Cependant,il est important de noter queles UGT ne sont pas exprimées uniquement danslestissusliés au métabolisme des médicaments(Gregory et al. 2004, Gundert-Remy et al. 2014). On considère aujourd’hui quela grande majorité des ARNm UGT sont exprimés de manière différentielle dans 28 tissus humains comprenantla voie respiratoire (poumons, fosses nasales, œsophage),le tractus gastro-intestinal (côlon, estomac), les tissus hormonaux-dépendants (ovaires, testicules, glandes mammaires, prostate), etc…(Gregory et al. 2004, Chen et al. 2005, Heydel et al. 2010, Gundert-Remy et al. 2014).

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Figure 4. Profil d’expression des UGT1A et 2B dansles différentstissus du métabolisme des médicaments. Chaque boite montrel’ensemble des UGT qui ont été détectées ou non au niveau del’ARNm dansles différentstissus (foie, œsophage,rein, côlon, petitintestin). Les graphiques circulaires montrentl’abondancerelative de chaque UGT pour lefoie(protéines) et pourle petitintestin(ARNm)(Figuretirée de Guillemette, 2014).

De manière générale,les profils précédemmentidentifiés sont basés surla quantification des ARNm UGT quireprésenteindirectementl’abondance des protéines. Cependant, pour certaines UGT,il a été clairement démontré qu’il n’y a pas delien direct entreles niveaux d’expression des ARNm etles niveaux des protéines(Izukawa et al. 2009, Ohtsuki et al. 2012). C’estle cas del’UGT2B7 pourlaquelle l’expression en ARNm et en protéine(r= 0.156) ne sont pas corrélées(Izukawa et al. 2009).Il semble alors nécessaire que ces profils d’expression soient confirmés aux niveaux protéique et, surtout,

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enzymatique. Certaines études ont mesurél’expression protéique des UGT par des approches basées surl’utilisation d’anticorps (immunobuvardage, ELISA,immunohistochimie) (Strassburg et al. 1999, Gaganis et al. 2007,Izukawa et al. 2009, Bellemare et al. 2011, Lu et al. 2015). Néanmoins,le manque de substrat spécifique pour certaines UGT etla similarité des séquences protéiques entreles UGT rendent difficilela mesure directe des activités enzymatiques etla mesure des protéines de chaque UGT. Par conséquent, destechniques plus évoluées utilisantla spectrométrie de masse(MS) ont été développées afin d’obtenirles profils d’expression protéique des UGT danslestissus humains. Au travers del’ensemble des quantifications des UGT,il a été déterminé qu’il existe une grande hétérogénéité dansl’expression des UGT entrelesindividus(Rowland et al. 2013, Guillemette et al. 2014, Gundert-Remy et al. 2014). Cette variabilité d’expression se retrouve danstousles organes exprimantles UGT et concerne aussi bienl’expression des ARNm et des protéines, quel’activité enzymatique. Ceci est notammentle cas pourl’enzyme UGT2B7, dontl’expression peut varier de 400 fois au niveau del’ARNm(entre 0.2 et 97.4 x104 _{copies d’ARNm/μg d’ARN), de 4fois au niveau de}

l’expression protéique(entre 4.45 et 18.2 pmol/mg de protéines), et d’environ 3.5fois pourl’activité de glucuronidation de la morphine (entre 500 et 1700 pmol/min/mg de protéine) entre les individus (Izukawa et al. 2009, Sato et al. 2012).Étant donnél’implication des UGT dansle métabolisme des médicaments et des hormones,il est à noter que cette diversité d’expression suscite un grandintérêt, notamment pourles compagnies pharmaceutiques qui ont besoin de caractériserl’expression de ces protéines pour améliorer leur modèle de prédiction du métabolisme des nouveaux composés pharmacologiques (Naritomi et al. 2015). Malgré l’identification de certains facteurs liés à l’environnement (alcool, âge, sexe, ethnicité, etc…) ou processus moléculaires (facteurs de transcription, épissage alternatif) danslarégulation des UGT, cette diversité d’expressionreste encore largementinexpliquée (Burchell and Coughtrie 1997, Court 2010, Guillemette et al. 2014, Hu et al. 2014). Ces différents acteurs seront ainsi détaillés plus précisément dansla prochaine partie.

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Les gènes codant pourles UGT sont aujourd’hui connus pour contenir de nombreux polymorphismes. Plus de 200 allèles de ces gènes ont ainsi pu êtreidentifiés(Stingl et al. 2014). Ces polymorphismes peuvent être localisés dans l’ensemble des séquences des gènes UGT (séquence promotrice,

15 séquence codante, et parties non-traduites). Cependant, l’impact d’une grande majorité de ces polymorphismes surl’activité etl’expression des UGT reste encore à être élucidé. Actuellement,le polymorphismele mieux caractérisé est celuilocalisé dansle promoteur del’UGT1A1 et qui se définit parla présence d’une ou de plusieursrépétitions de TA dansla boite TATA((TA)7-8TAA) aulieu de ((TA)6TAA). Ce polymorphisme appelé UGT1A1*28 a pour conséquence une diminution de 50% de l’expression del’UGT1A1, associée à une diminution de 30% à 50% del’activité de glucuronidation cellulaire(Iyer et al. 1998,Iyer et al. 2002, Fang and Lazarus 2004). Le substrat endogène principal del’UGT1A1 étantla bilirubine,le polymorphisme UGT1A1*28 est associé à del’hyperbilirubinémie et, par conséquent, au syndrome de Gilbert (Bosma et al. 1995). D’un point de vue pharmacologique, l’UGT1A1 est connue pourinactiverle SN-38, qui estle métabolite actif del’Irinotecan utilisé dansle traitement du cancer colorectal (Fuchs et al. 2006). Comme nous l’avons vu précédemment, le polymorphisme UGT1A1*28 a été associé à un risque augmenté de développer des neutropénies sévèreslors del’utilisation de cetraitement.(Iyer et al. 2002, Chen et al. 2013, Levesque et al. 2013, Guillemette et al. 2014). Ce polymorphisme est notammentintégré dans un nomogramme permettant d’évaluerlesrisques de développer ces effets secondaires pourles patientstraités avec del’Irinotecan (Ichikawa et al. 2015). Les polymorphismes n’influencent pas uniquementles niveaux d’expression des UGT. En effet, d’autres polymorphismes vontinduire une modification dela séquence protéique des UGT. C’estle cas du polymorphisme UGT1A6*2 augmentela métabolisation del’acétaminophène en modifiantla séquence protéique del’UGT1A6(Tankanitlert et al. 2007).

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En plus des polymorphismes ponctuels,la variation du nombre de copies des gènes UGT contribue à la variabilité d’expression de ces enzymes. En effet, des délétions d’une copie des gènesUGT2B17 et UGT2B28 ont été clairementidentifiées avec desfréquencesrespectives de 27% et 13,5%(Menard et al. 2009). Ces deux UGTfont partie des gènesles plus communément délétés dansle génome humain caucasien(McCarroll et al. 2006). De plus, des données produites aulaboratoire suggèrent qu’environ 57% dela population caucasienne possède au moins une délétion dansl’un de ces deux gènes. Le rôle physiologique de ces délétions reste encore à être déterminé avec précision. Cependant, leur implication pathologique a déjà été démontrée, puisque ces deux délétions sont associées aurisque derécidive du cancer dela prostate(Nadeau et al. 2011).

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Plus récemment, des études ont démontré quele mécanisme de méthylation del’ADN estimpliqué dansla distributiontissulaire des enzymes UGT. Le casle mieux décrit est celui del’UGT1A1 pour laquellel’hyperméthylation del’ADN etl’hypoacétylation des histones sont associées à une diminution de son expression dans deslignées cellulaires de cancer colorectal(Gagnon et al. 2006). D’autre part, dans desfoies humains, des données soutiennent ces résultats en suggérantl’existence de 4îlots CpGrépartis sur 500 nucléotides avantle site d’initiation detranscription del’UGT1A1 (Yasar et al. 2013). La méthylation de ces îlots CpG est directement corrélée avec l’expression protéique de l’UGT1A1(r=0.54; p=0.008) etl’activité de glucuronidation dela bilirubine(r=0.73; p<0.0001)(Yasar et al. 2013). Une autre étude suggère quela méthylation del’ADN peut être directementimpliquée dansla dérégulation del’expression des UGTlors du développementtumoral. En effet, une étude globale del’état de méthylation des 839îlots CpG dansle cancer du poumon a permis d’associer l’hyperméthylation du promoteur del’UGT1A7 avec une diminution dela survie des patients.(Lokk et al. 2012).Il apparait donc quel’étude dela méthylation des promoteurs UGT pourrait avoir unintérêt particulier dansla prédiction des effets des composés pharmacologiques et dansla spécificité de l’expressiontissulaire desUGT (Oda et al. 2013, Oda et al. 2014).

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ion

Larégulation del’expression des gènes UGT est soumise àl’activation d’un grand nombre defacteurs de transcription (Hu et al. 2014). Parmi ces facteurs, on trouve principalement des récepteurs nucléaires hormonaux, ou chimiosensibles, tels que le récepteur aux androgènes, le récepteur Farnesoid Xreceptor (FXR),lerécepteurVitamin D Receptor (VDR), oulerécepteur HNF1(Barbier et al. 2003, Gardner-Stephen et al. 2004, Lu et al. 2005, Sugatani et al. 2005, Kaeding et al. 2008, Erichsen et al. 2010, Bigo et al. 2013). L’ensemble desfacteurs detranscriptionrégulantl’expression des UGT a pu êtrerecensé dans plusieursrevuesrécentes et présenté untableau 1. Pour exercerleur action régulatrice, ces facteurs de transcription reconnaissent spécifiquement certaines séquences situées au niveau des gènes UGT,tels quel’élément deréponse aux xénobiotiques(XRE; «Xenobiotic Respons Element ») qui est reconnu par AhR dansla régulation del’UGT1A1 (Phelan et al. 1998, Yueh et al. 2003). Souvent, cesfacteurs detranscription vont assurer une boucle derétro-contrôle de l’expression des UGT parleurs substrats. C’estle cas des UGT2B15 et 2B17, dontles hormones androgéniques sontles substrats endogènes(Tableau 1). Dansla prostate,l’activation durécepteur

17 androgénique (AR) par ces hormones va induire la translocation du AR dans le noyau et la reconnaissance des promoteurs des gènes UGT2B15 etUGT2B17 afin de réprimerl’expression de ces deux UGT(Guillemette et al. 1996, Chouinard et al. 2007, Bao et al. 2008). Chacun des éléments (facteurs detranscription et co-facteurs)impliqués dans ce mécanisme de régulation estimportant. Ainsi,la présence de mutation ou de polymorphisme au niveau des séquences régulatrices, ou au niveau des gènes codant pourlesfacteurs detranscription, peutinfluencer ce mécanisme et avoir un impact surla voie de glucuronidation. D’autre part,l’expression de certainsfacteurs detranscription peut être spécifique à destypes cellulaires ou à destissus, ce quifait de cesfacteurs des éléments clés dansla distributiontissulaire etla variabilité d’expression des protéines UGT (Mackenzie et al. 2010, Bigo et al. 2013, Hu et al. 2014).

18

Tableau 1. Liste desfacteurs detranscription et desligands régulantl’expression des UGT. Facteurs de

transcription Ligands des récepteurs UGT cibles Références

HNF1α -UGT1A1, 1A3, 1A4, 1A8, 1A9, 1A10, 2B7, 2B17 (Bernard et al. 1999, Gregory et al. 2000,Ishii et al. 2000, Wells et al. 2004, Gardner-Stephen et al. 2005, Gardne

r-Stephen and Mackenzie 2007)

HNF1β - UGT1A3_2B17 , (Gregory et al. 2000)

Pbx2 - UGT2B17 (Gregory and₂₀₀₂ Mackenz₎ ie

AhR

3-methylcholanthrène, Benzo[a]pyrène, Bilirubine, TCCD, 12 -HETE UGT1A1, 1A3, 1A4, 1A6, 1A9 (Sugatani et al. 2004, Lankisch et al. 2008) HNF4α - UGT1A1_{1A6, 1A9}, (BarbStephenier et and al. 2005 Mackenz, Gardner-ie

2007) NRF2

Bilirubine, α -Naphtoflavone,ter t-buthylhydroquinone, Oltipraz

UGT1A1,

1A6 (Munzel eTukeyt al. 2003 2007, Yueh) and PXR _lRi_ifamp_thocoic_liquein, Ac_{, Hyper}ide_forine UGT1A11A3, 1A4,,

1A6

(Rae et al. 2001, Gardner-Stephen et al. 2004) CAR TCPOBOPandrosteno,l 3α, 3α, 5α, 5α-

-androstanol, Artemisinin UGT1A1 (Sugatani et al. 2001) FXR

acides Deoxycholique acide

Chenodeoxycholique, acide Cholique ,Z-Guggulsterone

UGT1A3,

2B4, 2B7 (Barb2005,ier Er eichsent al. 2003 et a,l Lu. 2010 et a)l. LXR 24(S)-Hydroxycho_{24(S),25-Epoxycho}les_lestero_terol,_{l UGT1A3} (Verreault et al. 2006)

PPARα acide Clofibrique Gemfobrozil Bezafirate GW 7647 20-HETE 11,12-EET UGT1A1, 1A3, 1A4, 1A6, 1A9, 2B4

(Barbier et al. 2003, Barbier et al. 2003, Senekeo -Effenberger et al. 2007) VDR 25_1,25-Hydroxyv_-Dihydroxyvitam_iin_tam D3_{in D3 2B15}, 2B17 (Kaeding et al. 2008) Erα _Tamox17-beta_ifen estradiol _2B15UGT1A4_,2B17, (Chen_Mackenz et al. 2009_{ie 2009}, Hu₎ and

AR

Testosterone Dihydrotestosterone R1881

Flutamide

UGT2B15, 2B17

(Guillemette et al. 1996, Chouinard et al. 2007, Bao et

19

4

.5

Ép

issage

a

lternat

if

(EA)

L’épissage alternatif est un mécanisme majeur impliqué dans la diversité d’expression des ARN messagers et des protéines(Wang and Burge 2008). Dansles dernières années,il a été clairement établi quel’une des causes dela diversité d’expression des UGTréside au niveau del’EA. En effet, ce mécanisme permet à la cellule d’augmenter considérablement la diversité des transcrits et des protéinesissus d’un même gène,tout en déterminantla nature de ces protéines parla sélection des exons del’ARNm(Guillemette et al. 2010). Ainsi, plusieurs protéinesissues du même gène peuvent avoir des structures primaires différentes (par exemple: gain ou perte de site d’interaction avecle substrat ou co-substrat, avec d’autres protéines ou des domaines delocalisation subcellulaire, etc.). Les mécanismes moléculaires régissant l’EA sont complexes et font intervenir plusieurs acteurs protéiques et nucléiques, qui sontfréquemment altérés en contexte néoplasique(Garcia-Blanco et al. 2004, Zhang et al. 2013).

Dansle contexte des UGT, notrelaboratoire a mis en évidence un grand nombre d’évènements d’EA intervenant dansla diversité del’expression desUGT1A, 2B4, 2B7 et 2B28(Guillemette et al. 2010). Grâce à ce mécanisme, de nouvellesisoformes UGT ont pu être découvertes etle nombre detranscrits potentiellement exprimés à partir des gènes UGT1A et deUGT2 a plus que doublé(Bellemare et al. 2010, Levesque et al. 2010, Menard et al. 2011, Rouleau et al. 2014). Àtitre d’exemple, notre groupe aidentifié et validé untotal de 22transcrits pleinelongueur pouvant être exprimés à partir du gène de l’UGT2B7 (Figure 5) (Menard et al. 2011, Menard et al. 2013). En 2001, 3 transcrits avaient été rapportés pourl’UGT2B28 (Levesque et al. 2001).

Plusrécemment, notre groupe a étendul’étude de ce mécanisme àl’ensemble des gènes UGT par l’utilisation destechniques de séquençage del’ARN à haut débit. Cette étude a permis d’évaluerle nombre de nouveaux variants potentiels à 130 pourl’ensemble des UGT(Tourancheau et al. 2015). De plus,lesrésultats suggèrent que ces variants sont exprimés de manière spécifique à certainstissus, et queleur expression est altérée dansles cancers (Tourancheau et al. 2015). Grâce àl’étude de certains des variantsissus des gènes UGT1A, 2B4, 2B7,il apparait que beaucoup des nouvelles isoformes produites ne possèdent pas d’activité de glucuronidation et diminuentl’activité enzymatique desisoformesfonctionnelles via desinteractions physiques(Bellemare et al. 2010, Bellemare et al. 2010, Rouleau et al. 2013). Ces études suggèrent également que ces nouveaux variants peuvent avoir desrôles encoreinsoupçonnés(Bellemare et al. 2011, Tourancheau et al. 2015). En effet,l’étude de

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l’interactome desisoformesi2issues del’épissage alternatif des UGT1A révèlent qu'elles semblent pouvoirinfluencerla réponse au stress oxydatif dela cellule parinteraction directe avecl’enzyme catalase et peroxiredoxin 1 (Rouleau et al. 2014). Cependant,le rôle dela majorité des nouvelles isoformes UGT demeure encorelargementinconnu et nécessite des études complémentaires.

Figure 5. Exemple de diversité des transcrits et isoformesissus d’évènements d'épissages alternatifs (Cas de l’UGT2B7).

Représentation schématique des protéines dérivées des transcrits d’UGT2B7. Les 22 transcrits issus de l’épissage alternatif del’UGT2B7 peuvent coder pour des protéines délétées en C-terminal (Partie blanche du cadre) et/ou en N -terminal(Partie grise du cadre)(Figuretirée de Menard, 2011).

4

.6

m

icroARN

Les microARN sont des petits ARN non-codants composés de 19 à 24 nucléotides ettranscrits à partir du génome humain. Cette catégorie d’ARN estimpliquée danslarégulation post-transcriptionnelle des gènes eninduisantle clivage oul’arrêt delatraduction des ARNm(Finnegan and Pasquinelli 2013, Ha and Kim 2014). Depuisla découverte du premier microARN(lin-4) chezle nématode C. Elegans en

21 1993, plus de 35 828 microARN ont étéidentifiés par clonage ou séquençage dans 223 espèces(Lee et al. 1993). Chezl’humain, on comptabilise 1 881 séquences de précurseurs menant àlaformation de 2 588 microARN matures que l’on prédit pour réguler plus de 60% des gènes humain (http://www.mirbase.org/ ; Release 21, septembre 2015)(Friedman et al. 2009, Ameres and Zamore 2013, Kozomara and Griffiths-Jones 2014). Au cours de mathèse,je me suis plus particulièrement intéressé à savoir si les microARN pouvaient être impliqués dans la régulation des UGT par les microARN. Ainsi,l’objectif de cette section est de détailler plus précisémentles mécanismesliés aux microARN afin de fournir les éléments de compréhension nécessaires pour l’explication de mes objectifs. Dans cette optique, cette partie del’introduction détaillerales étapes de biosynthèse et de régulation des microARN,leur mécanisme d’action, puisleursrôles dansles cellules, dans différentes pathologies et enfin en pharmacologie.

4.6.1 Biogénèse des microARN

Dansle génome humain,les séquences codant pourles microARN sontlocalisées au niveau de différents éléments génomiques,tels que desintrons ou des exonsissus detranscrits codants(43% et 9% des microARN, respectivement), des régions intergéniques (36% des microARN), ou des transcrits anti-sens(9% des microARN)(Rodriguez et al. 2004, Georgakilas et al. 2014). Lesloci des microARN sont souvent construits parl’enchainement de séquences de plusieurs microARNformant ce quel’on appelle une unité detranscription polycistronique, ou cluster (Lee et al. 2004). Au sein de ce cluster, les microARN sont souvent co-régulés au niveau transcriptionnel. Cependant, chaque microARN peut êtrerégulé différentiellement des autres au niveau post-transcriptionnel(Roush and Slack 2008).

A partir de ces cluster,les gènes de microARN sonttranscrits parl’ARN polymeraseII(ARN polII) souslaforme d’unlong ARN polycistronique appelé microARN primaire(pri-miARN)(Figure 6)(Lee et al. 2004, Bortolin-Cavaille et al. 2009, Georgakilas et al. 2014). Au niveau desrégionsintergéniques, les gènes codant pourles microARN peuvent aussi êtretranscrits parl’ARN polymeraseIII(ARN pol III), qui est spécialisée dansla production des ARN non codants(Exemple: ARN detransfert et ARN ribosomaux)(Borchert et al. 2006, Goodfellow and White 2007, Gu et al. 2009). Les pri-miARN ainsi produits sont modifiés afin d’intégrer une coiffe 7-méthyl guanylate àl’extrémité 5’ et une queue poly (A) àl’extrémité 3’, commele sontles ARNm(Figure 6)(Cai et al. 2004). Au sein des pri-miARN,il existe des séquences complémentaires dontl’interaction assurele repliement du pri-miARN etla

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formation d’une structure entige-boucle avec des extensions simple brin à chaque extrémité(Han et al. 2006). Cette structure spécifique au pri-miARN est reconnue parla protéine Di George Critical Region 8 (DGCR8)(Han et al. 2006). DGCR8 va ensuite permettrelerecrutement del’endonucléase detypeIII Drosha pourformerle complexe Microprocesseur(Figure 6)(Lee et al. 2003, Denli et al. 2004, Gregory et al. 2004, Han et al. 2004). Unefois positionnée, Drosha va cliverle pri-miARN à environ 11 nucléotides dela base delatige-boucle etlibérer un ARN de 60 à 70 nucléotides appelé microARN précurseur(pré-miARN)(Han et al. 2006). Ce pré-miARN est donc composé d’une structure tige-boucle avec une extrémité 3’ sortante de 2 nucléotides(Nicholson 2014).

Après cette étape de production du pré-miARN dansle noyau dela cellule, ces derniers sont exportés dansle cytoplasme parle complexe exportine 5, dontl’activité est dépendante dela protéineranGTP (Figure 6)(Bohnsack et al. 2004, Lund et al. 2004).

Suite à sontransport dansle cytoplasme,le pré-miARN subit une nouvelle étape de maturationfaisant intervenirl’endonucléase detypeIII Dicer et son cofacteurTAR(HIV-1) RNA binding protein 2 (TRBP) (Chendrimada et al. 2005, Haase et al. 2005). Grâce au domaine protéique Piwi/Argonaute/Zwill(PAZ), Dicerreconnaitle pré-miARN au niveau des 2 nucléotides del’extrémité 3’sortante, puis clive ce pré -miARN àla base dela boucle (Zhang et al. 2004). Ce clivagelibère alors un duplextransitoire de microARN exposant des protubérances de 2 nucléotides à chaque extrémité 3’ et dont la complémentarité d’hybridation estimparfaite (Figure 6) (Zhang et al. 2004). Ce duplex est ensuite intégré dansle complexeRNA-induced silencing complex (RISC) ou pré-miRNP, qui est composé des protéines Argonaute (Ago 1 à 4), Dicer, TRBP, etla proteinkinaser-activating (PACT)(Lee et al. 2006, MacRae et al. 2008). L’insertion du duplex dans ce complexe RISC va assurerla sélection du brin guide etla dégradation du brin opposé quel’on appelle brin passager. Néanmoins, chacun des brins formant le duplex peut conduire à la formation d’un miRNP mature fonctionnel. Les éléments intervenant dans cette sélection restent encore mal compris à ce jour. Il semble que la stabilité thermodynamique etla séquence des ARN du duplexfavorisentla sélection del’un des brins aux dépens du deuxième, qui est généralement moins stable(Khvorova et al. 2003, Schwarz et al. 2003, Hu et al. 2009). Unefoisle brin guide sélectionné,il estintégré dans une protéine Argonaute afin de formerle cœur du miRNP mature(Figure 6).

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Figure 6. La voie de biogénèse des microARN.

Le premier précurseur de microARN esttranscrit à partir du génome parl’ARN polyméraseII.Il est poly-adénylé en 3’ et une coiffe 7-méthylguanosine est ajoutée en 5’ pourformerle pri-microARN (pri-miRNA). Ce pri-microARN est pris en charge et clivé parle complexe Micro-processeur composé des protéines DGCR8 et DROSHA. Ce clivage mène àla production du précurseur pré-microARN(pre-miRNA) qui sera exporté dansle cytoplasme parl’exportine 5(XPO5), puis à nouveau clivé parle complexe DICER. Ce nouveau clivage permetla production du duplex de microARN qui seraintégré dans une protéine Ago afin d’isolerle brinfonctionnel du duplex etformerle complexe miRISC ou miRNP. Le miRISC peut alors s’hybrider avecl’ARNm cible et avoir ses actions derépression au niveau des P-body. (Figuretirée de Lin, 2015)

4.6.2 Mécanisme d’action des microARN 4.6.2.1 Reconnaissance du site deliaison.

Au sein du miRNP,lerôle du microARN est de guider ce complexe sur sa cible par complémentarité entreles séquences du microARN etla séquence del’ARNm ciblé. Cette reconnaissance et cette liaison sefont parl’intermédiaire deliaisons hydrogènes detype Watson-Crick,telles qu’observées entreles bases del’ADN(Figure 7)(Lee et al. 1993). Pourlefonctionnement du complexe miRNP,il n’est pas nécessaire d’avoir une complémentarité parfaite entrele microARN etl’ARNm cible comme c’estle cas pourles siARN(Figure 7). Cependant, une complémentarité parfaite augmentel’activité catalytique des protéines Ago2 menant au clivage direct de l’ARNm cible (Yekta et al. 2004). À l’inverse, une complémentaritéimparfaite conduit àla mise en place de mécanismes d’inhibition dela traduction. Communément, on considère quele site deliaison des microARN estlocalisé dansla partie

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3’ non-traduite(3’ untranslatedregion, 3’UTR) des ARNm(Orom et al. 2008, Bartel 2009, Hausser et al. 2013). Cependant desrégulations par microARN ont aussi étéidentifiéeslors d’interaction avecles parties 5’ non-traduites(5’ untranslatedregion, 5’UTR) etles parties codantes des ARNm(Orom et al. 2008). Malgréla petitetaille deleurs séquences(24-30 nucléotide),les microARN se composent de régionsimportantes dontle rôle est spécifique pourle bonfonctionnement du miRNP. Ainsi,il a été déterminé quele premier nucléotide en 5’ n’intervient pas dansla sélection dela cible mais assure l’intégration du microARN dansle complexe RNP(Ma et al. 2005). Entreles nucléotides 2 et 8, on retrouve une zone appelée « seed », dontl’interaction avecla cible est essentielle pour assurerla spécificité etlefonctionnement du siRNP. Cette zone permet également de classifierles microARN en famille dont les membres partagent les mêmes « seed » (Doench and Sharp 2004). Entre les nucléotides 9 et 11, onretrouve généralement une bulle qui n’est pas hybridée avecl’ARNm cible du miRNP conduisant à uneinhibition desfonctions de clivage dela protéine Ago2(Saxena et al. 2003, Brennecke et al. 2005, Farh et al. 2005). L’appariement dela portion 3’ du microARN permet de renforcerl’interaction entrele miRNP etl’ARNm cible(Figure 7).

Le décryptage des caractéristiques d’interaction entre microARN et ARNm ont conduit àla production d’algorithmes complexes permettant de prédireles cibles d’un microARN(Rieger et al. 2011, Gurtan and Sharp 2013, Agarwal et al. 2015). Grâce à ces algorithmes et aux méthodes expérimentales d’analyses globales dutranscriptome, on prédit queles microARN d’une mêmefamille peuventréguler entre 100 et 1000 ARNm (Lim et al. 2005). Cette flexibilité et cette complexité d’interaction sont également dues à des particularités propres au microARN. En effet, une étude a mis en évidence l’existence d’interactions entre des guanines (G) et des uraciles (U) entrel’ARNm etle microARN affectant ainsila spécificité etla stabilité de ces derniers (Doench and Sharp 2004). De plus, des variations des séquences sont observées sur certains microARN quel’on appelle alorsisomiR(Morin et al. 2008, Chiang et al. 2010). Ces variations dela séquences d’un microARN peuvent sefaire soit par une maturation imprécise de la part de Drosha ou Dicer, soit par des processus cellulaires particuliers,tels quel’édition des ARN, qui permettentla modification de manière ciblée d’un ou de plusieurs nucléotides dansla séquence ARN déjàtranscrit (Kawahara et al. 2007, Krol et al. 2010, Westholm et al. 2012).

Au niveau mécanistique,lorsquele complexe miRNP s’est hybridé à une cible parl’intermédiaire du microARN, on peut avoir plusieurs actions surl’ARNm cible. Lorsquele complexe miRNP est hybridé