TPL3BIOPHYANI

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Les Travaux Pratiques à l’Université Oran1-Ahmed Ben Bella

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de Biologie

Licence L3 Biologie et Physiologie Animale Semestre1

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T.P. N°01

 Matière: Histologie fonctionnelle

 Intitulé : Histologie des différents segments du tube digestif (Intestin grêle, Estomac et Colon)

 Protocole : Observation microscopique de lames contenants des fragments d’intestin grêle (Jéjunum), d’Estomac et de Colon au grossissent (X10), (X40) puis au grossissent (X100)

 Principe:

- Observer la structure histologique des différents segments (les quatre couches) - Apprécier l’architecture intestinale principalement les replis circulaires de la

muqueuse ou valvules conniventes (présence ou absence), les villosités (microvillosités)…..

 Méthodologie (succincte) :

- Dépôt des lames préparées sous le microscope optique.

- Observation aux grossissements X10, X40 et X100.

Produits chimiques Consommable/Verrerie Petits Matériels

 Huile à immersion

 Ethanol 96%  Lames préparées pour histologie avec préparations des tissus humains (duodenum, jejunum, iléon) estomac, colon.

 Pipettes pasteur (02 boites)  Pissettes (04)

 Poire (05)

T.P. N°02

 Intitulé : Histologie des voies aériennes inférieures de l’appareil respiratoire (trachée, Bronches et Poumons, Alvéoles).

 Protocole : Observation des muqueuses respiratoire de 3 voies aériennes

 Principe: Mettre en évidence la Lumière du tube, Cellules à mucus, cils vibratiles

- Observation microscopique des lames prêtes à l’emploi aux grossissements (X10), (X40) et (X100) de trachée, bronches, alvéoles et poumon.

- Dessiner, légender et titrer les coupes histologiques observées.

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 Ethanol 96% avec préparations des tissus: bronches, trachée, alvéoles et poumon

T.P. N°03

 Intitulé : Histologie du système nerveux

 Protocole :

 Principe: Observation de la matière grise et de la matière blanche d’un cerveau de

mouton

 Bleu de méthylène  Gants en latex (1 boite)

 Lames (4 boites)  Lamelles (4 Boites  Trousses de dissection (10)  Plateaux de dissection (10)

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Licence L3 BPA Semestre1

T.P. N°01

 Matière: Technique d’analyse biologique

 Intitulé : Chromatographie sur couche mince

 Protocole :

 Principe: La chromatographie sur couche mince est une technique analytique

principalement utilisée pour séparer des substances non volatiles, comme les pigments biologiques. La séparation s'effectue grâce à la migration, par capillarité, d'un solvant sur une plaque de chromatographie.

 Méthodologie (succincte): La plaque chromatographique est en général constituée de

deux parties : une couche d'environ 0,25 mm de gel de silice, fixée à une plaque rigide en aluminium (c'est le cas ici), en plastique ou parfois en verre. La fixation est assurée par un liant qui peut être du sulfate de calcium hydraté, de l'amidon ou un polymère organique.

 Solvant chromatographie  Ethanol  Acétone  Colorant; Tartrazine, bleu patenté V  Plaque de silice  Une microalgue verte  Papier absorbant  Une microalgue rouge

 Cuve de migration

T.P. N°02

 Matière: Technique d’analyse biologique

 Intitulé : Chromatographie liquide à haute performance HPLC

 Protocole :

 Principe: La CLHP suit le même principe fondamental que la chromatographie. Les

Différents composants dans l'échantillon ont des affinités variables au matériau adsorbant. Ceci entraîne une différence dans le débit pour chaque composant qui mène à leur séparation pendant qu'ils sortent du fléau. La seule différence est que la vitesse et la sensibilité de la CLHP est beaucoup plus élevée que celle du LC dû à l'application d'une haute pression.

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 Méthodologie (succincte): Chromatographie liquide à haute performance HPLC est

basés sur le partage de l'analyte entre une phase liquide mobile et une phase stationnaire solide très finement diviser pour obtenir un débit satisfaisant, il faut appliquer de fort pression (> 100 bar).

 Solvant: Hexane, méthanol, acétonitrile dichlorométhane, chloroforme.  Méthanol- eau,  Tétrahydrofurane, toluène  Pipette graduée

 Bécher  Appareil HPL Balance de

précision

Licence L3 BPA Semestre2

T.P. N°01

 Matière: Physiologie des grandes fonctions

 Intitulé : Hemolyse

 Protocole :

 Principe:

 Méthodologie (succincte): Etudier le comportement des hématies de rats lorsqu’elles

sont plongées dans des solutions d’osmolarités différentes.

 NACL  Glycérol  Urée  glucose

Tubes à hémolyse

 Gants jetables en latex (1 boite)  Pipettes pasteur

 Tubes à essai (50)

T.P. N°02

 Intitulé : Electrocardiographie

 Protocole :

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 Méthodologie (succincte): Faire un électrocardiogramme et étudier par les

dérivations standards d’Einthoven deux enregistrements (conditions normales puis apnée)

 Coton

 Ethanol 96%  Electrocardiographe

T.P. N°03

 Intitulé : Anatomie du cœur

 Protocole :

 Principe:

- Comprendre l’organisation interne d’un cœur de mouton

- Observation de l’écoulement du sang à travers le artériel et veineux,

 Méthodologie (succincte): Dissection et observation des différentes parties du

cœur :

 Anatomie externe du cœur pour mettre en évidence les ventricules droit et gauche,

les oreillettes droite et gauche, les artères : aorte droite et pulmonaire, le sillon inter-ventriculaire gauche, les vaisseaux coronariens, veines pulmonaires, veine cave, l’artère aorte et l’artère pulmonaire.

 Anatomie interne du cœur : couper à l’aide d’un ciseau dans l’artère pulmonaire et

continuer l’incision dans le ventricule pour mettre en évidence la valvule articulo-ventriculaire, le cordage tendineux, les piliers muscuaires et le myocarde

 Inciser l’aorte et découper vers les ventricules et poursuivre dans l’oreillette.

 Coton  Ethanol 96%

 Gants jetables en latex (1 boite)  Pissettes (04)

 Trousses de dissection (10)

 Plateaux de dissection (10)

T.P. N°04

 Intitulé : Formule leucocytaire

 Protocole :

 Principe:

 Méthodologie (succincte): Réaliser un frottis sanguin et établir la formule leucocytaire.

 Coton  Alcool  Colorant de MAY- Lames (4boites)  Lamelles (4 Boites)  Pissettes (04)

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CRUNWALD (MGG)

 Colorant de GIEMSA  Cristallisoir (10) Porte lame (5)

 Gants jetables (01 boite)  Comptes gouttes (05)

Licence L3 BPA Semestre2

T.P. N°01

 Matière: Endocrinologie fonctionnelle

 Intitulé : Extraction et mise en évidence de la quantité de glycogène présent dans le foie

 Protocole :

 Principe: Le foie est l’organe régulateur de la glycémie. Le glucose est stocké sous

forme du glycogène. Il s’agit de comparer l’absorbance de la solution de glycogène obtenue par l’extraction à celle d’autres solutions de concentrations connues.

 Méthodologie (succincte):

- Peser et couper en petits morceaux 10 g de foie frais

- Faire bouillir le foie dans 100 ml d'eau distillée pendant 2 minutes - Égoutter à l'aide d'une passoire puis le broyer avec un mixeur - Ajouter 50 ml d'eau distillée et faire bouillir 5 minutes

- Filtrer sous vide sur Buchner

- Précipiter le filtrat récupéré avec 5 gouttes d'HCl concentré, (si un précipité important se

- forme, filtrer à nouveau afin d'éliminer l'excès protéique).

- Traiter le filtrat récupéré par 4 fois son volume d'alcool à 95 puis filtrer sous vide - Récupérer le filtre, le laisser égoutter puis reprendre celui-ci avec 5 ml d'eau

distillée

- Tester la présence de glycogène en prenant 3 gouttes du liquide obtenu et rajouter une goutte d'eau iodée*, (on doit obtenir une couleur brun-acajou).

- Eau iodée : dissoudre 1 g d'iode dans 2 g d'iodure de potassium puis compléter à

100 ml avec de l'eau distillée.

- Dosage de l’échantillon selon la méthode de Beer-Lambert

 Glycogène, Eau iodée, alcool à 95%, lugol, acide trichloroacétique TCA à 40%,

 Acide chlorhydrique concentré

 Fiole à vide, Béchers, Éprouvettes, papier filtre, tubes à essai, trompe à vide, passoire.

 Connes jaunes  Cônes bleus

 Balance, Broyeur mortier, tubes de centrifugation, centrifugeuse,

 Colorimètre (L.O 470 nm)  pH mètre

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 Glucagon

 Insuline  Agitateur magnétique Pipettes automatiques

10-100 µl.

T.P. N°02

 Intitulé : Régulation de la thermogénèse par la thyroïde

 Protocole :

 Principe: Réaliser une thyroïdectomie chez le rat Wistar et montrer son impact sur la

thermogénèse reflétée par la mesure de la consommation d’oxygène

 Méthodologie (succincte): Anesthésier au chloral des rats Wistar. Pratiquer l’ablation de

la thyroïde. Apres 15 jours faire des mesures de la consommation d’oxygène.

 Antibiotique local en poudre  Levothyroxine  Chloral  Ether  Béchers 250 ml  Seringues 1ml  Gants  10 respiromètres volumétriques de Jeulin pour rat de 120-150g  01 Balance  02 Thermomètres à affichage digital  Baromètre- Clamps hémostatiques, 1 m de cathéters (Diamètre 2 et 3 mm)  Coton  Planches de contention

T.P. N°03

 Intitulé : Appareil Uro-génital chez un modèle animal (Souris Balb/C)

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 Principe: Dissection de la souris et observation de l’appareil urinaire et génital chez la

souris mâle et femelle.

1. préparation de la dissection de l’animal : la souris

2. Anesthésier la souris par voie intra-péritonéale (IP) : Chaque animal doit être pesé

précisément et sa dose d’anesthésique calculée exactement avant de lui être administrée.

- L’injection intra-péritonéale doit se faire dans le cadran inférieur droit de l’abdomen afin d’éviter tout organe vital. (dans le cas du Pentobarbital : la dose est de 40-50 mg/kg en IP , la durée de l’anesthésie est de 15-60 min et le temps de sommeil est de 120-240 min. (dans le cas de Alpha-Chloralose la dose est de 80-100 mg/kg en IP, la durée de l’anesthésie est de 60-120 min et la durée du sommeil est de 120-180 min.

3. fixation de l’animal : épingler la souris sur le dos à l’aide des épingles enfoncées

obliquement dans les pattes.

4. Mouiller les polis de la souris avec un coton afin qu’ils ne s’éparpillent pas sur les

organes lors de l’ouverture.

5. Ouverture de la cavité thoracique : enlever le diaphragme, décoller le foie et les

poumons.

6. Etude de l’appareil génital

7. Déterminer la différenciation sexuelle.

- Observation de la morphologie externe de la souris (reconnaitre le sexe de la souris : mettre en évidence la verge, les bourses, l’orifice urinaire et l’anus)  Appareil génital mâle : Observer les testicules (petites glandes blanches), les

voies génitales (épididyme), distinguer aussi les glandes annexes comme les vésicules séminales et la prostate.

 Appareil génital femelle : Observer les ovaires situés près des reins ainsi que les voies génitales (vagin, utérus et trompes de Fallope).

8. Schématiser les appareils génitaux et légender les dessins.

 Alpha-Chloralose ou

pentobarbital sodique Seringues à insuline 0,5 ml avec aiguille sertie (50)

 Gants jetables (01 boite)

 Trousses à dissection (10)  Planches à dissection (10).

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 Intitulé : Endocrinologie sexuelle du rat femelle

 Protocole :

 Principe: Le cycle sexuel ou œstral dont la durée varie en fonction de l’espèce, peut être

divisé en quatre périodes correspondant à différentes phases de l’activité ovarienne.  le proestrus : période de maturation folliculaire (phase folliculinique) ; un ou

plusieurs follicules sont en voie de maturation ; chez la ratte il dure un jour.  l’oestrus: état physiologique des femelles de mammifères qui les pousse à

rechercher l’accouplement.

 le metoestrus : formation et fonctionnement du corps jaune avec installation d’un état prégravidique de l’utérus (phase lutéale) ; il y’a transformation des follicules en corps jaunes à la suite de l’ovulation.

 le dioestrus : période de repos sexuel correspondant à la lutéolyse, cette phase peut être très longue

Chez la rate, les stades du cycle sont facilement identifiables cytologiquement à partir de frottis vaginaux.

- Anesthésier la rate par voie intra-péritonéale dans le cadran inférieur droit de l’abdomen afin d’éviter tout organe vital. (Pentobarbital : la dose est de 40-50 mg/kg en IP).

- Introduire un écouvillon stérile dans le vagin de la rate ensuite racler délicatement.

- Réaliser un frotti fixé sur lame suivi d’une coloration au bleu de méthylène (laisser environ 20-30 min).

- Rinçage et séchage.

- Observation microscopique aux grossissements (X40) puis au (X100).

- Le but de cette manipulation et de mettre en évidence les cellules présentes dans le frottis afin de déterminer la phase du cycle vaginal chez la rate.

 Bleu de methyléne  Ecouvillons stérile (20)

 Lames en verre (1 boite)  Lamelles (1 boite)  Seringues à insuline (20)

 Balance électronique

Licence L3 BPA semestre 2

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 Matière: Physiologie cellulaire et moléculaire

 Intitulé : Comparaison entre une cellule humaine et une cellule végétale

 Protocole :

 Principe: Observer les cellules humaines et végétales au microscope

- A l'aide d'un abaisse langue gratté un peu de la muqueuse interne de la joue et la

déposer sur une lame, et la recouvrir avec le rouge de neutre pour l'observation au microscope.

- A partir d'un oignon rouge, prend a l'aide d'une pince prendre une écaille de la face interne, faire une coloration au rouge neutre pour l'observation au microscope

 Rouge neutre  Verre à montre

 Lame et lamelle  Scalpels microscope

T.P. N°02

 Matière: Physiologie cellulaire et moléculaire

 Intitulé : Etude des échanges cellulaire (Osmose)

 Protocole :

 Principe: Observer les phénomènes de la turgescence, plasmolyse et déplasmolyse

- Sur une écaille d'oignon, on prélève un fragment d'épiderme (il doit être translucide), puis on l'étale soigneusement sur une lame, dans une goutte de rouge neutre dilué. On recouvre le tout d'une lamelle en évitant la formation de bulles d'air.

- Observation à fort grossissement : On distingue très bien les 3 constituants d'une cellule : la membrane, le cytoplasme et le noyau.

- L'intérieur de la cellule est occupé par une énorme vacuole colorée en rose rouge par le rouge neutre, qui occupe presque tout le volume de la cellule, car elle est gonflée d'eau colorée qui est entrée dans la cellule par osmose . On dit que ces cellules sont turgescentes.

- Sur la même lame, au contact de la lamelle, ajouté 1 ou 2 gouttes de solution concentrée de saccharose à 40%. De l'autre côté de la lamelle, on aspire la solution de rouge neutre avec un buvard ou papier filtre. Les cellules d'oignon sont maintenant en milieu très concentré. Après 2 à 3 minutes, on constate que les vacuoles sont devenues très petites et plus colorées. Il y a eu sortie d'eau vers le milieu extérieur, plus concentré. Les cellules sont plasmolysées.

-Apres la plasmolyse on ajoute de l'eau pure ou déminéralisée pour observer la déplasmolyse.

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 Une solution glucosée Hypotonique (20%)

 Une solution glucosée Hypertonique (45%)  Nacl  Rouge neutre  Ciseaux fins  Verre a montre  Lames  Des lamelles  Un scalpel  Une pipette  Une pince  Papier absorbant ou filtre  Béchers  Pipettes graduée  Microscope  Un scalpel  Balance de précision

Licence L3 BPA Semestre2

T.P. N°01

 Matière : Physiologie de la nutrition

 Intitulé : Manipulation sur le rat rendu obèse

 Protocole :

 Principe: Calcul de l’IMC et de l’indice de Lee, poids relatifs des organes

 Méthodologie (succincte): Mesure des paramètres anthropométriques, pesée des rats,

anesthésie, dissection, pesée et conservation des organes prélevés.

 Chloral.  Nacl.  Formol tamponné à 10%. Seringues 40 x (1ml). Béchers 2 x (50ml).

 Gants jetables en latex (1 boite).

 Balance électronique.  Balance de précision.  Mètre ruban.

 Trousse à dissection.  Planche à dissection.

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T.P. N°02

 Matière: Physiologie de la nutrition

 Intitulé : Test de tolérance au glucose par voie orale

 Protocole :

 Principe: Provoquer une hyperglycémie chez le rat Wistar.

 Méthodologie (succincte): Administration d’une charge orale en glucose, cinétique des

variations de la glycémie.

D-Glucose. Bandelettes pour glucomètre (2 boites de 50).

Sonde métallique pour gavage.

Seringues 40 x (1ml).

Becher (50ml).

Coton.

Alcool.

Gants jetables en latex (1 boite).

Glucomètre.

Boite à contention.

T.P. N°03

 Intitulé : Histologie du foie et du tissu adipeux

 Protocole :

 Principe: Histologie du foie et du tissu adipeux du rat Wistar rendu obèse.

- Coloration des lames préalablement montées.

- Mise au point et observation microscopique.

Colorants:

Hématoxyline et éosine

Cuve de coloration en verre.

Lames et lamelles.

Microscopes optiques.

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 Intitulé : Index glycémique  Protocole :

 Principe: Mesurer le pouvoir glycémiant de l’aliment à tester chez le rat.

- Administration de l’aliment ou du glucose par voie orale.

- Mesure de la glycémie chaque 30 min pd 2 heures

- Calculs de l’index glycémique.

Glucose

Amidon

Bandelettes pour glucomètre (2 boites de 50). Lancettes (2boites). Becher (50ml). Coton. Alcool. Glucomètre.

T.P. N°05

 Intitulé : Dosage des produits dans différents échantillons : Technique de

Lowry/Technique de Bradford

 Protocole :

 Principe: En milieu alcalin, le complexe formé par les ions Cu2+ et les groupements

tyrosine et tryptophane des protéines est réduit par le réactif de Folin. Il se développe une coloration bleue dont l’intensité est proportionnelle à la quantité de protéines de l’échantillon.

NaOH.

Na2CO3 anhydre. CuSO4.

Tartrate de potassium.

Sodium anhydre.

Gants jetables en latex (1 boite).

Tubes à hémolyse (5ml) (1 sachet)

Spatules 03

Portoir 03

Embouts bleus (cônes de pipettes) :(1

Balance de précision. Micropipettes 01 x (p100-1000µl et p10-100µl).  Spectrophotometre. Vortex.

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Serum albumine bovine.

Réactif de folin.

sachet de 1000)

Embouts jaunes (cônes de pipettes) :(1 sachet de 1000)

Microcuves en verre (2 boites)

Fioles jaugés 2X (25ml, 50ml, 100ml)