Étude du potentiel nutraceutique de la culture du
houblon au Québec
Thèse
Christiana Sarraf
Doctorat en biologie végétale
Philosophiæ doctor (Ph.D.)
Résumé
Le houblon (Humulus lupulus L.) est cultivé essentiellement pour ses inflorescences femelles appelées cônes et est utilisé dans les domaines brassicole et nutraceutique. Les principaux constituants des cônes sont les acides amers (acides α et β), connus comme agents d'amertume de la bière et ayant des propriétés anti-microbiennes, et le xanthohumol connu comme agent chimiopréventif du cancer. De plus, les cônes contiennent des composés phénoliques dont des proanthocyanidines connus pour leurs propriétés préventives contre les maladies chroniques. Bien que ces composés s'accumulent essentiellement dans les cônes, ils peuvent aussi s'accumuler sur la face inférieure des jeunes feuilles dans les poils glandulaires. Les feuilles et les tiges sont considérées comme des co-produits et sont très peu utilisées. Ce projet nous a permis d'étudier le potentiel agronomique et de quantifier les molécules reconnues pour leur action bénéfique sur la santé, de neuf cultivars de houblon cultivés pour la première fois au Québec. Nous avons étudié l'effet de la méthode de conservation sur le contenu en molécules bioactives des cônes et des feuilles après 12 mois d'entreposage. En plus, nous avons réussi à valoriser les co-produits du houblon et à produire des extraits de cônes, de feuilles et de tiges. Nos résultats ont montré que les feuilles et les tiges représentent plus de 50 % du poids sec total des plants et contiennent des quantités importantes de composés phénoliques dont des proanthocyanidines. Après 12 mois d'entreposage, des pertes importantes de xanthohumol et d'acides α et β ont été détectées dans les cônes secs. Par contre, la composition des cônes congelés est restée constante. La congélation n'est pas nécessaire pour conserver les feuilles puisque les concentrations de composés phénoliques totaux et de proanthocyanidines ne diminuent pas significativement dans les feuilles sèches. Les conditions optimales d'extraction ont été déterminées et sont de deux heures à 30 °C avec de l'éthanol 70 %, pour un ratio solide:liquide de 1:15 pour les cônes et les tiges et un ratio de 1:40 pour les feuilles. Les extraits ont été concentrés en utilisant une résine adsorbante et en utilisant l'huile comme co-solvant et trois extraits différents ont été obtenus.
Abstract
Hops (Humulus lupulus L.) is grown primarily for its female inflorescences known as hop cones and is used for nutraceutical purposes and for brewing. Cones contain mainly hop bitter acids (α- and β- acids) and xanthohumol. Hop bitter acids are known for their bitter taste in beer and for their anti-microbial properties while xanthohumol is known for its chemopreventive properties. In addition, cones contain proanthocyanidins and polyphenols known for their preventive properties against chronic diseases. Although these compounds accumulate mainly in the cones, they can also accumulate on the underside of young leaves. Leaves and stems are considered as co-products and are rarely used. In this work, we studied the agronomic potential and we quantified the bioactive molecules present in cones, leaves and stems of nine hop cultivars, grown for the first time in Quebec. We also studied the effect of the storage method on cones and leaves bioactive content after 12 months of storage. In addition, we successfully valorized hop co-products and we produced cones, leaves and stems extracts. Our results showed that leaves and stems represent more than 50 % of the total dry weight of plants and contain substantial amounts of total polyphenols and proanthocyanidins. After 12 months of storage, significant losses of xanthohumol and α- and β- acids were detected in dried cones. In contrast, the composition of frozen cones remained constant. Freezing was not necessary to store leaves since the concentrations of total polyphenols and proanthocyanidins did not decrease, significantly, in dried leaves. The extraction parameters were optimized and the maximum extraction yield for the molecules of interest were obtained at 30 °C, 2 h of extraction, an ethanol concentration of 70 % and a solid: liquid ratio of 1:15 for cones and stem and 1:40 for the leaves. Extracts were concentrated by adsorbtion and by using oil as co-solvent and three different hop extracts were obtained.
Table des matières
Résumé ... iii
Abstract ... v
Table des matières ... vii
Liste des tableaux ... xi
Liste des figures ... xiii
Liste des abréviations ... xvii
Remerciements ... xix Avant-propos ... xxi Chapitre 1 : Introduction ... 1 1.1 Le houblon ... 1 1.1.1 Composés du houblon ... 2 1.1.1.1 Acides α et β ... 3
1.1.1.2 Xanthohumol et prénylflavonoïdes connexes ... 4
1.1.1.3 Proanthocyanidines ... 5
1.1.2 Effets bénéfiques du houblon sur la santé ... 6
1.1.2.1 Phytothérapie ... 6 1.1.2.2 Fabrication de la bière ... 7 1.1.2.3 Antibactérien et antiviral ... 8 1.1.2.4 Prévention du cancer ... 8 1.1.2.5 Phytoestrogène ... 9 1.1.2.6 Antioxydant ... 9 1.1.3 Culture du houblon ... 10 1.1.3.1 Biomasse végétale ... 10 1.1.3.2 Systèmes de culture ... 12 1.1.3.3 Conditions de culture ... 14 1.1.4 Procédés de transformation ... 15 1.1.4.1 Séchage ... 15 1.1.4.2 Entreposage ... 16 1.1.4.3 Extraction ... 17
1.2 Les composés phénoliques ... 18
1.2.1 Rôle des composés phénoliques dans les plantes ... 19
1.2.2 Classification des composés phénoliques ... 20
1.2.2.1 Flavonoïdes ... 21
1.2.2.1.1 Flavonols ... 22
1.2.2.1.3 Flavan-3-ols ... 23
1.2.2.1.4 Anthocyanes ... 26
1.2.2.1.5 Flavanones ... 27
1.2.2.1.6 Isoflavones ... 27
1.2.2.2 Non flavonoïdes ... 27
1.2.2.2.1 Acides phénoliques simples ... 28
1.2.2.2.2 Acides hydroxycinnamiques ... 29
1.2.2.2.3 Stilbènes ... 30
1.2.3 Voies de synthèse ... 31
1.2.3.1 Biosynthèse des flavonoïdes ... 33
1.2.3.2 Biosynthèse des non flavonoïdes ... 35
1.2.4 Effets sur la santé ... 35
1.2.4.1 Activité antioxydante ... 36
1.2.4.2 Activité anticancéreuse ... 37
1.2.4.3 Prévention des maladies cardiovasculaires ... 39
1.3 Hypothèses et objectifs ... 39
Chapitre 2 : Yield and chemical composition of cones and leaves of hops (Humulus lupulus L.) grown in Québec, Canada ... 41
2.1 Résumé ... 43
2.2 Abstract ... 45
2.3 Introduction ... 47
2.4 Materials and methods ... 48
2.4.1 Plant material ... 48
2.4.2 Chemicals ... 48
2.4.3 Extraction ... 48
2.4.4 Analytical procedure ... 49
2.4.4.1 Total polyphenols ... 49
2.4.4.2 Xanthohumol, desmethylxanthohumol, α- and β-acids ... 49
2.4.4.3 Proanthocyanidins ... 49
2.4.5 Statistical analysis ... 50
2.5 Results ... 50
2.5.1 Yield ... 50
2.5.2 Prenylated chalcones, bitter acids, proanthocyanidins and total polyphenols content in cones ... 51
2.5.3 Prenylated chalcones, bitter acids, proanthocyanidins and total polyphenols content in leaves ... 52
2.6 Discussion and conclusion ... 53
2.7 Acknowledgements ... 54
Chapitre 3 : Yield and chemical composition of cones, leaves and stem of nine hop (Humulus lupulus L.) cultivars ... 55
3.1 Résumé ... 57
3.2 Abstract ... 59
3.3 Introduction ... 61
3.4.1 Plant material and growing conditions ... 62
3.4.2 Chemicals ... 63
3.4.3 Extraction ... 63
3.4.4 Analytical procedure ... 64
3.4.4.1 Total polyphenols ... 64
3.4.4.2 Xanthohumol, desmethylxanthohumol, 8-prenylnaringenin and α- and β-acids 64 3.4.4.3 Proanthocyanidins ... 65
3.4.5 Statistical analysis ... 65
3.5 Results ... 65
3.5.1 Yield ... 65
3.5.2 Chemical composition of cones ... 66
3.5.3 Chemical composition of leaves ... 67
3.5.4 Chemical composition of stems ... 68
3.5.5 Yield and chemical composition ... 69
3.5.6 Effect of the conservation method on cones composition ... 70
3.5.7 Effect of the conservation method on leaves composition ... 71
3.6 Discussion and conclusion ... 73
3.7 Acknowledgements ... 76
Chapitre 4 : Production of ethanolic extracts from hop (Humulus lupulus L.) cones, leaves and stems - Part 1: Optimization of prenylated chalcones, bitter acids, proanthocyanidins and total polyphenols extraction ... 77
4.1 Résumé ... 79
4.2 Abstract ... 81
4.3 Introduction ... 83
4.4 Materials and methods ... 84
4.4.1 Plant material ... 84
4.4.2 Chemicals ... 85
4.4.3 Extraction optimization ... 85
4.4.3.1 Cones extraction ... 85
4.4.3.1.1 Experiment 1: Grinding and number of extraction ... 85
4.4.3.1.2 Experiment 2: Solid:liquid ratio and ethanol concentration ... 85
4.4.3.1.3 Experiment 3: Extraction time and temperature ... 86
4.4.3.2 Leaves and stems extraction and optimization of the solid:liquid ratio ... 86
4.4.4 Analytical procedure ... 86
4.4.4.1 Total polyphenols ... 86
4.4.4.2 Desmethylxanthohumol, xanthohumol, α- and β-acids ... 87
4.4.4.3 Proanthocyanidins ... 87
4.4.5 Statistical analysis ... 87
4.5 Results and discussion ... 88
4.5.1 Cones extraction ... 88
4.5.1.1 Effect of grinding and number of extraction ... 88
4.5.1.2 Effect of solid:liquid ratio and ethanol concentration ... 90
4.5.1.3 Effect of extraction time and extraction temperature ... 95
4.5.2 Leaves and stems extraction ... 99
4.5.2.1 Comparison of ethanol extraction and water extraction of proanthocyanidins and total polyphenols in leaves and stems ... 103
4.5.2.2 Optimization of the solid:liquid ratio ... 104
4.6 Acknowledgements ... 106
Chapitre 5 : Production of ethanolic extracts from hop (Humulus lupulus L.) cones, leaves and stems - Part 2: Concentration of hop extracts by adsorption and oil ... 107
5.1 Résumé ... 109
5.2 Abstract ... 111
5.3 Introduction ... 113
5.4 Materials and methods ... 114
5.4.1 Plant material ... 114
5.4.2 Chemicals ... 114
5.4.3 Separation of cones compounds ... 115
5.4.4 Leaves and stem extract ... 115
5.4.5 Cones extract ... 115
5.4.6 Whole plant extract ... 116
5.4.7 Pilot scale essay ... 116
5.4.8 Canola oil reuse ... 117
5.4.9 Analytical procedure ... 117
5.5 Results and discussion ... 117
5.5.1 Separation of cones compounds ... 117
5.5.2 Leaves and stem extracts ... 118
5.5.3 Cones extract ... 121
5.5.4 Whole plant extract ... 123
5.5.5 Polyphenol profile of pilot scale extracts ... 124
5.5.6 Oil reuse ... 125
5.6 Acknowledgments ... 130
Chapitre 6 : Conclusion générale ... 131
Annexe : Optimization of hot air drying of hop leaves ... 137
Liste des tableaux
Table 2.1. Fresh and dry weight (FW and DW) and percentage of dry matter (% DM) of cones, leaves and stems of the plants of each cultivar. ... 51 Table 2.2. Amounts (% DM) of desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α- and β-acids, proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols content (TPC) in cones. ... 51 Table 2.3. Amounts (%DM) of desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α- and β-acids, proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols content (TPC) in leaves. .... 52 Table 3.1. Yield (kg/ha) of dried cones, leaves and stem of each cultivar ... 66 Table 3.2. Significance levels of the content of 8-prenylnaringenin (8-PN), desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), cohumulone (α-1), humulone + adhumulone (α-2), colupulone (β-1), lupulone + adlupulone (β-2), α- and β-acids, proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols (TPC) in cones, leaves and stem of the 9 cultivars ... 67 Table 3.3. Concentrations of 8-prenylnaringenin (8-PN), desmethylxanthohumol (DMX),
xanthohumol (XN), cohumulone (α-1), humulone + adhumulone (α-2), colupulone (β-1), lupulone + adlupulone (β-2), α- and β-acids, proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols (TPC) in cones ... 67 Table 3.4. Concentrations of 8-prenylnaringenin (8-PN), xanthohumol (XN), cohumulone (α-1), α-acids, proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols (TPC) in leaves ... 68 Table 3.5. Concentrations of proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols content (TPC) in stem ... 69 Table 3.6. Yield of cones (kg/ha) and content (kg/ha) of 8-prenylnaringenin (8-PN), desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α-acids, β-acids, proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols (TPC) ... 69 Table 3.7. Yield of leaves and stem (kg/ha) and content (kg/ha) of proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols (TPC) ... 70 Table 3.8. ANOVA of desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α-acids,
β-acids, total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) in dried and frozen cones ... 70 Table 3.9. ANOVA of desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α-acids,
β-acids, total polyphenols (TPC) and proanthocyanidins (PAC) in dried and frozen leaves ... 72
Table 3.10. Comparison of the degree of polymerization of proanthocyanidins (concentrations in ppm) in dried leaves of Brewers Gold and Nugget before and after 12 months of storage ... 73 Table 4.1. ANOVA results for desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN),
α-acids, β-α-acids, total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) in cones extraction ... 88 Table 4.2. Concentration (%DW) of desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN),
α-acids, β-acids, proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols content (TPC) in cones extract using ethanol and methanol as solvents ... 99 Table 4.3. ANOVA results for the total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) in the ethanol extraction of leaves and the water extraction of leaves and stem experiments ... 100 Table 4.4. Effect of extraction temperature and time on the extraction of proanthocyanidins of different degree of polymerization (concentrations in ppm) from hop leaves using water as solvent ... 101 Table 4.5. Concentrations (%DW) of total polyphenols content (TPC) and
proanthocyanidins (PAC) in leaves and stems using water or ethanol as a solvent ... 103 Table 4.6. Comparison between water and ethanol extraction of proanthocyanidins of
different degree of polymerization (concentrations in ppm) ... 104 Table 4.7. Effect of solid:liquid ratio on the concentrations of desmethylxanthohumol
(DMX), xanthohumol (XN), α-acids, β-acids, total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) and on the total extraction yield in cones, leaves and stems extracts ... 105 Table 5.1. Comparison of the concentrations of xanthohumol (XN), α-acids, β-acids, total polyphenols content (TPC), and proanthocyanidins (PAC) in the oil extracts and in the enriched by XAD7HP resin extracts of cones and whole plants ... 124 Table 5.2. Phenolic composition (mg/g) of leaves and stem extract and cones concentrated extract ... 125
Liste des figures
Figure 1.1. Structure des acides α et β (De Keukeleire et al., 2003) ... 3
Figure 1.2. Isomérisation des acides α en acides iso-α (De Keukeleire, 2000) ... 4
Figure 1.3. Isomérisation des chalcones en flavanones ... 5
Figure 1.4. Plant de houblon ... 11
Figure 1.5. Différentes parties d'un cône de houblon; 1: cône entier, 2: bractées, 3: bractéoles, 4: glande lupuline, 5: axe central (Rybacek, 1991) ... 12
Figure 1.6. Structure de base d'un flavonoïde (1) et structures chimiques des différentes sous-classes des flavonoïdes (2-13) (Crozier et al., 2009) ... 22
Figure 1.7. Structures chimiques de certains flavan-3-ols (Crozier et al., 2009) ... 24
Figure 1.8. Structure des procyanidines A2 et B2 (Hummer and Schreier, 2008) ... 25
Figure 1.9. Acides phénoliques de la série benzoïque (Crozier et al., 2009) ... 28
Figure 1.10. Acides phénoliques de la série cinnamique (Crozier et al., 2009) ... 30
Figure 1.11. Structure du resvératrol (Moreno and Peinado, 2012) ... 31
Figure 1.12. Schéma représentant les principales voies de biosynthèse et les enzymes clés impliquées dans la biosynthèse des tanins hydrolysables, de l'acide salicylique, des acides hydroxycinnamique et 5-caffeoylquinique (PAL: phénylalanine ammonia-lyase ; BA2H: acide benzoïque 2-hydroxylase ; C4H: cinnamate 4-hydroxylase ; COMT-1: acide cafféique/5-hydroxyférulique O-méthyltransférase ; 4CL: p-coumarate:CoA ligase ; F5H: férulate 5-hydroxylase ; GT: galloyltransférase ; ACoAC: acétylCoA carboxylase) (Crozier et al., 2006) ... 32
Figure 1.13. Origine de la biosynthèse des flavonoïdes (Crozier et al., 2006) ... 33
Figure 1.14. Schéma simplifié de la biosynthèse de différentes classes de flavonoïdes (Morreel et al., 2006) ... 34
Figure 2.1. Correlation between total polyphenols content (TPC) and yield of dried cones (a) and leaves (b) ... 53 Figure 3.1. Variation of the concentrations of desmethylxanthohumol (a), xanthohumol (b), α-acids (c), β-acids (d), total polyphenols (e) and proanthocyanidins (f) in the dried
cones of Brewers Gold and Nugget after 12 months of storage. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars). ... 71 Figure 3.2. Comparison of the concentrations of xanthohumol, β-acids and
proanthocyanidins in the dried (a, b and c) and in the frozen (d, e and f) leaves of Brewers Gold and Nugget after 12 months of storage. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars). ... 72 Figure 4.1. Concentrations of desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α-acids, β-acids, total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) in whole cones (a) and in ground cones (b) using one step (0.5 g + 15 mL) or two-step extraction (0.5 g + 2x7.5 mL). Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars). ... 89 Figure 4.2. Effect of ethanol concentration on the concentration (%DW) of
desmethylxanthohumol (DMX) and xanthohumol (XN) for solid: liquid ratios of 1:10, 1:20 and 1:40. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars). ... 91 Figure 4.3. Effect of ethanol concentration on the concentration (%DW) of α- and β-acids for solid: liquid ratios of 1:10, 1:20 and 1:40. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars). ... 92 Figure 4.4. Effect of ethanol concentration on the concentration (%DW) of total
polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) for solid: liquid ratios of 1:10, 1:20 and 1:40. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars). ... 93 Figure 4.5. Effect of extraction time on the concentration of desmethylxanthohumol (DMX) and xanthohumol (XN) for extraction temperatures of 30 °C, 40 °C, 50 °C and 60 °C. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars). ... 96 Figure 4.6. Effect of extraction time on the concentration of α- and β-acids for extraction temperatures of 30 °C, 40 °C, 50 °C and 60 °C. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars). ... 97 Figure 4.7. Effect of extraction time on the concentration of total polyphenols content
(TPC) and proanthocyanidins (PAC) for extraction temperatures of 30 °C (a), 40 °C (b), 50 °C (c) and 60 °C (d). Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars). ... 98 Figure 4.8. Effect of extraction time on the concentration of total polyphenols content
of 60 °C, 70 °C, 80 °C and 90 °C. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars). ... 100 Figure 4.9. Effect of extraction temperature (a) and extraction time (b) on the concentration of total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) in stems for water extraction. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars). ... 102 Figure 5.1. Concentrations of desmethyxanthohumol (DMX) and xanthohumol (XN) (a), α- and β-acids (b), and total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) (c) in water, ethanol 40 % and ethanol 70 % extracts. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars). ... 119 Figure 5.2. Enrichment of leaves and stem extracts in total polyphenols content (TPC) (a) and proanthocyanidins (PAC) (b) by Amberlite XAD-7HP resin. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars). ... 120 Figure 5.3. Concentrations of desmethylxanthohumol (DMX) and xanthohumol (XN) (a), α- and β-acids (b), and total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) (c) in the ethanolic cones extract (initial extract) and in the oil and concentrated extract fractions after ethanol evaporation. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars). ... 122 Figure 5.4. Enrichment of cones concentrated extract in xanthohumol (XN), α-acids,
β-acids, total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) by Amberlite XAD-7HP resin. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars). ... 123 Figure 5.5. Variation of the concentrations of desmethylxanthohumol (DMX) and
xanthohumol (XN) (a), α- and β-acids (b), and total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) (c) in cones oil extract with oil reuse. ... 126 Figure 5.6. Variation of the concentrations of desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α-acids, β-acids, total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) in concentrated whole plant extracts (a, c and e) and in whole plant oil extract (b,d and f) with oil reuse. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars). ... 128
Liste des abréviations
8-PN : 8-prénylnaringénine α-1 : Cohumulone α-2 : Humulone + adhumulone β-1 : Colupulone β-2 : Lupulone + adlupulone CO2 : Dioxyde de carbone CoA : Coenzyme A DMX: DesméthylxanthohumolHPLC : High-performance liquid chromatography
INAF : Institut sur la nutrition et les aliments fonctionnels
LC-TOF-MS : Liquid chromatography - time-of-flight - mass spectrometry MeOH : Méthanol
PAC : Proanthocyanidines
PAL : Phénylalanine ammonia-lyase
TPC : Total polyphenols content (contenu en composés phénoliques totaux)
UHPLC-PDA : Ultra-high-performance liquid chromatography with photo-diode array detection
UPLC-MS/MS : Ultra-performance liquid chromatography tandem mass-spectrometry UV : Ultra violet
VIH : Virus de l'immunodéficience humaine XN: Xanthohumol
Remerciements
Je tiens à remercier mon directeur de recherche, Dr. Yves Desjardins, de m'avoir accueillie dans son laboratoire. Je vous remercie pour vos judicieux conseils et votre vision critique de mes travaux. Je vous remercie également d’avoir dirigé, orienté et suivi la progression de mon projet de recherche. Mon travail avec vous m'a permis d'acquérir une expérience enrichissante et précieuse dans le domaine de la recherche.
Je tiens aussi à remercier mon codirecteur, Dr. André Gosselin, pour son soutien et sa disponibilité. Je vous remercie pour votre encouragement continuel et pour votre présence, surtout dans les moments difficiles. Je vous remercie d'avoir pris le temps de m'écouter et de me comprendre. Discuter avec vous dans votre bureau, pour quelques minutes, était suffisant pour que je reparte avec beaucoup d'optimisme et de courage. C’est votre aide et votre encouragement qui m'ont permis de persévérer et de finir mon doctorat. J’ai appris énormément de vous, tant au niveau professionnel qu'au niveau personnel. Vous m'avez montré comment organiser les priorités et comment confronter les problèmes avec un esprit positif pour que tout aille bien.
Je tiens aussi à remercier Dr. Paul Angers de codiriger une partie de mes travaux et d'avoir partagé avec moi ses connaissances en chimie. Je voudrais, de même, remercier Monsieur Jean Gosselin et Monsieur Guillaume Gosselin, propriétaires de Houblonnière Gosselin, d'avoir accepté que je réalise une partie de mon projet dans leur houblonnière et d'apporter une attention particulière à mes parcelles expérimentales.
J'ai eu l'occasion de travailler au sein d'une équipe de recherche riche et dynamique. Je voudrais remercier Pascal Dubé, professionnel de recherche dans le laboratoire de Dr. Yves Desjardins, pour son aide précieuse, sa gentillesse et sa disponibilité à partager ses compétences et son expérience en chimie. Mes remerciements vont aussi à Sébastien Léonhart, directeur scientifique de Nutra Canada, pour ses conseils et ses directives et d'avoir guidé l'aspect industriel du projet. Je voudrais, de même, remercier Dr. Ashraf Badr et Dr. Stéphanie Dudonné, professionnels de recherche, pour leur support scientifique et d'avoir pris le temps de répondre à mes questions. Je suis particulièrement reconnaissante de l’aide que m’ont apporté Thomas Lécurieux et Margot Delfour dans mes travaux lorsque
je les ai encadrés dans leurs stages. Je tiens aussi à nommer les autres membres de mon équipe, avec qui j’ai partagé de bons moments : Véronique, Maëlle, Minty, Kevin, Ana Sofia, Jérémie et Neda.
Ces travaux ont été réalisés grâce à une aide financière du programme de soutien à l’innovation en agroalimentaire du Ministère de l’Agriculture, des Pêcheries et de l’Alimentation (MAPAQ) et d'Agriculture et Agroalimentaire Canada (AAC), et grâce à deux partenaires industriels : Nutra Canada et Houblonnière Gosselin. Je suis reconnaissante aussi au FQRNT-CRSNG pour leur soutien financier et de m'avoir attribuée la bourse BMP Innovation.
Je voudrais aussi remercier mes parents, Lucia et Toufic, pour être toujours à mes côtés. Je vous remercie pour votre support, votre confiance et votre amour. C'est grâce à vous que je suis devenue la personne que je suis aujourd'hui. Je vous dédie ce mémoire et je vous promets d'apporter toujours le succès et la fierté. Je remercie aussi mes soeurs Marianne, Luciana et Zeina qui me donnent plein d'énergie, de joie et d'amour.
Durant ces quatre années d'études, j'ai rencontré un homme formidable qui a changé ma vie et m'a donné l'amour, la sécurité et la confiance. Merci Alexey de m'avoir choisi pour bâtir ensemble notre château, notre famille, qui est plus forte que tout. Notre amour a fructifié rapidement en un beau garçon qui soufflera sa première bougie bientôt. Serge, tu m'as appris la vraie signification du bonheur et qu'un sourire peut faire toute la différence. Je remercie Dieu chaque jour de m'avoir donné un mari si compréhensif et chaleureux et un enfant si heureux et intelligent.
Je remercie aussi tous mes amis pour leur support, leur gentillesse et leur aide. Je tiens surtout à remercier Catherine, Stéphanie et Ysela pour être non seulement des amies mais des soeurs pour moi. Je nomme aussi Julien, Shyam, Cheslav, Alina, Sergey et Robert. J'apprécie notre sincère amitié malgré que nous venions de sept pays différents.
Avant-propos
Cette thèse comprend une introduction et une conclusion générale (chapitres 1 et 6), ainsi que quatre chapitres principaux (2 à 5) rédigés et présentés sous forme d’articles scientifiques et une annexe. Ma contribution à chacun des articles se résume comme suit :
Chapitre 2 : Agronomic and nutraceutical potential of hops (Humulus lupulus L.) grown in Québec, Canada. (2013) Acta Hort. (ISHS) 1010:155-161. J'ai récolté les
plants qui ont été plantés, avant le début de mon projet, à la Houblonnière Gosselin. J'ai mesuré les poids frais et sec de chaque partie des plants après les avoir séparés manuellement à la salle d'empotage au Pavillon Des Services et j'ai effectué la partie analytique dans le laboratoire de Dr. Desjardins à l'INAF. J'ai analysé les données, effectué les analyses statistiques à partir des données brutes obtenues et j’ai rédigé entièrement l'article sous la supervision de mon directeur et de mon codirecteur de recherche. Cet article a été publié en 2013.
Chapitre 3 : Yield and chemical composition of cones, leaves and stem of nine hop (Humulus lupulus L.) cultivars. Cet article a été corrigé par Dr. André Gosselin et Dr.
Yves Desjardins et est en cours de soumission à la revue Scientia Horticulturae. J'ai établi mes parcelles expérimentales, planté les rhizomes avec l'aide de Thomas Lécurieux, récolté et analysé les plants. J’ai analysé les données, effectué les analyses statistiques à partir des données brutes obtenues et j’ai rédigé entièrement l'article sous la supervision de mon directeur et de mon co-directeur de recherche.
Chapitre 4 : Production of ethanolic extracts from hop (Humulus lupulus L.) cones, leaves and stems - Part 1: Optimization of prenylated chalcones, bitter acids, proanthocyanidins and total polyphenols extraction. Cet article a été corrigé par Dr.
André Gosselin et Dr. Yves Desjardins et est en cours de soumission à la revue Journal of Agricultural and Food Chemistry. J'ai réalisé les expériences, analysé les données, effectué les analyses statistiques à partir des données brutes obtenues et j’ai rédigé entièrement l'article sous la supervision de mon directeur et de mon co-directeur de recherche et la contribution de Dr. Paul Angers.
Chapitre 5 : Production of ethanolic extracts from hop (Humulus lupulus L.) cones, leaves and stems - Part 2: Concentration of hop extracts by adsorption and oil. Cet
article a été corrigé par Dr. André Gosselin et Dr. Yves Desjardins et est en cours de soumission à la revue Journal of Agricultural and Food Chemistry. J'ai planifié et supervisé les expériences. Une grande partie des expériences a été faite par Margot Delfour dans le cadre de son stage de Maîtrise. J'ai effectué les analyses statistiques et j'ai rédigé entièrement l'article sous la supervision de mon directeur et de mon co-directeur de recherche et la contribution de Dr. Paul Angers.
Chapitre 1 : Introduction
1.1 Le houblon
Le houblon (Genre Humulus L.) est une plante pérenne faisant partie de la famille des Cannabinacées dans l’ordre des Urticales. Le houblon sauvage a été classifié, en fonction de la morphologie des feuilles et de la distribution géographique, en 5 groupes taxonomiques: l’espèce lupulus pour le houblon Européen, l’espèce cordifolius pour le houblon Japonais et les espèces neomexicanus, pubescens et lupuloides pour le houblon Nord Américain (Patzak et al., 2010). Seul Humulus lupulus var. lupulus L. a un usage brassicole (Neve, 1991).
C'est une plante dioïque cultivée dans la plupart des zones tempérées du monde, essentiellement pour ses inflorescences femelles appelées cônes (Callemien et al., 2005; Li and Deinzer, 2006). Les éléments essentiels des cônes matures sont les trichômes glandulaires, appelées glandes lupulines, qui contiennent le lupulin, une poudre jaunâtre et résineuse (Hampton et al., 2002; Li and Deinzer, 2006). Cette substance contient des acides amers, des huiles essentielles et des flavonoïdes utilisés principalement dans l'industrie brassicole, mais aussi dans les recherches biomédicales (Kavalier et al., 2011).
La culture du houblon est connue en Europe depuis des milliers d'années. On pense que le houblon a été cultivé pour la première fois en Allemagne au 8ème siècle après J.C.
(Gerhauser, 2005b). La culture du houblon en Amérique du Nord a débuté au 17ème siècle et
la première brasserie commerciale au Canada a été fondée à Québec vers 1668 (Small and Catling, 2000). À la fin de la Deuxième Guerre mondiale, la culture du houblon a presque disparu à cause des maladies fongiques, principalement (Small and Catling, 2000). Présentement, la culture du houblon se répand dans plusieurs pays du monde. En 2013, les États unis étaient le leadeur en terme de production de houblon avec 27 782 tonnes suivie de l'Allemagne, de l'Éthiopie, et de la Chine avec 27 533, 21 600 et 11 300 tonnes, respectivement (FAOSTAT, 2015).
Les cônes du houblon constituent une matière première essentielle dans l'industrie brassicole (Hampton et al., 2002; Li and Deinzer, 2006). L'utilisation du houblon comme
additif lors de la fabrication de la bière remonte aux moines allemands au 12ème siècle
(Gerhauser, 2005b). De nos jours, il est ajouté au cours du processus de brassage, non seulement pour procurer l'amertume et l'arôme à la bière, mais aussi pour son rôle important comme agent de conservation. De plus, environ 20 à 30 % des composés phénoliques de la bière proviennent du houblon (Gerhauser, 2005a).
Les propriétés antiseptiques du houblon ont été décrites pour la première fois par Brown and Clubb (1913). Des recherches récentes ont démontré que certains composés du houblon ont des propriétés bénéfiques pour la santé. Les acides α et β (humulones et lupulones), constituants essentiels de la résine, auraient des propriétés antibiotiques contre les bactéries à Gram-positif (Gerhauser, 2005b). Le xanthohumol et son isomère l’isoxanthohumol sont des flavonoïdes prénylés synthétisés par les glandes lupulines et présentent des activités anti-inflammatoires et anti-tumorales (Nagel et al., 2008). Ces molécules préviendraient notamment la formation de la tumeur en inhibant la croissance des cellules précancéreuses (Gerhauser et al., 2002), en inhibant l'activation métabolique des procarcinogènes, en induisant les enzymes de détoxification de substances cancérigènes et en inhibant l'angiogenèse et les signaux inflammatoires (Stevens and Page, 2004).
1.1.1 Composés du houblon
Le houblon est une plante cultivée essentiellement pour ses métabolites secondaires utilisés en brasserie, les acylphloroglucinols prénylés (acides α et β), qui sont responsables de l'amertume de la bière (Nagel et al., 2008). De plus, le houblon constitue une source importante des composés phénoliques (Ceh et al., 2007). Les cônes de houblon séchés contiennent de 4 à 14 % de composés phénoliques, principalement des acides phénoliques, des chalcones prénylés, des flavonoïdes, des catéchines et des proanthocyanidines (Kavalier
et al., 2011). Ces auteurs ont identifié et quantifié 7 terpénophénols et 21 composés
phénoliques présents dans les cônes de houblon.
Collin and Crouzet (2011) ont divisé les composés phénoliques du houblon en 3 grandes catégories: les flavonoïdes, les acides hydroxybenzoïques et hydroxycinnamiques et les stilbènes. Les flavonoïdes se divisent eux mêmes en 5 groupes: les flavonols (mono, di et triglycosides de quercétine et de kaempférol et des traces de myricétine), les flavan-3-ols,
les proanthocyanidines, les prénylchalcones (xanthohumol et desméthylxanthohumol) et les flavanones dérivés (isoxanthohumol et hopéine (8-prényl-naringénine)).
1.1.1.1 Acides α et β
Les acides du houblon, appelés aussi résines molles, se composent de deux séries connexes, les acides α (humulone, cohumulone et adhumulone) et les acides β (lupulone, colupulone et adlupulone) (Zanoli et al., 2007) (Figure 1.1). Les formes humulone et lupulone sont dominantes dans la plupart des cultivars (Priest and Stewart, 2006). Les acides α et β possèdent tous la structure alicyclique de base (2,4-cyclohexadiene-1-one) mais les analogues diffèrent par la nature de la chaîne latérale acylée (Larson et al., 1996). Il existe également certains acides mineurs dans la plante comme les posthumulones, les postlupulones, les préhumulones et les prélupulones. Ceux-ci sont présents sous forme d'un mélange complexe de composition et de concentration variables. Les proportions relatives des acides α et des acides β ainsi que le contenu de co-homologues dépendent du cultivar de houblon et, pour un cultivar donné, des conditions de croissance (Garcia-Villalba et al., 2006). Des cultivars particuliers de houblon peuvent contenir jusqu'à 19 % de la matière sèche d'acides α d'où leurs noms ''houblon super α'' (De Keukeleire et al., 2003).
Figure 1.1. Structure des acides α et β (De Keukeleire et al., 2003)
Les acides α et β sont connus comme agents d'amertume et d'arômes de la bière. Au cours du processus du brassage, les acides α sont transformés en acides iso-α (Figure 1.2) identifiés comme les principales substances amérisantes (Khatib et al., 2010; Larson et al.,
1996). Les acides β sont beaucoup moins solubles et pratiquement indétectables dans la bière (Priest and Stewart, 2006). De plus, les acides α et β sont très sensibles à l'oxydation et à la dégradation durant l'entreposage. Leurs produits d'oxydation affectent significativement la saveur de la bière parce qu'une fois les acides α ont été oxydés, ils ne peuvent plus être isomérisés en acides iso-α; Ainsi, le potentiel amérisant du houblon diminue et les arômes deviennent désagréables (Garcia-Villalba et al., 2006).
Figure 1.2. Isomérisation des acides α en acides iso-α (De Keukeleire, 2000)
1.1.1.2 Xanthohumol et prénylflavonoïdes connexes
Les flavonoïdes prénylés sont sécrétés par les glandes lupulines des inflorescences femelles de houblon, conjointement avec les acides amers et les huiles essentielles. Les glandes lupulines produisent exclusivement les flavonoïdes du type chalcone, tel que le xanthohumol, puisqu'elles ne possèdent pas l'enzyme nécessaire pour la conversion des chalcones en leurs flavanones correspondantes (Gerhauser, 2005a). Le xanthohumol (3'-[3, 3-diméthyl allyl] -2', 4', 4-trihydroxy-6'-méthoxychalcone) a été isolé pour la première fois et nommé par Power et al. (1913). Le xanthohumol est le flavonoïde prénylé le plus abondant dans les cônes (0,1 à 1 % du poids sec) (Miranda et al., 1999; Stevens and Page, 2004) où il est accompagné d'au moins 13 chalcones connexes qui se produisent à des concentrations inférieures de 10 à 100 fois par rapport au xanthohumol (Ceh et al., 2007; Magalhaes et al., 2007; Stevens and Page, 2004). La plupart des chalcones contiennent un groupe 2'-hydroxy libre et peuvent donc s'isomériser en leurs flavanones correspondantes (Stevens and Page, 2004).
Au cours du processus de brassage, le xanthohumol est converti sous l'effet de la haute température en son isomère prénylflavanone, l'isoxanthohumol, lors de l'ébullition du moût (Figure 1.3). C'est la raison pour laquelle l'isoxanthohumol est le prénylflavonoïde le plus abondant dans la bière (Gerhauser, 2005a; Magalhaes et al., 2007; Miranda et al., 1999). On trouve aussi dans les cônes le desméthylxanthohumol considéré comme le précurseur de la plupart des flavonoïdes. Le desméthylxanthohumol donne par isomérisation la 8-prénylnaringénine, un phytooestrogène puissant (Zanoli and Zavatti, 2008). L'exposition humaine au xanthohumol et aux prénylflavonoïdes connexes, tels que la 8-prenylnaringénine et l'isoxanthohumol, se fait principalement par la consommation de la bière (Stevens and Page, 2004).
Figure 1.3. Isomérisation des chalcones en flavanones
1.1.1.3 Proanthocyanidines
Le houblon est considéré comme une source riche de proanthocyanidines. Selon le cultivar et l'origine géographique, les cônes de houblon contiennent 0,5 à 5 % en matière sèche de proanthocyanidines (Li and Deinzer, 2007). Les proanthocyanidines du houblon sont essentiellement la catéchine, l'épicatéchine, l'épicatéchine-(4β-8)-catéchine (procyanidin B1), l'épicatéchine-(4β-8)-épicatéchine (procyanidin B2), la catéchin-(4β-8)-catéchine
(procyanidin B3) et la catéchin-(4β-8)-épicatéchine (procyanidin B4) (Li and Deinzer, 2006).
1.1.2 Effets bénéfiques du houblon sur la santé
1.1.2.1 Phytothérapie
Le houblon est considéré comme une plante médicinale depuis des siècles (Callemien et al., 2005; Nagasako-Akazome et al., 2007). Au cours du 8ème et du 9ème siècle, le houblon a été
utilisé dans les cloîtres et les monastères pour ces propriétés pharmacologiques (Larson et
al., 1996). Dans la phytothérapie moderne, les cônes entiers sont utilisés comme sédatifs
pour traiter l'anxiété, les troubles de sommeil et les douleurs de la menstruation (Hall et al., 2008). Ils sont aussi utilisés comme analgésiques (Hall et al., 2008), ainsi que pour leurs effets sur le système endocrinien, et leurs propriétés antitumorales (Zanoli et al., 2007). D'après Hall et al. (2008), les acides rho iso-α produits par la réduction du carbone C6 carbonyl de l'acide iso-α par du borohydrure de sodium sont efficaces pour soulager la douleur associée aux réactions inflammatoires. Le houblon a aussi un effet sur le système nerveux central. Il a été démontré qu'un produit dérivant de la dégradation des constituants du houblon durant l'entreposage, le 2-méthyl-3-buten-2-ol, réduit la motilité des rats lorsqu'il est injecté par voie intrapéritonéale (Wohlfart et al., 1983). Zanoli et al. (2007) ont constaté un effet pentobarbital favorisant l'endormissement après l'administration orale d'un extrait de houblon enrichi en acides β. Cet effet s'explique par une réduction de l'activité gabanergique. Les molécules responsables de l'effet sédatif du houblon sont les acides β, le 2-méthyl-3-buten-2-ol résultant de la dégradation des acides α et les huiles essentielles qui réduisent l'activité locomotrice et augmente la durée du sommeil induit par la kétamine (Schiller et al., 2006). Une étude clinique menée par (Koetter et al., 2007) a prouvé que le houblon agit en synergie avec la valériane pour diminuer le temps d'endormissement. Un mélange de 500 mg d'extrait de valériane avec 120 mg d'extrait de houblon était plus efficace que l'utilisation de l'extrait de valériane seul. Les composés du houblon possèdent un effet similaire à la mélatonine et peuvent régulariser le rythme circadien (Koetter et al., 2007).
1.1.2.2 Fabrication de la bière
La valeur économique du houblon provient essentiellement de son application dans le monde entier comme un ingrédient essentiel dans l'industrie brassicole (De Keukeleire et
al., 2003). Le houblon a été utilisé pour la fabrication de la bière depuis plus de 500 ans
(Nagasako-Akazome et al., 2007). Traditionnellement, la bière était ''houblonnée'' en ajoutant des cônes de houblon séchés lors de l'ébullition du moût. Seules les inflorescences femelles sont utilisées et les cônes non fertilisés sont préférés parce que les acides gras des graines peuvent donner des saveurs indésirables à la bière (Kavalier et al., 2011). La qualité de la bière dépend partiellement du houblon utilisé lors du processus de brassage. C'est pour cela que les brasseurs ont une tendance à utiliser du houblon d'un cultivar et d'origine déterminés afin de maintenir la qualité de leur bière (Kovacevic and Kac, 2002).
Le houblon est responsable des principales caractéristiques de la qualité de la bière, soit le goût, l'arôme, la formation de la mousse, la couleur et la durée de vie (Jaskula et al., 2010). L'amertume provient des acides α et β, ainsi que de certains prénylflavonoïdes, tels que le xanthohumol (Haseleu et al., 2009). Pendant le processus de brassage, les acides α contenus dans les poils glandulaires des cônes mûrs, pratiquement insolubles, sont convertis en composés plus solubles qui sont les acides iso-α (Garcia-Villalba et al., 2006). Plusieurs études ont porté sur la transformation des acides α en acides cis-iso-α et trans-iso-α correspondants au cours du processus d'ébullition du moût (Haseleu et al., 2009; Jaskula et
al., 2010). Ces études montrent que ces isomères contribuent plus à l'amertume de la bière
que les acides α (Haseleu et al., 2009; Jaskula et al., 2010). Outre l'amertume, ces composés améliorent la qualité et augmentent la durée de vie de la bière, grâce à leurs activités bactériostatique et antimicrobienne (Haseleu et al., 2009; Larson et al., 1996; Royle et al., 2001). De plus, les acides amers peuvent interagir avec les protéines de différentes façons et sont responsables de la formation de la mousse (Fung et al., 1997). Dans le procédé de brassage moderne, il est plus courant d'utiliser des extraits de houblon et de les ajouter après la fermentation pour mieux contrôler le goût (Royle et al., 2001). De plus, les grands brasseurs sont devenus intéressés non seulement aux terpènes et aux huiles essentielles comme des composantes de la saveur de la bière, mais aussi par la contribution
sur la santé des ingrédients (Kavalier et al., 2011). Le rapport xanthohumol : acides α détermine la valeur brassicole d'un cultivar ou d'un produit de houblon (Ceh et al., 2007).
1.1.2.3 Antibactérien et antiviral
L’activité antibactérienne est la propriété anti-infectieuse la mieux étudiée des constituants du houblon. Les acides amers du houblon inhibent principalement les bactéries à Gram-positif, y compris certaines espèces de Bacillus, de Micrococcus, de Staphylococcus, de
Mycobacterium et de Streptomycètes. Les acides β sont environ deux fois plus actifs que les
acides α (Gerhauser, 2005b). Les acides iso-α inhibent aussi la croissance des ces bactéries Gram-positif (Garcia-Villalba et al., 2006). Larson et al. (1996) ont démontré que des extraits de houblon, contenant certaines concentrations d'acides α et β, peuvent inhiber la croissance de Listeria monocytogenes dans les milieux de culture ainsi que dans certains aliments. En général, l'activité antibactérienne des extraits de houblon dans les aliments augmente avec l'acidité et le faible contenu en matière grasse (Larson et al., 1996).
Le xanthohumol s'est révélé efficace contre le virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1). Il peut alors représenter un nouvel agent chimiothérapeutique pour les infections par le VIH-1 (Magalhaes et al., 2007). Cette molécule n'inhibe pas l'activité de la transcriptase inverse recombinante du VIH-1, ni l'entrée de ce virus dans les cellules. Il cible plutôt les mécanismes de transcription post-inverse (Gerhauser, 2005b). De plus, le xanthohumol peut inhiber la réplication de Plasmodium falciparum, l'agent responsable du paludisme (malaria).
1.1.2.4 Prévention du cancer
L'exposition, à long terme, à des agents non toxiques, préférablement dans le cadre de certains produits alimentaires peut aider à prévenir le cancer (Stevens and Page, 2004). Le xanthohumol a été caractérisé comme un agent chimiopréventif du cancer à large spectre (Ceh et al., 2007; De Keukeleire et al., 2003; Gerhauser, 2005b; Miranda et al., 1999). Il a montré une activité antiproliférative contre les lignées de cellules cancéreuses provenant des cancers de sein, du colon et de l'ovaire in vitro (Magalhaes et al., 2007; Miranda et al., 1999).
Le xanthohumol agit à divers niveau de la carcinogenèse (Gerhauser, 2005a). Il inhibe l'activation métabolique des procarcinogènes, induit les enzymes de détoxification de substance cancérigène et arrête la croissance de la tumeur en inhibant l'angiogenèse et les signaux inflammatoires (Stevens and Page, 2004). Le xanthohumol exerce aussi des effets cytoprotectifs, en induisant des protéines qui métabolisent les radicaux libres et qui possèdent des propriétés antioxydantes. De plus, le xanthohumol inhibe la prolifération des cellules du fibrosarcome et induit l'apoptose dans les cellules du cancer de la prostate (Nagel et al., 2008). Ces activités biologiques suggèrent que les prénylflavonoïdes du houblon ont un potentiel d'application dans des programmes de prévention du cancer (Stevens and Page, 2004).
1.1.2.5 Phytoestrogène
La 8-prenylnaringénine, produit de l'isomérisation du desméthylxanthohumol, est identifiée comme étant le phytoestrogène le plus puissant connu à ce jour (De Keukeleire et al., 2003; Stevens and Page, 2004). Grâce à ses propriétés oestrogéniques, la 8-prenylnaringénine agit comme un modulateur sélectif des récepteurs œstrogènes. Il a été démontré que cette molécule prévient l'ostéoporose chez les rats et inhibe l'angiogenèse et la métastase (Possemiers et al., 2005). Récemment, la 8-prenylnaringénine a été l'objet des recherches en génétique moléculaire et dans le domaine biomédical, en raison de ses propriétés contraceptives et pro-oestrogéniques (Kavalier et al., 2011). Notons que cette molécule peut, dans certains cas, avoir des effets indésirables puisqu'elle peut favoriser la prolifération cellulaire des cancers hormono-dépendants. Une étude clinique menée par (Heyerick et al., 2006) a montré qu'un extrait enrichi en 8-prenylnaringénine (100 et 250 microgrammes) est efficace pour diminuer les inconforts liés à la ménopause, notamment les bouffées de chaleur mais que l'effet n'est pas dose-dépendant.
1.1.2.6 Antioxydant
Les composés phénoliques sont les antioxydants naturels les plus efficaces. Lermusieau et
al. (2001) ont montré que les acides α ne contribuent pas de façon significative au pouvoir
réducteur du houblon. Les extraits de houblon avec un niveau élevé de substances amères et un niveau très faible en composés phénoliques ont un pouvoir réducteur faible. L'activité
antioxydante du houblon dépend des concentrations en composés phénoliques totaux et en flavonoïdes et non pas de la concentration en acides α et β (Lermusieau et al., 2001). Wang
et al. (2014) ont montré que les composés phénoliques du houblon possèdent une activité
antioxydante plus élevée que celle des composés phénoliques du thé vert, in vitro et in vivo. Ces auteurs ont montré que la capacité de l'extrait de houblon à piéger les radicaux libres (dOH et O2d−) in vitro et à inhiber la peroxydation lipidique induite par le bromobenzène dans le foie de souris est plus élevée que celle d'un extrait de thé ayant la même concentration en composés phénoliques.
1.1.3 Culture du houblon
Il existe plusieurs cultivars de houblon, chacun possédant sa propre teneur en molécules actives et ses propres caractéristiques agronomiques. Traditionnellement, les cultivars de houblon ont été divisés en deux groupes (aromatiques ou amers), selon leur contenu en acides α et leur flaveur caractéristique (Garcia-Villalba et al., 2006). Les cultivars de houblon peuvent être différenciés alors selon les métabolites secondaires (résines, huiles essentielles, composés phénoliques) localisés essentiellement dans les glandes lupulines. Ces dernières peuvent contenir 3 à 6 % de composés phénoliques totaux selon le cultivar, l'origine géographique et les techniques de récole, de séchage et d'emballage utilisées (Callemien et al., 2005).
1.1.3.1 Biomasse végétale
Les terpénophénols et les huiles essentielles s'accumulent essentiellement dans les trichômes glandulaires qui se trouvent entre les bractées des cônes (Priest and Stewart, 2006; Rybacek, 1991), mais également sur la face inférieure des jeunes feuilles (Kavalier et
al., 2011; Stevens and Page, 2004). Chaque kg de cônes frais génère au moins 1 kg de
matériel résiduel (feuilles, tige, branches et cônes désintégrés), ce qui constitue une perte agronomique importante (Grilc and Dabrowski, 1994). Les feuilles contiennent principalement des protéines (23 %), ce qui justifie leur utilisation en alimentation animale (Grilc and Dabrowski, 1994). Elles contiennent aussi des quantités faibles mais décelables de xanthohumol (Nagel et al., 2008). D'après Ceh et al. (2007), les feuilles peuvent contenir 0.009 à 0.08 % de matière sèche de xanthohumol. De plus, les feuilles contiennent plus
composés responsables du goût de la bière et ayant des effets bénéfiques sur la santé sont répartis sur différentes parties du plant du houblon.
Figure 1.4. Plant de houblon
Des travaux effectués par De Keukeleire et al. (2003) et Kavalier et al. (2011) ont montré que les acides α et β, le desméthylxanthohumol et le xanthohumol sont présents dès le début de l’inflorescence mais leurs quantités augmentent significativement d’un stade de développement à un autre. Ces composés s'accumulent, pratiquement, au fur et à mesure
!
Feuilles
Cône
que les cônes s'allongent, ce qui correspond à l'élongation des bractées et des bractéoles. À noter que les terpénophénols s'accumulent dans les trichômes glandulaires alors que les composés phénoliques s'accumulent dans les tissus verts des bractées et des bractéoles (Kavalier et al., 2011). De Keukeleire et al. (2003) ont montré que les teneurs en xanthohumol et en acides α et β augmentent, considérablement, au cours du développement des inflorescences femelles en cônes et que les feuilles des plants bien développés (à la fin de la saison) contiennent des niveaux faibles mais détectables d'acides et même des chalcones.
Figure 1.5. Différentes parties d'un cône de houblon; 1: cône entier, 2: bractées, 3: bractéoles, 4: glande lupuline, 5: axe central (Rybacek, 1991)
1.1.3.2 Systèmes de culture
Le houblon cultivé biologiquement représente un faible pourcentage de la production mondiale de houblon. La culture biologique du houblon se fait principalement en Nouvelle-Zélande. D'autres pays, comme la Chine, commencent à adopter ce mode de production (Turner et al., 2011). Aux États-Unis, 114,8 tonnes de houblon biologiques ont été produites en 2013 (AOHGA, 2013). La culture biologique est devenue une nécessité de nos jours en raison d'une tendance mondiale à réduire l'utilisation des pesticides horticoles et à utiliser des fertilisants biologiques (De Keukeleire et al., 2007). Les principaux défis de la
maladies et la gestion de la fertilisation et de l'irrigation (Turner et al., 2011). Les consommateurs de la bière sont de plus en plus intéressés par la bière 'biologique' et il y a une demande accrue de houblon biologique dans l'industrie brassicole. En revanche, peu de travaux de recherche scientifique se sont intéressés à la culture biologique du houblon. La culture biologique est une nécessité dans une perspective d'extraction des molécules bioactives afin d'éviter la concentration des contaminants comme les pesticides dans les extraits.
C'est une plante grimpante qui se développe à partir des rhizomes. En culture conventionnelle, les tiges de houblon sont supportées par des cordes fixées à des câbles qui sont soutenus solidement par des poteaux de bois de 6 mètres de hauteur (Priest and Stewart, 2006). En Europe, un système de croissance simplifié, connu sous le nom de culture de houblon bas-treillis ou nain, a été mis en place. Ce système implique la croissance du houblon à seulement 2,5-3 m de hauteur, plutôt qu'à 5-6 m de hauteur comme dans la culture conventionnelle. La basse hauteur facilite le dépistage et rend possible la surveillance de toute la hauteur des plants, alors que seuls quelques échantillons peuvent être évalués périodiquement à une hauteur de 5-6 m dans une culture conventionnelle (Darby, 2004). En outre, en production de houblon nain, l'utilisation des pesticides est réduite de plus de 50 % par rapport à une culture conventionnelle; la plus basse hauteur et la plus grande densité de feuillage dans une culture de houblon nain produisent un microclimat plus frais et plus humide qui est plus propice à l'activité des insectes bénéfiques. Cette culture offre alors la possibilité de réduire l'utilisation de pesticides en favorisant le développement des espèces prédatrices, naturelles ou introduites, ce qui renforce le potentiel de lutte biologique (Darby, 2004).
Bien que ce système de culture soit moins productif (63 % de la production conventionnelle) que le système traditionnel (Darby, 1999), il se rentabilise par la diminution des coûts de l'installation et des coûts de main-d’œuvre qui peuvent atteindre 45 %. Le principal avantage de ce système de culture est la facilité de la récolte. Cette dernière sera effectuée par une moissonneuse qui récolte les cônes et les feuilles des branches latérales. Par contre, en croissance de houblon classique, les branches sont coupées, chargées sur une remorque et retirées du champ pour les transporter vers une
machine statique de cueillette. Un autre avantage est la diminution du volume des feuilles récoltées (Darby, 2004).
1.1.3.3 Conditions de culture
Le houblon est cultivé dans un sol profond, fertile, et ayant des bonnes propriétés physiques. Le système racinaire des plants est bien développé et peut atteindre 7 à 8 m de longueur. La plante consomme une quantité importante d'eau et d'éléments nutritifs pendant la période de croissance ainsi qu'à la période de floraison-fructification (Lipecki and Berbec, 1997). Le houblon a tendance à produire plus de cônes dans les sols contenants des concentrations moyennes en phosphore et en nitrate de potassium. Autrement dit, une fertilisation enrichie en azote n’accroit pas la production. De plus, le houblon réagit bien à de petites quantités de bore (Kuepper, 2005).
Des maladies fongiques comme le mildiou et la verticilliose causent des dommages importants à de nombreuses houblonnières. Le mildiou, en particulier, peut se répandre très rapidement dans le sol (Kuepper, 2005). Les champignons du genre Verticillium et
Fusarium causent une diminution du rendement et engendrent des coûts additionnels pour
désinfecter le sol et replanter des nouveaux plants. Il n'y a pas de produits chimiques pour contrôler ces maladies. Il faut alors prendre des mesures préventives telles que l'utilisation d'une fertilisation minérale bien balancée et l'application fréquente de fertilisants organiques (Lipecki and Berbec, 1997).
Les pucerons sont les insectes nuisibles les plus couramment trouvés dans un champ de houblon. Leur présence est habituellement limitée par des prédateurs naturels (Kuepper, 2005). Les cultivars de houblon actuels sont souvent susceptibles à l'attaque par le puceron
Phorodon humuli qui peut inhiber la croissance et réduire le nombre de fleurs. La présence
de pucerons dans les cônes de houblon peut, dans certains cas, causer une diminution importante du rendement (Lorenzana et al., 2010). D'après ces auteurs, la contamination par les pucerons n'affecte ni le contenu en acides α, ni le poids sec des cônes mais réduit la valeur économique de la culture.
naturel le plus efficace est un arrosage abondant avec de l’eau froide. Une irrigation suffisante lors des périodes de sècheresse permettra, d'une part, de réduire les dommages causés par les acariens, et d'autre part, de diminuer les problèmes physiologiques causés par la sècheresse (Kuepper, 2005).
1.1.4 Procédés de transformation
1.1.4.1 Séchage
Au moment de la récolte, les cônes de houblon contiennent environ 75 à 80 % d’eau (Henderson and Miller, 1972; Neve, 1991; Pageau, 1951; Thompson et al., 1985). Ils doivent être séchés immédiatement après la récolte pour empêcher le phénomène d'oxydation qui endommage leur apparence et leur qualité (Pageau, 1951). En fait, le séchage inhibe la respiration des cônes et réduit leur humidité à un niveau auquel les microorganismes sont inactifs (Rybacek, 1991). L'humidité des cônes secs doit diminuer à 8-12 % d’eau pour qu’ils soient conservés dans des conditions convenables (Henderson and Miller, 1972; Neve, 1991; Thompson et al., 1985).
La qualité du houblon séché peut être déterminée par sa couleur, sa texture, ses arômes et son contenu en acides α (Doe and Menary, 1979). Lors du séchage, les facteurs qui influencent la qualité du houblon sont les conditions physiques tels que l’épaisseur de la couche à sécher, la température de l’air, sa vitesse et son humidité (Doe and Menary, 1979). La majorité des températures de séchage citées dans la littérature se situent entre 40 à 60 n . Tous les auteurs confirment qu’au-delà de 65 n , la qualité du houblon sera affectée négativement (Rybacek, 1991). D'après Burgess (1931), le contenu en acides α diminue d’environ la moitié en augmentant la température de 40 à 100 n . Notons que la température de séchage peut être séparée en plusieurs composantes : la température de l’air du séchoir, la température de la couche en surface et la température individuelle de chaque cône. Durant les premières étapes du séchage, le taux d’évaporation est élevé ce qui cause un refroidissement de la couche en surface et retarde l’augmentation de sa température (Bruce and Sykes, 1983; Henderson and Miller, 1972).
températures constantes au-dessus de 40 n =ouplées à un flux d’air de 0.19 m3.s-1.m-2
causent une détérioration de la qualité. Par contre, Zeisig (1970) a montré que des températures élevées (68 à 74 n ;==IGJ;AHY?M>OH@FOR>kair élevé (0.3 - 0.4 m3.s-1.m-2)
donnent du houblon de bonne qualité. La circulation de l’air joue alors un rôle important dans le séchage du houblon. Ce n’est pas tant la chaleur elle-même qui sèche le houblon, c'est surtout le passage rapide de l’air chaud à travers les couches qui les sèchent (Pageau, 1951). L’air en mouvement doit transférer aux cônes la chaleur nécessaire pour l’évaporation de l’eau, et assurer une évacuation rapide de l’humidité libérée. Un processus d’évacuation lent cause une augmentation de l’humidité relative dans les couches de houblon et par la suite une perte de l’éclat et un changement de la couleur des cônes (Rybacek, 1991). Donc, améliorer l’efficacité du séchage signifie diminuer la durée du séchage (Neve, 1991). Rybacek (1991) a défini la durée du séchage comme étant l’intervalle de temps avant que la température interne des cônes n’atteint celle de l’air du séchoir. D'après Thompson et al. (1985), la durée de séchage peut être diminuée de 32 à 35 % en utilisant une température élevée au début du séchage et en la diminuant ensuite graduellement. De même, Henderson and Miller (1972) ont montré que des débits et des températures d’air graduels sont nécessaires pour améliorer la qualité du houblon séché.
1.1.4.2 Entreposage
Une fois séchés, les cônes de houblon doivent être entreposés d'une façon appropriée. Les cônes secs sont hygroscopiques et absorbent rapidement l’humidité de leur environnement. Il faut alors stocker le houblon dans un endroit où l’humidité relative ne dépasse pas 65 % pour assurer aux cônes une humidité d’environ 10 %. Les cônes sont aussi photosensibles : une longue exposition à la lumière cause des changements dans leur structure biochimique qui se révèle par une couleur rouge-brun. De plus, les cônes sont capables d’absorber les odeurs de leur environnement. Des travaux effectués par Canbas et al. (2001) et Rybacek (1991) ont montré qu'un entreposage de 6 mois à l’obscurité à température ambiante cause une perte d’acides α et β et une augmentation significative des résines dures. De même, après une période d'entreposage de 1 an, seulement 46 % du contenu original en proanthocyanidines pouvait être détecté (Hummer and Schreier, 2008). Hormis les conditions de stockage, chaque cultivar a une tendance particulière à s'oxyder. L'état
d'oxydation du houblon est donc un facteur important qui doit être surveillé constamment pour s'assurer de la qualité du houblon utilisé dans l'industrie brassicole (Garcia-Villalba et
al., 2006).
1.1.4.3 Extraction
L'extraction des composés du houblon implique le passage d'un solvant à travers le matériel broyé pour recueillir le contenu des cônes, et enfin l'élimination du solvant pour produire un extrait. La solubilité des composés phénoliques dépend du type et de la polarité du solvant utilisé, du degré de polymérisation de ces composés phénoliques, ainsi que des interactions qui se produisent entre ces derniers et les autres constituants des cônes et qui se traduisent par la formation de complexes insolubles (Magalhaes et al., 2007). Une élimination préalable de ces composés indésirables est probablement nécessaire pour récupérer le plus possible de composés phénoliques (Callemien et al., 2005). Il n'y a donc aucune procédure complètement satisfaisante pour extraire tous les composés phénoliques ou une classe spécifique de ces substances phénoliques (Magalhaes et al., 2007).
Des solvants comme le méthanol, l'éthanol, l'acétone, l'acétate d'éthyle et, dans une moindre mesure, le propanol et le diméthylformamide sont fréquemment utilisés pour l'extraction des composés phénoliques (Collin and Crouzet, 2011). Le méthanol semble être le solvant le plus efficace pour l'extraction du xanthohumol avec un facteur de récupération de 90 à 92 % (Magalhaes et al., 2007). Néanmoins, l'éthanol a été l'un des premiers solvants utilisés pour extraire les composants aromatiques et amers du houblon. Bien qu'il soit très puissant, l'éthanol possède une faible sélectivité et mène à l'extraction non-sélective de pratiquement tous les composants de la lupuline, les chlorophylles et les cires cuticulaires. Par conséquent, l'extrait éthanolique présente une impureté élevée, une couleur sombre et une consistance visqueuse (Magalhaes et al., 2007). Le dioxyde de carbone (CO2) supercritique est actuellement un des solvants utilisés pour la fabrication d'extraits de
houblon. Ses extraits contiennent presque toutes les huiles essentielles du houblon, un ratio élevé d'acides α (humulones) : acides β (lupulones), une petite quantité de résines dures et des traces de triglycérides, de cires, de chlorophylle et de sels inorganiques (Magalhaes et
Le houblon est vendu sous différentes formes à savoir des cônes entiers, des granulés, des extraits et des extraits isomérisés (Canbas et al., 2001). Les extraits de houblon sont obtenus, essentiellement, en utilisant l'éthanol ou le CO2 supercritique comme solvants
(Magalhaes et al., 2007). À l'échelle industrielle, seuls les solvants organiques non toxiques sont utilisés pour l'extraction (Kowalczyk et al., 2013). Afin de maximiser le rendement de l'extraction des composés phénoliques, il faut déterminer les conditions optimales d'extraction du matériel végétal (Amado et al., 2014).
L'éthanol est un solvant écologique qui peut être produit à partir des ressources agricoles renouvelables (da Silva et al., 2010). En revanche, ce solvant a une faible sélectivité et une étape supplémentaire de purification est souvent nécessaire, d'une part, pour augmenter la concentration des composés phénoliques dans les extraits, et d'autre part, pour éliminer les impuretés qui peuvent accélérer la dégradation des composés phénoliques et altérer leurs activités (D’Alessandro et al., 2013). L'adsorption est la technique la plus utilisée pour séparer, d'une façon sélective, les composés phénoliques des autres molécules dans les extraits liquides. Les résines échangeuses d'ions sont formées d'une matrice de polymère (composés inorganiques, polysaccharides, ou résines synthétiques) et d'un groupe fonctionnel. La charge et l'affinité pour les contre-ions du groupe fonctionnel déterminent le mode d'action de la résine échangeuse d'ions (Soto et al., 2011). En plus d'être facile à utiliser, cette technique est peu coûteuse et peut être utilisée dans les secteurs alimentaires et pharmaceutiques (Soto et al., 2011). Plusieurs composés phénoliques, tels que l'hespéridine, la génistéine, l'apigénine, la quercétine et les anthocyanes ont été purifiés par l'adsorption (Chandrasekhar et al., 2012)
1.2 Les composés phénoliques
Les plantes synthétisent une large gamme de composés organiques. Ces composés sont divisés en 2 classes : les métabolites primaires et les métabolites secondaires. Les métabolites primaires sont les composés qui possèdent des rôles essentiels dans la photosynthèse, la respiration, la croissance et le développement de la plante tels que les lipides, les nucléotides, les acides aminés, les phytostérols et les acides organiques (Crozier
