Le but de cette thèse était d'identifier les cultivars de houblon ayant le meilleur rendement agronomique et dont les cônes contiennent des quantités importantes de molécules bioactives. De plus, elle visait à valoriser les feuilles et les tiges de houblon en déterminant leurs contenus en composés phénoliques. D’un point de vue pratique, cette thèse s’est intéressée à déterminer les conditions d’entreposage du matériel entre la récolte et l’extraction étant donné les capacités limitées d’une usine d’extraction. L'optimisation des conditions d'extraction et la production d'extraits de haute qualité ont été également étudiées.
Le chapitre 2 constitue une étude préliminaire qui visait à déterminer le rendement agronomique et à déterminer la composition chimique des cônes et des feuilles des plants qui ont été plantés à la houblonnière avant le début de mon projet. Les résultats ont montré qu'il existe des différences significatives entre les cultivars, en ce qui concerne les quantités de cônes, de feuilles et de tiges produits. De plus, les feuilles et les tiges représentaient 24,5 % et 30,5 % du poids sec total des plants, respectivement, ce qui nécessitait leur valorisation. En déterminant la composition chimique des feuilles, nous avons remarqué qu'ils contiennent des quantités importantes de proanthocyanidines et de composés phénoliques totaux. Nous avons voulu, ensuite, établir une relation entre le rendement en cônes et en feuilles et le contenu en composés phénoliques de ces derniers. Nos résultats ont montré qu'il n'y a pas de corrélation entre ces deux variantes.
Dans le chapitre 3, neuf cultivars ont été étudiés soit cinq cultivars des États-Unis (Cascade, Galena, Brewers Gold, Nugget et Willamette), deux cultivars du Royaume-Uni (Admiral et Herald qui est un cultivar nain) et deux cultivars de la République Tchèque (Agnus et Vital). Les cônes, les feuilles et les tiges des plants de chacun des cultivars ont été caractérisés. Nos résultats ont montré que les cultivars des États-Unis produisent plus de cônes que les cultivars du Royaume-Uni et de la République tchèque. En revanche, les cônes des cultivars européens étaient plus riches en molécules d'intérêt. Les plants ont été cultivés biologiquement, sans utilisation de pesticides, et en utilisant une fertilisation biologique. Les rendements en cônes des cultivars américains (580 à 1996 kg/ha) sont très
encourageants, comparativement aux rendements obtenus généralement en culture conventionnelle (1500 à 2000 kg/ha) (Turner et al., 2011). L'analyse du contenu des tiges en molécules bioactives a montré que les tiges contiennent, comme les feuilles, des proanthocyanidines et des composés phénoliques totaux, essentiellement. Les cultivars Brewers Gold et Galena étaient les deux cultivars qui ont produit le plus de cônes et dont les cônes, les feuilles et les tiges étaient les plus riches en biomolécules. Les rendements du cultivar Herald, qui est un cultivar nain, n'étaient pas assez élevés pour justifier l'installation d'une culture de houblon nain dans l'avenir. Dans ce volet, nous avons aussi étudié l'effet de la méthode de conservation (séchage ou congélation) sur le contenu des cônes et des feuilles de deux cultivars après 1 an d'entreposage. Les deux cultivars n'ont pas réagi de la même façon à la conservation. Après 12 mois d'entreposage, il y a eu des pertes importantes de xanthohumol et d'acides α et β dans les cônes secs de Brewers Gold alors que les concentrations de ces molécules ont augmenté dans les cônes secs de Nugget. La composition des cônes congelés des deux cultivars est restée constante. En plus, les concentrations de xanthohumol et d'acides β ont diminué, alors que la concentration de PAC a augmenté dans les feuilles sèches des deux cultivars après 12 mois d'entreposage. Durant le séchage, les proanthocyanidines sont mis en étroite proximité et peuvent probablement réagir malgré l'absence d'eau. La congélation est alors nécessaire pour conserver les cônes entre la récolte et l'extraction. Daoud and Kusinski (1992) ont montré que la conservation à basse température des cônes peut diminuer la dégradation des acides α et β. Par contre, vu que les feuilles contiennent essentiellement des proanthocyanidines et des composés phénoliques totaux et que ces deux composés ne se dégradent pas facilement, les feuilles peuvent être séchées après la récolte et conservées sous forme sèche.
Le chapitre 4 de la thèse portait sur l'optimisation de l'extraction des molécules caractérisées dans le chapitre précédent dans une perspective alimentaire en utilisant uniquement de l'eau et de l'éthanol comme solvants. Afin d'optimiser l'extraction, nous avons étudié l'effet du broyage, du nombre d'extractions, du volume et de la concentration de l'éthanol, de la température et de la durée de l'extraction sur la concentration de xanthohumol, d'acides α et β, de proanthocyanidines et de composés phénoliques totaux dans les cônes. En plus, nous avons déterminé les conditions optimales de l'extraction des
conditions optimales d'extraction ont été de deux heures d'extraction à 30 °C avec de l'éthanol 70 % pour un ratio solide:liquide de 1:15 pour les cônes et les tiges et un ratio de 1:40 pour les feuilles. Nous avons essayé d'utiliser l'eau chaude pour extraire les composés phénoliques totaux et les proanthocyanidines des feuilles et des tiges, mais l'extraction éthanolique s'est révélée plus efficace. Dans les cellules végétales, les composés phénoliques solubles sont présents généralement dans les vacuoles, alors que la majorité des composés phénoliques insolubles sont liés aux protéines et aux polysaccharides dans les membranes cellulaires (Dixon and Paiva, 1995). En utilisant des mélanges d'alcools et d'eau comme solvants, des rendements élevés en composés phénoliques peuvent être obtenus (Pinelo et al., 2005; Yilmaz and Toledo, 2006). Le rendement de l'extraction dépend aussi de la température à laquelle elle s'effectue. Selon Yang et al. (2009), le rendement de l'extraction des composés phénoliques augmente entre 20 et 50 °C, puis il diminue entre 50 et 60 °C. Les composés du houblon sont très sensibles à la chaleur (Karabin et al., 2013). De plus, les composés phénoliques peuvent s'oxyder à cause d'une longue durée d'extraction (Naczk and Shahidi, 2004). Les paramètres d'extraction que nous avons optimisés sont modulables à l'échelle industrielle. Après la récolte, les feuilles et les tiges doivent être séparés des cônes puis extraits. Les feuilles et les tiges peuvent être extraits dans un même lot, vu qu'elles contiennent les mêmes molécules.
Dans le chapitre 5, nous avons concentré les extraits obtenus dans le cadre des expériences du chapitre 4. À cause de la faible sélectivité de l'éthanol, les extraits éthanoliques contiennent beaucoup d'impuretés (Magalhaes et al., 2007). Une étape de purification est nécessaire afin de produire des extraits de haute qualité. La résine adsorbante choisie est une résine facilement utilisable à grande échelle. Le passage des extraits de feuilles et de tiges sur la colonne nous a permis d'obtenir un extrait contenant jusqu'à 50 % en matière sèche de composés phénoliques totaux, et jusqu'à 10 % en matière sèche de proanthocyanidines. Des extraits de feuilles et de tiges sous forme de poudre ont été obtenus. En ce qui concerne les extraits des cônes, le principal problème était la précipitation des composés insolubles dans l'eau lorsque l'éthanol a été évaporé. Pour résoudre ce problème, nous avons utilisé l'huile de canola comme co-solvant. L'utilisation des huiles végétales comestibles pour extraire les composés phénoliques du matériel
et al., 2013). À partir de l'extrait initial de cônes, nous avons obtenu deux extraits ; un
extrait aqueux qui a été concentré en utilisant la résine adsorbante et un extrait huileux. L'adsorption a permis d'enrichir le premier extrait de 6,3, 1,8, 18,7, 2,2, 1,4 fois en xanthohumol, en acides α, en acides β, en composés phénoliques totaux et en proanthocyanidines, respectivement. À notre connaissance, ceci est la première fois qu'une méthode d'adsorption est utilisée pour concentrer des extraits de houblon. En plus, nous avons réutilisé l'huile plusieurs fois afin de la concentrer en molécules d'intérêt. L'huile pourra être réutilisée jusqu'à 5 fois et les concentrations en desméthylxanthohumol, en xanthohumol, en acides α, en acides β et en composés phénoliques totaux peuvent être augmentées de 1,4, 1,3, 1,5, 1,5 and 1,4 fois. Nous avons essayé aussi de produire des extraits des plants entiers (cônes, feuilles et tige) en utilisant le même principe. Les extraits des plants entiers contenaient généralement moins de biomolécules que les extraits des cônes. Nous avons réussi à produire des extraits de haute qualité à base de feuilles et de tiges de houblon (sous forme de poudre) et de produire deux extraits à base des cônes (un extrait solide et un extrait huileux) en utilisant une méthode d'extraction écologique et sans utiliser aucun additif alimentaire.
Le houblon constitue une source de divers composés d'intérêt brassicole et biomédical. Cette thèse présente les résultats d'une première étude de la culture biologique de houblon au Québec. L'essai des cultivars permet d'orienter les producteurs de houblon dans leur choix de cultivars. De plus, les résultats ont prouvé qu'il est possible de produire du houblon biologique au Québec. Nous avons réussi également à valoriser les co-produits du houblon et à produire des extraits de feuilles et de tiges. Ceci est bénéfique aux producteurs puisque les feuilles et les tiges qui restent après la récolte des cônes peuvent être utilisées au lieu d'être jetées ou compostées. De plus, il n'existe aucun extrait biologique de feuilles et de tiges de houblon sur le marché jusqu'à présent. Les travaux concernant l'optimisation de l'extraction constituent une étude détaillée des effets des paramètres d'extraction, modulables à l'échelle industrielle, sur le rendement de l'extraction des biomolécules. Les extraits que nous avons obtenus sont intéressants pour le domaine brassicole. Ils seront utilisés pour la fabrication d'une bière 'biologique' québécoise. De plus, en utilisant l'éthanol comme solvant, il était impossible de séparer le xanthohumol des acides α et β et
cônes obtenus est inférieur à 2 % MS. La seule méthode pour séparer le xanthohumol des acides α et β et d'obtenir un extrait riche en xanthohumol (plus de 10 % MS) est d'utiliser le CO2 supercritique comme solvant. L'extrait de feuilles et de tiges obtenu est très riches en
composés phénoliques totaux et en proanthocyanidines. Nous avons étudié l'effet antibactérien de cet extrait sur les bactéries Gram (-) Pseudomonas cichorii et
Xanthomonas campestris et la dose bactéricide minimale était de 12,5 à 50 mg/mL.
D'autres travaux prouvant l'effet bénéfique des extraits de feuilles et de tiges sur la santé humaine seront nécessaires pour commercialiser ce produit.
Annexe : Optimization of hot air drying of hop leaves
Introduction
At harvest, hop cones contain near 80 % of water (Henderson and Miller, 1972; Neve, 1991; Thompson et al., 1985). Humidity content of cones should decrease to 8-12 % before storage (Henderson and Miller, 1972; Neve, 1991; Thompson et al., 1985). Drying temperatures used for hop ranged between 40 and 60 n . Temperatures above 65 n negatively affected the quality of dried cones (Rybacek, 1991). According to Burgess (1931), up to 50 % of the α-acids content can be lost if drying temperature increase from 40 to 100 n . Temperatures used for air drying depends on air flow and velocity (Rybacek, 1991). The circulating hot air must transfer to cones the heat needed to evaporate water and to ensure a rapid evacuation of moisture. A slow evacuation process causes an increase of the relative humidity in the layers of hops, a loss of brightness and a change in the color of cones (Rybacek, 1991). To improve drying efficiency, drying time must be as short as possible (Neve, 1991). Rybacek (1991) has defined drying time as the duration until the internal temperature of cones reaches the temperature of the air from the dryer. The aim of the present work was to optimize the drying conditions (drying temperature and time) of hop leaves and to study the effect of the drying process on the percentage of dry matter and on the content of DMX, XN, α- and β-acids, PAC and TPC in dried leaves.
Materials and methods
In August 2012, leaves of Brewers Gold were harvested and transported on the same day to Université Laval. Fresh leaves were divided into samples of 14 g. Each sample was dried using a specific temperature and time. Drying temperatures ranged from 30 to 60°C and drying times were 2, 4, 6 and 8 h. Dry materials were stored at 10 °C until analysis. In order to determine the effect of drying temperature and time on the moisture content of dried samples, 2 g of each sample was dried in a vacuum oven for 1 h at 105 °C. The percentage of dry matter was calculated by measuring the weight of each dried sample before and after vacuum oven drying. Extraction was conducted by adding 20 mL of ethanol 70 % to 1 g of dried and sieved leaves. The tubes were then vortexed for 1 min and sonicated for 2 h at ambient temperature. After extraction, the tubes were centrifuged (3500 rpm, 5 min) and the supernatant was collected. Sample of the supernatant (1 mL) was withdrawn and filtered through non-sterile 0.45 µm 13 mm nylon syringe filter (Chromatographic Specialties Inc., Brockville, ON, Canada) prior to analysis by HPLC. Total polyphenols content was determined by the Folin-Ciocalteu assay, DMX, XN, α- and β-acids were analyzed by HPLC coupled to UV according to the method of De Keukeleire et al. (2003) with modifications and PAC were analyzed by HPLC coupled to fluorescence according to the method of Wallace and Giusti (2010) (Sarraf et al., 2015, in press).
Results and discussion
The ANOVA results showed that interaction between drying temperature and time significantly affected the percentage of dry matter and the concentrations of DMX, XN, α- acids, β-acids, TPC and PAC in leaves (Table 1). A percentage of dry matter of approximately 80 % was reached after 8 h for the drying temperature of 30 °C and after 6 h for the drying temperature of 40 °C (Figure 1). For the drying temperatures of 50 °C and 60 °C, the percentage of dry matter reached 80 % after 4 h and 2 h, respectively. At 50 °C, the highest percentage of dry matter (92 %) was obtained after 6 h of drying. For the drying temperature of 60 °C, the percentage of dry matter reached 94 % to 97 % after 4 h of drying. Humidity content should decrease to 8-12 % water before storage (Henderson and Miller, 1972; Neve, 1991; Thompson et al., 1985). Drying conditions allowing a percentage of dry matter above 90 % are 6 h at 50 °C and 4 h at 60 °C.
Table 1: ANOVA of percentage of dry matter (% DM), desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α-acids, β-acids, total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC)
% DM DMX XN α-acids β-acids TPC PAC
Temperature (Tp) <0.0001 <0.0001 0.09 <0.0001 0.02 <0.0001 <0.0001
Time (T) <0.0001 <0.0001 0.0005 <0.0001 0.002 <0.0001 0.04
Tp x T <0.0001 0.002 0.05 0.0006 0.03 0.004 0.0002
Figure 1: Effect of drying time on the percentage of dry matter for drying temperatures of 30 °C (a), 40 °C (b), 50 °C (c) and 60 °C (d). Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars).
! ! ! 20! 40! 60! 80! 100! 2! 4! 6! 8!
Percentage of dry matter
! Time (h)! 20! 40! 60! 80! 100! 2! 4! 6! 8!
Percentage of dry matter
! Time (h)! 20! 40! 60! 80! 100! 2! 4! 6! 8!
Percentage of dry matter
! Time (h)! 20! 40! 60! 80! 100! 2! 4! 6! 8!
Percentage of dry matter
!
Time (h)!
(a)
(c) (d)
Figure 2: Effect of drying time on the concentrations of desmethylxanthohumol (DMX) and xanthohumol (XN) for drying temperatures of 30°C (a), 40°C (b), 50°C (c) and 60°C (d). Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars).
Figure 3: Effect of drying time on the concentrations of α- and β-acids for drying temperatures of 30°C (a), 40°C (b), 50°C (c) and 60°C (d). Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars).
! ! ! 0.00! 0.01! 0.02! 0.03! 0.04! 0.05! 2! 4! 6! 8! Concentration (%DW) ! Time (h)! DMX! XN! 0.00! 0.01! 0.02! 0.03! 0.04! 0.05! 2! 4! 6! 8! Concentration (%DW) ! Time (h)! DMX! XN! (a) (b) 0.00! 0.01! 0.02! 0.03! 0.04! 0.05! 2! 4! 6! 8! Concentration (%DW) ! Time (h)! DMX! XN! (d) 0.00! 0.01! 0.02! 0.03! 0.04! 0.05! 2! 4! 6! 8! Concentration (%DW) ! Time (h)! DMX! XN! (c) ! ! 0.00! 0.05! 0.10! 0.15! 0.20! 0.25! 2! 4! 6! 8! Concentration (%DW) ! Time (h)! α-acids! β-acids! 0.00! 0.05! 0.10! 0.15! 0.20! 0.25! 2! 4! 6! 8! Concentration (%DW) ! Time (h)! α-acids! β-acids! 0.00! 0.05! 0.10! 0.15! 0.20! 0.25! 2! 4! 6! 8! Concentration (%DW) ! Time (h)! α-acids! β-acids! 0.00! 0.05! 0.10! 0.15! 0.20! 0.25! 2! 4! 6! 8! Concentration (%DW) ! Time (h)! α-acids! β-acids! (c) (a) (d) (b)
Figure 4: Effect of drying time on the concentrations of total polyphenols (TPC) and proanthocyanidins (PAC) for drying temperatures of 30°C (a), 40°C (b), 50°C (c) and 60°C (d). Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars).
Fresh hop contain more bioactive molecules than dried hop (Burgess, 1943). Drying conditions must be optimized to reduce, as much as possible, the losses of bioactive molecules that occurs in the drying process. Drying temperature affects greatly the drying time and the quality of dried material (Burgess 1943). The highest concentrations of DMX (0.01 % DW), XN (0.04 % DW), α-acids (0.1 % DW), β-acids (0.2 % DW) and TPC (7.7 % DW) were obtained when leaves were dried for 2 h at 50 °C, while the highest concentration of PAC (1.5 % DW) was obtained when leaves were dried for 2 h at 40 °C (Figures 2, 3 and 4). Doe and Menary (1979) showed that the optimal drying conditions for α-acids were an air temperature of 48 °C and a drying time of 6 h. To prevent the activity of the micro-organisms associated to the biomass during storage, the moisture content should not exceed 10 % (Henderson, 1973). Based on the results of the percentage of dry matter, drying time and temperatures of 2 h at 40 or 50 °C could not be used for long-time storage of hop leaves since they did not decrease the moisture content to 10 %. The optimal drying conditions that ensure, simultaneously, a suitable percentage of dry matter for storage and a high content of bioactive molecules are 6 h at 50 °C for DMX, XN, α-acids, β-acids and 4 h at 60 °C for TPC and PAC.
! ! ! ! 0! 2! 4! 6! 8! 10! 2! 4! 6! 8! Concentration (%DW) ! Time (h)! TPC! PAC! 0! 2! 4! 6! 8! 10! 2! 4! 6! 8! Concentration (%DW) ! Time (h)! TPC! PAC! 0! 2! 4! 6! 8! 10! 2! 4! 6! 8! Concentration (%DW) ! Time (h)! TPC! PAC! 0! 2! 4! 6! 8! 10! 2! 4! 6! 8! Concentration (%DW) ! Time (h)! TPC! PAC! (c) (a) (b) (d)
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