Développement d’un oligonucléotide structuré
permettant l’amplification et l’hybridation des
acides nucléiques en une étape
Mémoire
Laurie Girard
Maîtrise en microbiologie-immunologie
Maître ès sciences (M.Sc.)
Québec, Canada
©Laurie Girard, 2015
Résumé
Ce mémoire de maîtrise présente les travaux liés au développement d’une technologie permettant de faciliter la conceptualisation des nouveaux outils de biologie moléculaire. Cette nouvelle technique est centrée sur la détection d’acides nucléiques et a été développée dans un contexte de diagnostic des maladies infectieuses. Ce mémoire est centré sur deux principales techniques : la PCR en temps réel (rtPCR) et l’hybridation sur biopuce. Notre technologie permet la réalisation de ces deux réactions biochimiques complexes dans une même chambre réactionnelle et dans un seul et même tampon, ceci à l’aide d’un oligonucléotide structuré. Le premier chapitre décrit les différentes techniques de rtPCR et les différents paramètres d’hybridation sur biopuce. Les principes directeurs de la recherche sont présentés dans le deuxième chapitre. Le troisième chapitre comporte le manuscrit démontrant la faisabilité de notre nouvelle technologie. Finalement, le quatrième chapitre discute des perspectives du projet.
Table des matières
Résumé ... iii
Table des matières ... v
Liste des tableaux ... vii
Liste des figures ... ix
Liste des abréviations ... xi
Remerciements ... xiii
Avant-propos ... xvii
Introduction ... 1
Chapitre 1 Méthode de détection des acides nucléiques : PCR en temps réel et hybridation sur biopuce ... 5
1.1 La réaction en chaîne de la polymérase ... 6
1.1.1 Sélection de la méthode de détection PCR en temps réel ... 9
1.1.1.1 Méthode utilisant des amorces marquées ... 9
1.1.1.1.1 Light upon extention (LUX) ... 9
1.1.1.1.2 Plexor ... 10
1.1.1.1.3 AmpliFluor ... 12
1.1.1.1.4 Amorces scorpions ... 13
1.1.1.1.5 Amorces sunrises™ ... 15
1.1.1.1.6 Amorces BD Qzyme™ ... 16
1.1.1.2 Méthode utilisant une sonde entre deux amorces ... 18
1.1.1.2.1 Sonde TaqMan ... 18
1.1.1.2.2 Beacons moléculaires ... 20
1.1.1.2.3 Cycling probe technology (CPT) ... 22
1.1.1.2.4 Sondes d’hybridation adjacentes ... 23
1.2 L’hybridation d’acides nucléiques sur biopuce ... 26
1.2.1 Biopuces ... 26
1.2.2 Paramètres d’hybridation ... 28
1.2.3 Dispositif intégré... 30
Chapitre 2 Principes directeurs de la recherche ... 33
2.1 Objectifs ... 34
2.2 Hypothèses de recherche ... 35
2.3 Critères de développement ... 36
2.4 Choix des modèles expérimentaux ... 37
Chapitre 3 Oligonucléotide structuré permettant l’amplification et l’hybridation spécifique des acides nucléiques dans une même chambre réactionnelle et dans un seul et même
tampon ... 39
3.1 Résumé ... 42
3.2 Abstract ... 43
3.3 Introduction ... 44
3.4 Materials and methods ... 46
3.4.1 Function of SCISSOHR probes ... 46
3.4.2 Design of SCISSOHR probes ... 47
3.4.3 Modeling the theoretical hybridization behavior of SCISSOHR probes ... 48
3.4.4 Model targets... 49
3.4.5 PCR ... 49
3.4.6 Microarray fabrication ... 49
3.4.7 Hybridization ... 50
3.4.8 Fluorescence acquisition and analysis ... 51
3.5 Results and discussion ... 52
3.5.1 Design of SCISSOHR probes ... 53
3.5.2 Hybridization in amplification buffers ... 54
3.5.3 Single-vessel multiplexed amplification and hybridization ... 55
3.6 Conclusion ... 58
3.7 Acknowledgements ... 59
3.8 References ... 60
3.9 Tables ... 63
3.10 Figures... 66
Chapitre 4 Discussion et perspectives ... 71
4.1 Amélioration de la structure de l’OS ... 72
4.2 Optimisation de l’essai ... 73
Liste des tableaux
Chapitre 3 - Tableau 1 : Structural and thermodynamic properties of the SCISSOHR
used for amplification and hybridization. ... 63
Chapitre 3 - Tableau 2 : Primers used for PCR amplification. ... 64
Chapitre 3 - Tableau 3 : Capture probes used for microarray hybridization. ... 64
Liste des figures
Chapitre 1 - Figure 1 : LUX ... 10
Chapitre 1 - Figure 2 : Plexor ... 11
Chapitre 1 - Figure 3 : AmpliFluor ... 13
Chapitre 1 - Figure 4 : Amorces scorpions ... 15
Chapitre 1 - Figure 5 : Amorces Sunrises™ ... 16
Chapitre 1 - Figure 6 : BD QZymeTM ... 17
Chapitre 1 - Figure 7 : Sonde TaqMan ... 20
Chapitre 1 - Figure 8 : Beacons moléculaires ... 22
Chapitre 1 - Figure 9 : CPT ... 23
Chapitre 1 - Figure 10 : Sondes d'hybridation adjacentes ... 25
Chapitre 3 - Figure 11 : Structured Oligonucleotide. ... 66
Chapitre 3 - Figure 12 : Schematics of the structured oligonucleotide biodetection system. ... 67
Chapitre 3 - Figure 13 : Experimental design for multiplexed amplification and hybridization assay with SO. ... 68
Chapitre 3 - Figure 14 : Fluorescence signal for hybridization of the tag segment in five amplification buffers. ... 69
Chapitre 3 - Figure 15 : Microarray fluorescence signal obtained for FluA, FluB, and RSV multiplex assays. ... 70
Liste des abréviations
A : adénine
ADN : acide désoxyribonucléique ARN : acide ribonucléique
ARNm : acide ribonucléique messager a.u. : arbitrary unit
C : cytosine
CPT : cycling probe technology
EDTA : acide éthylène diamine tétra-acétique FluA : Influenza A
FluB : Influenza B
FRET : transfert d'énergie par résonance de fluorescence G : guanine
IVR : infections des voies respiratoires kcal : kilocalorie
LUX : light upon extention LNA : locked nucleic acid M : molaire
MGB : minor groove binder group mL : millilitre mM : millimolaire mm : millimètre mol : mole nm : nanomètre nt : nucléotide OS : oligonucléotide structuré
PCR : réaction de polymérase en chaîne PDMS : polydiméthylsiloxane
PMMA : polyméthacrylate de méthyle RSV : virus respiratoire syncytial rtPCR : PCR en temps réel
SCISSOHR : structured cleavage induced single-stranded oligonucleotide hybridization reaction
SO : structured oligonucleotide
SSPE : solution saline avec tampon phosphate et EDTA T : thymine
Tm : melting temperature
µM : micromolaire μm : micromètre
Remerciements
Je veux premièrement remercier le Dr Michel G. Bergeron de m’avoir accueillie dans son
laboratoire et de m’avoir permis de travailler sur ce projet hautement stimulant. Merci de m’avoir transmis votre passion pour votre domaine d’expertise et d’être un modèle d’inspiration pour moi. Cette expérience restera une des plus belles de ma vie.
Je voudrais remercier les Drs Gale Stewart et Régis Peytavi pour leur source de motivation,
le partage de leur science et leurs encouragements à explorer mes propres idées. Merci au Dr Maurice Boissinot, source inépuisable de stimulation, pour sa contribution dans mon
développement scientifique et dans le cheminement de mes études graduées.
Je remercie aussi les Drs Ann Huletsky et Luc Bissonnnette, qui ont contribué à mon
encadrement et qui ont apporté des critiques constructives dans le cadre de mes projets de recherche, tant au niveau scientifique que rédactionnel.
Je tiens également à remercier tous les membres de notre laboratoire pour toutes les connaissances dans le domaine scientifique qu’ils m’ont transmises. Merci aux membres de l’équipe du Dr Denis Boudreau au COPL et aux membres de l’équipe du Dr Teodore Veres
du CNRC pour leur collaboration dans mon projet et pour le développement de mes connaissances dans leur domaine de recherche respectif.
Finalement, je voudrais remercier mes parents, Michel et Céline, de m’avoir encouragée et soutenue dans mes études et qui m’ont toujours incitée à croire en mes rêves. Je voudrais remercier Yohan pour son support et son encouragement tout au long de mes études. Merci aussi aux autres membres de ma famille et à mes amis.
« La chance ne sourit qu’aux esprits bien préparés. » Louis Pasteur
Avant-propos
Ce mémoire comporte un article scientifique réalisé avec des coauteurs. Pour cette raison, la description de ma contribution scientifique et de celle de mes coauteurs est insérée devant le chapitre pour en simplifier la compréhension.
Le résultat de ces travaux s’est aussi traduit par le dépôt d’une demande de brevet dont je suis co-inventrice.
Introduction
Les acides nucléiques, découverts en 1869 par Friedrich Miescher, se retrouvent sous deux formes : l’acide désoxyribonucléique (ADN) et l’acide ribonucléique (ARN). Toutes les cellules eucaryotes et procaryotes de même que les mitochondries et les chloroplastes contiennent les deux types d’acide nucléique. C’est en 1944 qu’Oswald T. Avery et son équipe firent l’annonce capitale que l’ADN était le principe génétique actif. L’ADN est le support de l’information génétique et renferme l’ensemble des informations nécessaires au développement et au fonctionnement d’un organisme. En 1953, James Watson et Françis Crick ont fait la découverte de la structure double hélice de l’ADN (basée sur des études de diffraction des rayons X). Dans cette double hélice, deux brins d’ADN complémentaires sont retenus ensemble par des liaisons hydrogènes entre les bases des brins opposés. Les deux brins s’enroulent l’un autour de l’autre afin de former un long polymère avec deux types de sillons : un petit (1,2 nm) et un grand (2,2 nm). L’appariement des deux brins est très spécifique. La base purique adénine (A) ne s’apparie uniquement qu’avec la base pyrimidique thymine (T), alors que la base purique guanine (G) ne s’apparie uniquement qu’avec la base pyrimidique cytosine (C). La séquence d’un brin d’ADN permet donc de définir exactement la séquence du brin complémentaire. Des séquences d’acides nucléiques contribuent à une caractéristique biologique particulière. Par exemple, la pathogénicité de bactéries peut être causée par la présence de gènes spécifiques et/ou d’un groupe de gènes. Autre exemple, l’altération d’un gène peut être la cause sous-jacente d’une maladie génétique héréditaire chez l’humain. Ces séquences d’acide nucléique possèdent une signature distinctive qui peut être utilisée comme déterminant si cette signature est détectable (Watson et al., 2009).
Au cours de ces années, les connaissances acquises au sujet de la structure et des lois d’appariement de l’ADN et de l’ARN ont permis de développer les techniques de l’hybridation et du séquençage. Ces techniques ont à leur tour permis d’analyser de façon détaillée la structure et l’expression des gènes. Par ailleurs, d’autres techniques de biologie moléculaire, comme le clonage et la réaction en chaîne de la polymérase (PCR), ont été développées. Ces techniques ont alors permis d’isoler et de produire en quantité illimitée, et
aussi souvent que souhaitée, n’importe quel segment d’ADN (Larry Snyder, 2007; Watson
et al., 2009).
Aujourd’hui, différentes techniques de biologie moléculaire peuvent être utilisées comme outil de diagnostic en détectant et en identifiant des séquences d’ADN. C’est le cas de la PCR en temps réel et de l’hybridation d’acides nucléiques sur biopuce. Ces techniques ont pu démontrer leur importance dans le domaine des maladies infectieuses par leur rapidité (environ 1 heure), leur spécificité et leur sensibilité. Les techniques communément utilisées dans les laboratoires de microbiologie clinique pour l’identification de pathogènes s’effectuent à l’aide de différentes méthodes de culture. Ces cultures sont suivies d’une série de tests biochimiques révélant des caractéristiques métaboliques variées (Boissinot and Bergeron, 2002). Ce procédé a l’inconvénient majeur d’être lent, puisqu’il implique la croissance de micro-organismes en milieu de culture (~24 à 48 heures). En raison des délais d’obtention des résultats de culture, le clinicien se voit parfois dans l’obligation de poser un diagnostic empirique et d’administrer de façon préventive un antibiotique aux patients. C’est la raison pour laquelle certaines infections virales sont traitées à tort avec des antibiotiques, suscitant par le fait même la résistance bactérienne à ces derniers. Par conséquent, de nouvelles méthodes de diagnostic moléculaire rapide sont nécessaires pour orienter adéquatement la prise de décision des médecins et ainsi offrir un traitement optimal aux patients.
Le Dr Régis Peytavi, l’étudiant au doctorat Karel Boissinot et moi-même avons développé
une nouvelle technique permettant d’effectuer l’amplification et l’hybridation des acides nucléiques en une seule étape afin de pouvoir détecter des séquences d’ADN signature de pathogène humain. Pour ce faire, nous avons combiné deux techniques de biologie moléculaire, la PCR en temps réel et l’hybridation sur biopuce, afin de tirer profit de leurs avantages respectifs. Le résultat est la conceptualisation d’un oligonucléotide structuré (OS) qui permet la détection de cibles spécifiques après l’amplification, et ce, sur une biopuce. L’OS, aussi appelé « Structured Cleavage Induced Single-Stranded Oligonucleotide Hybridization Reaction » (SCISSOHR) dans le chapitre 3, est utilisé comme une sonde spécifique pendant l’amplification, ce qui déclenche une modification
irréversible de sa structure lorsque la cible est présente. Une portion de l’oligonucléotide ainsi modifié peut alors s’hybrider sur la biopuce.
Dans un premier temps, je vais décrire la première technique utilisée dans mon projet qui est la PCR en temps réel (rtPCR). Dans cette section, je m’attarderai sur les différentes méthodes, basées sur la mesure d’émission de fluorescence, utilisées pour la détection de cible. Ensuite, je parlerai de la deuxième technique de biologie moléculaire utilisée qui est l’hybridation des acides nucléiques sur biopuce. Dans cette section, je parlerai des différents avantages et inconvénients de ces techniques et des conditions à respecter lors de leur utilisation. Les lignes directrices de recherche seront présentées dans le deuxième chapitre. Finalement, je présenterai l’article expliquant et démontrant la faisabilité de la nouvelle technologie que nous avons développée.
Chapitre 1
Méthode de détection des acides nucléiques : PCR en
temps réel et hybridation sur biopuce
1.1 La réaction en chaîne de la polymérase
En 1956, le biochimiste Arthur Kornberg parvient à démontrer qu’une enzyme de polymérisation spécifique est nécessaire pour catalyser la liaison entre les acides nucléiques pour former la chaîne polynucléotidique d’ADN. Des études ultérieures ont permis de montrer qu’un polypeptide, l’ADN polymérase I, est capable de catalyser la synthèse d’un nouveau brin d’ADN en associant les acides nucléiques par des liaisons phosphodiesters 3’-5’. Les ADN polymérases permettent la réplication efficace et fidèle du génome. Pour que la synthèse ait lieu, deux substrats sont nécessaires. Premièrement, la synthèse nécessite les quatre désoxyribonucléotides triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) pour allonger la chaîne polynucléotidique. Deuxièmement, il faut un oligonucléotide (petite séquence d’acide nucléique) appelé amorce. Cette séquence est plus courte que le brin matrice (qui dirige l’addition de désoxyribonucléotides (dNTP)) et est complémentaire à ce dernier. L’amorce doit avoir une extrémité 3’-OH libre adjacente à la région monocaténaire de la matrice. C’est à partir de cette extrémité 3’-OH libre que l’amorce est allongée en ajoutant des dNTP complémentaires au brin matrice. Certaines ADN polymérases possèdent une fonction exonucléase à leur extrémité 5’ qui leur permet d’enlever un ou plusieurs nucléotides situés immédiatement en amont du site de synthèse de l’ADN, ce qui permet d’augmenter la fidélité de la transcription. Deux amorces synthétiques sont nécessaires à la réaction pour copier les deux brins de l’ADN. L’une est complémentaire à l’extrémité 5’ d’un brin de la séquence d’ADN que nous voulons amplifier et l’autre est complémentaire à l’extrémité 3’ de la région que nous voulons amplifier sur l’autre brin. Un cycle PCR se divise en trois étapes. Premièrement, il y a l’étape de dénaturation (95 °C) qui permet de séparer les deux brins de l’ADN. Deuxièmement, il y a l’étape d’appariement (environ 58 °C) où les amorces viennent s’hybrider sur l’ADN cible (s’il y a présence d’ADN cible seulement) de façon complémentaire. Troisièmement, il y a l’étape d’élongation (72 °C) où l’ADN polymérase effectue la synthèse du brin complémentaire en ajoutant les dNTP à partir de l’extrémité 3’-OH des deux amorces. Le produit d’amplification est la séquence située entre les amorces. Ensuite, les ADN sont typiquement soumis à une quarantaine de cycles et la quantité théorique d’ADN ainsi générée est selon la formule 2n -1 (ou n est le
nombre de cycles et -1 suppose que l’on a débuté avec un seul exemplaire de matrice à amplifier). Le produit final d’amplification est généralement détecté sur gel d’agarose après
une électrophorèse. L’ajout d’un agent intercalant comme le bromure d’étidium permet de visualiser l’ADN sur le gel lors d’une exposition aux UV (Watson et al., 2009).
La découverte des polymérases qui synthétisent l’ADN a permis une grande avancée dans le domaine de la biologie moléculaire (Watson et al., 2009). L’isolement en 1965 de la bactérie thermophile Thermus aquaticus par Thomas D. Brock a permis la découverte d’une polymérase thermostable appelée Taq polymérase (Chien et al., 1976). Cette dernière a été utilisée en 1988 par Randy Saiki pour améliorer considérablement les réactions PCR.
La PCR a été inventée par Kary Mullis en 1983 (Bartlett and Stirling, 2003; Mullis et al., 1986). Au début de ses travaux, Kary Mullis travaillait avec deux amorces d’ADN qui s’hybridaient à chacun des brins d’ADN cible ainsi qu’avec une polymérase, la polymérase I d’Escherichia coli. Cette dernière catalysait la réaction d’amplification de l’ADN entre les deux amorces (Mullis et al., 1986; Mullis, 1990; Saiki et al., 1985). Cependant, après chaque cycle de réplication, la matrice doit être chauffée au dessus de 90 °C pour permettre la dénaturation des brins d’ADN nouvellement formés pour qu’ils puissent servir à leur tour à un prochain cycle d’amplification. Par conséquent, cette étape de chauffage inactive l’ADN polymérase qui était utilisée à cette époque. La Taq polymérase (thermostable), utilisée pour la première fois en 1988, a permis l'exécution de la PCR sans avoir à ajouter de l’enzyme après chaque cycle de dénaturation de l’ADN. Ainsi, l'utilisation de la Taq polymérase a été l'idée clé qui a permis à la PCR de devenir un pilier de la biologie moléculaire moderne concernant l'analyse de l'ADN (Saiki et al., 1988).
En revanche, la PCR en temps réel (rtPCR), inventée par Higuchi en 1992, a dû attendre la mise sur le marché d'un certain nombre d'innovations technologiques avant de se développer et d’arriver dans nos laboratoires. L’invention de la rtPCR a permis de rendre la méthode quantitative et d’éviter plusieurs étapes expérimentales contraignantes telles que l’électrophorèse sur gel (Higuchi et al., 1992). Le principe de la rtPCR repose sur la possibilité de suivre la quantité d'ADN amplifiée dans la réaction à tout instant et non à la fin de la PCR, comme c’était le cas auparavant. Ce suivi est rendu possible grâce au
marquage des amorces ou des sondes d’oligonucléotide avec une molécule fluorescente. Il est aussi possible de marquer les amplicons avec un agent intercalant fluorescent comme le SYBR green. Les molécules synthétiques marquées, comme les amorces et les sondes, produisent un changement dans le signal dépendant de l’interaction de ces dernières avec la cible et les amplicons. Le signal est directement lié à la quantité d'amplicons présents au cours de chaque cycle et augmente à mesure que la quantité d'amplicons augmente. Le désavantage majeur de l’utilisation de la PCR en temps réel est le faible taux de multiplexage. Effectivement, le nombre de cibles qui peuvent être détectées et identifiées simultanément dans une seule réaction n’est généralement pas plus grand que six en raison du chevauchement des spectres de fluorescence (Avolio et al., 2010; Bissonnette and Bergeron, 2012; Ullrich et al., 2012). Actuellement, les filtres utilisés dans les thermocycleurs ne peuvent séparer plus de six spectres d’émission fluorescente de façon non ambiguë.
Néamoins, la rtPCR est la méthode de choix pour le diagnostic moléculaire, mais aussi pour la recherche en laboratoire. Le développement de nouveaux tests basés sur ces techniques à des fins de diagnostic dépend de quatre paramètres : la rapidité, la sensibilité analytique, la spécificité analytique et l’ubiquité. En termes de rapidité, le test ne devrait durer approximativement qu’une heure ou moins avant l’obtention du résultat. Les tests doivent être capables de détecter la charge minimale du pathogène dans un échantillon causant la pathologie. Il doit aussi amplifier seulement la cible souhaitée tout en étant capable de détecter tous les variants de celle-ci (Boissinot and Bergeron, 2002).
Une étape critique dans le développement de tests diagnostiques basés sur la rtPCR est le choix de la chimie de détection. Il y a actuellement environ 20 chimies différentes pour la détection de cible avec la rtPCR (Buh Gasparic et al., 2010). Par contre, seulement quelques unes sont disponibles sur le marché et utilisées de façon courante dans les laboratoires (Buh Gasparic et al., 2010; Bustin, 2005).
Nous pouvons classer ces chimies en trois méthodes. La première est basée sur des fluorophores intercalants. Ensuite, il y a les méthodes basées sur le marquage des amorces
PCR. Finalement, il y a les méthodes basées sur les marquages d’un oligonucléotide synthétique s’hybridant sur la cible entre les deux amorces. On nomme ces dernières : sondes fluorescentes. Pour le reste de cette section, je m’intéresse en particulier aux principales méthodes de marquage des amorces et des sondes.
1.1.1 Sélection de la méthode de détection PCR en temps réel
Chaque méthode de marquage des amorces et des sondes possède des avantages et des inconvénients. Certaines se prêtent mieux à certaines études tandis que d’autres sont moins appropriées. La section suivante présentera la principale méthode de détection pour des applications de diagnostic de maladies infectieuses basée sur le marquage d’amorces ou sur le marquage de sondes.
1.1.1.1 Méthode utilisant des amorces marquées
La rtPCR utilisant des amorces fluorescentes pour la détection de cible est plus fiable que celle sur la base de colorants intercalants comme le SYBR green. Ici, un colorant n'a pas besoin d'être ajouté directement au mélange réactionnel, car une amorce de PCR marquée avec un fluorophore est plutôt utilisée. Ces tests sont relativement peu coûteux à exécuter et leur conception assez simple (Buh Gasparic et al., 2010).
1.1.1.1.1 Light upon extention (LUX)
Dans la technologie LUX, une des deux amorces possède une structure secondaire tige-boucle et est marquée avec un fluorophore près de l’extrémité 3’. En l’absence de cible spécifique, la présence d’une guanosine, extincteur de fluorescence naturel, positionnée à proximité du fluorophore dans la conformation tige-boucle, permet d’éteindre la fluorescence du fluorophore. Durant l’amplification PCR, l’amorce LUX est incorporée au produit d’amplification par l’extension de structure tige-boucle. Ceci a pour effet de produire de la fluorescence (Figure 1). En présence de la cible spécifique, l’ouverture de la tige-boucle, ainsi que l’appariement de cette dernière, permet la production de fluorescence (BIO-RAD Laboratories, 2006; Buh Gasparic et al., 2010; Nazarenko et al., 2002).
L’avantage de la technologie des amorces LUX est qu’elle permet une détection spécifique et multiplexée. De plus, puisqu’elle ne requiert pas de molécule fluorescence extinctrice, la synthèse des amorces est moins coûteuse que les oligonucléotides doublement marqués avec extincteur et fluorophore. Par contre, cette technique ne permet pas de faire une discrimination allélique (Wong and Medrano, 2005).
1.1.1.1.2 Plexor
La technologie Plexor permet quant à elle de mesurer une diminution d’un signal de fluorescence proportionnel à l’augmentation du nombre d’amplicons générés durant une réaction d’amplification. Une des deux amorces contient une base modifiée (isocytosine) liée au fluorophore à l’extrémité 5’ de l’amorce. Durant la réaction d’amplification PCR, il
y a incorporation d’une molécule complémentaire à l’isocytosine, l’iso-dGTP, qui est ajoutée dans le mélange réactionnel pour la PCR. L’Iso-dGTP est liée à un extincteur et lorsqu’elle est insérée en face de la base modifiée complémentaire, une réduction du signal de fluorescence est observée à cause de la proximité physique étroite d'un fluorophore et de l’extincteur (Figure 2) (Buh Gasparic et al., 2010).
La technologie Plexor représente un bon choix en ce qui concerne l’efficacité et le coût de réalisation de la technique. De plus, elle se prête bien aux études qualitatives et quantitatives (Buh Gasparic et al., 2010).
1.1.1.1.3 AmpliFluor
La technique AmpliFluor fonctionne avec trois amorces. Les deux premières amorces sont spécifiques à la cible, tandis que la troisième est universelle et possède une structure secondaire tige-boucle avec un extincteur et un fluorophore aux extrémités 3’ et 5’ (UniPrimer). Lorsque l’UniPrimer est retrouvé dans la conformation tige-boucle, la fluorescence du fluorophore est éteinte à cause de la proximité physique de l’extincteur. Une des deux amorces spécifiques contient une extension de séquence à son extrémité 5’ appelée séquence Z. La séquence Z est aussi retrouvée à l’extrémité 3’ de l’UniPrimer. Lors du premier cycle PCR, les premières amorces spécifiques viennent s’hybrider sur la cible et sont allongées. Durant le deuxième cycle d’amplification, à partir du produit du premier cycle d’amplification, il y a synthèse de la séquence complémentaire de la séquence Z. Au troisième cycle, le produit d’amplification du deuxième cycle permet l’hybridation de la séquence Z de l’UniPrimer sur sa séquence complémentaire nouvellement synthétisée. Dans le quatrième cycle, l’extension d’amorce 3’ provoque l’ouverture de la structure tige-boucle de l’UniPrimer supprimant ainsi la proximité de l’extincteur et du fluorophore, ce qui permet l’émission de fluorescence (BIO-RAD Laboratories, 2006; Nazarenko et al., 1997).
Cette technique procure une très bonne spécificité. Par contre, la détection ne peut être mesurée en utilisant une courbe de dissociation des brins d’ADN. De plus, elle est très coûteuse et non souhaitable pour des études de quantification (Buh Gasparic et al., 2010).
1.1.1.1.4 Amorces scorpions
L’amorce scorpion consiste en une séquence simple brin, appelée sonde, qui se présente dans une conformation tige-boucle à cause de la complémentarité de courtes séquences situées au bout de ses deux extrémités. La sonde est marquée à l’extrémité 5’ avec un fluorophore. L’extrémité 3’ est reliée à un bloqueur de PCR qui porte l’extincteur. La sonde est reliée à l’extrémité 5’ d’une amorce par le bloqueur de PCR. Le bloqueur prévient l’élongation de la sonde par la Taq polymérase. La proximité physique de l’extincteur et du fluorophore dans la conformation tige-boucle conduit à l’inhibition de la fluorescence du fluorophore. Au début de la réaction de rtPCR, la Taq polymérase allonge les amorces et synthétise le brin complémentaire de la cible spécifique. Durant le cycle PCR suivant, la tige-boucle s’ouvre et la région de boucle s'hybride de façon intramoléculaire sur la séquence cible nouvellement synthétisée. À ce moment, l’extincteur est physiquement trop
éloigné du fluorophore pour inhiber la fluorescence (Figure 4). L'augmentation significative du signal fluorescent est directement proportionnelle à la quantité d'ADN cible (Sigma, 2008).
Les amorces scorpions combinent une sonde et une amorce dans une seule et même molécule, ce qui produit un événement unimoléculaire. Un événement unimoléculaire est cinétiquement favorable et très efficace en raison de la liaison covalente de la sonde à l'amplicon, assurant que chaque sonde est associée à une séquence cible (Whitcombe et al., 1999). Le clivage enzymatique n'est pas nécessaire, ce qui permet d’avoir une réaction plus rapide. Ceci permet d’induire des cycles PCR plus courts et d’avoir un signal de fluorescence plus fort, comparativement aux méthodes utilisant des TaqMan ou des beacons moléculaires (Thelwell et al., 2000). Les scorpions sont parfaitement adaptés à la détection de mutation au niveau d’un seul nucléotide et peuvent être multiplexés facilement. Par contre, cette technique est très coûteuse (Wong and Medrano, 2005).
1.1.1.1.5 Amorces sunrises™
Le principe de la technique utilisant les amorces sunrise™ est pratiquement le même qu’avec les amorces scorpions (Nazarenko et al., 1997). Les sondes sont marquées avec un fluorophore et un extincteur à l'extrémité 5' et à l'extrémité 3' respectivement et reliées à l’extrémité 5’ d’une amorce. Lorsque non liées, les sondes sont retrouvées dans leur conformation tige-boucle, provoquant ainsi l’inhibition de la fluorescence du fluorophore par l’extincteur à cause de leur proximité physique. Aprèsintégration dans le produit PCR nouvellement formé, le fluorophore et l'extincteur deviennent suffisamment éloignés pour permettre l’émission de fluorescence (Figure 5).
Cette technique permet d’effectuer des essais multiplexés, la discrimination allélique et procure également une bonne spécificité. Par contre, cette méthode est très coûteuse (Wong and Medrano, 2005).
1.1.1.1.6 Amorces BD Qzyme™
Le principe de l’essai avec la technologie BD QZyme™ est basé sur un oligonucléotide (DNAzyme) ayant une activité catalytique. Le substrat d’acide nucléique est clivé au niveau des liaisons phosphodiesters spécifiques. Le DNAzyme consiste en un domaine catalytique flanqué par deux domaines de reconnaissance (R1 et R2). Dans ce type d’essai, nous retrouvons premièrement une amorce 5’ spécifique au gène d’intérêt joint avec la même séquence que celle retrouvée dans le DNAzyme appelée séquence inactive. Nous retrouvons également une amorce 3’ spécifique au gène d’intérêt. Le DNAzyme est marqué en 5’ avec un fluorophore et en 3’ avec un extincteur. Lorsque le DNAzyme est intact, la
proximité physique de l’extincteur au fluorophore éteint la fluorescence du fluorophore. Durant l’amplification et à la suite de la duplication du brin complémentaire, les amplicons produits contiennent la séquence complémentaire à la séquence inactive de l’amorce 5’ appelée séquence active. La séquence active est aussi complémentaire au DNAzyme. Le cycle suivant permet donc la liaison de la DNAzyme à son substrat (séquence active), ce qui catalyse le clivage de l’oligonucléotide. Ce clivage permet de séparer physiquement l’extincteur du fluorophore et de produire de la fluorescence (Figure 6). Finalement, à chaque cycle d’amplification, la catalyse du DNAzyme augmente en proportion directe avec la quantité d’ADN produite (de séquence active produite) (BIO-RAD Laboratories, 2006; Clontech, 2003).
Cette technique possède une bonne sensibilité, permet de réaliser la détection multiplexée et est compatible avec tous les instruments de PCR en temps réel (Clontech, 2003).
1.1.1.2 Méthode utilisant une sonde entre deux amorces
Pour augmenter la spécificité d’un essai, on peut utiliser un troisième oligonucléotide, une sonde fluorescente, qui est complémentaire à une séquence cible située entre les amorces de PCR. Dans cette méthode, le fait d’utiliser deux amorces et une sonde confère trois niveaux de spécificité et permet donc d’avoir des essais très spécifiques. Ces méthodes sont plus dispendieuses, ceci en raison de l’ajout de ce troisième oligonucléotide (Buh Gasparic et
al., 2010).
1.1.1.2.1 Sonde TaqMan
Les sondes TaqMan (Heid et al., 1996) sont les premières sondes à avoir été utilisées pour la rtPCR. Les sondes TaqMan sont de petits oligonucléotides d’ADN linéaire qui
reconnaissent spécifiquement une séquence d’ADN et qui contiennent un fluorophore à leur extrémité 5’ et un extincteur à leur extrémité 3’. Cette méthode exploite l’activité exonucléase 5’→ 3’ de la Taq polymérase pour cliver la sonde marquée lorsque celle-ci est hybridée sur sa séquence cible complémentaire (Holland et al., 1991). Si la cible spécifique n’est pas présente dans le mélange réactionnel pour la PCR, la sonde reste intacte et les signaux de fluorescence restent au niveau de base puisque la sonde est dessinée afin que, dans sa forme intacte, l’extincteur soit suffisamment près du fluorophore pour inhiber l’émission de fluorescence. Si la cible spécifique est présente dans le mélange réactionnel, la sonde s’hybride à chaque étape d’appariement durant la PCR. La polymérase qui reconnaît l’extrémité de 3’ OH de l’amorce appariée va commencer la polymérisation. L’activité exonucléase 5’→ 3’ va permettre la dégradation de l’extrémité 5’ de la sonde au moment où la polymérase va rencontrer la sonde appariée en aval de l’amorce. Ce processus libère le fluorophore en 5’ dans la solution. Le fluorophore spatialement séparé de l’extincteur conduit à une augmentation irréversible de fluorescence (Figure 7) (Espy et
al., 2006).
Dans cet essai, il est important de contrôler les températures d’appariement pour assurer que l’appariement de la sonde se produise avant l’appariement des amorces. Cette technique de rtPCR est la technique de choix pour la plupart des applications de quantification et pour celles qui exigent le multiplexage. Cette technique est aussi très spécifique car les deux amorces et la sonde permettent d’avoir trois niveaux de spécificité. Ces sondes peuvent aussi être utilisées pour détecter un polymorphisme spécifique prédéfini dans le produit d'amplification par PCR (Espy et al., 2006). De plus, ce système a des lignes directrices et des protocoles très bien écrits, ce qui en fait une des méthodes les plus utilisées en rtPCR (Sigma, 2008).
La conception originale de la sonde TaqMan a été encore élargie. Différentes modifications comme les « minor groove binder group » (MGB) (sonde d'ADN de ligand du petit sillon) et les « locked nucleic acid » (LNA) ont été développées pour augmenter l’efficacité de cette technique (Buh Gasparic et al., 2010).
Les MGB sont des molécules qui adoptent une forme en croissant qui leur permet de lier les duplexes d’ADN dans le sillon mineur. Les sondes portant des MGB forment des duplexes extrêmement stables avec les molécules d’ADN simple brin cibles, ce qui permet d’avoir des sondes de longueur plus petite. De plus, en comparaison avec les sondes non modifiées, les sondes MGB ont des températures de fusion beaucoup plus élevées et une spécificité augmentée, spécialement quand un mésappariement se retrouve dans la région MGB du duplexe (Kutyavin et al., 2000). Finalement, cette modification est compatible avec tout système de détection en temps réel (Sigma, 2008).
Les nucléotides LNA sont des analogues d’acide nucléique qui ont une fraction ribose modifiée avec un pont 2′-O,4′-C- méthylène supplémentaire. Ceci permet d’augmenter la stabilité thermique avec le nucléotide complémentaire. Les nucléotides LNA « verrouillent » la sonde sur la cible. Les LNA permettent donc d’augmenter la stabilité thermale des duplexes, d’améliorer la spécificité des sondes, d’effectuer une discrimination allélique renforcée, de faciliter la conception des sondes et sont compatibles avec de
nombreux systèmes (Costa et al., 2004; Sigma, 2008). Ces deux types de modification ne s’appliquent pas seulement aux sondes TaqMan, mais aussi à toutes les autres méthodes de détection de l’ADN.
1.1.1.2.2 Beacons moléculaires
Les beacons moléculaires (Mhlanga and Malmberg, 2001) sont basés sur le principe d’une sonde structurée et non d’une sonde hydrolysée, comme c’est le cas avec les sondes TaqMan. Ces sondes sont dessinées de façon à obtenir une structure tige-boucle avec une région boucle et une tige formée par l’appariement des extrémités qui sont complémentaires. Ces sondes sont marquées à une extrémité par un fluorophore et à l’autre par un extincteur. En solution, la sonde adopte une conformation tige-boucle, ce qui permet de maintenir physiquement rapprochés le fluorophore et l’extincteur qui sont situés aux extrémités 5’ et 3’. L’inhibition de la fluorescence en résulte. Durant la PCR, à l’étape d’appariement, le beacon moléculaire s’hybride sur sa séquence cible, ce qui ouvre la structure tige-boucle et sépare le fluorophore et l’extincteur. La distance physique qui sépare le fluorophore de l’extincteur devient trop grande pour que ce dernier puisse inhiber la fluorescence du fluorophore. Ceci résulte en une augmentation de l’émission de fluorescence directement proportionnelle à la quantité d'ADN cible. En contraste avec les
sondes TaqMan, l’acquisition de la fluorescence dans un essai utilisant les beacons moléculaires est réalisée à l’étape d’appariement au lieu d’être réalisée à l’étape d’élongation. Si la séquence d'ADN cible ne correspond pas exactement à la séquence de la sonde, il n’y a pas d’hybridation, donc pas d’émission de fluorescence. Lorsque la température remonte pour permettre l'extension d'amorce (72 °C), les sondes se dissocient de la cible et le processus est répété avec les cycles subséquents de la PCR (Figure 8) (Espy
et al., 2006; Sigma, 2008).
Les beacons moléculaires sont devenus populaires pour les analyses standards : comme la quantification de l'ADN et de l’ARN (Antony and Subramaniam, 2001). Ils sont aussi utilisés pour monitorer en temps réel la production ARNm intracellulaire, le traitement « processing » des ARN et le niveau de transcription dans les cellules vivantes (Dirks et al., 2001; Liu et al., 2002; Perlette and Tan, 2001). Ils sont aussi idéaux pour analyser des mutations puisqu’ils peuvent détecter les différences d’un seul nucléotide. La haute sensibilité des beacons moléculaires permet leur utilisation pour effectuer des détections précises et multiplexées (Sigma, 2008). L’appariement des beacons moléculaires est critique puisqu’il faut s’assurer qu’il s’effectue avant l’étape d’élongation. Ceci est donc à prendre en compte lors du dessin de ces oligonucléotides.
1.1.1.2.3 Cycling probe technology (CPT)
Les sondes CPT sont des sondes linéaires marquées à leur extrémité en 5’ par un fluorophore et en 3’ par un extincteur. Cette technologie diffère des sondes TaqMan au niveau de leur constitution en acide nucléique. Elles sont constituées en partie de nucléotides d’ARN qui forment des duplexes avec l’ADN après l’hybridation sur la cible. Lorsque la sonde est intacte, la distance entre le fluorophore et l’extincteur est suffisamment petite pour que la fluorescence du fluorophore soit éteinte par l’extincteur. Lors de l’hybridation des amorces sur la cible, le duplexe ARN-ADN est reconnu et coupé par la RNaseH. À la suite du clivage d'une sonde, les fragments de sonde résultants (un portant le fluorophore et l’autre l’extincteur) sont instables à la température de réaction, et se dissocient donc de la cible et retournent dans le mélange réactionnel. Ceci permet à la séquence cible de devenir disponible pour un nouveau cycle et de médier le clivage d'une autre sonde. Le fragment ainsi décroché éloigne le fluorophore de l’extincteur, ce qui
permet l’émission de fluorescence (Figure 9). L’augmentation de la fluorescence suit une cinétique linéaire, permettant ainsi de suivre la quantité de cibles (Duck et al., 1990).
Le principal avantage des sondes CPT est que l’essai est réalisé à une seule température et est donc compatible avec les techniques isothermes. Par contre, cette technique n’est pas optimale pour des essais qui demandent d’avoir une bonne sensibilité (Buh Gasparic et al., 2010).
1.1.1.2.4 Sondes d’hybridation adjacentes
Dans cette technique, deux sondes sont dessinées pour s’hybrider de façon adjacente sur la cible, en plus des deux amorces nécessaires pour la PCR. La première sonde est marquée à son extrémité 3’ avec un fluorophore donneur. La deuxième sonde est marquée à son extrémité 5’ avec un autre fluorophore accepteur et à son extrémité 3’ avec un phosphate pour inhiber l’élongation de la sonde par la Taq polymérase. Les donneurs et les accepteurs sont choisis de telle sorte que le spectre d'émission du fluorophore donneur chevauche
sensiblement le spectre d'excitation du fluorophore accepteur, alors que le spectre d'émission du fluorophore donneur est spectralement séparé du spectre d'émission du fluorophore accepteur. L'excitation est réalisée à la longueur d'onde spécifique du donneur et l’émission est mesurée à la longueur d'onde d'émission de l’accepteur. À l’étape d’appariement au cours de la PCR, les sondes s'hybrident à leurs séquences cibles dans une disposition tête-à-queue. Cela amène les molécules fluorescentes à proximité, permettant un transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) du donneur excité à l'accepteur. La fluorescence émise par l’accepteur est ensuite mesurée (Figure 10). La quantité croissante de fluorescence de l'accepteur est proportionnelle à la quantité d'amplicons présents.
L’avantage de cette technique est que les sondes, n’étant pas hydrolysées, nous permettent d’avoir une fluorescence réversible (Sigma, 2008). Cette technologie peut être utilisée pour la détection de site de mutation unique lorsqu’une des sondes est placée sur le site de mutation, ceci provoquant la dissociation de la sonde à une température différente de l'amplicon entièrement complémentaire (Pals et al., 2001). Cette technique peut également être utilisée pour générer des courbes de fusion et pour effectuer des essais multiplex. Cette dernière est par contre très coûteuse, ceci à cause de l’utilisation de quatre oligonucléotides (deux amorces et deux sondes) (Wong and Medrano, 2005).
1.2 L’hybridation d’acides nucléiques sur biopuce
Une caractéristique importante lors du développement d’un test de diagnostic est la capacité de multiplexage ou, en d’autres mots, la capacité de détecter et d'identifier plus d'une cible simultanément à partir du même échantillon. Ceci est d’autant plus important dans les laboratoires cliniques afin de diminuer l’échantillonnage de prélèvements et leur temps de manipulation. Les biopuces sont une approche qui permet la détection et la caractérisation multiparamétrique. Dans cette section, une description de cette technique est présentée.
1.2.1 Biopuces
Les biopuces, aussi appelées puces à ADN, consistent en une matrice d’ADN synthétique (sonde de capture) fixée sur une surface solide de façon à former des micropoints spatialement déterminés. Une cible d’ADN simple brin peut par la suite se lier à son complémentaire, soit la sonde de capture. Théoriquement, il est possible de discriminer autant de cibles différentes qu’il y a de sondes de capture identifiables par une coordonnée cartésienne (X, Y) ou une couleur (Sibley et al., 2012). Il existe plusieurs biopuces qui peuvent être distinguées sur la base de certaines caractéristiques dont la nature de la sonde, la nature du support solide utilisé et le procédé spécifique utilisé avec la sonde d'adressage et/ou de détection de cible (Miller, 2009). Parmi celles-ci, il y a les sondes imprimées, les biopuces synthétisées in situ, les billes à haute densité, les biopuces électroniques et les billes de suspension liquide (Miller and Tang, 2009). Dans cette section, je vais me concentrer sur la méthode de sonde imprimée puisque mes expériences sont basées sur cette technique.
Les biopuces imprimées ont été les premières puces utilisées dans les laboratoires. Les sondes de capture sont immobilisées sur une surface solide par un lien covalent, par des interactions streptavidine-biotine ou par des liens électrostatiques afin de former un microdamier dont les micropoints ont une grosseur généralement de 100 à 150 μm. Une des surfaces solides les plus utilisées est la lame de microscope en verre. Par contre, les lames de verre ne sont pas facilement adaptables à un système intégré de diagnostic (Miller and
Tang, 2009). Certains polymères plastiques comme le Zeonex E48R et le Zeonor 1060R peuvent aussi être utilisés pour l’hybridation d’acides nucléiques (Diaz-Quijada et al., 2007). De plus, ils sont moins coûteux, ils sont compatibles avec les systèmes portables d'analyse micrototale et leurs propriétés optiques permettent la détection ultrasensible d’acides nucléiques marqués (Zhao et al., 2008). Afin de pouvoir imprimer les oligonucléotides synthétiques sur les lames de plastique, ces dernières subissent deux traitements chimiques. La première étape, l’oxydation des lames en présence d’ozone, permet de produire des groupements acides carboxyliques. La deuxième étape est l’activation des groupements acides carboxyliques. Pour ce faire, les lames subissent un traitement avec une solution de 1-ethyl-3 (3-diméthylaminopropyle) carbodiimide (EDC) et une solution de N-hydroxysuccinimide (NHS) dans un tampon salin phosphate. Durant cette étape d’activation, l’acide carboxylique réagit avec le NHS pour former des groupements esters-NHS qui vont ensuite réagir avec les groupements amino préalablement liés aux sondes d’ADN pour former un lien amide (Zhao et al., 2008). Lors de l’impression, la densité de chaque micropoint où les différentes sondes sont imprimées est de 10 000 à 30 000 sondes, ce qui est moins dense que les biopuces synthétisées in situ et les billes à haute densité qui peuvent atteindre une densité de un million de sondes par point imprimé (Miller and Tang, 2009).
Dans un cadre de diagnostic moléculaire, la détection par hybridation sur biopuce peut être couplée à la PCR afin d’augmenter la capacité de multiplexage. Pour ce faire, nous avons besoin de deux amorces spécifiques pour la PCR : une marquée en 5’ avec un fluorophore pour générer le brin cible (complémentaire à la sonde de capture située sur la biopuce) et une autre phosphorylée en 5’ pour générer le brin complémentaire au brin cible. Cette dernière modification va permettre la dégradation du brin complémentaire au brin cible à l’aide de l’exonucléase lambda (Boissinot et al., 2007). La dégradation du brin complémentaire permet de diminuer les problèmes de compétition entre le brin complémentaire et la sonde de capture. Ceci permet donc une plus grande disponibilité de sondes pour la détection du brin cible (Peytavi et al., 2005). Finalement l’hybridation du brin complémentaire fluorescent permet la détection de cibles spécifiques.
Les biopuces sont une technologie de choix en ce qui concerne la détection multiplexée. Un des désavantages de cette technique est que la séquence de la sonde de capture est dépendante de la séquence cible. Ceci peut mener à des problèmes d’hybridation croisée non prédictible (Yilmaz et al., 2012) lorsqu’une discrimination d’organismes génétiquement rapprochés est réalisée (Carter et al., 2005; Tezak et al., 2006). Un autre désavantage est que la réalisation de cette technique demande plusieurs étapes manuelles (Ullrich et al., 2012). L’utilisation de différentes solutions est aussi nécessaire pour la réalisation de chacune des étapes. Tout cela complexifie le développement à moindre coût d’outils intégrés de diagnostic.
1.2.2 Paramètres d’hybridation
Plusieurs paramètres peuvent influencer l’efficacité de l’hybridation des acides nucléiques sur les biopuces. Ces paramètres comprennent la longueur de la sonde, l'encombrement stérique, la structure secondaire de l'ADN cible et la capacité de liaison de la sonde à la surface du support solide. La longueur de la sonde influence beaucoup la spécificité. Effectivement, une sonde de 70 nucléotides donne une meilleure spécificité et des signaux d’hybridation menant à une meilleure reproductibilité. Par contre, les oligonucléotides courts, de 15 à 20 nucléotides, permettent une discrimination plus efficace des polymorphismes au niveau d’un seul nucléotide (Miller and Tang, 2009). L'encombrement stérique peut varier en fonction de la densité des sondes dans les micropoints, la longueur des espacements, l'hydrophobicité et la charge du support solide (Chizhikov et al., 2001). Effectivement, en fonction de la charge de la surface du support solide, la cible peut interagir avec cette dernière et être séquestrée, ce qui conduit à une diminution du signal d’hybridation. La structure secondaire de l'ADN peut influencer l'intensité de l'hybridation. Ceci peut être démontré à l'aide des oligonucléotides auxiliaires qui s'hybrident à côté de la sonde (Peplies et al., 2003; Wang et al., 2002). L'influence de la structure secondaire de la cible peut être en partie contournée en sélectionnant des sondes en fonction de leur comportement thermodynamique théorique (Matveeva et al., 2003).
La nature et la concentration du contre-ion contenu dans le tampon d’hybridation peuvent aussi influencer l’hybridation des acides nucléiques qui sont chargés négativement. Lors de l’hybridation, l’objectif est de rapprocher deux matrices d’ADN complémentaires ayant la même charge. Il est donc nécessaire d’avoir un contre-ion disponible pour venir neutraliser les charges des matrices d’ADN afin de permettre leur rapprochement. De façon conventionnelle, durant l’ère pré-PCR, l’ion monovalent sodium (Na+) était utilisé comme
contre-ion. Ce dernier permettait de mieux suivre les cinétiques d’hybridation qu’avec des tampons contenant des ions divalents. Les ions monovalents permettent une neutralisation plus lente des brins d’ADN (Hames and Higgins, 1985). Pour avoir une hybridation optimale, l’ion Na+ est normalement retrouvé à des concentrations aux alentours de 1M
dans les expériences d’hybridation. Springer et al. ont démontré qu’un tampon contenant une concentration aux environs de 2,5 mM de magnésium (Mg2+) (ion divalent) permettait
d’obtenir une hybridation comparable à celle effectuée dans un tampon concentré de 1M (Springer et al., 2010). Weifeng Li et al. ont étudié les effets des ions Mg2 + par rapport aux
ions Na+ sur l’hybridation de l’ADN, sur la structure de l'ADN et sur la dynamique de
conformation. L’ion Mg2+ possède une sphère d’hydratation stable qui contient six
molécules d’eau. Ces dernières interagissent avec l’ADN, principalement avec des liaisons hydrogènes. La sphère d’hydratation de l’ion Na+ contient également six molécules d’eau.
Par contre, cette dernière est relativement moins stable que celle de Mg2+ et a tendance à
perdre ses molécules d’eau. Ceci est causé par les attractions électrostatiques faibles des ions monovalents Na+ et aura une incidence sur leurs interactions avec l'ADN puisque ce
sont en partie les molécules d’eau qui permettent l’interaction avec les acides nucléiques. Ceci explique en majeure partie pourquoi une plus grande concentration de Na+ est
nécessaire pour obtenir une hybridation optimale. Par ailleurs, les ions Mg2+ agissent
spécifiquement dans les sillons majeurs de l’ADN contenant les bases G ou C. Cette spécificité est de nature électrostatique et n’est pas provoquée par des contraintes stériques. L’azote (N) 7 et l’oxygène (O) 6, à la base de la guanine, créent un environemement négatif propice à accepter une liaison hydrogène avec le Mg2+ hydraté tandis que les atomes
d’hydrogène (H) chargés positivement, que l’on retrouve sur les groupements amino en N6 des bases adénines, repoussent le Mg2+ hydraté. La liaison du Mg2+ rend le duplexe d'ADN
flexion locale. De plus, un cation Mg2+ permet de stabiliser deux brins d’ADN en même
temps tandis que le Na+ ne peut stabiliser qu’un brin à la fois (Li et al., 2011). Finalement,
peu importe le choix du contre-ion, que ce soit un ion monovalent ou divalent, la concentration de celui-ci est un paramètre critique. Une concentration trop grande diminue la spécificité de l’hybridation des acides nucléiques et une concentration trop faible produit une hybridation non optimale.
1.2.3 Dispositif intégré
L’application de la microfluidique aux dispositifs médicaux est une technologie qui repose sur des chambres et des canaux de dimension micrométrique moulés dans différents matériaux comme le silicone, le polydiméthylsiloxane (PDMS) et le polyméthacrylate de méthyle (PMMA), et qui permet le déplacement des liquides. Cette technologie microfluidique a eu une croissance explosive au cours des 20 dernières années sous l'impulsion de la convergence des techniques de diagnostic clinique (Madou, 2002). Cette technologie suscite un intérêt particulier dans le développement de dispositifs intégrés de diagnostic. Effectivement, elle offre plusieurs avantages : la miniaturisation des dispositifs, l’utilisation de faibles quantités de réactifs, la portabilité, la détection rapide et l’automatisation des étapes nécessaires pour réaliser un essai (Foudeh et al., 2012). En effet, il est possible d’effectuer l’automatisation des étapes de l’hybridation sur biopuce à l’aide des systèmes microfluidiques. L’échantillon, confiné dans les microcanaux, est conduit à la surface de la biopuce pour entrer en contact avec les sondes de capture. Pour générer les flux de liquide, différentes techniques ont été développées dont les systèmes électrocinétiques, les techniques à aspiration par le vide, les techniques à pompe, l’hydrostatique, et les techniques thermales et centrifuges (Wang and Li, 2011). Les plates-formes fluidiques basées sur la centrifugation, souvent fabriquées sous la forme d'un disque (Madou et al., 2006), utilisent la force centrifuge pour diriger l'écoulement des fluides provenant des réservoirs placés à proximité du centre du disque vers les réservoirs distants du centre du disque. Un moteur est requis pour la rotation de ce dernier. L’ouverture des différentes valves pour la libération des liquides au moment opportun sur la plate-forme est accomplie soit par un système de valves passives, soit par un système de valves actives. Les
valves actives reposent sur l'interaction entre les forces centrifuges (dépendamment de la vitesse de rotation) et les forces de capillarité (dépendamment du matériau et de la géométrie des canaux) (Walker, 2013). Les valves actives ont besoin d’être actionnées de manière externe, par exemple : l'utilisation d'une source de lumière infrarouge focalisée pour faire fondre un bouchon de cire (Abi-Samra et al., 2011). La microfluidique par centrifugation permet d’effectuer plusieurs procédés dont le fractionnement du sang, la lyse des cellules et l’homogénéisation de certains mélanges. Ceci rend le dispositif fluidique en forme de CD très attrayant pour des applications de diagnostic (Gorkin et al., 2010) (Ducrée et al., 2007).
Chapitre 2
La rtPCR permet de faire la détection rapide et sensible des acides nucléiques, mais est limitée par le nombre de cibles pouvant être détectées dans un même essai (cinq ou six cibles). Une détection multiplexée plus importante est possible en hybridant les amplicons générés lors de la PCR sur biopuce. L’incorporation de ces réactions biochimiques dans un dispositif intégré est souhaitable pour permettre l’automatisation de ces processus. Cependant, le nombre de chambres réactionnelles requis pour effectuer ces opérations ainsi que le nombre de réactifs à gérer sont trop importants pour permettre l’intégration à moindres coûts. Ceci complexifie aussi la fabrication du dispositif. Nous avons donc développé un oligonucléotide structuré (OS) qui permet de réaliser dans la même chambre de réaction et avec un seul et même tampon l'amplification par PCR et l'hybridation sur biopuce des acides nucléiques. Ce mémoire repose sur la nouvelle technologie inventée par Régis Peytavi, Karel Boissinot et moi-même. En effet, cette nouvelle technique permettrait de réduire le nombre d’étapes réactionnelles, facilitant la conception des dispositifs et permettant plus facilement l’automatisation de processus intégrés.
2.1 Objectifs
Objectif 1 : Développer un oligonucléotide structuré qui permet d’effectuer l’amplification et l’hybridation des acides nucléiques dans une même chambre réactionnelle avec un seul et même tampon.
Objectif 2 : Mettre au point un essai multiplexe avec la technologie de l’OS pour la détection et l’identification de cibles génétiques.
2.2 Hypothèses de recherche
– Il est possible d’effectuer l’amplification et l’hybridation des acides nucléiques dans une même chambre réactionnelle et dans un seul et même tampon, grâce à des changements conformationnels d’un OS et à l’activité exonucléase 5’→3’ de la polymérase permettant des modifications irréversibles de l’OS.
– L’OS a la propriété de fonctionner en milieu liquide et de jouer le rôle de sonde PCR et de sonde pour l’hybridation.
– Le tampon PCR permet l’hybridation des acides nucléiques sur biopuce.
– L’OS permet la détection multiplexe (plus de trois cibles) de cibles génétiques dans un même essai.
– L’OS permet de diminuer le nombre de chambres réactionnelles et le nombre de réactifs dans un dispositif intégré.
2.3 Critères de développement
Une des premières contraintes du projet est que les réactions doivent être réalisées dans un système fermé. L’ouverture du système pourrait conduire à des contaminations avec les amplicons produits lors de la PCR. Effectivement, comme la PCR produit des milliards d’amplicons pendant une réaction d’amplification, l’ouverture du dispositif à la fin de la réaction peut conduire à la contamination de l’espace de travail et à l’obtention de faux-positifs dans les essais subséquents.
Dans le cadre de notre projet, l’amplification et l’hybridation doivent être réalisées dans la même chambre réactionnelle. Comme la réaction d’amplification doit être réalisée dans un thermocycleur qui n’accepte que des tubes de format 0.2 mL, les biopuces utilisées doivent avoir les dimensions adéquates pour entrer dans ces tubes. Ceci nous oblige à découper les biopuces en plus petits morceaux pour permettre leur insertion dans les tubes d’amplification.
Finalement les réactions d’amplification et d’hybridation doivent être réalisées dans un seul et même tampon. De façon conventionnelle, les tampons utilisés pour l’hybridation d’acides nucléiques sur biopuce ont une forte concentration en ions monovalents Na+
(~1M), ceux-ci permettant de médier le rapprochement des deux molécules d’ADN. Par contre, comme nous voulons effectuer l’hybridation dans la chambre PCR, le tampon disponible sera le tampon PCR. Nous devons donc être capables de réaliser l’hybridation des acides nucléiques sur biopuce avec le tampon PCR. Dans ce dernier, les contre-ions disponibles sont : l’ion divalent (Mg2+), à une concentration variant de 1-6 mM selon le
tampon; et l’ion monovalent potassium (K+), à une concentration variant de 10-50 mM
selon le tampon. Par contre, dans la littérature, nous avons trouvé que la concentration de 10-50 mM de K+ avait un effet minime sur l’hybridation (Springer et al., 2010). L’ion Mg2+
est donc le seul contre-ion à avoir une contribution non négligeable sur la formation des duplexes d’ADN.
2.4 Choix des modèles expérimentaux
Comme expliqué au début du chapitre 2, les modèles utilisés pour les travaux découlent du projet principal subventionné par le NIH pour le développement d’un test diagnostique des infections respiratoires.
Les infections des voies respiratoires (IVR) sont causées dans 80 % des cas par des virus (Leruez-Ville, 2006). Une grande diversité des virus respiratoires peut être responsable de ces infections. Approximativement 200 virus connus peuvent produire des symptômes respiratoires (Abed and Boivin, 2006). Comme pour la plupart des infections, le diagnostic des IVR requiert un long temps de réponse ainsi que du personnel qualifié, ce qui pousse souvent le clinicien à poser un diagnostic empirique et à la prescription inapropriée d’antibiotiques lors d’infections virales. Le diagnostic empirique conduisant à la prescription d’antibiotiques lors d’infections virales se produit dans environ 25 % des cas (Leekha et al., 2013). La charge virale normalement retrouvée lors de ces infections peut varier de 103 à 1010 copies de gène/mL (Franz et al., 2010). Les virus respiratoires suscitent
donc un grand intérêt pour le développement de nouveaux tests de diagnostic rapide à haut multiplexage. Trois virus ont été sélectionnés pour effectuer la preuve de concept de notre technologie soient FluA, FluB et RSV. Ces derniers ont été choisis pour leur prévalence, leur intérêt clinique et la disponibilité préalable du matériel comme l’ARN/ADN génomique et les amorces d’amplification.
2.5 Aperçu des résultats et contribution scientifique
Dans un premier temps, nous avons prouvé que l’hybridation des acides nucléiques était possible dans un tampon PCR contenant du Mg2+ comme contre-ion à une concentration de
2,5 mM. À partir de cela, j’ai pu établir un protocole de dessin des OS afin de commencer leur conception. Ensuite, nous avons prouvé que l’OS permet, en simplexe, de réaliser l’amplification et l’hybridation des acides nucléiques dans une même chambre réactionnelle et dans un seul et même tampon. Nous avons ensuite été capables de faire la détection des trois cibles virales dans un essai multiplexe. Cette technologie permet de réduire les étapes des essais conventionnels d’amplification et d’hybridation et de diminuer le nombre de chambres réactionnelles et le nombre de réactifs retrouvés dans les dispositifs intégrés. Durant mon projet, j’ai apporté des modifications importantes à la structure de l’OS, ce qui m’a valu une contribution en tant qu’inventrice sur une demande de brevet (Régis Peytavi, Karel Boissinot et Laurie Girard Nucleic acid detection method. 2012. Demande de brevet US. Ref : # 61/613,109) (Peytavi et al., 2012).
Chapitre 3
Oligonucléotide structuré permettant l’amplification et
l’hybridation spécifique des acides nucléiques dans une
même chambre réactionnelle et dans un seul et même
Avant propos
Structured oligonucleotides for target indexing to allow single-vessel PCR amplification and solid support microarray hybridization.
Auteurs :
Laurie Girard1,2,ǂ, Karel Boissinot1,2,ǂ, Régis Peytavi1,2, Maurice Boissinot1,2, Michel G.
Bergeron1,2,*
1 Centre de recherche en infectiologie de l’Université Laval, Centre hospitalier universitaire
de Québec (Pavillon CHUL), Québec, Québec, Canada.
2 Département de microbiologie-infectiologie et immunologie, Faculté de médecine,
Université Laval, Québec, Québec, Canada.
ǂ. These authors have contributed equally to this manuscript
* address correspondence to this author at: Centre de Recherche en Infectiologie de l’Université Laval, Centre Hospitalier Universitaire de Québec, Pavillon CHUL, 2705 Laurier Blvd., Quebec City, Québec, G1V 4G2 Canada; fax 418-654-2715, e-mail Michel.G.Bergeron@crchul.ulaval.ca
Rôle de l’étudiante
J’ai participé au développement et à la conception du projet de recherche. J’ai aussi participé à la démonstration et à la validation des concepts. J’ai réalisé les expériences et j’ai analysé des données expérimentales. J’ai corédigé la première version du manuscrit et intégré les commentaires des coauteurs.
Rôle des coauteurs
Karel Boissinot a collaboré à la conception du projet de recherche, à la réalisation d’une partie des expériences et à l’analyse des résultats. Michel G. Bergeron, Régis Peytavi et Maurice Boissinot ont participé à l’élaboration et à la supervision du projet de recherche,
