Extraction et caractérisation des extraits cireux
de graines de Jatropha curcas pour application
biopesticide
MÉMOIRE
Abdoulaye Diakité
Département de Sols et de Génie Agroalimentaire Programme de Maitrise en Génie Agroalimentaire
Maître ès Sciences (M. SC.)
Québec, Canada
iii
RÉSUMÉ
Jatropha curcas L. est une espèce trouvée dans presque toutes les régions tropicales. Ces
graines contiennent de l’huile qui convient à la production de biodiesel et par conséquent, elle a reçu un intérêt mondial en tant que source de biocarburant. Cependant, à ce jour
Jatropha curcas n’a pas atteint son plein potentiel. Outre son utilisation pour la production
de biodiesel, le développement d’autres sous-produits de graines de Jatropha comme la cire s’ajoute à la valeur économique de cette plante. Cependant, aucune étude détaillée n’a été apportée sur le rendement en cire de graines de Jatropha et ses utilisations dans la production de biopesticide.
La présente étude a révélé que le rendement en cire de graines de Jatropha par les méthodes d’extraction utilisant le n-hexane, l’eau bouillante et l’azote liquide, était de 0,11%, 0,03% et 0,02%, respectivement.
L’analyse des thermo grammes DSC par calorimétrie différentielle à balayage montre que la cire extraite par l’hexane est plus complexe indiquant la présence de plusieurs composés différents, comparée aux cires obtenues par les deux autres méthodes. Ceci est en accord avec les résultats obtenus au microscope électronique par balayage qui montrent moins de cire sur la surface et l’intérieur de graines de Jatropha traitées à l’hexane par rapport aux deux autres solvants.
Le test biologique exploratoire effectué a révélé que les extraits cireux devraient posséder une certaine propriété biocide. Ils induisaient 100 % de mortalité des larves de stade 4 de
iv
ABSTRACT
Jatropha curcas L. is a species found in almost all tropical regions. The seeds of Jatropha curcas contain oil that is suitable for biodiesel production and therefore has received global
interest as a source of biofuel. However, so far Jatropha curcas has not reached its full potential. In addition to its use for biodiesel production, the development of other Jatropha seed by-products such as wax will add to the economic value of this plant. No detailed studies have been conducted on Jatropha seed wax performance and its uses in biopesticide production.
The present study revealed that the wax yield of Jatropha seeds was 0.11%; 0.03% and 0.02% respectively for extraction methods using n-hexane, boiling water and liquid nitrogen.
Differential scanning calorimetry analysis of the DSC thermograms shows that wax extracted with the hexane is more complex indicating the presence of several different compounds, compared to the waxes obtained by the other two methods. This is in agreement with the scanning electron microscope results which show less wax on the surface of hexane-treated Jatropha seeds compared to the other two solvents.
The exploratory biological test carried out revealed that the waxy extracts should have some biocidal property. They induced 100% mortality of stage 4 Choristoneura fumiferana larvae at a concentration of 20%.
v Table des matières
Résumé ... iii
Abstract ... iv
Table des matières... v
Liste des tableaux ... vii
Liste des figures ... viii
Liste des acronymes et des symboles... ix
Remerciements ... xi
Introduction ... 1
CHAPITRE 1. Revue de littérature ... 3
1.1. Le pourghère : Jatropha curcas ... 3
1.1.1. Description botanique ... 3 1.1.1.1. Morphologie ... 3 1.1.1.2. Taxonomie ... 6 1.1.2. Origine et distribution ... 6 1.1.3. Écologie ... 6 1.1.4. Usages ... 7 1.2. Biopesticides ... 8 1.2.1. Description ... 8
1.2.2. Potentiel insecticide de Jatropha curcas ... 9
1.3. Procédés d’extraction de cires ... 11
1.3.1. Généralité des cires ... 11
1.3.1.1. Définition ... 11
1.3.1.2. Structure, composition chimique et rôle ... 11
1.3.2. Méthodes d’extraction des lipides en utilisant des solvants ... 12
1.3.3. Extraction des cires ... 14
1.4. Le ravageur : Choristoneura fumiferana ... 16
1.4.1. Description taxonomique et morphologique ... 16
1.4.2. Origine et distribution ... 16
1.4.3. Biologie Choristoneura fumiferana ... 17
1.4.4. Dégâts et incidences économiques dus à Choristoneura fumiferana ... 18
1.4.5. Tests aux biocides ... 18
1.5. Conclusion ... 19
CHAPITRE 2. Hypothèse et Objectifs ... 20
vi
2.2. Objectif ... 20
2.2.1. Objectif général ... 20
2.2.2. Objectifs spécifiques ... 20
CHAPITRE 3. MATÉRIEL ET Méthodes ... 21
3.1. Matériel ... 21
3.2. Méthodes ... 21
3.2.1. Méthode par Soxhlet ... 22
3.2.2. Méthode d’immersion dans l’azote liquide... 23
3.2.3. Méthode par décoction à l’eau ... 25
3.2.4. Détermination du rendement... 25
3.3. Examen des surfaces de graines de J. curcas par microscopie électronique à balayage (MEB) ... 27
3.4. Analyse des extraits cireux de graines de J. curcas par calorimétrie différentielle à balayage (CDB) ... 27
3.5. Test biologique... 28
3.5.1. Préparation des produits utilisés ... 29
3.5.2. Répartition des traitements expérimentaux ... 29
3.5.3. Suivie des larves ... 29
3.6. Traitement statistique des données ... 31
CHAPITRE 4. Résultats et discussions ... 32
4.1. Extraction ... 32
4.1.1. Méthode d’extraction par Soxhlet ... 32
4.1.2. Méthode d’extraction par immersion dans l’azote liquide ... 34
4.1.3. Méthode d’extraction par décoction à l’eau... 37
4.1.4. Étude comparée des trois méthodes d’extraction des extraits cireux de graines entières de Jatropha curcas ... 38
4.2. Observation des extraits cireux par microscopie électronique à balayage (MEB) 38 4.3. Analyse des extraits cireux par calorimétrie différentielle à balayage (CDB) ... 40
4.4. Test biologique... 42 CHAPITRE 5. Conclusion ... 44 Bibliographie... 46 Annexes... 54 Annexe 1 ... 54 Annexe 2 ... 56 Annexe 3 ... 61 Annexe 4 ... 63
vii Liste des tableaux
Tableau 1 : Composition de la graine de Jatropha curcas (Winkler et al., 1997)... 5
Tableau 2 : Usages des parties de J. curcas (Temesgen, 2016) ... 8
Tableau 3 : Rendement et le temps correspondant des trois méthodes d’extraction ... 38
Tableau 4 : Anova du pourcentage des extraits cireux de graines de J. curcas extraits par le n-hexane ... 54
Tableau 5 : Pourcentage d’extraction des extraits cireux de J. curcas par le n-hexane. .. 54
Tableau 6 : Les données expérimentales correspondantes à la méthode d’extraction par Soxhlet des extraits cireux de graines de J. curcas. ... 55
Tableau 7 : Poids d’extrait de cires sec et rendement correspondant de la méthode d’extraction par immersion à l’azote liquide des extraits cireux de graines de J. curcas… ... 56-58 Tableau 8 : Test d'hypothèses pour les termes linéaires, quadratiques et inter-produits .. 59
Tableau 9 : Estimation des paramètres ... 59
Tableau 10 : Test du manque d’ajustement ... 59
Tableau 11 : Table Anova ... 60
Tableau 12 : Valeurs propres de l’analyse canonique ... 60
Tableau 13 : Point stationnaire maximum ... 60
Tableau 14 : Anova du pourcentage de cire de Jatropha curcas extrait par l’eau. ... 61
Tableau 15 : Pourcentage d’extraction de cire de Jatropha curcas par l’eau. ... 61
Tableau 16 : Poids d’extrait de cires sec et rendement correspondant de la méthode d’extraction par décoction des extraits cireux de graines de J. curcas. ... 62
Tableau 17 : Traitement de larves avec McMorran ... 63
Tableau 18 : Traitement de larves avec de l’hexane mélangés la diète ... 64
viii Liste des figures
Figure 1 : Parties importantes de Jatropha : (a) branche fleurie, (b) écorce, (c) feuille, (d) pistil, (e) fleur male, (f) coupe transversale de fruit immature, (g) fruits, (h) coupe
longitudinale de fruit, (i) graine (Heller,1996). ... 3
Figure 2 : Fruits et graines ... 5
Figure 3 : Distribution de Jatropha curcas (Heller, 1996) ... 7
Figure 4 : Cycle de vie de C. fumiferana (Rauchfuss et Ziegler, 2011). ... 17
Figure 5 : Dispositif de l’appareil Soxhlet sous la hotte chimique……….. 22
Figure 6 : Dispositif de l’appareil évaporateur rotatif ... 23
Figure 7 : Dispositif des extraits cireux par l’azote liquide ... 24
Figure 8 : Dispositif d’extraction des extraits cireux par l’eau bouillante ... 26
Figure 9 : Schéma général du processus d’extraction utilisés ... 26
Figure 10 : Microscopie électronique (JEOL, modèle JSM6360LV ; Japon) ... 27
Figure 11 : Calorimétrie différentielle à balayage (TA Instrument DSC Q1000; Newcastle, USA)... 28
Figure 12 : Dispositif expérimental pour l’élevage ... 30
Figure 13 : Dispositif de mise en expérience ... 30
Figure 14 : Répartition des différentes diètes dans le solo-cups ... 31
Figure 15 : Cinétique d’extraction des extraits cireux de graines de J. curcas par n-hexane ... 33
Figure 16 : Effet du rapport volume hexane (mL)/masse graines (g) de J. curcas sur le rendement à différentes durées d’extraction ... 34
Figure 17 : Représentation de la surface de réponse ... 35
Figure 18 : Cinétique d’extraction des extraits cireux de graines de J. curcas par immersion dans l’azote liquide ... 36
Figure 19 : Cinétique d’extraction des extraits cireux de graines J. curcas par décoction ... ...37
Figure 20 : Image de la surface par MEB de graines de J. curcas : (a) initial, (b) traité par de l’hexane, (c) traité par de l’azote liquide et (d) traité par de l’eau bouillante. ... 39
Figure 21 : Thermogrammes des extraits cireux de graines J. curcas : (a) du chauffage, (b) du refroidissement. ... 41
Figure 22 : Impact de différentes diètes sur la mortalité de larves TBE ... 42
Figure 23 : Différents traitements sur le développement des larves. (a) Diète McMorran, (b) Diète McMorran avec Hexane et (c) Diète McMorran avec extrait de Jatropha Curcas ………43
ix Liste des acronymes et des symboles Anova : Analyse de variance
Btk : Bacillus thuringiensis var. kurstaki
CDB ou DSC : Calorimétrie différentielle à balayage
L : Linné Von Carl
L : N : Lumière par rapport à la nuit
MEB : Microscope électronique à balayage
TBE : Tordeuse des bourgeons de l’épinette
°C : Celsius
g : gramme
g/ha : gramme par hectare
ha : hectare
h.r. : humidité relative
mL : millilitre
x
R (%) : Rendement exprimé en pourcentage
tpm : tour par minute
SC-CO2 : dioxyde de carbone supercritique
xi Remerciements
J’aimerais tout d’abord, remercier ma directrice de recherches, Madame la professeure Cristina Ratti, pour son soutien scientifique et moral tout au long de mon mémoire.
J’adresse mes remerciements à Céline Paquin, Jocelyne Giasson, Diego Canizares et Thanh Khuong Nguyen pour leurs supports techniques et leurs conseils au laboratoire.
J’aimerais remercier Monsieur Richard Janvier qui m'a aidé pour la prise de photos en microscopie électronique.
Je tiendrais également à remercier Véronique Martel chercheuse scientifique au Centre de Foresterie des Laurentides (Ressources naturelles Canada) pour son implication dans mon projet d’étude et pour m’avoir fait profiter de sa connaissance entomologique. Un remerciement particulier va à la technicienne Paule Huron pour son apport technique à la réalisation de mes expériences sur l’insecte.
Enfin, j’aimerais remercier le projet FASAM (Formation Agricole pour la Sécurité Alimentaire au Mali), pour l’octroi de ma bourse d’études.
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INTRODUCTION
Récemment le Jatropha curcas L, plante vivace de la famille des Euphorbiaceae, a suscité un regain d'intérêt dans le domaine de la production de biodiesel. En dehors de son utilisation potentielle en tant que matière première de biodiesel, il est reconnu que d'autres sous-produits pourraient également être développés pour augmenter la valeur économique des graines de J.
curcas (Achten et al., 2008).
Notre étude vise la valorisation du Jatropha curcas connu comme plante à potentiel biocide dont l’huile des graines est utilisée majoritairement dans la production du biodiesel. Nous avons choisi de valoriser cette plante à travers l’utilisation d’autres parties de la graine du Jatropha et en particulier la cire. Cette cire de graines de Jatropha curcas se trouve dans l’écorce de leur noix et elle est composée d'un mélange d’alcool mélissylique et de l‘ester d'acide mélissimique (Orwa et al., 2009). Les cires sont un mélange de lipides apolaires à longue chaîne qui couvrent les différentes parties aériennes de la plante et jouent le rôle d'une barrière physique / chimique vers l'extérieur permettant ainsi de contrôler les transferts de masse et les attaques de ravageurs (Lecomte, 2009). Les cires ont été considérées comme des sous-produits ou des déchets provenant de la production d'huile et sont généralement éliminés par les procédés de raffinage avant la commercialisation des huiles (Kim, 2008).
Pour extraire les cires, de nombreuses méthodes utilisant des solvants organiques ont été utilisés. En raison de leur hydrophobie intrinsèque, les cires ont principalement été extraites par des solvants non-polaires (Ohnishi et al., 1986 ; Avato et al., 1990), ou des mélanges de solvants comme le chloroforme-méthanol, le benzène et d'hexane (Hwang et al., 2002 ; 2004 ; 2005). Ces solvants sont très efficaces pour dissoudre les lipides. Cependant, ils sont aussi inflammables, très volatils et toxiques. Face à la demande des consommateurs concernant la qualité, la sécurité et l'impact environnemental des produits alimentaires, des alternatives à l’extraction par solvant organique doivent être étudiées. L’extraction avec des solvants dits « verts » tels que l’azote liquide et l’eau peuvent servir à cette fin. Des études ont montré que les cire de graines ou de fruits de certaines plantes, peuvent être extraite par l’azote liquide et par l’eau chaude (Pham et al., 2018 ; Warth, 1947).
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L'huile de graines, les extraits de graines et les esters de phorbol de l'huile de J. curcas ont été utilisés pour lutter contre divers ravageurs, souvent avec des résultats positifs (Orwa et al., 2009). Aussi l’influence de cire épicuticulaire sur le mode d’alimentation d’un insecte phytophage a été étudiée (Daoust et al., 2010). Ces études nous ont conduit à mener un test exploratoire en laboratoire, de l’activité larvicide des extraits cireux des graines du Jatropha
curcas Malien.
Ce présent mémoire comportera dans le premier chapitre, une revue bibliographique ; en second chapitre, l’hypothèse et objectifs ; dans le troisième chapitre, matériel et méthodes ; le quatrième et dernier chapitre est réservé à la présentation des résultats et discussion à partir desquels a été tirée une conclusion générale.
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CHAPITRE 1. REVUE DE LITTÉRATURE
1.1. Le pourghère : Jatropha curcas
1.1.1. Description botanique
1.1.1.1. Morphologie
Jatropha curcas est un grand arbuste aux branches plus ou moins serrées ou un arbre
relativement petit pouvant atteindre une taille de 5 à 6 mètres (Henning, 2003 ; Pellet et Pellet, 2007), exceptionnellement jusqu’à 8 – 10 mètres. Les parties importantes du Jatropha curcas L sont illustrées dans la Figure 1.
Figure 1 : Parties importantes de Jatropha : (a) branche fleurie, (b) écorce, (c) feuille, (d)
pistil, (e) fleur male, (f) coupe transversale de fruit immature, (g) fruits, (h) coupe longitudinale de fruit, (i) graine (Heller,1996).
Les feuilles ont une variabilité significative de leur morphologie du vert au vert pâle, alternes à sub-opposées, et à cinq-lobées avec une phyllotaxie en spirale (Nahar et Ozores-Hampton, 2011). La plante est monoïque et les fleurs sont unisexuées ; il y a parfois des fleurs hermaphrodites (Dehgan et Webster, 1979). Une fleur est formée de dix étamines disposées en
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deux spires distinctes de cinq chacune dans une seule colonne dans l'androecium, et à proximité les unes des autres. Dans le gynécée, les trois styles minces sont reliés aux deux tiers environ de leur longueur, se dilatant en un stigmate massif bifurqué (Dehgan et Webster, 1979). Les fleurs sont pollinisées par les insectes, en particulier les abeilles. Chaque inflorescence donne un bouquet d'environ 10 fruits ovoïdes ou plus.
Le fruit est une capsule presque sphérique, de 4 cm de long et 3 cm d'épaisseur, à trois loges séparées (les carpelles) contenant chacune une graine. Le fruit est vert lorsqu‘il se forme, puis il jaunit et devient rouge-noir ridé et rugueux. Il contient 1, 2 ou 3 graines séparées les unes des autres par une cloison. Sur 50 fruits observés par (Silveira da Cunha, 1934) au Cap Vert, 26 avaient 3 graines, 15 en contenaient 2 et 9 n‘en possédaient qu’une. Les fruits secs et mûrs restent sur la plante et libèrent rarement les graines, même en tombant au sol, car les carpelles restent soudés du côté du pédoncule des graines. Les fruits mûrs ont un poids moyen de 2,16 g (Silveira da Cunha, 1934).
Les graines sont noires marbré ou brunes foncé marbré. Elles mesurent entre 1,5 cm et 2,5 cm de long, pour une épaisseur comprise entre 0,8 cm et 1,2 cm (Pellet et Pellet, 2007). Les graines, 1 à 3 par fruit, présentent quelques analogies avec les graines de ricin. De forme ovale allongée, elles sont enveloppées d‘un tégument extérieur très dur à cassure nette, souvent appelé coque. Sous ce tégument, une pellicule blanche (tégument intérieur) recouvre l'amande (Figure 2). Cette dernière est formée d'un albumen huileux blanchâtre contenant l'embryon pourvu de 2 larges cotylédons aplatis. Les graines représentent 53 à 62 % du poids du fruit sec (Silveira da Cunha, 1934) et 15 % du fruit frais (Sucher, 1999).
Les graines contiennent environ 20% d'acides gras saturés et 80% acides gras insaturés et donnent 25 à 40% d'huile en poids (Garba et al., 2013). Elles contiennent environ 37% de l’écale et 63% de noyau (Achten et al., 2008). Outre les compositions des graines de Jatropha (Tableau 1) sont rapportées par Winkler et al. (1997).
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Figure 2 : Fruits et graines
Composés Graines avec écales (%) Graines sans écales (%)
Matière sèche 94,23 92,00
Matière sèche organique 91,06 88,16
Protéine 17,08 22,24 Huile brute 34,38 54,38 Fibre brute 22,96 2,21 Amidon 0,04 0,15 Sucre 2,67 3,30 Hémicellulose 3,22 0,18 Cellulose brute 13,98 2,91 Lignine 14,25 0,17
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1.1.1.2. Taxonomie
Jatropha curcas est une plante du sous règne des Phanérogames, de l’embranchement des
Angiospermes, de la classe des Magnoliopsida, la sous classe des Rosidae, de l’ordre des
Euphorbiales et de la famille des Euphorbiaceae. Cette plante fait partie de la sous-famille des Crotonoideae (Jussieu, 1789) et du genre Jatropha qui contient environ 170 espèces connues
(Dehgan et Webster, 1979). Dehgan et Webster (1979) ont réétudié la subdivision faite par Pax (1910) du genre Jatropha. Ils sont arrivés à distinguer deux sous genres (le Jatropha et le
curcas) et rapportent que le Jatropha curcas L. est la forme primitive du genre Jatropha.
1.1.2. Origine et distribution
Un certain nombre de scientifiques ont tenté de définir l'origine de Jatropha curcas, mais la source reste controversée. Martin et Mayeux (1984) ont identifié l'état de Ceara au Brésil comme un centre d'origine mais sans donner d'arguments. Dehgan et Webster (1979) citent, la partie de la flore du Mexique et probablement le nord de l'Amérique centrale. Selon d'autres sources, le J. curcas semble être originaire d'Amérique centrale ainsi qu'au Mexique où il se trouve naturellement dans les forêts des régions côtières (Aponte, 1978). A partir des Caraïbes, le Jatropha a été probablement importé par les navigateurs portugais à partir des îles du Cap-Vert et de la Guinée Bissau vers les autres pays Africains ainsi qu’en Asie (Heller, 1996) (Figure 3). Aujourd’hui, cette plante est largement cultivée dans la plupart des régions tropicales et subtropicales sèches (Garg et al., 2011).
1.1.3. Écologie
Jatropha curcas nécessite pas de type de sol particulier, se développant généralement dans les
sols arides et semi-arides. Il répond très bien aux sols avec un pH non neutre. Le Jatropha peut pousser sur des sols sablonneux, salins et sur des sols pierreux les plus pauvres, il peut même pousser dans les crevasses des pierres. Sur le plan climatique, le Jatropha curcas se rencontre dans les régions tropicales et subtropicales, il résiste très bien à la chaleur mais résiste également aux basses températures et peut supporter même un léger gel.
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Son besoin en eau est extrêmement faible, il ne prospère que sur 250 à 600 mm de pluie par an et peut supporter de longues périodes de sécheresse. Il vit dans les champs ouverts, comme dans les nouvelles parcelles (Recalde Posso et Duran, 2009).
Figure 3 : Distribution de Jatropha curcas (Heller, 1996)
1.1.4. Usages
Jatropha peut être utilisée dans plusieurs domaines. Chaque partie de la plante de Jatropha telle
que ses feuilles, ses coques de fruits, ses latex et ses graines a ses propres utilisations (Tableau 2) et cela fait de la plante un type polyvalent. Au Mali, les plantes de Jatropha servent de clôtures des champs de coton (Lutz, 1992 ; Henning et Von Mitzlaff, 1995). Traditionnellement au Mali l’huile des graines de Jatropha entre dans la production du savon. Elle peut remplacer le carburant fossile dans les régions éloignées où il n’est pas disponible (Lutz, 1992 ; Heller, 1996). Les tourteaux des fruits en raison de leur teneur en azote (3,2% à 3,8%) peuvent servir comme engrais organiques (3,2% à 3,8%) (Juillet et al., 1955 ; Moreira, 1970 et Heller, 1996).
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Parties de J. curcas L. à utiliser. Usages Coques de fruits - Combustibles, fumier vert
Des graines
Huile de graines
- Production de savon, carburant, insecticide, utilisations médicinales.
Tourteaux de graines
- Engrais, production de biogaz, Fourrage (provenant de variétés non toxiques).
Coquille de graine
- Combustibles
Feuilles - Utilisations médicinales.
Latex - Substance anti-inflammatoire, contient une protéase de cicatrisation, utilisations médicinales.
Tableau 2 : Usages des parties de J. curcas (Temesgen, 2016)
1.2. Biopesticides
Les produits chimiques de synthèse sont largement utilisés dans tous les pays du monde mais sont considérés comme écologiquement inacceptables. Par conséquent, il existe une pression sociale accrue pour les remplacer par des biopesticides (Mazid et al., 2011).
1.2.1. Description
Les biopesticides, « organismes vivants ou produits issus de ces organismes ayant la particularité de supprimer ou limiter les ennemis des cultures » (Thakore, 2006), sont utilisés depuis des siècles par les fermiers et paysans. Les produits considérés comme des biopesticides par les agences de règlementation européennes et mondiales sont d’origines diverses. Ils peuvent être classés en trois grandes catégories, selon leur nature : les biopesticides microbiens, végétaux et animaux (Chandler et al., 2011 ; Leng et al., 2011). Les biopesticides végétaux qui constituent un groupe important de produits phytosanitaires d'origine naturelle, contiennent des mélanges de substances biologiquement actives, de sorte que les organismes nuisibles et pathogènes ne peuvent développer de résistance (Saxena, 1983). Par conséquent, l'utilisation
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de biopesticides végétaux a été recommandée comme une alternative à la protection des plantes avec un minimum de risques négatifs (Isman, 2006). En particulier, les bioinsecticides botaniques font depuis longtemps l'objet de recherches dans le but de développer des alternatives aux insecticides conventionnels. L'utilisation d'extraits de plantes contre les ravageurs est une tradition à long terme dans le monde, Entre autres en Italie (Dayan et al., 2009) ; en Chine ancienne (Long et al., 2006), en Égypte, en Grèce et en Inde (Isman, 2006).
1.2.2. Potentiel insecticide de Jatropha curcas
Compte tenu de la grande diffusion de cette plante et de la présence de toxines dans la plupart de ses constituants, les propriétés biocides du Jatropha ont attiré l'attention des utilisateurs puis des scientifiques pour lutter contre des insectes prédateurs des cultures ou des stocks, ou contre des vecteurs de maladies (Domergue, 2008). Nithiyanantham et al. (2013) montrent que les différents extraits de graines présentent un pouvoir antioxydants important. De nombreuses observations et tests ont été réalisés sur divers insectes nuisibles. Les expérimentations complètes se sont efforcées de montrer l'intérêt de la démarche comme substitut à un produit synthétique, sans effet sur l'environnement. Toutes les parties de la plante ont fait l'objet d'études : les feuilles, l'écorce mais surtout l'huile.
En 2000, Solsoloy et Solosoy se sont intéressés à la lutte contre les nuisibles du coton. Deux niveaux de concentration d'huile de Jatropha en pulvérisation (800 et 1 250 mL/ha) ont été comparés à des insecticides couramment utilisés (profenofos à 400 g/ha et deltamétrine à 12,5 g/ha). Les populations d'insectes nuisibles et utiles ont été évaluées avant et après les traitements. La récolte a aussi été évaluée, tant d'un point de vue quantitatif que qualitatif. Trois prédateurs étaient concernés : une sauterelle (Amrarsca biguttula), un aphide (Aphid gossypii) et une chenille (Helicoverpa armigera). A. gossypii a mieux été contrôlée avec l'huile de
Jatropha qu'avec la deltamétrine, ce qui n'est pas le cas de A. biguttula. Au début des
traitements, les insecticides de synthèse ont été plus efficaces que l'huile de Jatropha sur H.
armigera ; l'huile ayant un effet sur la croissance des insectes, son effet est plus lent que les
produits de synthèse. Les parcelles traitées avec les produits de synthèse ont donné des rendements supérieurs. Un effet phytotoxique a été observé sur la parcelle traitée avec la plus
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forte concentration d'huile de Jatropha. A ce sujet, des observations ont montré un effet négatif important de la deltamétrine sur les insectes utiles, alors que les produits à base d'huiles de
Jatropha ont maintenu ces populations à un niveau suffisant. L'auteur suggère que ce sont les
acides gras qui auraient des propriétés insecticides naturelles, et qu'ils pourraient remplacer les insecticides de synthèse.
Solsoloy et Solosoy (2000) ont testé des émulsions d'huile en milieu expérimental, contre les insectes nuisibles des stocks de grains de maïs, Sitophilus zeamays, et de haricot mungo :
Callosubruchus chinensis. Les semences étaient pulvérisées puis séchées. Les dilutions testées
étaient de 0.5, 1.0, 2.5 et 10 %. La toxicité directe du traitement est faible mais l'efficacité du produit augmente avec le temps. Ainsi, après 2 mois, les dommages aux graines ne sont plus que de 10 % avec un dosage à 10 % pour S. zeamays et un dosage de 5 % pour C. chinensis. Le nombre d'œufs déposés diminue, probablement à cause d‘une capacité de reproduction en diminution et d’une répulsion du produit de traitement pour le dépôt des œufs. Il a été vérifié que la qualité germinative de la graine n'était pas affectée par le traitement.
Adebowale et Adedire (2006) ont mené une expérience similaire en laboratoire sur
Callosobruchus maculatus, insecte nuisible des graines de niébé, avec des dosages de 0.5, 1.0,
1.5, et 2.0 % d'huile de Jatropha. Ils ont observé une réduction élevée des pontes aux plus fortes concentrations et une mortalité totale des œufs et des larves quelle que soit la concentration. Les auteurs en déduisent que les graines sont ainsi protégées pendant 12 semaines, et avancent que l'effet insecticide pourrait avoir pour origine les stérols et les alcools terpènes contenus dans l'huile.
Les travaux menés par Ratnadass et al. (1997) ont montré des résultats satisfaisants pour l’efficacité insecticide d'extraits de J. curcas sur Busseola fusca Fuller (Lépidoptère : Noctuidae) et Sesamia calamistis Hampson (Lépidoptère : Noctuidae) foreurs des tiges de sorgho causant de nombreux dégâts au Nigeria et au Burkina Faso. L'efficacité de l'huile de J.
curcas (1 % du milieu nutritif) a été comparée à celle d'esters de phorbol à 0.025, 0.05 et 0.1%
incorporé au milieu nutritif pour S. calamistis et 0.01, 0.1 et 1 % du milieu nutritif pour B. fusca. Les taux de nymphose ont été nuls pour S. calamistis pour tous les traitements ayant reçu un
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produit, comme pour B. fusca pour les traitements à 0.1 et 1.0 % d'huile alors qu'il était de 55 % sur le traitement supplémenté à 0.01% et de 70% sur le témoin. Oliveira et al. (2013) a vérifié les effets des huiles de Jatropha curcas dans l'éclosion des chenilles de Diatraea saccharalis. Les résultats obtenus, ont montré que les huiles de J. curcas affectaient l'éclosion des chenilles de D. saccharalis et interféraient dans la durée de la phase d'œuf, présentant ainsi une action insecticide.
Devappa et al. (2011) indiquent que les phorbol esters isolés de l’huile de Jatropha présentent une activité antibactérienne significative.
1.3. Procédés d’extraction de cires
1.3.1. Généralité des cires
1.3.1.1. Définition
Le terme anglo-saxon wax tire son origine du vieil anglais weax qui signifie littéralement « nid d’abeille ». En ce sens, le terme de cire a été très longtemps indissociable de la cire d’abeille, un solide jaunâtre, hydrofuge et insoluble dans l’eau, cassant à froid, malléable à chaud et fondant à une température d’environ 63°C. Par extension, toute substance similaire en consistance, apparence ou composition à la cire d’abeille pouvait être qualifiée de cire. Ainsi une définition plus large et commune aux biologistes et botanistes pourrait se résumer à « un mélange de lipides apolaires à longue chaîne » (Lecomte, 2009).
1.3.1.2. Structure, composition chimique et rôle
La cuticule, formant la couche la plus externe des tissus végétaux et étant en contact direct avec l'environnement, est constituée de cires et de cutine (Tomaszewski et Zielinski, 2014). Les cires sont des mélanges complexes d'aliphatiques à très longues chaînes comprenant des alcools primaires (n-alcan-1-ols), des aldéhydes, des acides gras (acides n-alcanoïques) et des esters d'alkyle, tous se présentant principalement avec des longueurs de chaîne paires. Et les hydrocarbures, les alcools secondaires et les cétones avec prédominance de longueurs de
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chaînes impaires. Selon Christie (2011), les cires végétales sont de deux types de cires : les cires épicuticulaire et intracuticulaire. Les cires épicuticulaires sont présentes dans la surface extérieure du revêtement de graines alors que les cires intracuticulaire à l'intérieur de la couche d'enrobage des graines. D’après Buschhaus et al. (2007) la cire épicuticulaire est riche en alcanes tandis que la cire intracuticulare en alcools primaires et triterpénoïdes. Les cires épicuticulaires forment généralement un film mince et continu mais peuvent aussi être décorées de cristaux microscopiques protubérants se présentant sous forme de filaments, de bâtonnets, de plaquettes, de tubes et de structures dendritiques complexes (Jeffree, 1986 ; Barthlott et al., 1998). Irmak et al. (2006) montrent que la quantité de cire dans les graines dépend à la fois du type de graines et de leur variété.
La couche cireuse épicuticulaire agit comme une barrière entre la plante et son environnement et joue donc un rôle fondamentalement protecteur (Eglinton, 1967 ; Baker, 1982). Les fonctions les plus importantes sont la réduction de la transpiration et le contrôle des échanges gazeux (Grncarevic et Radler, 1967 ; Sutter et Langhans, 1982).
D'autres fonctions sont la réduction de la mouillabilité superficielle (Holloway, 1970 ; Juniper et Southwood, 1983) et la protection contre les agents pathogènes fongiques, les bactéries, les virus et les attaques d'insectes (Atkin et Hamilton, 1982). Les cires naturelles offrent des propriétés exceptionnelles dans divers systèmes de produits cosmétiques, pharmaceutiques, alimentaires et ménagers (Endlein et Peleikis, 2011). Elles sont également appliquées sur la surface de fruits pour leur conservation (Sreenivas et al., 2011).
1.3.2. Méthodes d’extraction des lipides en utilisant des solvants
Les lipides sont des corps gras caractérisés par leur insolubilité dans l’eau et leur solubilité dans les solvants organiques. Ils ont pour constituants majeurs les triglycérides et pour constituants mineurs les phospholipides, les cérides (cires) et les composants de l’insaponifiable (Djandoun, 2012). L'extraction par solvant a été définie comme un procédé de transport de matériaux d'une phase à une autre dans le but de séparer un ou plusieurs composés des mélanges (Johnson et Lusas, 1983).
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Un grand nombre de méthodes d'extraction des lipides ont été développés et décrit à l'échelle de laboratoire. Parmi eux, le procédé d'extraction par Soxhlet est l'un des plus couramment utilisés, dans lesquels on utilise des solvants organiques pour solubiliser les lipides à partir de matières solides. Il est la principale référence à laquelle la performance des autres méthodes de lixiviation est comparée (Luque de Castro et Garcia-Ayuso, 1998). Comme les lipides sont des composés hydrophobes, ils sont généralement extraits par l'hexane, le benzène, le chloroforme, l'éther de pétrole et d'acétone (Hwang et al., 2002). Actuellement l'hexane est le solvant de choix par les transformateurs d'oléagineux (Johnson et Lusas, 1983). Selon une étude d'Achten
et al. (2008), le n-hexane apparaît comme le plus commun dans l'extraction chimique et celui
qui présente le plus de rendement de 95 à 99%. Le schéma du Soxhlet est indiqué à la Figure 5 (voir matériels et méthodes). Pendant le processus d’extraction, le solvant extrait transporte les matières extraites avec lui. Ce cycle est répété en continu jusqu'à ce que le chauffage soit arrêté. Typiquement, l'extraction utilise une grande quantité de solvant et doit être effectuée pendant plusieurs heures (Sin, 2012). Brossard-González et al. (2010) ont effectué des extractions sur les graines entières de J. curcas dont les coquilles ont une pigmentation foncée, les solvants utilisés étaient alcool éthylique et n-hexane. Les températures d’extraction étaient de 50-60°C pour le n-hexane et de 60-70 °C pour l'éthanol. Probablement, les huiles extraites par les deux solvants ont des différences de composition marquées en raison des différentes polarités et constantes diélectriques des solvants. Il est important de noter que l'augmentation du temps d'extraction à l'éthanol peut faciliter la solubilisation des pigments et des hydrates de carbone présents. Cependant, dans le cas du n-hexane du fait de son caractère non polaire, les dits phénomènes de solubilisation ne se produisent pas. Bagan et al. (2012) apportent que l’huile de
Jatropha curcas a été extraite au Soxhlet avec de l’hexane à 69°C après que les graines ont été
convenablement séchées au soleil, triées et débarrassées de toutes les impuretés puis enfin broyées finement. De même l’huile de Jatropha curcas, a été obtenue par extraction des graines (finement broyées), au Soxhlet pendant 6 heures à la température de 70°C. Les traces d'hexane ont été éliminées au rotavapor (Djenontin et al., 2006).
14 1.3.3. Extraction des cires
Pour extraire les cires végétales, les solvants organiques sont généralement utilisés (Christie, 2011). En raison de leur hydrophobie intrinsèque, les cires ont principalement été extraites par des solvants non-polaire (Ohnishi et al., 1986 ; Avato et al., 1990) des mélanges de solvants comme le chloroforme-méthanol, le benzène et d'hexane (Hwang et al., 2002 ; 2004 ; 2005). Les cires peuvent être extraites en utilisant diverses techniques d'extraction par solvant telles que Soxhlet. Les techniques d’extraction sont les mêmes que celles pour des lipides. Dans le but supplémentaire de séparation de la cire à partir de l'extrait, deux voies ont été proposées. La première consiste en une évaporation du solvant à partir du mélange contenant des cires et mélanger l'extrait de cire avec d'autres solvants polaires (acétone ou d'alcool), suivi par la précipitation des cires et de la filtration. Le second, en cristallisant les cires par une incubation du mélange d'extraction à -18 ° C, puis les cires cristallisées sont recueillies par filtration (Hwang et al., 2002). Hwang et al. (2004 ; 2005) ont appliqué la méthode décrite précédente pour extraire la cire à base de céréales sélectionnées d'origine coréenne (sorgho, riz brun, riz violet, blé et maïs). Ces graines ont été chauffées au reflux dans de l'hexane pendant 30 minutes, le rapport de l'hexane et les graines était de 1 : 1 (v / p). Ces mélanges ont ensuite été filtrés à basse température et la cire précipitée a été obtenue. Le rendement de cire varie de 0,2 à 0,3% selon le type de graines et les solvants. Une autre méthode a été décrite par Hemmers et Gülz (1986), dans lequel les pousses de feuilles ont été extraites deux fois par une courte immersion dans du chloroforme distillé. Les extraits de cire ont été combinés, filtrés, évaporés à sec, pesés et ensuite redissous dans un petit volume d’hexane distillé avec un léger réchauffement. Cependant, les méthodes avec solvants organiques présentent plusieurs inconvénients tels qu'un fonctionnement qui prend du temps, des solvants dangereux et inflammables et un aspect hostile à l'environnement et des résidus particulièrement dangereux restant dans les produits finaux.
Au cours de l'extraction de produits naturels de grandes quantités de solvants sont utilisées et éliminées. Alors son impact sur l'environnement doit être considéré avec soin pendant le processus de sélection. Les chercheurs et les industries ont développé des « guides verts » à base de solvants pour mettre en évidence les problèmes environnementaux associés aux solvants individuels et visent à l'utiliser comme guide des solvants plus écologiques. La plupart
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des guides de solvants prennent en compte trois domaines principaux : les impacts sur l'environnement, la santé et la sécurité associés à chaque solvant (Sin, 2012).
La séparation de cires végétales peut être réalisée aussi en utilisant des solvants non organiques tels que fluides cryogéniques, ainsi que de l’eau (Pham et al., 2018; Warth 1947). La méthode d'extraction pour les lipides alimentaires connue par le nom d’extraction par fluide supercritique a récemment été largement documentée pour de nombreuses raisons. Le principe d'extraction répond à la capacité unique des fluides supercritiques qui peuvent diffuser à travers les solides comme un gaz, et de dissoudre les matériaux comme un liquide. Le dioxyde de carbone et de l'eau sont les deux substances couramment utilisées pour extraire des matériaux hydrophobes et hydrophiles, respectivement. Des méthodes d'extraction par fluide supercritique utilisant du CO2 (SC-CO2) ont été utilisées pour extraire de nombreuses sources alimentaires et médicamenteuses puisque le CO2 peut facilement devenir gazeux à l'état ambiant (Lang et al., 2001).
L’azote liquide est produit à partir d'environ 78% de diazote présent dans l'air atmosphérique. Il est produit en grande quantité par distillation fractionnée de l'air liquide (CGA, 1981). L'azote existe en phase liquide, à la pression ambiante, entre -209,86°C (point de fusion) et -195,8°C (point d'ébullition) (Rockswold et Buran, 1982). Ketata et al. (2013) ont montré que l'azote liquide pouvait réduire la teneur en cire de la surface des bleuets, ce qui raccourcissait le processus de séchage. De même, les bleuets, les fruits d'argousier et les raisins verts traités à l'azote liquide ont montré une diminution des temps de séchage pour différentes méthodes de séchage (vide, air chaud et lyophilisation). La surface de ces fruits a été observée par microscopie électronique à balayage avant et après prétraitements à l'azote liquide, indiquant la disparition de leur cire épicuticulaire, qui est principalement responsable de ralentir le séchage (Thromas et al., 2010 ; 2011). Une autre étude d’extraction des cires des graines (riz, sorgho et blé) par l’azote liquide a été effectuée par Pham et al. (2018). Ces céréales ont été immergées dans l’azote liquide de 1 à 3 cycles à différentes durées d’immersion (0,5 à 10 minutes à la température de -196 ° C) et différents temps de repos entre les cycles (1-5 minutes à la température ambiante). L’expérience a été fait en triplicata pour chaque cycle et chaque durée d’immersion. Les résultats ont montré que le rendement d’extraction le plus élevé était de
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0,026% (g pds cire/100g pds grain) (riz-11minutes d'extraction), 0,032% (sorgho - 4 minutes) et 0,025% (blé-13 minutes). Une étude similaire mais avec une légère modification a été réalisée par (Lours, 2016) sur les graines de lin. L’expérience donne à 20 secondes d’immersion un rendement optimum de 0,015% (g pds cire/100g pds graines).
Certaines études ont montré que l’eau peut extraire la cire/graisse des graines/fruits. L’eau est le solvant le plus utilisé en industrie agroalimentaire (Bimbenet et al., 1993). La cire est séparée des baies Myrica Cordiflolia en les faisant bouillir avec de l'eau lorsque la cire flotte à la surface et peut être enlevée par écumage. Le processus d'ébullition est poursuivi pendant environ quatre heures, période au cours de laquelle pratiquement toute la cire est extraite. La cire chaude est filtrée et recueillie dans des récipients séparés, puis laissée refroidir et se solidifier (Schoeman, 1946). Une autre étude rapporte que l’on peut extraire la cire des baies de Myrica jalapensis Kunth et de M. xalapensis H.B.K. en les faisant bouillir dans l’eau. A mesure que l’eau bout la cire blanche-verdâtre surnageant est recueillie au-dessus de l’eau. Il a été rapporté que les baies contiennent de 7 à 12% de cire blanche-verdâtre extractible à l'eau bouillante (Warth, 1947).
1.4. Le ravageur : Choristoneura fumiferana
1.4.1. Description taxonomique et morphologique
La tordeuse des bourgeons de l'épinette (Choristoneura fumiferana) est un lépidoptère, identifié et initialement assigné au genre Tortrix. Elle appartient à la famille des tortricidés, d’où elle tire son nom vernaculaire. Le genre Choristoneura compte environ treize espèces, dont fumiferana (Harvey, 1985). Le corps d’adulte a une longueur d’environ un demi-pouce et une largeur de trois quarts de pouce. Les ailes antérieures ont une forme oblongue et des couleurs très variables. Il y a généralement une tache blanchâtre assez grande et visible au milieu de la marge supérieure de l'aile antérieure (Mathers, 1932). Toutefois aux premiers stades, la chenille a une tête noire et des pattes thoraciques de couleur brun foncé (Rose et Lindquist, 1994).
1.4.2. Origine et distribution
La tordeuse des bourgeons de l'épinette (Choristoneura fumiferana) est un insecte indigène en Amérique du Nord où il est considéré comme le pire fléau des forêts de sapin et d’épinette
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(Martineau, 1985). L’habitat de la tordeuse est associé à la foret coniférienne et mixte. La distribution continentale de l’insecte correspond à celle du sapin baumier et de l’épinette blanche (Harvey, 1985).
1.4.3. Biologie Choristoneura fumiferana
Le cycle de vie de Choristoneura fumiferana se déroule en une seule année (Figure 4). Les larves de deuxième stade qui passent l'hiver émergent au printemps et commencent à s'alimenter sous les bourgeons des pousses en expansion. Lorsqu'ils atteignent le quatrième stade au début de juin, les larves se nourrissent à l'extérieur sur un nouveau feuillage jusqu'à la fin du sixième stade, puis se purifient sur le feuillage. Les adultes émergent du début à la mi-juillet et pondent des œufs en masses composées d'environ 20 œufs. Les œufs éclosent et les premiers stades se dispersent, sans se nourrir, pour produire des hibernacles hivernants sur les branches des arbres où ils muent jusqu'au deuxième stade et entrent en diapause hivernale (Smith et al., 2002).
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1.4.4. Dégâts et incidences économiques dus à Choristoneura fumiferana
Les dégâts de la tordeuse des bourgeons de l'épinette sont commis par les chenilles lors de leur alimentation et ils sont surtout accentués lors du dernier âge larvaire (Martineau, 1985.) La tordeuse des bourgeons de l'épinette (Choristoneura fumiferana) est un insecte indigène qui défolie les arbres à feuilles caduques, en particulier le sapin baumier (Abies balsamea) et l'épinette (Picea spp.), Dans le nord de l'Amérique plusieurs millions d'hectares de sapin baumier peuvent être tués lors d'une éclosion de la tordeuse des bourgeons de l'épinette (Simpson et Coy, 1999), décimant à l'échelle régionale la source de bois hautement souhaitable pour les industries du papier et du bois de sciage (Irland, 1980). La perte annuelle de volume de bois productif attribuée aux insectes au Canada était d'environ 56,6 millions de m3 de 1977 à 1987. La tordeuse des bourgeons de l'épinette a causé plus de 60% de cette perte de productivité forestière (Fleming, 2000 ; Sterner et Davidson,1982 ; Hall et Moody, 1994).
1.4.5. Tests aux biocides
Parmi les biopesticides les plus utilisés dans le monde, le Bacillus thuringiensis var. Kurstaki HD-1 (ATCC 33679) (Btk) est le plus efficace dans la lutte contre la tordeuse des bourgeons de l’épinette (Glare et O’Callaghan, 2000 ; Valéro et al., 1999). Une expérience a été conduite sur le système d’interaction tannins d’épinette blanche - Bacillus thuringiensis var. Kurstaki (Btk) -Tordeuse des bourgeons de l’épinette (TBE) à l’aide d’extraits polyphénoliques de feuillage et de toxines de Btk incorporés seuls et/ou en combinaison à diverses concentrations dans un substrat alimentaire artificiel. Les résultats de ces travaux ont montré qu’individuellement ces deux types de composés (tannins et Btk) ont de sérieux effets délétères sur l’insecte. Cependant, lorsqu’ils sont présents ensemble dans la nourriture, ces derniers ont des effets antagonistes mutuels réduisant ainsi leurs effets létaux respectifs envers l’insecte (Kumbasli, 2005).
Dans une plantation de l’épinette blanche au sud du Québec composée d’arbres résistants et sensibles à la tordeuse de bourgeons d'épinette, une étude a été menée pour identifier le rôle de cire épicuticulairedans les mécanismes de la résistance des arbres à la tordeuse en comparant la composition de cires foliaires des arbres sensibles et résistants et le mode d'alimentation des
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larves au premier contact avec le feuillage. Le résultat de cette étude a montré une réduction du nombre de périodes d'ingestion et une réduction de la durée du premier repas dans le cas des insectes en présence d'arbres résistants. Lorsque les cires épicuticulaires ont été enlevées, le nombre de tordeuses qui a passé de la phase de palpage à la phase d'ingestion a augmenté sur les aiguilles provenant d'arbres résistants. L’analyse chimique a montré que des feuilles prélevées sur des arbres résistants contenaient à leur surface des concentrations plus élevées de monoterpènes α-pinène et de myrcène à celles trouvées dans les feuilles prélevées sur des arbres sensibles. Ceci indique que les monoterpènes dans la cire influencent le mode d'alimentation de la tordeuse et jouent un rôle important dans la résistance de l'épinette blanche à la tordeuse (Daoust et al., 2010).
Des bioessais faits à la suite d’applications de tébufenozide sur des arbres en pots dans des enclos extérieurs ont révélé de multiples effets sur la survie et le recrutement de la tordeuse. Une exposition chronique (14 jours) de larves d’âge avancé à du feuillage traité a réduit non seulement leur survie, mais également celle des chrysalides, le succès d’accouplement et la fécondité des survivants, selon la concentration appliquée. Des traitements produisant un dépôt foliaire de ~ 0.5–1.5 μg de tébufenozide par g ont causé une forte mortalité. L’exposition à un dépôt de ~ 0.15–0.5 μg par g a causé une mortalité retardée au cours de la pupaison et la réduction du succès d’accouplement des survivants. L’exposition à ~ 0.07–0.15 μg par g a quant à elle réduit la fécondité des femelles accouplées. L’exposition sous-létale n’a eu aucun effet sur la progéniture des survivants, que ce soit en termes d’éclosion des œufs, de survie en diapause ou de survie et performance post-diapause (Van Frankenhuyzen et Régnière, 2017). Les stratégies des grands industriels du secteur phytosanitaire et l’évolution des choix des consommateurs (Deravel et al., 2014).
1.5. Conclusion
Ces résultats rapportés appuient fermement d’une part que l'azote liquide et l’eau pourraient être utilisés pour extraire des cires à partir des surfaces végétales comme les graines de Jatropha et d’autre part, tester l’efficacité de ces extraits cireux sur les insectes.
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CHAPITRE 2. HYPOTHÈSE ET OBJECTIFS
2.1. Hypothèse
Les extraits cireux de graines de Jatropha curcas peuvent être extraites par des solvants non organiques tels que l’azote liquide et de l’eau bouillante et pourraient être utilisés comme biocides naturels.
2.2. Objectif
2.2.1. Objectif général
Développer le bioinsecticide à partir de cires de graines de plantes propre au Mali pour la protection de cultures.
2.2.2. Objectifs spécifiques
- Étudier différentes méthodes d’extraction par solvant sur le rendement en extraits cireux de graines de Jatropha curcas.
- Caractériser les extraits cireux par calorimétrie différentielle à balayage et la surface de graines de Jatropha curcas après extraction, par microscopie électronique à balayage.
- Faire un test exploratoire du potentiel insecticide des extraits cireux sur les insectes nuisibles (larves de Choristoneura fumiferana).
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CHAPITRE 3. MATÉRIEL ET MÉTHODES
3.1. Matériel
Les graines de Jatropha curcas ont été achetées au marché du Mali entre novembre 2016 et février 2017. Elles ont été nettoyées à l’aide des chiffons en tissu pour éliminer les particules de poussière, puis séchées à l'air sur un plateau en plastique à température ambiante pendant trois semaines pour éliminer l’humidité résiduelle. Les graines ont été emballées dans des sacs de plastique de manière à l’empêcher de devenir parasitées ou de propager un parasite pour ensuite être importées au Canada puis entreposées dans la chambre froide de la Faculté des sciences de l’agriculture et de l’alimentation de l’Université Laval jusqu’à leur utilisation. L'azote liquide a été obtenu auprès de Praxair, Canada. Le n-hexane, le papier Wathman, les vials et les ballons de chauffe ont été achetés au magasin scientifique Biobars Université Laval, Québec Canada l’équipement Soxhlet a été fourni par Glas-Col 711 Hulman St, Terre Haute, États-Unis.
Les larves de Choristoneura. fumiferana et le substrat artificiel (diète McMorran) utilisées ont été fournies par le laboratoire d’entomologie du Centre de foresterie des Laurentides (CFL),1055 rue du PEPS Université Laval Québec (Québec). Les tordeuses de bourgeons de l’épinette (TBE) de la souche non diapausante ont été reçues sous forme d'œufs et ont été élevées sur de la diète artificielle (McMorran, 1965) en chambre de croissance, à 25 ±1°C, 60 ± 5% h.r., et sous une photopériode 16h :8h (L : N). Les TBE diapausantes ont été reçues à différentes périodes de leur développement : œufs, tout juste après avoir tissé l'hibernaculum, 4, 8, 12, 16, 20 et 24 semaines en diapause et post diapause.
3.2. Méthodes
L’extraction des graines de J. curcas a été effectuée dans un laboratoire du département des Sols et Génie Agroalimentaire de l’Université Laval. Les solvants utilisés pour l’extraction sont : l’eau, l’azote liquide et n-hexane. Trois types de procédés d’extraction ont été réalisés : La décoction à l’eau, l’immersion en azote liquide et l’extraction en Soxhlet (n-hexane).
22 3.2.1. Méthode par Soxhlet
La méthode utilisée a été celle de Hwang et al. (2005) mais avec quelques modifications. La cire a été extraite des graines de Jatropha en utilisant n-hexane. L’extraction a été réalisée sur 25 à 50 grammes de graines entières de J. curcas dans un ballon pyrex à fond rond de 250 mL, auxquelles est ajoutée 150 mL de n-hexane. L’ensemble est placé sur un manchon de chauffage Glas-Col communiqué à un régulateur de tension (Figure 5) dont l’extraction se fait à une température constante de 69°C et à des temps différents : 15, 30, 60, 90, 120 ,180 et 240 minutes. Le rapport solide / solvant variait de (6 :1 à 3 :1). L’apparition des premières gouttes dans le ballon marque le début du comptage du temps d’extraction. Une fois l'extraction terminée, le mélange est filtré à travers un double papier filtre (le papier Whatman #2 ᴓ125mm et le papier filtre à café conique) et le filtrat récupéré dans un ballon à fond plat de 250 mL a été évaporé à l’aide d’un évaporateur rotatif de Buchi (Rotavapor R-205 ; T= 42°C et vitesse de rotation = 100 tpm) (Figure 6) qui consistait dans un premier temps à évaporer le contenu du ballon jusqu’à 5 mL. Ensuite à transvaser le contenu du ballon dans un vial pesé au préalable puis rincer le ballon (en vue de détacher des composés lipidiques accolés à la paroi du ballon d’évaporation) à trois reprises avec chaque fois 5 mL du solvant, qui ont été recueillis dans le même vial. Dans un deuxième temps le contenu du vial a été évaporé complètement. Trois répétitions pour chaque temps d'extraction ont été effectuées.
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Figure 6 : Dispositif de l’appareil évaporateur rotatif
Les extraits cireux dans le flacon ont été placés sous la hotte chimique pendant 24 heures en vue d’éliminer éventuel d’hexane résiduel. Le vial été pesé à nouveau afin de déterminer la masse des extraits. Apres détermination de la masse de cire, elle a été stockée dans le congélateur à -18°C pour les tests postérieurs.
3.2.2. Méthode d’immersion dans l’azote liquide
L’extraction de la cire a été réalisée selon la méthodologie décrit par Pham et al. (2018) en y apportant quelques modifications. Un bol de 3 litres en inox (Figure 7) est rempli au 2/3 à l’azote liquide dans lequel nous plongions 25 g de graines entières de Jatropha placées dans une passoire. L’extraction se fait à différentes durées d'immersion (de 1 à 10 minutes) et nombre de cycles (de trois à cinq). Après chaque immersion dans l'azote liquide (-195,8°C) les graines ont été placés à température ambiante pendant (1 à 3 min) et cela se fait de façon cyclique. Un cycle a été défini comme étant la période pendant laquelle les échantillons étaient dans l'azote liquide (Timm) et le temps pendant lequel les échantillons passent à la température ambiante (Trep). Une fois l’extraction terminée le bol contenant les cires a été laissé à la température ambiante jusqu’à l’évaporation complète de l’azote liquide. Après cette évaporation, nous ajoutions 50 mL d’hexane pour rincer le bol. Le mélange hexane-cires est filtré et le filtrat a été récupéré dans un ballon à fond plat de 250 mL. Afin de bien récupérer toute la cire présente
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dans le bol, a été rincé deux fois de plus avec 50 mL d’hexane qui ont été filtré respectivement. Tous les filtrats sont récupérés dans le même ballon. De la même manière que précédemment nous évaporions le solvant à l’aide de l’évaporateur rotatif de Buchi jusqu’à avoir environ 5 mL au fond du ballon puis nous transférions le contenu du ballon dans un vial dans lequel a été évaporée la totalité du solvant.
Les cires recueillies sont stockées dans le congélateur à -18 °C jusqu’à usage ultérieur. L'expérience a été triplée pour chaque cycle et chaque durée d'immersion.
Figure 7 : Dispositif des extraits cireux par l’azote liquide
Le temps d’extraction total a été calculé selon Pham et al. (2018) par l’équation (1) :
Text = Ncycle x Timm + ( Ncycle - 1) x Trep (1)
où Text : temps d'extraction (min) ; Ncycle : nombre de cycle d'immersion dans l'azote liquide ; Timm : temps d'immersion (min) ; Trep : durée pendant laquelle les échantillons traités restent à température ambiante jusqu'à ce qu'ils soient soumis au second traitement (min).
L’impact des paramètres de traitements (temps d’immersion, temps de repos et le nombre de cycle) sur le rendement en extraits cireux de graines de Jatropha a été déterminé en utilisant un modèle de surface de réponse. Dans cette étude, on fait l’hypothèse que le rendement de cire produite par les graines de Jatropha est influencé par ces trois dits paramètres. L’objectif de
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cette modélisation est de déterminer la combinaison de facteurs d’entrée (temps d’immersion, temps de repos et nombre de cycles) qui permet d’optimiser la variable de sortie (rendement). La méthodologie des surfaces de réponse a pour but d’explorer les relations entre une variable réponse y et plusieurs variables dépendantes 𝑥𝑥1, … , 𝑥𝑥𝑑𝑑 par ajustement d’une fonction mathématique, dans l’objectif notamment d’optimiser la réponse y. Le principe de la méthode est de trouver les conditions d’expérimentation optimales en réalisant un nombre restreint d’expériences. Les résultats des tests d'hypothèses, d’estimation des paramètres, de tests du manque d’ajustement, de l’analyse Anova et de l’analyse canonique ont été placés dans les Tableaux 8, 9, 10, 11, 12 et 13 en Annexe 3.
3.2.3. Méthode par décoction à l’eau
L’extraction est réalisée à l’eau distillée dans un bécher de 1 000 mL chauffé jusqu'à l’ébullition auxquelles a été ajoutée de graines entières avec une proportion de 1/10 (g/mL) pendant 10 à 15 minutes (Figure 8). Après extraction à l’eau les graines ont été séparées du mélange à l’aide d’une passoire pour être centrifugé à l’aide d’une centrifugeuse (20°C, 10000 tpm, 15 min). Puis récupérer la phase aqueuse contenant les extraits cireux à laquelle a été ajoutée du n-hexane (ratio hexane/extrait aqueux :1/4 (mL/mL)). Agiter manuellement pendant 3 à 5 minutes et laisser le mélange reposer au moins à 15 minutes jusqu'à l’obtention de deux phases, une phase hexane surnageant et une phase aqueuse puis prélever le surnageant avec une pipette Pasteur et le transférer dans le ballon en le filtrant avec le papier filtre à café. Éliminer l’hexane du filtrat à l’aide de l’évaporateur rotatif sous vide jusqu’à un volume d’environ 5 mL. Comme dans les deux méthodes précédentes le filtrat a été transféré dans le vial auquel la totalité du solvant a été évaporée. Les extraits cireux obtenus ont été conservés dans le congélateur à -18 °C jusqu’à leur utilisation postérieure. L'expérience a été triplée pour chaque temps d’extraction.
3.2.4. Détermination du rendement
Le poids de l’extrait sec a été déterminé par la différence entre le poids du vial plein (après évaporation) et le poids du vial vide (avant évaporation). Le pourcentage du rendement a été calculé en utilisant l’équation (2) :
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𝑅𝑅(%) = Poids d′extraits cireux(g)
Poids de graines (g) x 100 (2)
Figure 8 : Dispositif d’extraction des extraits cireux par l’eau bouillante
La Figure 9 résume la procédure d’extraction de cires aux trois méthodes étudiées.
Figure 9 : Schéma général du processus d’extraction utilisés
Extraction à l’azote liquide Extraction à n-hexane
Extraction à l’eau Filtration Filtrat Extraits aqueux Centrifugation Évaporation Hexane Phase aqueuse Conservation à -18°C pour tests ultérieurs Extraits cireux Surnageant Extraits cireux brutes
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3.3. Examen des surfaces de graines de J. curcas par microscopie
électronique à balayage (MEB)
Les graines ont été d'abord nettoyées de manière à leur ôter les impuretés, puis séchées. Ensuite les graines sont métallisées avec du palladium dans une chambre à plasma d'argon. Les observations ont été portées sur des graines non traitées et des graines traitées de Jatropha aux différents solvants, vues sous différents angles dans le but de visualiser les cires à la surface de l’ensemble de revêtement de graines. Les graines ont été placés sur le support d'observation du microscope électronique à balayage de type JEOL, JSM 6360 LV (Figure 10). Les surfaces de graines ont ensuite été observées par le microscope fonctionnant à une tension d'accélération de 15 kV et un grossissement de 1000 X.
Figure 10 : Microscopie électronique (JEOL, modèle JSM6360LV ; Japon)
3.4. Analyse des extraits cireux de graines de J. curcas par calorimétrie
différentielle à balayage (CDB)
Les caractéristiques thermiques des échantillons de cire ont été mesurées à l'aide de la calorimétrie différentielle à balayage (TA Instrument DSC Q1000 ; Newcastle, USA) voir Figure 11 ci-dessous. L'indium a été utilisé comme référence et les mesures ont été utilisés
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comme référence et les mesures ont été effectuées sous un flux d’azote de 50 mL/min. Les échantillons de (1-10 mg) ont été pesés et placés dans de microcapsules de fusion en aluminium qui sont ensuite scellées hermétiquement puis placées à l’intérieur de la chambre calorimétrique à balayage avec le récipient de référence vide. Après refroidissement par de l'azote liquide, l'échantillon a été chauffé de 20°C à 90°C à la vitesse de 10°C / min, maintenu à 90 °C pendant 1 min et refroidi à -30 ° C à 10 ° C / min. Après maintien de l'échantillon à -30 ° C pendant 1 min, il a été chauffé de -30 à 90°C à 10°C / min et maintenu pendant 1 min à 90°C. Les deux étages de chauffage et de refroidissement fonctionnaient à 20 mL / min de gaz de purge et à 50 mL / min de gaz de protection (azote gazeux). Chaque essai à la calorimétrie différentielle a été effectuée en double.
Figure 11 : Calorimétrie différentielle à balayage (TA Instrument DSC Q1000; Newcastle,
USA).
3.5. Test biologique
Les extraits cireux de graines de Jatropha curcas (Figure 13a) obtenus précédemment à partir des différentes méthodes d’extraction ont servi pour les tests biologiques. L’objectif de ces essais biologiques consistait à avoir une idée préliminairede l’impact insecticide des extraits cireux de Jatropha sur les larves de Choristoneura fumiferana. Les Tordeuses de bourgeons d’épinette de la souche non diapausante ont été reçues sous forme d'œufs et ont été élevées sur de la diète artificielle (McMorran, 1965) en chambre de croissance (voir Figure 12), à 25 ±1°C,
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60 ± 5% h.r., et sous une photopériode 16h : 8h (L : N). Des larves de 4ème stade de la TBE ont été utilisées lors des traitements puisque ce stade de développement est une préférence lors des épidémies, par les agents d’applications de contrôle (Pedersen et al., 1997).
3.5.1. Préparation des produits utilisés
La diète a été préparée selon la méthode de McMorran (1965) avec une légère modification. Elle comportait deux grandes étapes. La première était de produire en grande quantité le régime alimentaire en vue de la conserver sur une longue période de temps au congélateur. La deuxième étape a consisté à décongeler la diète préparée (Figure 13b), la chauffer dans un four micro-ondes de façon à la rendre liquide et permettre l’incorporation des vitamines (ratio = 1g/99,4g de diète) et des extraits cireux (ratio = 1g/5g de diète). Le mélange a été ensuite coulé dans les cups solo prépesés dans lesquelles les insectes sont placés pour l’expérience (voir Figure 14).
3.5.2. Répartition des traitements expérimentaux
La recette de 45g de McMorran a été répartie en trois parties de traitement à savoir le traitement 1 ou témoin (diète McMorran) ; le traitement 2 (diète McMorran + Hexane à 1/100 du mélange) et le traitement 3 (diète McMorran + extrait de Jatropha Curcas à 20/100 du mélange). Pour chaque traitement, 5 petit solo-cups ont été préparés avec 5 larves par cup. Donc 25 larves du stade 4 ont été placées par traitement (voir Figure 14).
3.5.3. Suivie des larves
Le temps a été suivi en jours juliens. Le jour julien est la base d'un système de datation consistant à compter le nombre de jours et fraction de jour écoulés depuis une date conventionnelle fixée. La datation en jours juliens rend particulièrement simples les calculs sur les dates puisqu'elle est indépendante de cycles calendaires complexes (durée inégale des mois, mois intercalaires, jours supplémentaires, années bissextiles, etc.).
A l’intérieur de la chambre les larves ont été laissées s’alimenter dans les solo-cups. Ainsi, le jour julien a été noté ainsi que le développement, la mortalité des larves, le poids et le sexe des chrysalides, s’il y a lieu.
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Figure 12 : Dispositif expérimental pour l’élevage
(a) Extraits cireux (b) diète
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Figure 14 : Répartition des différentes diètes dans le solo-cups
3.6. Traitement statistique des données
Les expériences d’extraction ont été répétées trois fois. L’analyse de variance a été utilisée pour tester la différence entre les moyennes de rendement et de comparaison de l'efficacité des trois méthodes d'extraction, qui ont été analysées par le test multiple-rang du test de Duncan a un niveau de signification de 95% (P <0,05) en utilisant le logiciel statistique 9.4 (SAS Institute, USA).
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CHAPITRE 4. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS
4.1. Extraction
Les solvants utilisés dans cette étude ont été du n-hexane, de l’azote liquide et de l’eau bouillante. Les résultats de cette partie d’étude ont porté principalement sur le rendement d’extraction des extraits cireux par ces trois méthodes d’extraction et les facteurs qui pouvaient les influencer, en vue de leur optimisation.
4.1.1. Méthode d’extraction par Soxhlet
La cinétique de l'extraction de cires est présentée à la Figure 15. Les expériences réalisées pour déterminer la cinétique d'extraction de cires ont été effectuées entre 15 et 240 min. La quantité de cires extraite à chaque temps a été identifiée sur la base du rendement. Sur le graphique de la cinétique d’extraction (Figure 15), on observe que l’extractibilité augmente avec le temps d’extraction jusqu’à une valeur d’équilibre à partir de laquelle l’augmentation devient négligeable. L’extraction est presque complète après 120 minutes avec un rendement d’équilibre de 0,11%. On observe à partir de l’analyse de variance du tableau (Anova en Annexe 1) qu’il n’y a pas de différence significative entre les moyennes à partir de 120 minutes. Par conséquent, après 120 min d'extraction, l’extraction de cires de graines de Jatropha est supposée atteindre l'équilibre. Pour la même durée d’extraction, les quantités de cires extraites de graines de Jatropha restent un peu inférieures à celles obtenues par Pham et al. (2018)dans l’extraction de cires de certaines céréales (blé=0,12%, riz=0,18% et sorgho=0,30%). Selon Hwang et al. (2004 ; 2005) pour les mêmes plantes céréalières le rendement de cire était de 0,2 à 0,3% pour un temps d’extraction optimale de 30 min.
