Pépite | Caractérisation de la perte de l'haplotype HLA spécifique du receveur en rechute après allogreffe haplo-identique

(1)

Université de Lille

Année Universitaire 2019/2020

Faculté de Pharmacie de Lille

MÉMOIRE

POUR LE DIPLÔME D'ÉTUDES SPÉCIALISÉES

DE BIOLOGIE MÉDICALE

Soutenu publiquement le 04 octobre 2019

Par M

lle

_{Laëtitia ANQUETIL}

conformément aux dispositions réglementaires en vigueur

tient lieu de

THÈSE EN

_{VUE DU DIPLÔME D’ÉTAT DE DOCTEUR EN PHARMACIE}

_____________________________

CARACTÉRISATION DE LA PERTE DE L’HAPLOTYPE HLA

SPÉCIFIQUE DU RECEVEUR

EN RECHUTE APRÈS ALLOGREFFE HAPLO-IDENTIQUE

_____________________________

Membres du jury :

Président : Madame le Professeur Annabelle DUPONT (CHU de Lille)

Assesseurs : Madame le Professeur Myriam LABALETTE (CHU de Lille)

Madame le Docteur Dominique BORIES (APHP, Créteil) Madame le Docteur Micha SROUR (CHU de Lille)

(2)

1 Université de Lille

Année Universitaire 2019/2020

Faculté de Pharmacie de Lille

MÉMOIRE

POUR LE DIPLÔME D'ÉTUDES SPÉCIALISÉES

DE BIOLOGIE MÉDICALE

Soutenu publiquement le 04 octobre 2019

Par M

lle

_{Laëtitia ANQUETIL}

conformément aux dispositions réglementaires en vigueur

tient lieu de

THÈSE EN

_{VUE DU DIPLÔME D’ÉTAT DE DOCTEUR EN PHARMACIE}

_____________________________

CARACTÉRISATION DE LA PERTE DE L’HAPLOTYPE HLA

SPÉCIFIQUE DU RECEVEUR

EN RECHUTE APRÈS ALLOGREFFE HAPLO-IDENTIQUE

_____________________________

Membres du jury :

Président : Madame le Professeur Annabelle DUPONT (CHU de Lille)

Assesseurs : Madame le Professeur Myriam LABALETTE (CHU de Lille)

Madame le Docteur Dominique BORIES (APHP, Créteil) Madame le Docteur Micha SROUR (CHU de Lille)

(3)

2 Université de Lille

Président : Jean-Christophe CAMART

Premier Vice-président : Damien CUNY

Vice-présidente Formation : Lynne FRANJIÉ Vice-président Recherche : Lionel MONTAGNE Vice-président Relations Internationales : François-Olivier SEYS

Directeur Général des Services : Pierre-Marie ROBERT Directrice Générale des Services Adjointe : Marie-Dominique SAVINA

Faculté de Pharmacie

Doyen : Bertrand DÉCAUDIN

Vice-Doyen et Assesseur à la Recherche : Patricia MELNYK Assesseur aux Relations Internationales : : Philippe CHAVATTE Assesseur à la Vie de la Faculté et aux

Relations avec le Monde Professionnel : Thomas MORGENROTH Assesseur à la Pédagogie : Benjamin BERTIN

Assesseur à la Scolarité : Christophe BOCHU

Responsable des Services : Cyrille PORTA

Liste des Professeurs des Universités - Praticiens Hospitaliers

Civ. NOM Prénom Laboratoire

Mme ALLORGE Delphine Toxicologie

M. BROUSSEAU Thierry Biochimie

M. DÉCAUDIN Bertrand Pharmacie Galénique

M. DEPREUX Patrick ICPAL

M. DINE Thierry Pharmacie clinique

Mme DUPONT-PRADO Annabelle Hématologie

M. GRESSIER Bernard Pharmacologie

M. LUYCKX Michel Pharmacie clinique

M. ODOU Pascal Pharmacie Galénique

M. STAELS Bart Biologie Cellulaire

Faculté de Pharmacie

de Lille

3, rue du Professeur Laguesse - B.P. 83 - 59006 LILLE CEDEX  03.20.96.40.40 -  : 03.20.96.43.64

(4)

3 Liste des Professeurs des Universités

M. ALIOUAT El Moukhtar Parasitologie

Mme AZAROUAL Nathalie Physique

M. BERTHELOT Pascal Onco et Neurochimie

M. CAZIN Jean-Louis Pharmacologie – Pharmacie clinique

M. CHAVATTE Philippe ICPAL

M. COURTECUISSE Régis Sciences végétales et fongiques

M. CUNY Damien Sciences végétales et fongiques

Mme DELBAERE Stéphanie Physique

M. DEPREZ Benoît Lab. de Médicaments et Molécules

Mme DEPREZ Rebecca Lab. de Médicaments et Molécules

M. DUPONT Frédéric Sciences végétales et fongiques

M. DURIEZ Patrick Physiologie

M. FOLIGNE Benoît Bactériologie

M. GARÇON Guillaume Toxicologie

Mme GAYOT Anne Pharmacotechnie Industrielle

M. GOOSSENS Jean François Chimie Analytique

M. HENNEBELLE Thierry Pharmacognosie

M. LEMDANI Mohamed Biomathématiques

Mme LESTAVEL Sophie Biologie Cellulaire

M. LUC Gerald Physiologie

Mme MELNYK Patricia Onco et Neurochimie

M. MILLET Régis ICPAL

Mme MUHR _{– TAILLEUX} Anne Biochimie

Mme PAUMELLE-LESTRELIN Réjane Biologie Cellulaire

Mme PERROY Anne Catherine Législation

Mme ROMOND Marie Bénédicte Bactériologie

Mme SAHPAZ Sevser Pharmacognosie

M. SERGHERAERT Eric Législation

Mme SIEPMANN Florence Pharmacotechnie Industrielle

M. SIEPMANN Juergen Pharmacotechnie Industrielle

M. WILLAND Nicolas Lab. de Médicaments et Molécules

Liste des Maîtres de Conférences - Praticiens Hospitaliers

Mme BALDUYCK Malika Biochimie

Mme GARAT Anne Toxicologie

Mme GOFFARD Anne Bactériologie

M. LANNOY Damien Pharmacie Galénique

Mme ODOU Marie Françoise Bactériologie

(5)

4 Liste des Maîtres de Conférences

Mme ALIOUAT Cécile Marie Parasitologie

M. ANTHERIEU Sébastien Toxicologie

Mme AUMERCIER Pierrette Biochimie

Mme BANTUBUNGI Kadiombo Biologie cellulaire

Mme BARTHELEMY Christine Pharmacie Galénique

Mme BEHRA Josette Bactériologie

M BELARBI Karim Pharmacologie

M. BERTHET Jérôme Physique

M. BERTIN Benjamin Immunologie

M. BLANCHEMAIN Nicolas Pharmacotechnie industrielle

M. BOCHU Christophe Physique

M. BORDAGE Simon Pharmacognosie

M. BOSC Damien Lab. de Médicaments et Molécules

M. BRIAND Olivier Biochimie

M. CARNOY Christophe Immunologie

Mme CARON Sandrine Biologie cellulaire

Mme CHABÉ Magali Parasitologie

Mme CHARTON Julie Lab. de Médicaments et Molécules

M CHEVALIER Dany Toxicologie

M. COCHELARD Dominique Biomathématiques

Mme DANEL Cécile Chimie Analytique

Mme DEMANCHE Christine Parasitologie

Mme DEMARQUILLY Catherine Biomathématiques

M. DHIFLI Wajdi Biomathématiques

Mme DUMONT Julie Biologie cellulaire

Mme DUTOUT-AGOURIDAS Laurence Onco et Neurochimie

M. EL BAKALI Jamal Onco et Neurochimie

M. FARCE Amaury ICPAL

Mme FLIPO Marion Lab. de Médicaments et Molécules

Mme FOULON Catherine Chimie Analytique

M. FURMAN Christophe ICPAL

Mme GENAY Stéphanie Pharmacie Galénique

M. GERVOIS Philippe Biochimie

Mme GOOSSENS Laurence ICPAL

Mme GRAVE Béatrice Toxicologie

Mme GROSS Barbara Biochimie

M. HAMONIER Julien Biomathématiques

Mme HAMOUDI Chérifa Mounira Pharmacotechnie industrielle Mme HANNOTHIAUX Marie-Hélène Toxicologie

Mme HELLEBOID Audrey Physiologie

M. HERMANN Emmanuel Immunologie

M. KAMBIA Kpakpaga Nicolas Pharmacologie

M. KARROUT Youness Pharmacotechnie Industrielle

Mme LALLOYER Fanny Biochimie

M. LEBEGUE Nicolas Onco et Neurochimie

Mme LECOEUR Marie Chimie Analytique

Mme LEHMANN Hélène Législation

Mme LELEU-CHAVAIN Natascha ICPAL

Mme LIPKA Emmanuelle Chimie Analytique

Mme MARTIN Françoise Physiologie

M. MOREAU Pierre Arthur Sciences végétales et fongiques

M. MORGENROTH Thomas Législation

Mme MUSCHERT Susanne Pharmacotechnie industrielle

(6)

5

Mme PINÇON Claire Biomathématiques

M. PIVA Frank Biochimie

Mme PLATEL Anne Toxicologie

M. POURCET Benoît Biochimie

M. RAVAUX Pierre Biomathématiques

Mme RAVEZ Séverine Onco et Neurochimie

Mme RIVIERE Céline Pharmacognosie

Mme ROGER Nadine Immunologie

M. ROUMY Vincent Pharmacognosie

Mme SEBTI Yasmine Biochimie

Mme SINGER Elisabeth Bactériologie

Mme STANDAERT Annie Parasitologie

M. TAGZIRT Madjid Hématologie

M. VILLEMAGNE Baptiste Lab. de Médicaments et Molécules

M. WELTI Stéphane Sciences végétales et fongiques

M. YOUS Saïd Onco et Neurochimie

M. ZITOUNI Djamel Biomathématiques

Professeurs Certifiés

M. HUGES Dominique Anglais

Mlle FAUQUANT Soline Anglais

M. OSTYN Gaël Anglais

Professeur Associé - mi-temps

M. DAO PHAN Hai Pascal Lab. Médicaments et Molécules

M. DHANANI Alban Droit et Economie Pharmaceutique

Maîtres de Conférences ASSOCIES - mi-temps

M. BRICOTEAU Didier Biomathématiques

Mme CUCCHI Malgorzata Biomathématiques

M. FRIMAT Bruno Pharmacie Clinique

M. GILLOT François Droit et Economie pharmaceutique

M. MASCAUT Daniel Pharmacie Clinique

M. ZANETTI Sébastien Biomathématiques

M. BRICOTEAU Didier Biomathématiques

AHU

Mme DEMARET Julie Immunologie

Mme HENRY Héloïse Biopharmacie

(7)

(8)

REMERCIEMENTS

7

À mon président de thèse,

Madame le Professeur Annabelle DUPONT,

Merci d’avoir accepté et de me faire l’honneur de présider ce jury de thèse. Merci pour votre investissement, votre gentillesse et votre disponibilité.

Ce fut un réel plaisir de travailler avec vous.

À mes assesseurs,

Madame le Professeur Myriam LABALETTE,

Je tiens tout d’abord à vous remercier de m’avoir permis de réaliser mon travail de thèse au sein de votre laboratoire. Merci pour votre disponibilité et votre soutien. J’admire votre implication, votre rigueur et votre pédagogie. Je suis honorée de soutenir ce travail de thèse

devant vous.

Madame le Docteur Dominique BORIES,

Je vous remercie d’avoir accepté sans hésitation de faire partie du jury de cette thèse. Merci pour votre intérêt et pour votre expérience qui permettra d’enrichir ce travail.

Madame le Docteur Micha SROUR,

Merci d’avoir accepté avec enthousiasme de venir juger mon travail de thèse. Votre collaboration et votre expérience sont essentielles à ce travail mais aussi à notre métier.

À mon directeur de thèse,

Madame le Docteur Pauline VARLET,

Merci de m’avoir fait confiance et de m’avoir proposée ce sujet de thèse passionnant. Merci de m’avoir aussi bien encadrée, d’avoir été disponible et bienveillante quand il le fallait. J’ai

beaucoup appris de tes connaissances, de ton enthousiasme et de ton dynamisme. Je n’aurai pas pu rêver mieux que toi pour encadrer ma thèse. J’espère avoir l’occasion de

(9)

REMERCIEMENTS

8

Tout d’abord je tiens à remercier l’ensemble du laboratoire d’Immunologie, pour votre bonne humeur, votre gentillesse et votre accueil qui ont rendu mes stages encore meilleurs, À l’équipe du cellulaire, Virginie, Véro L., Véro B., Marie-Thérèse, les deux Coralie, Jacques,

vous êtes une équipe géniale,

avec laquelle j’ai toujours grand plaisir de travailler et de discuter.

À l’équipe de l’humorale, Manue, Sandrine, merci encore pour le projet que j’ai réalisé avec toi lors de mon premier semestre, Laure, Justine, Hélène, Isabelle, Elisabeth...

Merci pour votre gentillesse.

À l’équipe du HLA, que j’ai appris à connaitre au cours de ce travail de thèse et ce semestre, Cécile, Céline, Ève-Marie, Juliette, Tiffanie, Dominique, Antoine, Cédric, Vincent, Pascale G, un grand merci aux techniciens du NGS et merci à toi, Pascale C., pour le temps précieux

que tu as pris pour les manips et pour m’encadrer.

À l’ensemble des biologistes d’immunologie, pour leur pédagogie et leur encadrement durant ces deux semestres, Benjamin, Stéphanie, Anne-Sophie, Sylvain, Guillaume.

À Rébecca, merci pour tes précieux conseils, tes encouragements, et ta bienveillance, je suis heureuse d’avoir pu travailler avec toi et même danser !

À Isabelle, qui m’a fait découvrir l’univers du HLA avec beaucoup de gentillesse et de patience, c’est un plaisir de travailler avec toi.

À Vincent, merci pour ta pédagogie, que ce soit en humorale et aujourd’hui au HLA ou durant mon travail de thèse, qui me donne envie de continuer dans ce domaine, je te

remercie pour les premières corrections soignées et attentionnées de cette thèse. Aux secrétaires du laboratoire avec qui j’ai toujours plaisir de discuter.

Merci à mes co-internes actuels, Caroline, Geoffrey et Mathieu, qui m’ont permis de travailler sur ma thèse lorsque j’en avais besoin.

Je tiens à remercier l’ensemble de l’équipe de l’EFS : Christine, Gauthier, Odile, Pascale ainsi que tous les techniciens et cadres, qui m’ont soutenue une partie durant ce travail de thèse. Merci pour votre accueil, votre bonne humeur au quotidien, j’ai passé un super stage

(10)

REMERCIEMENTS

9

Merci également à tous les biologistes et techniciens que j’ai eu la chance de rencontrer durant mon internat : Sylvie, Patrice, Catherine, Amel, Jean-Michel, Delphine, Bodalé,

Thomas, Emmanuelle, Christophe, Michel…

À tous les co-internes que j’ai appris à connaitre au cours des semestres et des soirées, Maximilien, Adé, Caroline, Félix, Pauline, Lucie, Belka, Romane, Camille, Sarah, …

À ma scolarité, qui m’a permis de rencontrer mes meilleures amies, À ma Souille, qui est là depuis quasiment le début,

Merci d’être là, d’être toi, de m’écouter sans jugement, et de m’apprendre la géographie, À notre belle amitié, pour notre passé et notre avenir,

Et surtout, un grand merci pour ta belle collaboration sur cette thèse…, À ma Flo, au destin qui fait bien les choses, ou les paillettes,

Merci d’être une amie dévouée et attentionnée sur laquelle je peux compter, pour tout ce qu’on a partagé et qu’on partagera encore, JTMPQMPV,

À ma Élea, qui permet de finir les LEEF,

À tes belles bouclettes, parce que tu me fais toujours rire et que je suis née un 14 juillet, À ma Bichette, à notre rencontre au premier rang de la petite salle,

À notre complicité, à nos fous rires, merci pour ton écoute et ton soutien sans faille, tu es ma petite bulle de bonheur et de réconfort,

et parce que tu me manques dans ma vie de tous les jours, À ma Clémence, à notre première route ensemble,

Une amie unique et exceptionnelle, j’ai beaucoup de chance de t’avoir à mes côtés, merci pour ton grand cœur, tu me complètes et me rends meilleure,

et merci pour avoir relu avec enthousiasme et bienveillance mon travail, À ma Juju, ma co-interne adorée (petite tape sur l’épaule),

Merci pour tous ces semestres partagés avec toi, tu es aussi belle que touchante, merci pour avoir été mon modèle, pour ne pas m’avoir écoutée, à notre complicité qui est née, et qui

(11)

REMERCIEMENTS

10

À ma belle Julie, tu es une belle personne, touchante et généreuse,

Un grand MERCI pour ton soutien tout le long de cette thèse, de la rédaction des invitations aux relectures attentionnées, jusqu’à l’impression, tu es mon petit ange,

et je te souhaite tout le bonheur que tu mérites tant ! Aux petits potes et aux Normands à Lille,

À Nicole et Marc,

Merci d’être là aujourd’hui, et pour votre bienveillance,

À ma tante, et Stéphane,

Merci d’être présents et de m’avoir toujours soutenue, je vous en suis reconnaissante,

À mes parents,

Je suis heureuse de vous rendre fiers, parce que vous le méritez et que je vous aime,

À ma sœur, mon bouboune, ma nini,

Je suis tellement fière de toi, à notre belle complicité, à ta future vie de maman, et parce que je t’aime de tout mon cœur,

À Pierre,

Merci de m’apporter tout ce bonheur, merci de m’aimer comme tu le fais, à notre avenir…

À toi mamie,

Les mots ne suffiront pas pour te dire combien je te remercie, merci pour tout l’amour que tu m’as apportée, je te dois tout ce que je suis aujourd’hui, de là où tu es,

(12)

SOMMAIRE

11

I. INTRODUCTION ... 17

A. Allogreffe de cellules souches hématopoïétiques ... 17

1. Généralités et actualités ...17

2. Alloréactivités antigéniques ...19

a. Effets immunologiques de l’allogreffe de CSH ...19

b. Compatibilité HLA ...21

B. Greffe haplo-identique ... 26

C. Rechute post-allogreffe ... 33

1. Facteurs prédictifs de la rechute post-allogreffe ...33

2. Suivi post-allogreffe ...34

3. Mécanisme d’échappement immunitaire ...36

a. Après allogreffe de CSH...36

b. Le cas de la perte HLA après greffe haplo-identique ...37

4. Conséquences dans la prise en charge de la rechute ...40

II. _{OBJECTIFS DE L’ÉTUDE ... 43}

III. MATÉRIEL ET MÉTHODES ... 45

A. Population étudiée ... 45

1. Critères d’inclusion ...45

2. Critères d'exclusion ...45

3. Échantillons d’intérêt ...45

B. Techniques analytiques de la perte HLA ... 46

1. PCR quantitative en temps réel (qPCR) ...46

a. Choix des marqueurs spécifiques des receveurs ...46

i. Marqueur HLA ...46

ii. Marqueur non-HLA ...47

b. Principe de la technique ...48

c. Protocole analytique ...49

d. Interprétation des résultats ...50

e. Limites ...50

2. Séquençage de nouvelle génération (NGS) ...51

a. Principe de la technique ...51

(13)

SOMMAIRE

12

C. Stratégie globale d’analyse de la perte HLA ... 54

D. Analyse des résultats ... 54

IV. RÉSULTATS ... 55

A. Population étudiée ... 55

1. Population incluse dans l’étude ...55

2. Caractéristiques de la population étudiée...55

B. Perte HLA ... 57

1. Sélection de la technique et résultats obtenus ...57

2. Résultats des analyses par qPCR ...58

a. Rechute « classique » ...60

b. Rechute avec perte HLA ...61

c. Cas particulier : rechute « classique » suivie d'une perte HLA après injections de lymphocytes du donneur (DLI) ...62

d. Concordance entre les sondes ...63

3. Résultats des analyses par NGS ...63

a. Rechute « classique » ...63

b. Rechute avec perte HLA ...65

c. Cas particulier : rechute « classique » suivie d'une perte HLA après injections de lymphocytes du donneur (DLI) ...66

d. Concordance entre les allèles ...67

V. DISCUSSION ... 69

VI. CONCLUSION ET PERSPECTIVES ... 75

BIBLIOGRAPHIE ... 77

(14)

TABLE DES

ANNEXES

13 Annexe 1 : Spécificités des sondes HLA QTRACE (JETA Molecular). ... 87

Annexe 2 : Spécificités des sondes HLA KMR (GenDx). ... 87

Annexe 3 : Caractéristiques de la population étudiée. ... 88

Annexe 4 : Conditionnements utilisés dans la population étudiée. ... 89

Annexe 5 : Haplotypes HLA des donneurs et des receveurs avec les sondes

choisies et leurs spécificités HLA. ... 90

Annexe 6 : Présentation du NGS. ... 91

(15)

(16)

TABLE DES ABRÉVIATIONS

15

ABM : Agence de la Biomédecine

ALDH : Aldéhyde déshydrogénase CAR-T : Chimeric Antigen Receptor T Cellules NK : cellules Natural Killer CMF : Cytométrie en flux

CMH : Complexe Majeur d'Histocompatibilité cnLOH : copy-neutral Loss Of Heterozygotie CPA : Cellules Présentatrices d'Antigènes CSH : Cellules Souches Hématopoïétiques CSP : Cellules Souches Périphériques Ct : Cycle threshold

Cy : Cyclophosphamide

DLI : Donor Lymphocyte Infusion, injection de lymphocytes du donneur

G-CSF : Granulocyte Colony Stimulating Factor, facteur de croissance hématopoïétique spécifique de la lignée granulocytaire

GvI : Graft versus Infection, réaction du greffon contre les infections GvH : Graft versus Host, réaction du greffon contre l’hôte

GvHa : GvH aiguë GvHc : GvH chronique

GvL : Graft versus Leukemia, réaction du greffon contre la leucémie HLA : Human Leukocyte Antigen, CMH humain

HPN : Hémoglobinurie Paroxystique Nocturne ICT : Irradiation Corporelle Totale

KIRs : Killer cell Immunoglobulin-like Receptors LA : Leucémie Aiguë

LAL : Leucémie Aiguë Lymphoblastique LAM : Leucémie Aiguë Myéloblastique LLC : Leucémie Lymphoïde Chronique LMC : Leucémie Myéloïde Chronique

(17)

TABLE DES ABRÉVIATIONS

16

LNH : Lymphome Non Hodgkinien

MH : Maladie de Hodgkin MM : Myélome Multiple MMF : Mycophénolate Mofétil MMUD : Mismatch Unrelated Donor MRD : Match Related Donor MUD : Match Unrelated Donor MO : Moelle Osseuse

NGS : Next Generation Sequencing

NRM : No Relapse Mortality, mortalité non liée à une rechute PCR : Polymerase Chain Reaction

PRS : Post-Relapse Survival, survie après une rechute qPCR : PCR quantitative

RC : Rémission Complète RC1 : Première RC RC2 : Deuxième RC

RIC : Conditionnement d'Intensité Réduite R-IPSS : Revised Index Pronostic System SAL : Sérum Anti-Lymphocytaire

SFGM-TC : Société Francophone de Greffe de Moelle et de Thérapie Cellulaire SMD : Syndrome Myélodysplasique

SMP : Syndrome Myéloprolifératif STR : Short Tandem Repetition UPD : Uniparental disomy UPDa : UPD acquise

(18)

I.

Introduction

17

I. INTRODUCTION

A. Allogreffe de cellules souches hématopoïétiques

1. Généralités et actualités

Depuis plus de 60 ans, l’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) représente un traitement curatif potentiel pour de nombreuses hémopathies malignes (1) mais aussi non malignes telles que les aplasies médullaires (1,2), les hémoglobinopathies (2,3) ou encore les déficits immunitaires primitifs sévères (4). L’ensemble des indications de l’allogreffe de CSH est regroupé dans le Tableau 1.

Tableau 1 : Principales indications de l'allogreffe de CSH.

Hémopathies malignes Autres maladies

Leucémie aiguë myéloblastique (LAM) Leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) Leucémie myéloïde chronique (LMC) Syndromes myélodysplasiques (SMD) Syndromes myéloprolifératifs (SMP) Lymphomes non hodgkinens (LNH) Maladie de Hodgkin (MH)

Leucémie lymphoïde chronique (LLC) Myélome multiple (MM)

Leucémie myéloïde chronique juvénile

Aplasies médullaires

Hémoglobinurie paroxystique nocturne (HPN) Anémie de Fanconi

Anémie Blackfan-Diamond β-Thalassémie majeure Drépanocytose

Déficits immunitaires congénitaux Syndrome de Wiskott-Aldrich Maladies héréditaires métaboliques Tumeurs solides

L’allogreffe de CSH est principalement indiquée dans le traitement d'hémopathies malignes myéloïdes à haut risque de rechute (5), notamment dans la leucémie aiguë myéloïde (LAM), représentant 40,5% des indications en 2016 d’après l’Agence de la Biomédecine (ABM). En France, 1 902 allogreffes de CSH ont été recensées en 2017 contre 855 en 2001 (base de données de l’EBMT, European Bone Marrow Transplantation et de ProMISe, Projet Manager Internet Server). Cette activité est en constante progression depuis plusieurs années du fait de l’augmentation du nombre de donneurs potentiellement éligibles au don et de la diminution de la toxicité liée à cette procédure, même si on remarque un plateau depuis 2014. Actuellement, en Europe, plus de 15 000 allogreffes de CSH sont réalisées chaque année (6).

(19)

I.

Introduction

18

Une allogreffe de CSH est considérée comme une véritable immunothérapie adoptive (7,8). Les cellules souches multipotentes (CD34+) issues d’un donneur sain vont permettre de restaurer une hématopoïèse complète et fonctionnelle chez un malade, le receveur. Le greffon va également apporter des cellules immunocompétentes du donneur permettant d’obtenir un effet anti-tumoral du greffon contre la leucémie (Graft-versus-Leukemia, GvL), correspondant à l’effet positif de la greffe. Cependant, cet effet est souvent associé à une réaction du greffon contre les tissus sains de l’hôte (Graft-versus-Host, GvH) représentant l’une des principales complications de la procédure d’allogreffe. Ces effets peuvent être modulés par certains traitements, en fonction du type de conditionnement, du choix des donneurs ou par l’utilisation de réinjection de lymphocytes du donneur (Donor Lymphocyte Infusion, DLI).

Un conditionnement est utilisé avant l’allogreffe de CSH permettant de détruire les cellules malignes médullaires résiduelles du receveur et de laisser la place pour la reconstitution d’une hématopoïèse complète et normale. Ce conditionnement permet aussi de détruire les cellules immunocompétentes du receveur qui pourraient empêcher la prise de la greffe et entrainer un rejet du greffon. Il existe différents schémas de conditionnement en fonction de leur caractère myélotoxique et immunomodulateur. Ceci permet de différencier un conditionnement :

 Myélo-ablatif : le premier à avoir été utilisé et associant le plus souvent une irradiation corporelle totale (ICT) avec du cyclophosphamide (Endoxan), pour les hémopathies myéloïdes ou de la fludarabine, pour les leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL).

 Non myélo-ablatif ou dit d’intensité réduite (RIC) : qui ne comporte aucune chimiothérapie myélotoxique, permettant d’élargir les indications de l’allogreffe et de rendre éligibles des patients âgés et/ou avec des co-morbidités associées.

Le greffon de CSH peut provenir de différentes sources : la moelle osseuse, le sang périphérique ou le sang placentaire.

 Le prélèvement de moelle osseuse correspond à la première source de CSH qui a été utilisée. La ponction est réalisée au niveau des crêtes iliaques postérieures (riches en CSH) voire au niveau sternal, sous anesthésie générale.

 Le prélèvement de CSH issues de sang périphérique, appelées CSP, est réalisé après stimulation médullaire du donneur par notamment, un facteur de croissance hématopoïétique spécifique de la lignée granulocytaire, le G-CSF. L’utilisation du

(20)

(21)

G-I.

Introduction

20

Elles peuvent reconnaitre également des antigènes allogéniques sur les cellules du receveur et provoquer des conflits immunologiques : on parle d’alloréactivité. Ces conflits sont liés à des différences antigéniques entre les cellules du donneur et du receveur. Plus de 90% des antigènes allogéniques sont les molécules du Complexe Majeur d’Histocompatibilité (CMH). Après une allogreffe de CSH, 1 à 10% des lymphocytes T du donneur vont être alloréactifs (10,11) et induire des réactions allogéniques dont :

 Une réaction allogénique contre les tissus sains du receveur correspondant à

un effet de greffon contre l’hôte (Graft-versus-Host, GvH). Cet effet est la

principale complication post-allogreffe et peut mettre en jeu le pronostic vital du receveur. Elle survient chez 70% des malades et entraine un décès dans 15 à 40% des cas. Il existe deux formes cliniques : la GvH aiguë survenant en général avant le 100e_{jour post-greffe et la GvH chronique, plus tardive.}_{L’effet de GvH est lié plus}

précisément à une réaction lymphocytaire T du greffon dirigée contre les cellules présentatrices d’antigènes (CPA) du receveur, étrangères à ce dernier et provoquant des lésions notamment au niveau cutané, hépatique, digestif, pulmonaire…(10,12). D’après Glucksberg et al (13), il existe plusieurs stades de gravité, notamment pour la GvH aiguë (grade I à IV), utilisés pour évaluer le pronostic et la survie des patients (14). L’utilisation d’immunosuppresseurs permet de prévenir cet effet.

 Une réaction allogénique contre les cellules malignes résiduelles du receveur

responsable de _{l’effet anti-tumoral recherché (Graft-versus-Leukemia, GvL)}

(15,16). Les mécanismes physiologiques permettant d’expliquer l’effet GvL sont liés principalement à l’incompatibilité du CMH entre le donneur et le receveur, aux antigènes mineurs d’histocompatibilité présents sur les cellules malignes du receveur ou encore liés à des antigènes spécifiques de tumeur. Les antigènes mineurs d’histocompatibilité sont des produits de la dégradation de protéines intracellulaires n’appartenant pas au CMH. Les cellules NK jouent également un rôle dans l’effet GvL. En effet, au cours d’une allogreffe de CSH, les cellules NK du donneur présentes dans le greffon ne vont pas reconnaitre les récepteurs inhibiteurs (Killer cell Immunoglobulin-like Receptors

,

KIRs) du receveur et ainsi provoquer une activation de la fonction effectrice de cellules NK alloréactives et une lyse des cellules malignes du receveur (17,18).

Les mécanismes immunologiques responsables de l’effet GvL sont étroitement liés à ceux de la GvH. Le modèle des allogreffes syngéniques (absence de différences allogéniques entre le donneur et le receveur) illustre cette perte d’alloréactivité par une augmentation du

(22)

I.

Introduction

21

risque de rechute (15). De plus, il existe une diminution du risque de rechute lors d’une GvH chronique (19–21).

Les cellules hématopoïétiques résiduelles du receveur peuvent également reconnaitre des antigènes allogéniques du donneur et provoquer un rejet de la greffe. Cependant, le rejet reste rare car le receveur est souvent très immunodéprimé du fait de son hémopathie, des traitements et du conditionnement reçus avant la greffe.

L’ensemble des réactions immunologiques entre un donneur et un receveur après une allogreffe de CSH est représenté dans la Figure 2.

Figure 2 : Effets immunologiques de l’allogreffe de CSH.

GvH : réaction du greffon contre l’hôte ; GvL : réaction du greffon contre la leucémie ; GvI : réaction du greffon contre les infections.

b. Compatibilité HLA

Plus de 90% des antigènes allogéniques responsables de ces conflits immunologiques sont des protéines codées dans le CMH. Ces protéines sont responsables de la présentation des antigènes aux lymphocytes T ainsi que de l’histocompatibilité, c’est-à-dire la compatibilité des tissus d’un donneur et d’un receveur permettant la survie du greffon (22). Chez l’Homme, le CMH humain est constitué par le complexe des antigènes leucocytaires humains (Human Leukocyte Antigen, HLA).

Le système HLA représente un ensemble de plus de 200 gènes, situé sur le bras court du chromosome 6 (6p) (Figure 3). Chaque individu possède à la surface de ces cellules des combinaisons différentes de molécules HLA, extrêmement variables d’un individu à un autre au sein d’une population. Ce polymorphisme génétique multiallélique explique le risque de

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rejet de greffe entre un donneur et un receveur différent, ce qui fut à l’origine de sa découverte par Jean Dausset (23).

Le système HLA est subdivisé en 3 régions (11):

• La région du CMH de classe I avec 3 gènes HLA de classe I dits « classiques

»,

appelés allèles ou locus: HLA-A, HLA-B et HLA-C.

• La région du CMH de classe II avec trois paires de gènes HLA de classe II dits « classiques », appelés allèles ou locus: HLA-DP (gènes DPA et DPB), HLA-DQ (DQA et DQB) et HLA-DR (DRA et DRB).

• La région du CMH de classe III correspond à des gènes codant différentes protéines n’intervenant pas dans la présentation antigénique (protéines du complément, cytokines, enzymes,..).

Chaque allèle HLA code pour des protéines avec des séquences en acides aminés spécifiques. Les différences sont surtout concentrées au niveau des régions codant le sillon de liaison aux peptides, correspondant à la zone la plus polymorphe (Figure 3) (11)

.

Les molécules HLA de classe I sont présentes sur presque toutes les cellules nucléées et les plaquettes et présentent des fragments peptidiques cytosoliques endogènes (protéines du soi en fin de vie, défectueuses ou protéines du non soi infectieuses ou cancéreuses) aux lymphocytes T CD8+ cytotoxiques. Les molécules HLA de classe II sont présentes sur les CPA (macrophages, cellules dendritiques, lymphocytes B), les lymphocytes T activés et les cellules endothéliales dans un contexte inflammatoire. Elles présentent des fragments de protéines exogènes surtout mais aussi endogènes aux lymphocytes T CD4+.

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En première intention, un donneur familial HLA identique de compatibilité 10/10, appelé géno-identique issu de la fratrie du receveur, va être recherché, on parle également de MRD (Match Related Donor). La probabilité d’être HLA identique dans la fratrie est d’une chance sur quatre. En cas d’absence d’un donneur familial, un donneur HLA identique non apparenté est recherché, appelé donneur phéno-identique ou MUD (Match Unrelated Donor). Ce sont des donneurs vivants non apparentés issus de fichiers internationaux ou nationaux de donneurs volontaires (26).

Du fait de la difficulté de trouver des donneurs HLA identiques et des progrès constants dans ce domaine, le recours aux greffes avec un ou plusieurs mismatchs est une option envisageable (Figure 5). Il est possible de recourir à une greffe alternative avec un donneur non apparenté avec un mismatch HLA (compatibilité 9/10), appelée MMUD (Mismatch Unrelated Donor), ou de recourir à des greffes de sang placentaire ou des greffes haplo-identiques (semi-compatibles). Ainsi, au sein d’une fratrie, il y a une chance sur deux d’avoir un donneur semi-compatible, c’est à dire partageant un des deux haplotypes HLA hérités du père ou de la mère. Pour les greffes à partir de sang placentaire, on ne s’intéresse qu’aux locus : HLA-A, HLA-B et HLA-DRB1. Il est possible et admis d’avoir plusieurs mismatchs pour ce type de greffe compte tenu de l’immaturité cellulaire du sang placentaire. L'un des principaux inconvénients est la quantité de cellules nécessaires par rapport au poids du patient qui nécessite souvent deux USP pour un adulte. De plus, la sortie en aplasie peut être plus lente et le risque infectieux plus important du fait d'un nombre moins important de cellules souches et de cellules T matures. Le risque de GvH est diminué ainsi que l’effet GvL, pouvant induire un risque de non prise de greffe ou de rechute. L'avantage de ces greffes reste leurs disponibilités puisque les USP sont déjà typées et congelées. Aujourd’hui, ces greffes ne sont quasiment plus pratiquées. Les greffes haplo-identiques sont quant à elles en plein essor (6,27).

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Des protocoles pour comparer ces greffes sont actuellement en cours : le protocole ALTERGREF : NCT03250546 (9/10 versus haplo-identique), le protocole HAPLOMUDELDERLY-IPC2015-004 : NCT02623309 (10/10 versus haplo-identique), avec un conditionnement RIC et le protocole MACHAPLOMUD : NCT03655145 (10/10 versus haplo-identique), avec un conditionnement myélo-ablatif. Notre centre lillois participe notamment à ces études randomisées permettant de mieux positionner la greffe haplo-identique dans l'avenir.

C. Rechute post-allogreffe

1. Facteurs prédictifs de la rechute post-allogreffe

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Figure 11 : Mécanismes d’échappement immunitaire post-allogreffe de CSH. D’après Zeiser et Vago (71).

En effet, des altérations des gènes HLA ont souvent été observées dans des tumeurs solides, montrant la capacité d’échappement immunitaire des cellules cancéreuses (73,74). Notamment, une perte ou une diminution de l’expression des molécules HLA de classe I avec plusieurs mécanismes proposés dont une absence de la β2-microglobuline, une délétion ou une recombinaison mitotique du chromosome 6 (75).

b. Le cas de la perte HLA après greffe haplo-identique

Un des mécanismes d’échappement immunitaire le plus représenté après une greffe haplo-identique est une perte du HLA. Les équipes de Crucitti et Vago (76–78) ont mis en évidence chez des patients en rechute, une perte de l’haplotype HLA spécifique du receveur dans le génome des cellules malignes. La principale hypothèse mécanistique repose sur une perte de l’hétérozygotie (copy-neutral loss of heterozygotie, cnLOH), par perte d’une copie d’un des deux parents qui est remplacée par l’autre, appelé aussi disomie uniparentale (Uniparental disomy, UPD). Dans ce contexte, ce phénomène est acquis du fait d’une forte pression immunologique liée à la greffe et d’instabilités génomiques des hémopathies, on parle de UPD acquise (UPDa). Ce mécanisme entraine une perte partielle du bras court du chromosome 6 où sont situés les gènes HLA de classe I et II puis une substitution de la partie perdue par la région correspondante de l’autre chromosome (Figure 12). Dans le cas de la greffe haplo-identique, c’est l’haplotype HLA spécifique du receveur (haplotype HLA mismatch) qui est remplacée par la copie correspondant à l’haplotype HLA commun, conservé. Le typage HLA des cellules malignes du receveur à la rechute paraitra donc homozygote avec le typage de l’haplotype HLA conservé, commun au donneur et au

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receveur. Cela n’entraine pas de perte totale du matériel génétique et l’expression des molécules de CMH de classe I persiste pour la copie non perdue (78,79).

Ainsi, la conséquence est un échappement des cellules tumorales du receveur de l’alloreconnaissance des lymphocytes T du donneur entrainant une perte de l’effet GvL de l’allogreffe lié aux antigènes majeurs d’histocompatibilité (80).

Figure 12: Mécanisme d’échappement immunitaire de cellules malignes du receveur en rechute : perte HLA post-greffe haplo-identique.

En bleu : haplotype HLA commun au donneur et au receveur ; en rouge : haplotype HLA spécifique du receveur ; en vert : haplotype HLA spécifique du donneur.

UPDa = disomie uniparentale acquise ; 6p = bras court du chromosome 6.

De nombreuses études réalisées pour la plupart sur des patients atteints de LAM, ont mis en évidence qu’une rechute sur trois était concernée. Nous pouvons ainsi distinguer deux types de rechute :

 Les rechutes dites « classiques », sans perte HLA ;

 Les rechutes avec perte HLA et plus précisément avec perte de l’haplotype HLA spécifique du receveur (haplotype HLA mismatch).

L’équipe de Crucitti et al (76), a montré que les rechutes avec perte HLA apparaissaient plus tardivement par rapport aux rechutes « classiques » (Figure 13). Cependant, en termes de mortalité et de survie, il n’a pas été mis en évidence de différence significative entre une rechute avec perte HLA et une rechute « classique » (le taux de survie à six mois post-rechute était de 28,5% pour les post-rechutes avec perte HLA et 27,4% pour les post-rechute sans perte HLA). De plus, du fait de rechute plus tardive et d’une longue phase d’équilibre

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mais avec des efficacités variables dépendant notamment de l’intensité de la rechute et du type d’hémopathie (16). Les DLI peuvent également être données en préemptif ou en prophylactique, notamment en cas d'hémopathie à haut risque de rechute (85).

Dans le contexte de traitement de rechute après une greffe haplo-identique, les protocoles de DLI sont différents des greffes conventionnelles, notamment en termes de quantité de cellules/kg. En effet, du fait du risque de GvH post-DLI et des nombreuses incompatibilités HLA présentes dans les greffes haplo-identiques, le risque de GvH est d’autant plus important que l’utilisation des DLI sera réalisée avec une grande précaution. De ce fait, les premières réinjections présentent des quantités de cellules/kg plus faibles de l’ordre de 1x103 _{à 1x10}4 _{cellules CD3+ /kg (86).}

L’effet des DLI étant de déclencher un effet GvL, il est important que les cellules T du greffon puissent toujours agir contre les cellules malignes en rechute. En cas de rechute avec perte de l’haplotype HLA spécifique du receveur, l’efficacité des DLI est remis en question, puisque l’effet GvL serait fortement amoindri dans ce cas (16,86). Des alternatives thérapeutiques devront être envisagées, notamment l’utilisation d’immunothérapies ou une seconde allogreffe avec un donneur différent (87).

Concernant le pronostic des patients en rechute après une greffe haplo-identique, celui-ci semble plus mauvais par rapport aux greffes MUD et MRD. En effet, une étude a comparé les taux de survie à un an après rechute post-greffe (post-relapse survival, PRS) qui est de 17%, 46% et 40%, pour les greffes haplo-identique, MUD et MRD, respectivement. Ce taux de survie moins bon peut être expliqué notamment par une utilisation plus limitée des DLI chez les patients en rechute après une greffe haplo-identique.

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II.

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II. _{OBJECTIFS DE L’ÉTUDE}

La rechute de la maladie initiale reste une des causes principales de décès post-greffe haplo-identique. Une meilleure compréhension de l’effet GvL et des mécanismes d’échappement de la maladie est nécessaire pour améliorer la prise en charge de ces patients allogreffés.

De récentes études ont mis en évidence comme principal mécanisme d’échappement immunitaire, une perte de l’haplotype HLA spécifique du receveur dans une rechute sur trois. Une nouvelle approche technique, par qPCR en temps réel, permet de détecter rapidement cette perte HLA en utilisant des sondes ciblant des allèles HLA spécifiques de cet haplotype. Le but étant de pouvoir différencier une rechute, avec ou sans perte HLA, et d’obtenir une prise en charge spécifique et rapide du patient en rechute.

Mon travail de thèse était de réaliser une étude rétrospective pour tester cette technique sur une population de patients en rechute après une greffe haplo-identique et de définir le pourcentage de rechutes « classiques », sans perte HLA et de rechutes avec perte HLA. L’objectif est de vérifier si nous obtenons des résultats similaires aux études réalisées sur ce sujet. De plus, cette approche permet d’apporter une nouvelle perspective de suivi post-greffe de ces patients en rechute et d’orienter au mieux leur prise en charge. Nous avons utilisé la même technique que celle utilisée pour l’étude du chimérisme au laboratoire HLA-Transplantation de l’Institut d’Immunologie. À terme, ce test pourra être proposé au moment de la mise en évidence d’une rechute avec des cellules malignes quantifiables dans le sang et/ou dans la moelle osseuse.

Ce projet est mené en collaboration avec le Service des Maladies du Sang du CHU de Lille et le laboratoire HLA-Transplantation de l’Institut d’Immunologie. Cette étude pourra également servir à l’étude rétrospective réalisée par la SFGM-TC sur ce sujet et permettra de participer à l’élaboration de nouvelles recommandations.

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III. Matériel et méthodes

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III. MATÉRIEL ET MÉTHODES

A. Population étudiée

1. Critères d’inclusion

Pour réaliser notre étude les patients inclus étaient des patients ayant bénéficié d’une allogreffe haplo-identique au CHU de Lille et étant en situation de rechute après cette allogreffe.

Pour cela, nous avons réalisé une étude rétrospective. Nous avons tout d’abord récupéré les identités des patients ayant subi une allogreffe haplo-identique au CHU de Lille entre janvier 2014 et mars 2019 à partir des données du Service des Maladies du Sang (données de ProMise) et du laboratoire HLA-Transplantation de l’Institut d’Immunologie du CHU de Lille. Pour sélectionner parmi cette population, les patients en situation de rechute après leur greffe haplo-identique, nous avons analysé les comptes rendus de consultation de suivi de ces patients, à l’aide du logiciel de gestion des dossiers médicaux, SILLAGE (SIB), ainsi que les résultats des bilans de suivi réalisés aux laboratoires d’Hématologie et HLA-Transplantation, stockés dans le logiciel du laboratoire, MOLIS (CGM LAB).

Nous avons inclus les patients présentant des cellules malignes circulantes à la rechute. La rechute était définie par les cliniciens sur la base de différents critères selon les hémopathies malignes : présence de cellules malignes ou d’anomalies cytologiques significatives dans le sang et/ou dans la moelle osseuse, maladie résiduelle positive (MRD) en cytogénétique et/ou en biologie moléculaire (surexpression WT1, mutations FLT3, NPM1…), chimérisme mixte avec au moins 2% de cellules du receveur.

2. Critères d'exclusion

Nous avons exclus les patients en rechute ne présentant pas de cellules malignes circulantes du receveur au moment de la rechute.

3. Échantillons d’intérêt

Les échantillons d’intérêt étaient des échantillons d’ADN extraits de sang total et/ou de moelle osseuse prélevés sur un tube avec un anticoagulant EDTA, en pré-greffe et au moment de la rechute (Figure 15). Un consentement éclairé, pour réaliser des analyses à des fins de recherche, a été obtenu au moment de la consultation pour l’allogreffe de CSH. L’extraction des ADN a été réalisée sur un extracteur Quikgene mini80 (AutoGen)

.

Les ADN étaient ensuite conservés et stockés à -20°C au laboratoire HLA-Transplantation et/ou à

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