Utilisation de nanoparticules d’or plasmoniques pour le
relargage contrôlé de médicaments et la détection
d’ATP en milieu cellulaire
Mémoire
Mélina Drouin
Maîtrise en chimie
Maître ès Sciences (M. Sc.)
Québec, Canada
© Mélina Drouin, 2017
Utilisation de nanoparticules d’or plasmoniques pour le
relargage contrôlé de médicaments et la détection
d’ATP en milieu cellulaire
Mémoire
Mélina Drouin
Sous la direction de :
iii
Résumé
Les nanomatériaux attirent l’attention dans le domaine biomédical en raison de leurs propriétés liées à leur taille. Les nanoparticules métalliques, plus particulièrement, possèdent un plasmon de surface localisé leur conférant une signature d’extinction de la lumière caractéristique. Bien que l’argent possède de meilleures propriétés plasmoniques, l’or est habituellement préféré pour des applications médicales, puisqu’il est stable en conditions biologiques en plus d’être biocompatible. Ce projet a donc pour objectif d’exploiter les propriétés des nanoparticules d’or dans le cadre de deux applications : le relargage contrôlé de médicaments et la détection d’analytes en milieu cellulaire.
Dans un premier temps, des nanobâtonnets d’or possédant une bande plasmonique dans le proche infrarouge sont utilisés afin de développer des nano-véhicules pour le transport actif de médicaments. Ces bâtonnets sont entourés d’une couche de polymère thermosensible permettant l’encapsulation et le transport de biomolécules jusqu’au site biologique d’intérêt. Un laser dans le proche infrarouge est utilisé comme stimulus externe pour déclencher le relargage des molécules bioactives en causant une augmentation locale de température autour des nanobâtonnets. Ces nouveaux modules sont développés en collaboration avec le Dr. Patrick Mathieu à l’Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec pour étudier la décalcification des valves cardiaques.
Le second projet vise à développer un outil micrométrique pour la détection d’adénosine 5’-triphosphate dans l’environnement des cellules, et ce, en collaboration avec les groupes des professeurs Jean-François Masson de l’Université de Montréal et Joachim Spatz de l’Université d’Heidelberg en Allemagne. Cet outil consiste en une micropipette de verre recouverte de nanoparticules d’or fonctionnalisée avec un aptamère fluorescent qui possède une grande affinité pour l’ATP. Lorsque l’aptamère se lie à sa cible, il se replie sur lui-même, rapprochant ainsi le fluorophore de la surface plasmonique. En microscopie de fluorescence, il est possible de mesurer l’extinction de fluorescence résultant de ce changement de conformation pour quantifier la concentration d’ATP localement.
iv
Abstract
Nanomaterials have attracted a great deal of attention in the fields of biology and medicine because of their unique properties arising from their small size. Metallic nanoparticles, more precisely, can interact with light in various ways as a result of their localized surface plasmon. Even though silver is the best plasmonic material, gold is usually preferred for medical applications because it is both more stable in biological conditions and biocompatible. Therefore, the objective of this project is to take advantage of the properties of gold nanoparticles in two distinct applications: controlled drug delivery and detection of biomolecules in cell cultures.
First, gold nanorods with a plasmon in the near-infrared region are used to develop new nanocarriers for active drug transport. These nanorods are covered with a thermosensitive polymeric shell allowing the encapsulation of bioactive molecules. A near-infrared laser is used as an external stimulus to trigger the release of the drug once the nanocarriers have reached the desired biological location by locally increasing the temperature of the gold nanorods. These new modules are developed in collaboration with Dr. Patrick Mathieu from the Quebec Heart and Lung Institute of Université Laval in order to study the decalcification of heart valves.
The second project aims at developing a micrometric tool for the detection of adenosine 5’-triphosphate in the vicinity of live cells, in collaboration with the groups of Prof. Jean-François Masson of Université de Montréal and Prof. Joachim Spatz of Heidelberg University in Germany. This tool consists of a glass micropipette covered with gold nanoparticles and functionalized with a fluorescent ATP-selective aptamer. Upon binding to its target, the aptamer changes conformation to form a hairpin, which brings the fluorophore closer to the plasmonic surface. Using fluorescence microscopy, it is possible to measure the fluorescence quenching resulting from this change of conformation, and thus to quantify the concentration of ATP locally.
v
Table des matières
Résumé ... iii
Abstract ... iv
Table des matières ... v
Liste des tableaux ... vii
Liste des figures ... viii
Liste des abréviations ... xiii
Remerciements ... xvii
1. Introduction ... 1
1.1 Utilisation de nanoparticules d’or pour le relargage contrôlé de médicaments ... 3
1.2 Utilisation de nanoparticules d’or comme biocapteurs pour la mesure d’ATP dans des cultures cellulaires ... 7
1.3 Liste des objectifs des deux projets ... 12
2. Principes théoriques ... 13
2.1 Nanomatériaux ... 13
2.1.1 Nanoparticules métalliques ...13
2.1.2 Mécanisme de formation de nanoparticules ...14
2.2 Fluorescence ... 16
2.2.1 Mécanismes menant à la luminescence ...16
2.2.2 Extinction de fluorescence ...18
2.2.3 Interactions entre un fluorophore et une nanoparticule métallique ...19
2.3 Polymères thermosensibles ... 22
2.4 Aptamères d’acides nucléiques ... 23
2.4.1 Avantages ...23
2.4.2 Processus de sélection ...24
3. Méthodes expérimentales ... 26
3.1 Méthodes de synthèse ... 26
3.1.1 Nanoparticules d’or sphériques ...26
3.1.2 Nanobâtonnets d’or ...27
3.2 Techniques de caractérisation... 31
3.2.1 Microscopie électronique à transmission et à balayage ...31
3.2.2 Microscopie de fluorescence ...34
3.2.3 Spectrométrie d’émission atomique à plasma à couplage inductif ...36
3.2.4 Diffusion dynamique de la lumière ...38
3.2.5 Analyse du suivi individuel des particules...39
3.2.6 Liste des appareils ...40
4. Développement de nano-véhicules plasmoniques pour le relargage contrôlé de médicaments en milieu biologique ... 41
vi 4.1.1 Protocoles de synthèse...41 4.1.2 Caractérisation ...43 4.2 Couche de silice ... 48 4.2.1 Protocole de synthèse ...48 4.2.2 Caractérisation ...50
4.3 Couche de polymère thermosensible ... 52
4.3.1 Choix du polymère ...52
4.3.2 Premier protocole de synthèse ...53
4.3.3 Caractérisation et problèmes rencontrés ...54
4.3.4 Second protocole de synthèse ...56
4.3.5 Caractérisation ...56
5. Développement d’une sonde micrométrique pour la détection d’ATP dans l’environnement des cellules ... 62
5.1 Aptamère spécifique à l’ATP ... 62
5.1.1 Choix de l’aptamère ...62
5.1.2 Modifications apportées à l’aptamère ...64
5.2 Synthèse des nanoparticules d’or ... 65
5.2.1 Protocole de synthèse ...65
5.2.2 Caractérisation ...67
5.3 Préparation du substrat plasmonique ... 69
5.3.1 Protocole de préparation ...69
5.3.2 Caractérisation ...72
5.4 Détection d’ATP dans un milieu tampon contrôlé ... 75
5.4.1 Montage de microscopie de fluorescence ...75
5.4.2 Résultats en microscopie de fluorescence ...77
6. Conclusion et perspectives ... 85
Bibliographie ... 89
Annexe 1 – Protocole détaillé pour la première synthèse de nanobâtonnets d’or76... 97
Annexe 2 – Protocole détaillé pour la seconde synthèse de nanobâtonnets d’or100 ... 99
Annexe 3 – Protocole détaillé pour le dosage des nanobâtonnets d’or par ICP-AES ... 100
Annexe 4 – Protocole détaillé pour l’ajout d’une couche de silice à la surface des nanobâtonnets d’or107,108 ... 101
Annexe 5 – Protocole détaillé pour l’ajout d’une couche de polymère thermosensible sur la silice113... 102
Annexe 6 – Protocole détaillé pour l’ajout d’une couche de polymère thermosensible sur la surface d’or115 ... 103
Annexe 7 – Protocole détaillé pour la synthèse de nanoparticules d’or sphériques ... 104
Annexe 8 – Protocole détaillé pour la préparation des biocapteurs à base de micropipettes de verre ... 105
vii
Liste des tableaux
Tableau 3.1 – Liste des appareils utilisés pour la caractérisation des nanoparticules d’or ... 40 Tableau 4.1 – Évolution des dimensions et du ratio d’aspect des nanobâtonnets au cours de la première synthèse. ... 43 Tableau 4.2 - Dimensions et concentration des nanobâtonnets obtenus avec le second protocole de synthèse. ... 47 Tableau 4.3 – Épaisseur de la coquille obtenue pour l’ajout de différents volumes d’une solution de TEOS 9 mM, tel que déterminé à l’aide des images TEM. ... 50 Tableau 5.1 – Évolution des propriétés des nanoparticules d’or au cours de la synthèse. Données extraites des analyses au TEM, en NTA et en spectroscopie UV-visible. ... 67 Tableau 5.2 – Liste des composantes du premier montage de microscopie de fluorescence. ... 75 Tableau 5.3 – Liste des composantes du second montage de microscopie de fluorescence. ... 80
viii
Liste des figures
Figure 1.1 – Quelques exemples de nanomatériaux utilisés dans le domaine biomédical.1 ... 1
Figure 1.2 –Schéma présentant la cytotoxicité des nanoparticules d’argent en milieu biologique riche en phosphates et chlorures.8 ... 2
Figure 1.3 – Utilisation des nanoparticules d’or sous différentes formes pour des applications biomédicales.11 ... 2
Figure 1.4 – Différents types de stimuli utilisés afin de contrôler le relargage d’un médicament.1 ... 4
Figure 1.5 – Absorption de différents composantes des tissus.19 ... 5
Figure 1.6 – Schéma illustrant la meilleure pénétration des tissus dans la fenêtre de transparence biologique.21 ... 5
Figure 1.7 – Schéma du nano-transporteur plasmonique imaginé afin de répondre aux objectifs du projet. ... 6 Figure 1.8 – Structure chimique de l’adénosine 5’-trisphosphate et de ses sous-produits d’hydrolyse, l’adénosine 5’-diphosphate et l’adénosine 5’-monophosphate.26 ... 7
Figure 1.9 – Méthode de détection d’ATP par bioluminescence entre une luciférase et la D-luciférine.32 ... 8
Figure 1.10 – Schéma présentant la technique de détection d’ATP à la surface des cellules par l’incorporation d’une luciférase membranaire à l’aide d’une mutation génétique.31 ... 9
Figure 1.11 – a) Métabolisme enzymatique du glycérol en présence d’ATP et d’oxygène, suivi de l’oxydation du peroxyde d’hydrogène la surface de l’électrode de platine. b) Droite d’étalonnage du biocapteur par électrochimie.34... 10
Figure 1.12 – Schéma de concept de l’outil développé par le groupe de Jean-François Masson pour la détection de bioanalytes dans l’environnement des cellules par diffusion Raman exaltée par une surface plasmonique.35 ... 11
Figure 1.13 – Schéma de concept de l’outil micrométrique développé afin de répondre aux différents objectifs du projet. ... 11 Figure 2.1 – Schéma présentant un plasmon de surface localisé pour une particule métallique soumise à un champ électromagnétique externe.39 ... 13
Figure 2.2 - Spectres d’extinction normalisés pour (A) des nanoparticules sphériques de différentes compositions et (B) des nanoparticules sphériques d’argent de différentes tailles.42... 14
Figure 2.3 – (A) Diagramme d’énergie libre de nucléation avec, en rouge, la courbe résultante des deux phénomènes compétitifs. (B) Diagramme de LaMer illustrant la nucléation et la croissance de nanoparticules.44... 15
Figure 2.4 – Diagramme de Jablonski illustrant les différents types de transitions électroniques qui peuvent avoir lieu lors des processus de luminescence.48 ... 17
Figure 2.5 – Positions spectrales relatives des phénomènes d’absorption, de fluorescence et de phosphorescence.47 ... 18
Figure 2.6 – Diagramme de Jablonski modifié pour un fluorophore à proximité d’une particule plasmonique, avec l’apparition de nouveaux chemins d’excitation et d’émission du fluorophore.49 19
ix
Figure 2.7 – Impact de la distance entre une nanoparticule métallique et un fluorophore sur les composantes d’extinction et d’exaltation de fluorescence.50 ... 20
Figure 2.8 – Facteurs d’exaltation de fluorescence pour des fluorophores placés à proximité de nanoparticules (A) d’argents42 et (B) d’or51 de différents diamètres recouvertes d’une couche de silice
modulable. ... 21 Figure 2.9 – Diagrammes de phase illustrant la température critique (A) inférieure et (B) supérieure de solubilité de polymères thermosensibles.52 ... 22
Figure 2.10 – Schéma de concept d’un hydrogel thermosensible s’affaissant sur lui-même à une température supérieure à sa LCST, libérant ainsi son cargo .54 ... 23
Figure 2.11 – Changement de conformation d’un aptamère en réponse à sa molécule-cible, ici l’ATP.56 ... 23
Figure 2.12 – Schéma de la méthode SELEX utilisée pour isoler les aptamères.59 ... 24
Figure 3.1 – Schéma de synthèse pour (A) le protocole de Turkevich et (B) le protocole de Brust.62
... 26 Figure 3.2 – (A) Oscillation transversale et longitudinale des électrons de conduction des nanobâtonnets. (B) Spectres d’extinction pour des nanobâtonnets d’or ayant différents ratios d’aspect. (C) Images de microscopie électronique à transmission des nanobâtonnets caractérisés en (B) (barre d’échelle de 50 nm).64 ... 27
Figure 3.3 - Structure chimique du CTAB et son arrangement sous forme de bicouche à la surface des nanobâtonnets d’or.64 ... 28
Figure 3.4 – Formes de nanoparticules attendues suite à l’ajout de différents halogènes à une solution de croissance de germes d’or contenant du nitrate d’argent.75 ... 29
Figure 3.5 – (A) Schéma réactionnel de la réduction autocatalytique du complexe d’or à la surface des nanoparticules. (B) Croissance et changement de morphologie des nanobâtonnets au fil du temps.72 ... 30
Figure 3.6 – (A) Image HR-TEM d’un nanobâtonnet d’or et (B) sa cartographie élémentaire correspondante obtenue par STEM-EDX montrant la présence d’argent sur toutes les facettes cristallines.82 ... 31
Figure 3.7 – Schéma des phénomènes pouvant avoir lieu lors de l’interaction entre un faisceau d’électrons incidents et un échantillon.88 ... 32
Figure 3.8 – Schéma des composantes d’un microscope optique en comparaison avec un microscope électronique à transmission et à balayage.90 ... 33
Figure 3.9 – Schéma des composantes typiques d’un montage de microscope de fluorescence.92 34
Figure 3.10 – (A) Spectres d’excitation et d’émission d’un fluorophore et (B) signatures de transmission des différentes composantes du cube de fluorescence utilisé pour imager ce fluorophore (filtre d’excitation, miroir dichroïque et filtre d’émission) .91 ... 35
Figure 3.11 – Processus d’atomisation d’un échantillon introduit dans une source à plasma.93 ... 36
Figure 3.12 – Schéma des composantes d’un spectromètre d’émission atomique dans un ICP-AES.93
... 37 Figure 3.13 – Fluctuations temporelles de l’intensité de diffusion d’une lumière laser par de grosses particules comparativement à de petites particules.95... 38
x
Figure 3.14 – Distinction entre le rayon réel des nanoparticules, tel que mesuré au TEM, et le rayon hydrodynamique calculé à l’aide de l’analyse DLS.97 ... 39
Figure 3.15 – Schéma du montage optique utilisé pour les mesures d’analyse du suivi individuel des particules.98 ... 40
Figure 4.1 – Schéma de concept du premier protocole de synthèse de nanobâtonnets d’or utilisé. 41 Figure 4.2 – Schéma de concept du second protocole de synthèse de nanobâtonnets d’or utilisé. 42 Figure 4.3 – Images TEM pour les nanobâtonnets obtenus avec le premier protocole pour des aliquots prélevés (A) après la première étape de croissance, puis après (B) 30 min, (C) 60 min, (D) 90 min, (E) 120 minutes et (F) la totalité de la seconde croissance. ... 43 Figure 4.4 – Évolution du spectre d’extinction des nanobâtonnets au cours de la première synthèse pour une même concentration de nanoparticules en solution. ... 44 Figure 4.5 – (A) Distribution de tailles des nanobâtonnets à la fin de la seconde croissance tel que déterminé au TEM (n = 187) avec, en bleu, la droite désignant les dimensions de nanosphères. (B) Évolution de la concentration d’or déterminée par ICP-AES pour des aliquots de nanobâtonnets dissous dans de l’eau régale avec, en bleu, la droite désignant la concentration d’or dans le milieu réactionnel (λ = 267,595 nm)... 45 Figure 4.6 - Images TEM pour les nanobâtonnets obtenus avec le second protocole pour les synthèses A, B et C. ... 46 Figure 4.7 - Spectres d’extinction des nanobâtonnets obtenus avec la seconde méthode de synthèse comparativement à la première méthode. ... 48 Figure 4.8 – Schéma de la méthode d’ajout d’une couche de silice à la surface des nanobâtonnets d’or par échange de ligands, puis condensation de TEOS. ... 49 Figure 4.9 – Mécanisme d’hydrolyse et de condensation d’un précurseur alkoxysilane par un procédé de type Stöber catalysé par une base.109 ... 49
Figure 4.10 – Images de microscopie électronique à transmission de nanobâtonnets d’or recouverts d’une couche de silice de (A) (8±1) nm, (B) (16±1) nm, (C) (23±2) nm, (D) (25±2) nm et (E) (30±3) nm. ... 50 Figure 4.11 – Évolution de la couche de silice sur les nanobâtonnets d’or pour l’ajout de différents volumes de TEOS 9 mM. ... 51 Figure 4.12 – Spectres d’extinction des nanobâtonnets d’or après l’échange de ligands avec le MPTMS, puis après l’étape d’ajout d’une couche de silice d’épaisseur modulable. ... 52 Figure 4.13 – (A) Structure de deux monomères : le NIPAM et le NIPMAM. (B) LCST de différents polymères thermosensibles, dont le PNIPAM (en bleu) et le PNIPMAM (en magenta).112 ... 53
Figure 4.14 – Schéma de synthèse pour l’ajout d’une coquille de polymère thermosensible à la surface des nanobâtonnets d’or recouverts de silice par (A) fonctionnalisation de surface à l’aide de groupements méthacrylate, puis (B) polymérisation par précipitation du NIPMAM. ... 54 Figure 4.15 – Images TEM de AuNBs@SiO2@MPS (A) dans l’éthanol et (B) dans l’eau après 2 h à
70°C. À titre de comparaison, images TEM de AuNPs@SiO2 (C) dans l’éthanol et (D) dans l’eau
après 2 h à 70°C. ... 55 Figure 4.16 - Schéma de synthèse alternatif pour l’ajout d’une coquille de polymère thermosensible à la surface des nanobâtonnets d’or par (A) polymérisation par précipitation du styrène, puis (B) polymérisation par précipitation du NIPMAM. ... 56
xi
Figure 4.17 – Spectres d’extinction des nanobâtonnets d’or à différentes étapes de l’ajout d’une couche de PNIPMAM. ... 57 Figure 4.18 – Images TEM de AuNBs@PS@PNIPMAM (A) après 30 min et (B) après 120 min de polymérisation du NIPMAM, puis (C) après un traitement thermique à 46°C pour l’échantillon en (A). Analyse DLS de (D) AuNBs@PS et (E) AuNBs@PS@PNIPMAM en fonction de la température. . 58 Figure 4.19 – Spectres d’extinction des nanobâtonnets d’or après des traitements dans différents milieux réactionnels. ... 59 Figure 4.20 – Images TEM de nanobâtonnets d’or (A) directement après leur synthèse, (B) après un traitement de 2h dans l’eau à 70°C et (C) après un traitement de 2h dans l’eau à 70 °C en présence de KPS. ... 59 Figure 4.21 - Distribution de tailles des nanobâtonnets après différents traitements tel que déterminé au TEM. ... 60 Figure 4.22 – Analyse DLS des nanobâtonnets d’or dans l’eau nano à température pièce. ... 61 Figure 5.1 – (A) Schéma présentant le changement de conformation attendu pour deux aptamères spécifiques à l’ATP possédant une séquence d’acides nucléiques légèrement différente. (B) Courbes de dénaturation des deux aptamères en présence d’urée mesurées par électrochimie. (C) Courbes de réponse des aptamères à l’ATP mesurées par électrochimie.120 ... 62
Figure 5.2 – Schéma du repliement de l’aptamère pleine longueur (27 bases azotées) (A) en absence d’ATP et (B) en présence d’ATP avec l’alignement des paires de bases. L’encadré noir présente le site de liaison des deux molécules d’ATP.121 En rouge, les bases nucléiques absentes dans la
séquence de l’aptamère déstabilisé sont mises en évidence.120 ... 63
Figure 5.3 – Modifications apportées aux extrémités de l’aptamère sensible à l’ATP. (A) Ajout à l’extrémité 5’ d’une chaine alcane possédant un lien disulfide. (B) Ajout à l’extrémité 3’ d’un fluorophore, le Quasar 670, avec (C) ses spectres d’excitation et d’émission dans l’eau. ... 65 Figure 5.4 – Schéma de synthèse des nanoparticules d’or sphériques par croissance contrôlée de germes. ... 66 Figure 5.5 – (A) Image TEM des germes d’or. (B) à (F) Images TEM des nanoparticules d’or obtenues lors de la croissance après chacun des 5 ajouts de réactifs. ... 67 Figure 5.6 – Distributions de tailles normalisées de nanoparticules d’or en solution, tel que déterminé par analyse du suivi individuel des particules. ... 68 Figure 5.7 – Évolution du spectre d’extinction des nanoparticules d’or au cours de la croissance. . 69 Figure 5.8 – Schéma de la fonctionnalisation des micropipettes de verre lors de la fabrication du biocapteur. ... 69 Figure 5.9 – Mécanisme en quatre étapes proposé pour la polycondensation d’un silane tel que l’ATPMS à la surface d’un substrat de verre.125 ... 70
Figure 5.10 – Mécanisme de réduction d’un lien disulfide à l’aide du TCEP.127 ... 71
Figure 5.11 – Schéma d’une monocouche de molécules thiolées sur une surface d’or, les sphères jaunes représentant les atomes de soufre, avec les défauts de surface possibles.129 ... 71
Figure 5.12 – Schéma de greffage de l’aptamère (en jaune) et du 6-mercaptohexanol (en mauve foncé) à la surface d’une nanoparticule d’or. ... 72
xii
Figure 5.13 – Images SEM d’une micropipette recouvertes de nanoparticules d’or de 47 nm. (A) Vue d’ensemble de la pointe et (B) vue rapprochée de la surface permettant de distinguer les nanoparticules individuellement. ... 72 Figure 5.14 – Spectres d’extinction de nanoparticules d’or déposées sur une surface de verre avec une faible densité et une grande densité.130 ... 73
Figure 5.15 – Comparaison du spectre d’extinction des nanoparticules d’or en solution et du spectre de diffusion des nanoparticules d’or sur la pointe de la micropipette, mesurés en microscopie à champ sombre à l’aide d’un sténopé de 5 µm et d’un spectromètre UV-visible Ocean Optics USB 2000+. Superposition des spectres des nanoparticules avec les spectres d’excitation et d’émission du Quasar 670. ... 74 Figure 5.16 – Concordance entre les spectres d’excitation et d’émission du Quasar 670 et les spectres de transmittance des composantes du cube de fluorescence utilisées dans le montage optique. ... 76 Figure 5.17 – Schéma du montage d’élution placé sur la platine du microscope, composé d’une lamelle de verre sur laquelle est immobilisée une pointe de micropipette surmonté d’une cellule de polydiméthylsiloxane permettant l’insertion de solutions aqueuses. ... 77 Figure 5.18 – (A) Correction du déplacement de la pointe lors de l’expérience par un traitement d’image sur le logiciel ImageJ grâce à l’extension StackReg. (B) Mesure de la moyenne des niveaux de gris de différentes régions d’intérêt (en pointillé) sur la pointe du biocapteur à l’aide du logiciel de traitement d’images. ... 78 Figure 5.19 – Variation du signal de fluorescence de la pointe de la pipette en fonction de la concentration d’ATP présente dans la cellule à perfusion. Les mesures sont effectuées sur le premier montage de microscopie de fluorescence et la cellule est lavée à l’aide de tampon PBS entre chaque étalon d’ATP analysé. ... 79 Figure 5.20 - Variation du signal de fluorescence de la pointe de la pipette en fonction de la concentration d’ATP présente dans la cellule à perfusion. Les mesures sont effectuées sur le second montage de microscopie de fluorescence et la cellule est lavée à l’aide de tampon PBS entre chaque étalon d’ATP analysé. ... 81 Figure 5.21 – Courbes d’étalonnage obtenues pour quatre pipettes préparées sur une échelle de plusieurs mois avec différents lots de réactifs et différents lots d’aptamère. Les barres d’erreur sur les courbes des pipettes 3 et 4 correspondent à l’écart-type sur des données provenant de trois régions d’intérêt sur chaque pipette. ... 81 Figure 5.22 – Comparaison des courbes d’étalonnage obtenues pour des pipettes recouvertes de nanoparticules d’or de 90 nm et de 50 nm et pour des biocapteurs avec et sans 6-mercaptohexanol. ... 82 Figure 5.23 - Schéma de greffage de l’aptamère (en jaune) en l’absence de 6-mercaptohexanol à la surface d’une nanoparticule d’or. ... 83 Figure 6.1- Déplacement du CTAB à la surface de nanobâtonnets d’or par échange de ligands avec du PEG-SH, puis avec du RSH.64 ... 87
xiii
Liste des abréviations
ADN Acide désoxyribonucléique
ADP Adénosine 5’-diphosphate
AMP Adénosine 5’-monophosphate
APTMS (3-Aminopropyl)triméthoxysilane
AR Ratio d’aspect
ARN Acide ribonucléique
ATP Adénosine 5’-triphosphate
AuNBs Nanobâtonnets d’or
AuNBs@MPTMS Nanobâtonnets d’or recouverts de (3-mercaptopropyl)triméthoxysilane
AuNBs@PS Nanobâtonnets d’or recouvertes de polystyrène
AuNBs@PS@PNIPMAM Nanobâtonnets d’or recouvertes de polystyrène, puis de poly(N-isopropylméthacrylamide) AuNBs@SiO2 Nanobâtonnets d’or recouverts de silice
AuNBs@SiO2@MPS Nanobâtonnets d’or recouverts de silice, puis de 3-méthacryloxypropyltriméthoxysilane
AuNPs Nanoparticules d’or sphériques
AuNPs@SiO2 Nanoparticules d’or sphériques recouvertes de silice
CCD Dispositif à transfert de charge
Ccrit Concentration critique de nucléation
CMC Concentration micellaire critique
Cmaxnu Concentration de nucléation maximale
Cminnu Concentration de nucléation minimale
CS Concentration de solubilité
CTAB Bromure de cétyltriméthylammonium
CTAC Chlorure de cétyltriméthylammonium
CTAI Iodure de cétyltriméthylammonium
Cα Concentration d’un métal dans une solution de nanoparticules dissoutes
xiv
DLS Diffusion dynamique de la lumière
DMA Diméthylamine
h Constante de Planck (6,62607004 × 10-34 m² kg / s)
HR-TEM Microscopie électronique à transmission à haute résolution ICP-AES Spectrométrie d’émission atomique à plasma à couplage inductif ICP-MS Spectroscopie de masse à plasma à couplage inductif
ISC Croisement inter-système
kB Constante de Boltzmann (1,38064852 × 10-23 m² kg s-2 K-1)
KPS Persulfate de potassium
LCST Température critique inférieure de solubilité
LSPR Plasmon de surface localisé
MBA N,N’-Méthylènebisacrylamide MPS 3-Méthacryloxypropyltriméthoxysilane MPTMS (3-Mercaptopropyl)triméthoxysilane NIPAM N-Isopropylacrylamide NIPMAM N-Isopropylméthacrylamide NPs Nanoparticules
NTA Analyse du suivi individuel des particules
PBS Tampon phosphate salin
PCR Amplification en chaîne par polymérase
PEG-SH Polyéthylène glycol méthyl éther thiol
PNIPAM Poly(N-isopropylacrylamide)
PNIPMAM Poly(N-isopropylméthacrylamide)
PS Polystyrène
RH Rayon hydrodynamique
RSH Alcanethiol
R* Rayon critique de nucléation
SDS Dodécylsulfate de sodium
SELEX Évolution systématique de ligands par enrichissement exponentiel
xv
SM Solution mère
STEM-EDX Spectrométrie à dispersion d’énergie couplée à la microscopie électronique à balayage par transmission
S0 Niveau électronique singulet fondamental
S1 Premier niveau électronique excité à l’état singulet
S2 Deuxième niveau électronique excité à l’état singulet
u.a. Unités arbitraires
UCST Température critique supérieure de solubilité
UV Ultra-violet
T Température
TCEP Tris(2-carboxyéthyl)phosphine
TCEP•HCl Tris(2-carboxyéthyl)phosphine sous forme de sel d’hydrochlorure
TEM Microscopie électronique à transmission
TEOS Orthosilicate de tétraéthyle
T1 Premier niveau électronique excité à l’état triplet
V Volume d’une nanoparticule
XPS Spectrométrie de photoélectrons induits par rayon X
ΔG Énergie libre du système
ΔGS Énergie libre de surface
ΔGV Énergie libre de volume
ΔG* Énergie libre maximale du système
η Viscosité d’un milieu
λ Longueur d’onde
νA Fréquence du photon absorbé
νF Fréquence du photon de fluorescence
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Extremists have shown what frightens them most : a girl with a book.
- Malala Yousafzai
And to all the little girls who are watching this, never doubt that you are valuable and powerful and deserving of every chance and opportunity in the world to pursue and achieve your own dreams.
xvii
Remerciements
Mon expérience aux études graduées s’achève enfin après tous ces mois d’efforts, de creusage de méninges et d’obstacles à surmonter, et je suis si reconnaissante envers tous ceux et celles qui m’ont accompagnée au cours de cette belle et grande aventure. Je voudrais d’abord offrir le plus grands des mercis à Denis, mon directeur de maîtrise, pour m’avoir donné le goût et la motivation de faire de la recherche scientifique avec son éternel enthousiasme et ses idées débordantes. Merci de m’avoir offert une place au sein de votre groupe lorsque je n’étais qu’une simple stagiaire et d’avoir toujours su trouvé du temps pour moi malgré votre horaire de Premier Ministre! Merci de m’avoir donné l’opportunité de prendre en mains mes projets, de faire mes propres erreurs et mes propres découvertes. Merci de m’avoir exilée en Allemagne pendant 2 semaines en plein dans le mois de décembre – je n’oublierai jamais le goût du Glühwein et les gens incroyables que j’ai rencontrés là-bas.
Un merci spécial à Marie et Phil, les deux collègues de mon année avec qui j’ai partagé tant de bons souvenirs au cours du bac. Nous avons formé un beau trio durant la maîtrise et vous m’avez redonné le sourire lorsque j’étais contrariée par mes nanoparticules (et disons-le, ça m’est arrivé souvent!). Merci également à Jérémie pour avoir été mon mentor depuis les trois dernières années et pour m’avoir remise sur le bon chemin un nombre incalculable de fois. Je suis reconnaissante pour toutes les pauses Dr. Pepper – ou dans notre cas, les pauses Pokemon Go – qui m’ont permis de demeurer saine d’esprit, surtout en période d’écriture. Je vais vraiment m’ennuyer de nos discussions enflammées sur les théories les plus obscures de Game of Thrones et de ton interminable guerre de
memes avec Phil.
Merci aussi aux autres membres du groupe, passés et actuels (Félix, Marie-Christine, Alex, Josée et Sam), qui m’ont bien fait rire avec leurs sujets de conversations éclectiques et leurs grands débats sur l’heure du diner. Je vais m’ennuyer de la grande famille du groupe Boudreau et des pots du vendredi au Pub Universitaire. Merci aussi à mes stagiaires, Mélanie Romain et Lydia Parent, qui ont contribué à mon premier projet de maîtrise.
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Plus important encore, je voudrais remercier de tout mon cœur ma fabuleuse famille sur qui j’ai toujours pu compter. Mille mercis Papa et Maman pour tout ce que vous avez fait pour moi, et pour tout ce que vous continuez de faire dans l’ombre. Merci d’être mon éternel support moral, mes plus grands
cheerleaders et les meilleurs modèles d’accomplissement qu’une petite fille aurait pu recevoir. Quand
j’avais 9 ans, plutôt que de rêver d’être une princesse, je disais que j’irais à l’Université Laval pour avoir autant de diplômes que vous. Je ne vous remercierai jamais assez de m’avoir aidée à réaliser ce rêve. Merci également à Sodie (ma soeurette, mon ancienne coloc et ma deuxième maman) pour avoir pris le temps de m’écouter quand ça allait moins bien, même quand tu venais de passer la semaine à sauver des bébés à l’hôpital. Tu as toujours été là pour me donner le coup de pied au derrière dont j’avais besoin. Merci d’avoir partagé mon trip de visiter la Corée du Sud – je rêve encore de notre ascension du Mt. Namsan et de nos moments entre sœurs à jaser dans les cafés de Séoul. Merci également à Mathieu de t’occuper aussi bien de Mélo, et surtout, merci de m’avoir accompagnée dans mon marathon effréné de Gilmore Girls!
Finalement, je tiens à remercier Pierre-Olivier, mon bébé d’amour, pour avoir enduré mes changements d’humeur, mon anxiété et mes moments de doute au cours des deux dernières années. Tu as été mon petit soleil, mon épaule sur laquelle pleurer et tu m’as redonné le sourire tant de fois que j’en ai perdu le compte. Merci pour les aventures qu’on a partagées ensemble, pour les éclats de rire autour d’un bon épisode de How I Met Your Mother, pour les excellents repas et pour les vignobles qu’on a visités. Tu es la seule personne avec qui je veux dériver au milieu d’un lac sur un ponton. Je t’aime fort bébé.
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1. Introduction
Malgré ses récentes avancées technologiques, la médecine moderne continue de faire face à de nombreux défis, dans des domaines aussi variés que l’imagerie, le diagnostic, la thérapie et la prévention des maladies. En effet, l’un des principaux obstacles auquel se butent les chercheurs est la complexité du corps humain, qui rend très difficile la compréhension de certains phénomènes biologiques. Parmi les stratégies employées pour s’adresser à ces problématiques, les nanomatériaux organiques et inorganiques apparaissent comme des outils de choix, puisqu’ils possèdent des
propriétés intéressantes qui les distinguent des matériaux à l’état macroscopique.
Figure 1.1 – Quelques exemples de nanomatériaux utilisés dans le domaine biomédical.1
Il suffit de penser au graphène qui, grâce à ses propriétés électroniques uniques, est à la base de plusieurs biocapteurs électrochimiques2, ou encore aux points quantiques qui permettent d’imager des
régions précises dans les tissus en raison de leur forte luminescence.3 Les particules magnétiques
présentent quant à elles un potentiel dans le traitement de tumeurs cancéreuses, puisqu’elles peuvent pénétrer les cellules malsaines et entrainer une hyperthermie mortelle lorsque soumises à un champ magnétique externe.4 De leur côté, les liposomes sont surtout utilisés comme vecteurs pour le transport
actif de médicaments dans un organisme, en raison de leur morphologie qui rappelle celle des membranes cellulaires et de leur cavité permettant d’emmagasiner des molécules bioactives.5
Les nanoparticules métalliques attirent également l’attention dans le domaine biomédical grâce à leurs propriétés optiques facilement modulables qui découlent de leur plasmon de surface localisé (LSPR). Les nanoparticules d’argent, plus particulièrement, possèdent l’intensité LSPR la plus élevée parmi
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tous les métaux,6 ce qui en fait de bons candidats entre autres pour le développement de biocapteurs
optiques. Toutefois, leur utilisation in vitro et in vivo demeure limitée en raison de leur cytotoxicité et de leur manque de stabilité dans des milieux biologiques complexes. En effet, la surface des nanoparticules d’argent tend à former des oxydes et peut même libérer des ions Ag+ dans leur
environnement. Ces ions sont reconnus pour leurs propriétés biocides, ce qui explique pourquoi les nanoparticules d’argent sont parfois utilisées comme agents antimicrobiens.7,8 Bien sûr, il existe
certaines méthodes afin de réduire la cytotoxicité des nanoparticules d’argent, comme l’ajout d’une couche de silice autour de la particule pour diminuer la diffusion des ions à sa surface. Toutefois, ces techniques présentent une efficacité limitée.9
Figure 1.2 –Schéma présentant la cytotoxicité des nanoparticules d’argent en milieu biologique riche en phosphates et chlorures.8
Étant à la fois biocompatibles et inertes, les nanoparticules d’or sont donc les plus largement utilisées en milieu biologique. Bien que le plasmon des nanosphères d’or soit typiquement dans le domaine du visible, il est possible de modifier leur forme et leur taille de façon à obtenir une longueur d’onde de résonance jusque dans le proche infrarouge. Ceci permet donc d’adapter les nanoparticules d’or pour une foule d’applications dans le domaine biomédical.10
3
Les nanoparticules d’or présentent également un intérêt au niveau de leur surface, qui peut être assez aisément modifiée de façon à y ajouter différentes fonctionnalités. Il est possible, par exemple, d’ajouter une couche de silice fluorescente autour des nanoparticules, ou encore de greffer à leur surface des anticorps, des protéines et même des brins d’ADN. Plusieurs groupements présentent d’ailleurs une bonne affinité pour les surfaces d’or, comme les amines et les thiols.12 Ce projet a donc pour but
d’exploiter les propriétés optiques et les propriétés de surface des nanoparticules d’or dans deux domaines connexes : le relargage contrôlé de médicaments et la détection d’ATP en milieu cellulaire.
1.1 Utilisation de nanoparticules d’or pour le relargage contrôlé de médicaments
La plupart des traitements médicaux envers un patient reposent sur l’administration d’un médicament composé d’une ou plusieurs molécules bioactives dans le corps humain. L’impact du traitement thérapeutique dépend alors de trois grands facteurs : l’efficacité du transport du médicament jusqu’au site biologique d’intérêt (une tumeur, un organe, un tissu, etc.), le contrôle de la dose administrée au site d’importance et le suivi thérapeutique permettant d’ajuster le traitement d’un patient à l’autre.13
Toutefois, la plupart des traitements disponibles sur le marché sont non-ciblés, ce qui diminue grandement leur efficacité. Il suffit de penser à la chimiothérapie, un traitement non-ciblé contre le cancer, qui utilise le système sanguin afin d’acheminer le médicament à travers pratiquement tout le corps. Puisque seule une fraction des molécules bioactives administrées se rend aux tumeurs cancéreuses visées, la chimiothérapie demande l’utilisation de doses élevées de médicaments. Ceci peut mener à l’apparition de nombreux effets secondaires indésirables, tels que la perte des cheveux, l’apparition de plaies buccales, la diminution de la fertilité et la dépression.14
Étant donné la complexité des barrières naturelles du système immunitaire et le manque de sélectivité des méthodes conventionnelles, le relargage contrôlé de molécules dans l’organisme représente un enjeu de taille pour l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques. De plus en plus, les recherches se tournent donc vers la médecine de précision, qui vise à personnaliser les traitements en utilisant entre autres la thérapie ciblée.15 Ce type de thérapie consiste à utiliser des nanomatériaux
comme véhicules afin de transporter des médicaments vers un site spécifique grâce à un ciblage actif. En effet, les nanomatériaux peuvent être fonctionnalisés à l’aide de différents agents de ciblage qui ont une affinité pour certaines structures biologiques, comme des anticorps, des brins d’ADN ou des protéines.13
4
Dans un second temps, la thérapie ciblée utilise un stimulus externe afin de contrôler la libération du médicament. Il peut s’agit d’un stimulus physique, comme de la lumière, un changement de température ou encore des ultrasons. D’autres systèmes emploient plutôt des stimuli biologiques, comme une molécule sécrétée par un certain type de cellules, ou encore des stimuli chimiques, comme un changement de pH ou la présence d’un oxydant.1 Le troisième aspect consiste plutôt à intégrer au
nano-véhicule un système de suivi de l’effet thérapeutique. Ceci peut inclure par exemple des éléments luminescents qui seraient visible en microscopie de fluorescence,16,17 ou encore des nanoparticules
magnétiques détectables par imagerie à résonance magnétique.18
Figure 1.4 – Différents types de stimuli utilisés afin de contrôler le relargage d’un médicament.1
Les nanoparticules d’or s’avèrent être de bons candidats afin de développer des nano-véhicules sensibles à la lumière. Les nanosphères d’or possèdent une résonance plasmonique typiquement autour de 530 nm, c’est-à-dire qu’elles peuvent absorber et diffuser la lumière dans la région du visible. Par contre, il n’est pas idéal de travailler avec le domaine du visible en milieu biologique, puisque plusieurs composantes des tissus (comme les protéines, l’eau et l’hémoglobine) possèdent un grand coefficient d’absorption à ces longueurs d’onde.19 De plus, certaines structures biologiques, telles que
les acides aminés, les flavines, les porphyrines et la mélanine peuvent causer l’autofluorescence des tissus dans cette région spectrale.20
5
Figure 1.5 – Absorption de différents composantes des tissus.19
Il est par conséquent préférable de se déplacer vers le proche infrarouge, plus spécifiquement entre 650 nm et 1450 nm, une région reconnue comme la fenêtre de transparence biologique et dans laquelle la pénétration des tissus est maximale et les dommages causés aux cellules sont limités.21 Certaines
nanoarchitectures d’or possèdent d’ailleurs un plasmon dans cette région spectrale. Les nanobâtonnets22 de même que les nanoparticules hybrides possédant un cœur de silice et une coquille
d’or18 représentent des structures intéressantes à cet égard, particulièrement pour des dimensions
inférieures à 100 nm, soit une taille optimale pour l’accumulation dans les tissus biologiques.23
Figure 1.6 – Schéma illustrant la meilleure pénétration des tissus dans la fenêtre de transparence biologique.21
6
L’objectif du projet est donc de développer une plateforme plasmonique multifonctionnelle qui permettra à la fois d’encapsuler des molécules bioactives, de cibler la région biologique d’intérêt et d’effectuer le suivi du traitement médical en temps réel. Pour ce faire, nous avons imaginé une nanostructure basée sur un nanobâtonnet d’or entouré d’une couche de silice fluorescente et d’une couche de polymère thermosensible dans laquelle un médicament peut être encapsulé. Ce véhicule peut également être décoré d’agents de ciblage afin d’assurer le transport actif du cargo.
Figure 1.7 – Schéma du nano-transporteur plasmonique imaginé afin de répondre aux objectifs du projet.
Selon ce concept, en réponse à un stimulus lumineux dans le proche infrarouge, le nanobâtonnet absorbe une partie de l’énergie incidente et la transmet sous forme de chaleur à son environnement. Ceci entraine l’affaissement de la couche de polymère, qui possède une température critique minimale de solubilité supérieure à la température du corps humain, libérant ainsi son contenu dans le milieu biologique. En réponse au traitement, les cellules génèrent alors une molécule ou un ion et, si le fluorophore incorporé dans la couche de silice y est sensible, il est alors possible de suivre le traitement en temps réel par microscopie de fluorescence.
À plus long terme, l’application visée pour ces transporteurs à nanocargos est le traitement de maladies dermatologiques orphelines, puisque la peau peut être facilement traversée par un laser dans l’infrarouge. Par contre, pour faire une preuve de concept, ces nano-véhicules seront d’abord étudiés pour effectuer la décalcification des valves aortiques dans des cultures cellulaires cardiaques. Nos collaborateurs, le Dr. Patrick Mathieu et son équipe à l’Institut universitaire de cardiologie et de
7
pneumologie de Québec, ont en effet développé un médicament pour traiter cette maladie, soit la
2-thiouridine-5'-triphosphate.24 Puisqu’une conséquence du traitement est la libération d’ions calcium
dans le milieu cellulaire, l’incorporation d’un fluorophore sensible au calcium à la couche de silice permet de faire le suivi du traitement.
1.2 Utilisation de nanoparticules d’or comme biocapteurs pour la mesure d’ATP dans des cultures cellulaires
Une des molécules les plus étudiées dans le domaine des biocapteurs est l’adénosine 5’-triphosphate (ATP). Découverte par Karl Lohmann en 1929,25 sa structure consiste en un sucre, le ribose, auquel
sont liées une chaine de trois groupements phosphates ainsi qu’une base azotée portant le nom d’adénine (voir figure 1.8). L’intérêt de l’ATP provient de son rôle central en tant que source d’énergie dans le métabolisme des cellules. En effet, l’hydrolyse de l’ATP est une réaction exothermique qui alimente une grande variété de processus biologiques, tels que le transport actif transmembranaire, la division cellulaire et la synthèse de biomolécules essentielles à la survie cellulaire. Au cours de cette réaction, les sous-produits générés sont l’adénosine 5’-diphosphate (ADP) ainsi qu’un groupement phosphate libre, mais l’ADP peut être hydrolysée à son tour pour former de l’adénosine 5’-monophosphate (AMP), ce qui libère davantage d’énergie.26
Figure 1.8 – Structure chimique de l’adénosine 5’-trisphosphate et de ses sous-produits d’hydrolyse, l’adénosine 5’-diphosphate et l’adénosine 5’-monophosphate.26
Étant donné le rôle vital de l’ATP pour le métabolisme, il n’est pas étonnant d’apprendre que sa concentration en milieu intracellulaire est relativement élevée; plusieurs études l’estiment dans le
8
domaine du faible millimolaire (1-10 mM) tout dépendant du type de cellule étudié.27,28 Toutefois, les
chercheurs ont longtemps cru que la concentration d’ATP dans le milieu extracellulaire était nulle. À l’époque, il était illogique de penser que les cellules puissent se débarrasser d’une partie – même infime – de leur ATP, car le seul rôle qu’on lui octroyait était celui de carburant. Cette croyance était appuyée par le fait qu’aucun mécanisme de transport membranaire n’était alors connu pour l’ATP.29
Cependant, des études menées à partir des années 1950 ont permis de démontrer que l’ATP est bien présente en milieu extracellulaire, bien que ce soit en faible concentration (typiquement de 20 nM à 10 µM). Il s’avère que l’ATP traverse la membrane cellulaire par exocytose et joue alors un rôle important dans la régulation de plusieurs phénomènes biologiques, comme la contraction musculaire, l’agrégation des plaquettes sanguines, la neurotransmission et la vasoconstriction.29 Cette molécule
est également excrétée par les cellules en réponse à un stress externe, puisqu’elle promeut la réparation tissulaire et l’activation du système immunitaire.30
Afin de mieux comprendre les différents rôles de l’ATP, il est important de connaître avec précision sa concentration dans les cellules ainsi que dans leur environnement en fonction du temps. L’une des techniques les plus utilisées pour la mesure d’ATP dans le milieu extracellulaire repose sur la bioluminescence générée par une interaction entre une enzyme oxydative, une luciférase, et une molécule pouvant générer de la lumière lorsqu’elle subit une oxydation, une luciférine. De manière générale, une luciférase est utilisée pour catalyser la réaction à multiples étapes entre la D-luciférine, l’oxygène ainsi que l’ATP avec son cofacteur métallique (Mg2+). L’oxyluciférine est alors formée à l’état
excité et émet de la lumière à une longueur d’onde de 560 nm en retournant au niveau fondamental. Cette méthode, bien qu’elle possède une sensibilité et une sélectivité très élevées, repose cependant sur des mesures d’ensemble qui ne permettent pas le suivi en temps réel.31,32
9
Il y a une dizaine d’années, un groupe de recherche a toutefois exploité ce couple luciférase/luciférine dans le but d’effectuer le suivi de la concentration d’ATP à la surface de cellules.33 Pour ce faire, une
protéine membranaire comportant un segment luciférase a été incorporée à une lignée cellulaire. Cette enzyme oxydative est située à l’interface en contact avec le milieu extracellulaire, comme le montre la figure 1.10, ce qui permet de sonder l’ATP tout près des récepteurs membranaires. Dans le cadre de cette étude, la concentration d’ATP tout près de la membrane s’est révélée plus élevée que dans le reste du milieu extracellulaire, soit de l’ordre de 100 à 200 µM pour les deux types de cellules étudiés.
Figure 1.10 – Schéma présentant la technique de détection d’ATP à la surface des cellules par l’incorporation d’une luciférase membranaire à l’aide d’une mutation génétique.31
Cependant, cette technique est peu applicable à d’autres systèmes, puisqu’elle requiert l’incorporation d’une nouvelle protéine à la membrane cellulaire par mutation génétique. En plus d’être complexe, cette manipulation génétique pourrait également avoir un impact sur le métabolisme des cellules et, par conséquent, modifier la concentration d’ATP par rapport aux cellules préexistantes. Cette méthode se limite également à la mesure d’ATP à l’interface entre la membrane et le milieu extracellulaire. Afin de s’adresser à ces problématiques, d’autres outils de mesure plus localisés ont également été imaginés. Le groupe de Nicholas Dale, par exemple, a développé une microélectrode de platine recouverte de glycérol kinase et de glycérol-3-phosphate oxydase. Ces enzymes, en présence d’ATP et d’oxygène, permettent de métaboliser le glycérol pour former du peroxyde d’hydrogène. L’oxydation de ce dernier composé, catalysée sur une surface de platine, peut alors être détectée par une simple mesure d’électrochimie, ce qui permet de quantifier la concentration d’ATP en milieu extracellulaire dans une gamme de 200 nM à 50 µM (voir figure 1.11).
10
Figure 1.11 – a) Métabolisme enzymatique du glycérol en présence d’ATP et d’oxygène, suivi de l’oxydation du peroxyde d’hydrogène la surface de l’électrode de platine. b) Droite d’étalonnage du biocapteur par
électrochimie.34
Encore une fois, cette technique de mesure possède certains inconvénients. Tout d’abord, le diamètre de la microélectrode (25-100 µm) est du même ordre de grandeur que le diamètre des cellules, ce qui rend cet outil très invasif en plus de limiter sa précision spatiale. De plus, la mesure dépend à la fois de la concentration d’ATP et de glycérol dans l’environnement cellulaire, deux paramètres qui varient aussi bien dans le temps que dans l’espace sondé.
Le présent projet vise donc à développer un outil micrométrique non-invasif pour effectuer la détection localisée d’adénosine 5’-triphosphate dans les milieux intra et extracellulaire, et ce, en fonction du temps. Cette méthode de détection doit être à la fois non-invasive et présenter une grande sélectivité pour l’analyte d’intérêt. De plus, le biocapteur doit posséder une bonne sensibilité dans le domaine de concentration de l’analyte retrouvé dans les échantillons biologiques. Idéalement, cet outil doit également être polyvalent afin de détecter éventuellement d’autres biomolécules intéressantes. Pour y arriver, nous nous sommes tournés vers les nanoparticules d’or afin de tirer profit de leurs propriétés plasmoniques et de leur biocompatibilité. Afin de trouver un support micrométrique pour ces nanoparticules d’or, nous nous sommes inspirés de travaux effectués par nos collaborateurs, le groupe de Jean-François Masson à l’Université de Montréal, qui se spécialisent dans le développement de biocapteurs. Récemment, cette équipe a développé un outil composé d’une micropipette de verre recouverte de nanoparticules d’or pour la détection de biomolécules par microscopie Raman (voir figure 1.12).35
11
Figure 1.12 – Schéma de concept de l’outil développé par le groupe de Jean-François Masson pour la détection de bioanalytes dans l’environnement des cellules par diffusion Raman exaltée par une surface plasmonique.35
En effet, ce concept tire profit des propriétés plasmoniques des nanoparticules d’or afin d’exalter la diffusion Raman d’un métabolite se trouvant à proximité. Nos collaborateurs ont testé ces biocapteurs en milieu biologique et sont parvenus à détecter différentes biomolécules d’intérêt, notamment l’ATP, le glucose, le pyruvate, le lactate ainsi que l’urée. Cependant, cette technique est présentement limitée à de la détection semi-quantitative, puisque l’intensité des bandes Raman varie grandement en fonction de l’orientation du métabolite et de la distance qui le sépare de la surface plasmonique.
Figure 1.13 – Schéma de concept de l’outil micrométrique développé afin de répondre aux différents objectifs du projet.
Le but est donc de nous baser sur ce prototype afin de développer un outil de détection quantitatif pour l’ATP. Pour ce faire, nous avons imaginé un substrat composé d’une micropipette de verre recouverte
12
de nanoparticules d’or de 50 nm de diamètre. La surface du capteur est fonctionnalisée avec un aptamère fluorescent, soit un court simple brin d’ADN modifié avec un fluorophore, qui possède une grande affinité pour l’ATP. Lorsque l’aptamère se lie à sa molécule cible, il se replie sur lui-même, rapprochant ainsi le fluorophore de la surface des nanoparticules d’or. Grâce à un montage de microscopie de fluorescence, il est alors possible de mesurer l’extinction de fluorescence résultant de ce changement de conformation et, par conséquent, de quantifier la concentration d’ATP localement.
1.3 Liste des objectifs des deux projets
Pour résumer, les objectifs du premier projet sont de :
• Développer une nanoarchitecture plasmonique biocompatible dans le domaine de l’infrarouge; • Permettre l’encapsulation de molécules bioactives à proximité de la nanoparticule;
• Inclure un agent de ciblage pour assurer le transport actif du cargo;
• Assurer un suivi du traitement en incorporant un fluorophore sensible au calcium. Dans un second temps, les objectifs du projet de détection d’ATP sont de :
• Développer un outil de détection micrométrique pour quantifier la concentration d’ATP dans l’environnement de cellules;
o Synthétiser des nanoparticules d’or sphérique avec un contrôle adéquat de la morphologie et de la taille;
o Greffer ces nanoparticules à la surface de micropipettes de verre; o Ajouter un aptamère spécifique à l’ATP en surface.
• Développer une plateforme de détection en microscopie de fluorescence;
• Tester les performances de l’outil de détection avec des solutions d’ATP aqueuses; • Tester les performances de l’outil de détection dans des conditions biologiques.
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2. Principes théoriques
2.1 Nanomatériaux
Les nanomatériaux représentent une classe de matériaux ayant au moins une dimension dans le domaine nanométrique. Leur intérêt provient principalement de leur taille, à la frontière du domaine atomique, qui leur confère des propriétés différant grandement du matériau à l’état macroscopique. Le confinement des électrons dans une ou plusieurs dimensions, par exemple, procure aux nanostructures des propriétés électroniques et optiques uniques qui suscitent l’attention dans une multitude de domaines. Par ailleurs, leur grand rapport surface/volume ouvre la porte à une grande gamme de modifications de surface qui permet de créer des nanoarchitectures adaptées à de nouvelles applications.36,37
2.1.1 Nanoparticules métalliques
Les nanoparticules métalliques présentent un intérêt particulier dans les technologies émergentes en raison de leurs propriétés plasmoniques. En effet, en présence d’un champ électromagnétique externe d’une certaine fréquence, les électrons de conduction des nanoparticules métalliques peuvent se mettre à osciller collectivement autour du noyau chargé positivement. Cette résonance, illustrée à la figure 2.1, porte le nom de plasmon de surface localisé, en raison du confinement de la nanoparticule dans les trois dimensions.38,39
Figure 2.1 – Schéma présentant un plasmon de surface localisé pour une particule métallique soumise à un champ électromagnétique externe.39
Une conséquence de ce phénomène électronique est que les nanoparticules métalliques possèdent une signature d’absorption et de diffusion de la lumière à des longueurs d’onde bien précises. Lors du processus d’absorption, la lumière incidente est convertie sous forme de chaleur par le plasmon, alors qu’elle est réémise de manière isotropique à la même fréquence au moment de la diffusion. La
14
combinaison de ces deux phénomènes, que l’on nomme l’extinction, peut d’ailleurs être mesurée par spectroscopie UV-visible.40 La fréquence à laquelle les électrons d’une nanostructure entrent en
résonance dépend toutefois de nombreux facteurs, tels que la nature du matériau la composant, sa taille, sa forme ainsi que la constante diélectrique de son milieu environnant.41 Des nanoparticules
sphériques d’indium, par exemple, possèdent un maximum plasmonique dans l’ultraviolet, tandis que les nanoparticules composées d’argent et d’or ont un maximum respectivement aux environs de 400 nm et 530 nm. De plus, comme l’illustre la figure 2.2, la position de la bande plasmonique se déplace vers le rouge lorsque le diamètre des nanoparticules, ici composées d’argent, augmente.42
Figure 2.2 - Spectres d’extinction normalisés pour (A) des nanoparticules sphériques de différentes compositions et (B) des nanoparticules sphériques d’argent de différentes tailles.42
La taille des particules influence également leur propension à absorber et à diffusion la lumière. En effet, le spectre d’extinction des particules de petite taille est dominé par la composante d’absorption, tandis que les grosses particules sont considérées comme plus diffusives.43 Plusieurs paramètres
doivent donc être considérés lors du choix d’une nanostructure pour une application visée.
2.1.2 Mécanisme de formation de nanoparticules
Il existe deux grands types d’approche afin de préparer des nanoparticules. L’approche descendante consiste à former des colloïdes à partir d’un matériau macroscopique, ce qui inclut entre autres les différentes techniques de lithographie et d’ablation laser. L’approche ascendante, de son côté, utilise les atomes et les molécules comme blocs de départ pour former des nanoparticules, que ce soit par exemple par déposition chimique en phase vapeur, par procédé solution-gélification ou par émulsion.
15
Dans le cas des nanoparticules métalliques, la méthode de synthèse la plus courante est la réduction de complexes métalliques en solution. Ce processus ascendant suit généralement deux étapes : la nucléation et la croissance des germes. La nucléation est un processus au cours duquel des précurseurs atomiques ou moléculaires à l’état solvaté s’assemblent pour former des cristaux solides. D’un point de vue thermodynamique, cette réaction est favorisée par la diminution de l’énergie libre de volume (ΔGV) issue de la formation des cristaux. Ce changement de phase, par contre, mène à
l’apparition d’une nouvelle interface solide-liquide, ce qui fait augmenter l’énergie libre de surface du système (ΔGS). Pour des germes très petits, la résultante ΔG de ces deux phénomènes compétitifs
donne une valeur positive, puisque le rapport surface/volume est très important (voir figure 2.3 A). Un rayon critique R*, cependant, est atteint lorsque l’énergie libre du système est à son maximum (ΔG*). À partir de cette taille, la pente de ΔG devient négative et la diminution de l’énergie libre de volume devient la force motrice qui stabilise les germes formés.44
Figure 2.3 – (A) Diagramme d’énergie libre de nucléation avec, en rouge, la courbe résultante des deux phénomènes compétitifs. (B) Diagramme de LaMer illustrant la nucléation et la croissance de nanoparticules.44
Le diagramme de LaMer à la figure 2.3 B permet d’illustrer la cinétique de nucléation et de croissance des germes en solution. Selon ce modèle, une espèce atomique est d’abord ajoutée en solution; dans le cas de nanoparticules métalliques, il s’agit souvent d’un précurseur sous forme de complexe qui est réduit par l’ajout d’un réducteur. Au début de la réaction, la concentration atomique augmente jusqu’à atteindre, dans un premier temps, la concentration de saturation (CS). À ce point, le coût énergétique
16
stables. La concentration atomique continue par conséquent d’augmenter jusqu’à la concentration minimale de nucléation (Cminnu ). Au-delà de cette valeur, la concentration critique de nucléation (C
crit)
est atteinte, ce qui mène à la formation de germes jusqu’à ce que les réserves atomiques retombent sous la barre de Cminnu . Typiquement, une étape du nucléation de courte durée permet d’obtenir une
population de germes de faible polydispersité. C’est pour cette raison que le réducteur ou le précurseur métallique est habituellement ajouté très rapidement dans le milieu réactionnel.
Les germes ainsi formés subissent par la suite une période de croissance lors de laquelle les réactifs sont consommés, et ce, jusqu’à ce que la concentration atomique atteigne de nouveau la concentration de solubilité. Durant cette étape, cependant, les germes ne grossissent pas au même rythme, ce qui mène à un certain régime de tailles de particules. Les plus petites particules, qui possèdent une énergie libre de surface plus élevée, sont alors susceptibles de se dissoudre en solution puis de s’agglomérer à des particules de plus grande taille afin de diminuer l’énergie de surface globale du système. Ce processus est nommé la maturation d’Ostwald.44,45
2.2 Fluorescence
La luminescence est une émission de lumière qui se produit lorsqu’une molécule dans un état électronique excité retourne à son état fondamental. Ce processus est divisé en deux catégories distinctes, soit la fluorescence et la phosphorescence, en fonction des niveaux électroniques impliqués lors de l’émission.46
2.2.1 Mécanismes menant à la luminescence
Les différents phénomènes qui entrent en jeu lors de la luminescence peuvent être illustrés à l’aide d’un diagramme de Jablonski schématisant les principaux niveaux énergétiques d’une molécule luminescente (voir figure 2.4). Celle-ci est considérée à l’état fondamental lorsque ses électrons se trouvent au niveau électronique singulet de plus faible énergie (S0). En présence d’un faisceau incident
d’énergie suffisante, les électrons de la molécule peuvent être excités du niveau fondamental vers un niveau singulet plus énergétique (S1 ou S2, par exemple). Ce processus d’absorption est ultrarapide,
soit de l’ordre de 10-15 seconde. Puisque que chaque niveau électronique possède plusieurs
sous-niveaux vibrationnels, il existe un grand nombre de transitions électroniques possibles lors de l’excitation. C’est pour cette raison que le spectre d’absorption d’une molécule présente une bande large plutôt qu’une raie très étroite.46,47
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Figure 2.4 – Diagramme de Jablonski illustrant les différents types de transitions électroniques qui peuvent avoir lieu lors des processus de luminescence.48
Une fois à l’état excité, la molécule peut retourner à l’état fondamental par l’intermédiaire de plusieurs phénomènes radiatifs ou non-radiatifs. De manière générale, les électrons des différents niveaux vibrationnels de plus haute énergie retournent rapidement (10-12 s) au niveau vibrationnel fondamental
de S1 ou S2 par un processus non-radiatif appelé la relaxation vibrationnelle. Lorsque les niveaux
vibrationnels de deux niveaux électroniques se chevauchent, les électrons peuvent également être transférés vers l’état de moindre énergie sans émettre de photon. Si le transfert s’effectue entre deux niveaux singulets, ce phénomène est nommé conversion interne. Puisqu’il y a conservation de la multiplicité, ce transfert électronique est permis par les règles de sélection. À l’inverse, un croisement inter-système (ISC) désigne un transfert d’un niveau excité singulet S1 vers un niveau excité triplet T1
qui est interdit par ces mêmes règles. Pour cette raison, le croisement inter-système est significativement plus lent (10-10 s) que la conversion interne (10-12 s).
Lors de la désexcitation radiative, les électrons reviennent aux différents niveaux vibrationnels de l’état fondamental S0 en convertissant leur énergie sous forme de photons plutôt que sous forme de chaleur.
Dans le cas de la fluorescence, les électrons se trouvent initialement dans un état excité singulet, tandis que la phosphorescence implique une transition à partir d’un état excité triplet. Étant donné que la phosphorescence demande un changement de la multiplicité qui est interdit, il s’agit d’un phénomène moins probable et beaucoup plus lent (10-5-10-7 s) que la fluorescence (10-8-10-9 s). Le temps de vie
