Ces travaux de maîtrise avaient pour but d’exploiter les propriétés uniques des nanoparticules d’or dans différentes applications biomédicales. Dans un premier temps, des nanobâtonnets d’or ont été utilisés dans le développement de nano-véhicules pour le relargage contrôlé de médicaments, en raison de leur biocompatibilité et de leurs propriétés optiques modulables. Par la suite, des nanoparticules d’or sphériques ont servi à l’élaboration d’un outil de détection de l’ATP en milieu biologique, grâce à leurs propriétés plasmoniques.
L’objectif du premier projet était de développer un nano-véhicule capable d’encapsuler des molécules bioactives d’intérêt, de les transporter au site biologique visé grâce à du ciblage actif, puis de les relarguer de façon contrôlée grâce à un stimulus externe. L’architecture imaginée repose sur un nanobâtonnet d’or possédant un plasmon longitudinal dans la fenêtre du proche infrarouge. Cette nanostructure est entourée d’une couche de silice dopée d’un fluorophore pouvant interagir avec le milieu biologique, ainsi que d’une couche de polymère thermosensible permettant l’encapsulation un médicament. À la surface du nano-véhicule sont greffés des agents de ciblage pour assurer leur transport jusqu’au site d’intérêt. Ce concept original prévoit également l’utilisation d’un laser dans le proche infrarouge pour déclencher le relargage du principe actif, puisque les nanobâtonnets d’or peuvent absorber ces photons incidents, entrainant ainsi une hausse de température locale et donc un affaissement de la couche de polymère thermosensible.
Au cours de ces travaux, des nanobâtonnets d’or ont d’abord été synthétisés par croissance contrôlée de germes à l’aide de deux protocoles adaptés de la littérature. Les nanobâtonnets obtenus possèdent un ratio d’aspect variant entre 3 et 5,8, ce qui permet de moduler leur bande plasmonique longitudinale entre 800 et 1150 nm, en fonction du laser qui sera utilisé dans l’application finale. Par la suite, les AuNBs ont été recouverts d’une couche de silice uniforme à l’aide d’un protocole de polycondensation du TEOS catalysé en milieu basique. L’épaisseur de la couche de silice a pu être ajustée entre 5,6 et 33 nm en fonction du nombre et du volume d’ajouts de TEOS en solution. Le plan était ensuite de greffer un silane comportant une fonction méthacrylate à la surface de la couche de silice de façon à créer des points d’ancrage pour la polymérisation par précipitation du polymère thermosensible, le PNIPMAM. Toutefois, il s’est avéré que la couche de silice est instable en milieu aqueux, et plus
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particulièrement à haute température. Puisque cette érosion n’est pas observée dans le cas de nanosphères d’or recouvertes de silice, il semble que la présence de CTAB dans le milieu réactionnel au cours de la condensation de type Stöber mène à l’obtention d’une couche de silice poreuse et sensible à l’hydrolyse autour des nanobâtonnets d’or.
Pour contourner ce problème, les nanobâtonnets d’or ont plutôt été recouverts d’une mince couche de polystyrène avant d’effectuer la polymérisation du NIPMAM en milieu aqueux, une technique rapportée dans plusieurs articles scientifiques. La couche de PNIPMAM obtenue est d’environ 80 nm et possède une LCST d’environ 42 °C, ce qui permettrait en théorie d’incorporer une quantité appréciable de molécules bioactives et de les relarguer uniquement en présence d’un stimulus lumineux. Les travaux effectués sur ce projet ont donc mené à la synthèse de structures de type AuNBs@PS@PNIPMAM qui servent de base aux nano-véhicules imaginés.
Dans le but de compléter les objectifs de ce projet, certains éléments supplémentaires devront toutefois être incorporés à ces nano-véhicules. Puisque l’idée est d’abord de tester ces nano-véhicules pour la décalcification des valves aortiques à l’aide de cultures cellulaires cardiaques, il sera important d’encapsuler le médicament (la 2-thiouridine-5’-triphosphate) dans la couche de polymère thermosensible, ce qui peut être effectué à basse température. De plus, pour assurer le transport actif vers les cellules d’intérêt, il faudra ajouter un agent de ciblage à la surface de ces nanostructures. Il peut s’agir, par exemple, d’un anticorps spécifique à la myosine, une protéine exprimée dans le cœur pour la contraction musculaire.132 De plus, il sera nécessaire d’intégrer de façon covalente un
fluorophore sensible aux ions calcium à la couche de polystyrène ou de PNIPMAM de façon à suivre le traitement de décalcification en temps réel.
Cependant, avant d’effectuer les tests en milieu biologiques, il sera essentiel de s’adresser au problème de la présence de CTAB dans l’environnement des nanobâtonnets d’or. En effet, le CTAB est reconnu comme étant cytotoxique à partir d’une concentration relativement basse de 1 à 10 µM. De plus, ce surfactant forme une bicouche dense et extrêmement stable à la surface des AuNBs en milieu aqueux, mais les molécules de CTAB peuvent se détacher en milieu biologique hautement salin et causer la mort cellulaire.133 Il existe différents moyens dans la littérature pour retirer le CTAB de la
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intéressante en vue d’éviter l’agrégation des nanobâtonnets est d’effectuer une ou plusieurs étages d’échange de ligands, suivi de centrifugations pour retirer les molécules de CTAB. Par exemple, la figure 6.1 illustre une technique de déplacement du CTAB à l’aide molécules thiolées comme le polyéthylène glycol méthyl éther thiol (PEG-SH) ou un alcanethiol (RSH). Ce genre de réaction permettrait de retrouver le caractère biocompatible des nanobâtonnets d’or afin de les rendre applicables en milieu de culture cellulaire.
Figure 6.1- Déplacement du CTAB à la surface de nanobâtonnets d’or par échange de ligands avec du PEG-SH, puis avec du RSH.64
Le second projet visait à développer un biocapteur sélectif à l’ATP et de taille micrométrique dans le but d’effectuer des mesures en temps réel à l’intérieur comme à l’extérieur de cellules. Pour ce faire, l’outil de détection doit être à la fois non-invasif, posséder une grande affinité pour l’analyte d’intérêt et présenter une grande sensibilité dans le domaine de concentration d’ATP retrouvé dans le milieu biologique. Le but du projet était également de développer un outil polyvalent, c’est-à-dire qui pourrait éventuellement être adapté pour la détection de différentes biomolécules d’intérêt.
Au cours de ces travaux de maîtrise, un outil de détection d’ATP basé sur une micropipette de verre a été développé avec succès en collaboration avec le groupe du professeur Jean-François Masson. Tout d’abord, la pointe de la micropipette a été fonctionnalisée à l’aide d’un silane comportant un groupement amine terminal. Des nanoparticules d’or synthétisées par croissance contrôlée de germes ont par la suite été immobilisées sur la surface grâce à des interactions avec les fonctions amine, créant ainsi un tapis de nanoparticules plasmoniques. Un aptamère thiolé sélectif à l’ATP a ensuite été greffé sur la surface d’or, suivi de 6-mercaptohexanol afin de favoriser le redressement des brins
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d’ADN. Ce biocapteur mise sur le changement de conformation de l’aptamère en fonction de son milieu, passant d’une configuration dépliée en l’absence d’ATP à une configuration repliée en présence de sa molécule cible. Un fluorophore, le Quasar 670, est en effet ajouté à l’extrémité 3’ du brin d’ADN et son intensité de fluorescence varie grandement selon la distance qui le sépare de la surface d’or. En microscopie de fluorescence, il a donc été possible de détecter le phénomène d’extinction de fluorescence caractéristique au rapprochement de la sonde de la surface plasmonique en présence d’ATP.
Les performances du biocapteur ont été testées sur un montage de microscopie de fluorescence avec des étalons d’ATP dans une solution de tampon phosphate salin. Dans ces conditions, les micropipettes analysées ont permis de détecter quantitativement l’adénosine 5’-trisphosphate dans une gamme entre 1 et 10 mM, ce qui correspond à la concentration d’ATP retrouvée en milieu intracellulaire. Ces résultats ont également démontré une bonne répétabilité des mesures sur une même micropipette ainsi qu’une bonne reproductibilité entre des biocapteurs synthétisés sur plusieurs mois et à partir de différents lots de réactifs. De plus, la perte de signal observée est significative, atteignant environ 25% à une concentration de 10 mM d’ATP. En raison de leur faible diamètre, de leur biocompatibilité et de leur efficacité, ces pipettes micrométriques s’avèrent donc être des candidats de choix pour la détection d’adénosine 5’-triphosphate à l’intérieur des cellules.
Pour la suite du projet, il serait intéressant de poursuivre les études de détection d’ATP dans un milieu plus complexe, par exemple dans un milieu de culture cellulaire qui comporte une grande quantité de biomolécules et d’ions qui pourraient influencer les performances de l’aptamère. Ensuite, les micropipettes pourraient être testées à l’intérieur de cellules afin de vérifier l’efficacité de cet outil de détection sur des échantillons biologiques réels. Ces études sont déjà en cours grâce à la collaboration de deux groupes de recherche, soit celui du professeur Joachim Spatz à l’Université de Heidelberg en Allemagne et celui du professeur André Marette de l’Université Laval. Finalement, l’aptamère en surface du biocapteur pourrait être remplacé par un brin d’ADN sensible à une autre biomolécule, comme le glucose, le pyruvate ou le lactate afin de vérifier la versatilité de la plateforme de détection développée.
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