Université de Montréal
Étude de la sécrétion de la prosornatostatine humaine dans les cellules
AtT2O
Mémoire présenté à la faculté des études supérieures
en vue de l’obtention du grade de
Maltre ès sciences (M.Sc.)
en biochimie
Mai 2004
©, Caroline Meilleur, 2004
o
par
Caroline Meilleur
Département de biochimie
Faculté de médecine
Q
de Montréal
Direction des bibliothèques
AVIS
L’auteur a autorisé l’Université de Montréal à reproduire et diffuser, en totalité ou en partie, par quelque moyen que ce soit et sur quelque support que ce soit, et exclusivement à des fins non lucratives d’enseignement et de recherche, des copies de ce mémoire ou de cette thèse.
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Université de Montréal
Faculté des études supérieures
Ce mémoire intitulé
Étude de la sécrétion de la prosomatostatine humaine dans les cellules
AtT2O
Présenté par:
Caroline Meilleur
a été évalué par un jury composé par les personnes suivantes
Président dujuiy:
Membre du
jury:Directeur de recherche:
Codirecteur de recherche
Mémoire accepté le:
Dr. Léa Brakier-Gingras
Dr.
Nabil Seidah
Dr. Guy Boileau
SOMMAIRE
Les cellules eucaryotes possèdent toutes la voie de sécrétion constitutive. Cependant, seules les cellules spécialisées comme les cellules endocrines, exocrines et neuronales sont capables d’emmagasiner des protéines de sécrétion et de les relâcher suite à un stimulus extérieur. En effet, ces cellules possèdent un mécanisme de triage très spécialisé au niveau du réseau trans-Golgien qui cible les protéines soit vers les vésicules de sécrétion de la voie constitutive ou vers les grains associés à la voie régulée. Ce ciblage implique la présence d’un ou de plusieurs signaux portés par les protéines afin que celles-ci atteignent leur destination finale dans la cellule. Jusqu’à maintenant, le mécanisme par lequel s’effectue cette reconnaissance du signal demeure encore mal connu. Afin de mieux caractériser le mécanisme de ciblage de la prosomatostatine humaine vers les grains de sécrétion des cellules neuroendocrines AtT2O, trois approches furent utilisées. Dans un premier temps, des anticorps dirigés spécifiquement contre la région pro de la prosomatostatine furent produits afin de suivre la protéine entière dans la cellule. Pour la deuxième approche, une protéine de fusion consistant en la prosomatostatine fusionnée au peptide HA du virus influenza fut exprimée dans les cellules AtT2O. Des anticorps commerciaux furent utilisés afin de suivre la protéine de fusion dans la cellule. Aucune de ces deux approches n’a permis de suivre la protéine entière dans la voie de sécrétion régulée de la cellule AtT2O. La troisième approche consistait en la fusion de l’amylase pancréatique du rat avec le N-terminal de la prosomatostatine humaine. Cette stratégie nous a permis de démontrer que l’amylase, une protéine dirigée vers la voie constitutive dans les cellules AtT2O, pouvait être déviée vers la voie régulée lorsqu’elle est jumelée avec une protéine empruntant cette voie.
Mots clés : ciblage, voie de sécrétion régulée, prosomatostatine
SUMMARY
Protein secretion from eukaryotic celis can be either constitutive or regulated. While the constitutive pathway is ubiquitous, the regulated pathway is a hallmark of the endocrine, exocrine and nervous system. In this regulated pathway, newly synthesized proteins are stored within the celi and released only upon stimulation. It is in the trans-Golgi network that proteins belonging to the regulated pathway will be actively sorted from those to be secreted by the constitutive pathway. This targeting involves one or several recognition signais carried by the protein itself, within its structure. So far, this mechanism remains elusive. In order to characterize the sorting of the human prosomatostatin to the regulated pathway in neuroendocrine AtT2O celis, three different strategies have been used. First, we produced antibodies against the pro dornain of the prosomatosatin to follow the entire protein in the ceils. Secondly, a fusion protein lias been produced between the prosomatostatin and the peptide HA from Influenza virus. Commercial antibodies have been used to follow
(J
our hybrid in the ceils. None of these strategies lielped us to follow the prosomatostatin in the celis. Finally, another hybrid protein has been expressed in AtT2O celis. Rat pancreatic amyiase lias been fused to the N-terminal of human prosomatostatin. We showed by this approach that amylase, a constitutive secreted protein in AtT2O celis, may be targeted and secreted by the regulated pathway, when fused to a protein following that way.Key words: targeting, regulated secretion, prosomatostatin
TABLE DES MATIÈRES
SOMMAIRE III
SUMMARY Iv
TABLE DES MATIÈRES V
LISTE DES FIGURES VIII
LISTE DES ABRÉVIATIONS x
REMERCIEMENTS XII
CHAPITRE 1: REVUE DE LA LITTÉRATURE 1
1.1 Le Système vacuolaire central 1
1.1.1 Translocation co-traductionnelle 4
1.1.2 Transit dans le RER 6
1.1.2.1 Repliement des protéines dans le RER 6 1.1.2.2 Rétention des protéines dans le dans le RER 8
O
1.1.3 Transport vésiculaire 101.1.3.1 Biogenèse des vésicules enrobées de COP I 11 1.1.3.2 Biogenèse des vésicules enrobées de COPII 12 1.1.3.3 Biogenèse des vésicules enrobées de clathrine 13
1.1.3.4 fusion 14
1.1.4 Transit dans l’appareil de Golgi et le TGN 17 1.1.4.1 La rétention dans l’appareil de Golgi 20
1.1.4.2 La rétention dans le TGN 21 1.1.5 Modification post-traductionnelles 22 1.1.5.1 LaN-glycosylation 22 1.1.5.2 La O-glycosylation 25 1.1.5.3 La sulfatation et la phosphorylation 26 1.1.5.4 L’acetylation et l’amidation 27 1.1.5.5 Maturation des précurseurs 28
1.1.6 Ciblage à partir du TON 32
1.1.6.1 Ciblage des enzymes lysosomiales 33 1.1.6.2 Ciblage vers la voie de sécrétion régulée 34
1.2 La prosomatostatine 46
1.3 But du travail 50
CHAPITRE 2: MATÉRIEL ET MÉTHODES 52
2.2 Tampons .52
2.3 Méthodes 54
2.3.1 Construction des différents plasmides 54 2.3.1.1 Construction du plasmide pGEX-2T-région Pro 54
2.3.1.2 Construction du plasmide pRc/CMV— prosomatostatine-HA et. pRc/CMV-amylase
prosomatostatine 59
2.3.2 Expression de la protéine de fusion GST-région pro et
immunisation 62
2.3.3 Culture cellulaire 63
2.3.3.1 Conditions de culture 63
2.3.3.2 Passage des cellules 63
2.3.3.3 Congélation des cellules 64
2.3.3.4 Décongélation des cellules 64
2.3.3.5 Transfection 65
2.3.4 Extractions des protéines cellulaires et analyse 66
2.3.5 Immunofluorescence 67
2.3.6 Stimulation de la sécrétion 6$
2.3.7 Marquage métabolique et chasse 69
2.3.8 Immunoprécipitation 70
CHAPITRE 3: RÉSULTATS 71
0
3.1 Production d’anticorps polyclonaux dirigés contre larégion pro de la prosomatostatine humaine chez la lapin 71 3.1.1 Production de la protéine de fusion GST-région pro de la
prosomatostatine dans un système bactérien 74 3.1.2 Vérification de la réactivité des anticorps polyclonaux
anti région pro de la prosomatostatine humaine sur des
cellules LLCPKI exprimant la protéine de façon stable 74 3.1.3 Vérification de la réactivité des anticorps polyclonaux
anti région pro de la prosomatostatine humaine sur des
cellules AtT2O exprimant la promatostatine de façon stable 77 3.2 Expression de la protéine de fusion prosomatostatine-HA
dans les cellules AtT2O 80
3.3 Expression et caractérisation de la protéine de fusion Amylase
Prosomatostatine dans les cellules AtT2O 84
3.3.1 Expression de la chimère Amylase-Prosomatostatine
et de l’Amylase dans les cellules At120 $4 3.3.2 Maturation et sécrétion de la chimère Amylase
Prosomatostatine par les cellules AtT2O 91 3.3.3 Localisation intracellulaire de la chimère Amylase
Prosomatostatine par immunofluorescence dans les cellules
Q
3.3.4 Essai de la stimulation de la sécrétion de la chimère AmylaseProsomatostatine par les cellules AtT2O 99 3.3.5 Marquage métabolique et chasse de la chimèreAmylase-Prosomatostatine en présence de bréfeldine A dans
les cellules AtT2O 102
CHAPITRE 4: DISCUSSION 106
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES FUTURES 116
BIBLIOGRAPHIE 117
LISTE DES FIGURES
Figure 1.1 : Schéma représentant le système vacuolaire central et ses voies de
sécrétion 2
Figure 1.2 : Modèles de transport intra-Golgien 18
figure 1.3 : LaN-glycosylation 23
Figure 1.4: Modèle de sécrétion t « Sorting-for -entry » 40
f igure 1.5 : Modèle de sécrétion: «Sorting-by-retention» 44
Figure 1.6 t Schéma représentant la prosomatostatine et ses produits de
maturation 48
Figure 2.1: Séquence de Ï’ADNc de la préprosomatostatine humaine 55 Figure 2.2 t Construction du vecteur pGEX-2T-région Pro de la
prosomatostatine 57
f igure 2.3 t Construction du vecteur pRc/CMV-prosomatostatine-HA 60
Figure 3.1: Expression de la protéine GST-région pro de la prosomatostatine
chez E.coli 72
Figure 3.2 : Réactivité des anticorps polyclonaux de lapins dirigés contre la
région pro de la prosomatostatine 75
f igure 3.3 t Réactivité des anticorps polyclonaux de lapins dirigés contre la
région pro de la prosomatostatine envers la chimère amylase
prosomatostatine 7$
Figure 3.4 : Expression de la protéine de fusion prosomatostatine-HA dans
les cellules AtT2O $2
Figure 3.5 t Expression de la chimère amylase-prosomatostatine dans les
cellules AtT2O $5
Figure 3.6 t Schéma représentant la chimère amylase-prosomatostatine et les
portions reconnues par les différents anticorps 87 Figure 3.7: Sécrétion et maturation de la chimère Amylase-prosomatostatine par
les cellules AtT2O transfectées de façon stable $9 Figure 3.8 t Localisation de la chimère amylase-prosomatostatine dans les cellules
Figure 3.9 : Localisation de l’amylase dans les cellules AtT2O par
immunofluorescence indirecte 95
Figure 3.10 : Localisation immunohistochimique de la chimère amylase
prosomatostatine dans les grains de sécrétion des cellules AtT2O 97 Figure 3.11: Essai de stimulation de sécrétion de la chimère amylase
prosomatostatine dans les cellules AtT2O 100 Figure 3.12 : Sécrétion et maturation de la chimère amylase-prosomatostatine
par les cellules AtT2O en présence de Bréfeldine A 103
(D
LISTE DES ABRÉViATIONS ACTH hormone adrénocorticotropiqueAP adaptor protein BFA brefeldine A
Bip immunoglobulin heavy chain binding protein
C cellules
cDNA acide désoxyribonucléique complémentaire CON cis Glogi Network
COPI coat protein type I COPII coat protein type II
DMEM Dubelco’s modified medium DM$O Dimethylsulfoxide
C
ERGIC compartiment intermédiaire entre le RE et le Golgi GS4B glutathione sépharose 4BGST gluthatione s-transferase GTP guanosine triphosphate
HA épitope de l’hémaglutinine du virus influenza BBS Hepes buffered saline
TPTG isopropyl-J3-D-thiogalactoside kD kilodalton
M milieux
PBS phosphate buffered saline PC protéine convertase POMC pro-opiomélanocortine PM poids moléculaire
o
RER réticulum endoplasmique rugueux RIPA radioimrnune precipitation buffer
SNAP soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion atachment protein SNARE SNAP receptor
SRP signal recognition peptide TGN trans Golgi Network
REMERCIEMENTS
Je tiens à remercier mon directeur, Dr Guy Boileau, de m’avoir accueilli dans son laboratoire. Je tiens aussi à le remercier pour son appui, son grandsens critique et pour sa patience au cours de la rédaction de ce mémoire.
Je voudrais aussi remercier mon codirecteur, Dr Denis LeBel, d’avoir
fortement contribué à ce projet. Je garde un très bon souvenir de son positivisme et de sa créativité.
Je remercie également toutes les techniciennes et agentes de recherche du laboratoire qui m’ont si gentiment aidée. Merci à Claire Vézina, Line Lespérance et Louise Cournoyer. Votre aide m’a été précieuse.
f inalement, je remercie du fond du coeur ma mère et mon frère qui m’ont
supporté et aidé énormément pour la rédaction de ce mémoire. Aussi un gros merci à Jean-Sébastien Rivard pour m’avoir épaulée et encouragée dans les dernières années.
CHAPITRE 1- REVUE DE LA LITTÉRATURE
1.1 Le système vacuolaire central
La grande majorité des protéines synthétisées par les cellules eucaryotes partagent une origine de biosynthêse commune dans le cytosol, d’où elles doivent ensuite migrer pour atteindre leur destination finale. Ces protéines possèdent donc l’information nécessaire afin d’être localisées dans le bon compartiment cellulaire.
Plusieurs organelles de la cellule eucaryote sont regroupées en un réseau de vacuoles communément appelé système vacuolaire central. Les protéines destinées à être sécrétées devront emprunter plusieurs de ces organelles. Le système vacuolaire
C
central est illustré de façon schématique à la figure 1.1. Les organelles formant ce réseau sont le réticulum endoplasmique (RE), le compartiment de récupération ou CGN (cis-Golgi network), les saccules de l’appareil de Golgi, le TGN (trans-Golgi network), les lysosomes, les grains de sécrétion, les endosomes ainsi que toutes les vésicules qui assurent le transport entre ces différents compartiments. La voie de sécrétion (voie d’exocytose) peut être elle même divisée en voies de sécrétion réguléeet constitutive.
La voie de sécrétion constitutive est une voie présente dans toutes les cellules eucaryotes. Cette voie est dite constitutive car l’exocytose des protéines s’y fait dans un processus continuel, limité seulement par la disponibilité du produit. Conséquemment, les protéines qui utilisent cette voie, suite à leur synthèse, seront immédiatement acheminées vers la membrane plasmique par des vésicules de transport à partir du TGN. Les protéines qui empruntent cette voie comprennent, par
o
Figure 1.1 : Schéma représentant le système vacuolaire central et ses voies de sécrétion. Ce schéma est une adaptation d’une figure du traité Molecular biology of the celi, Albert et colT., 1994. RE: réticuTum endoplasmique; CGN: «cis-Golgi network »; TGN: «trans-Golgi network ».
C
o
CYSOSOMEO
ENDOSOME TAROIP MEMBRANE NUCLÉAIRE / RÉTICUCUM ENOOPLASMIQUE II II_I CON MÉDIAN TONET ET do TRANS VOIE MATURÂTME GRAIN DE SÉCRÉTION APPAREIL DE GOLGI
exemple, les protéines qui composent la membrane plasmique et les protéines de la matrice extra-cellulaire. La voie de sécrétion dite régulée se trouve seulement dans les cellules spécialisées pour la sécrétion, soit les cellules endocrines, exocrines et neuroendocrines. Cette voie est dite régulée car les protéines sont emmagasinées dans des grains de sécrétion qui se fusionnent à la membrane plasmique suite à une stimulation exercée par un sécrétagogue externe. Les protéines qui sont dirigées vers cette voie comprennent les précurseurs d’enzymes digestives, les neuropeptides et les prohormones.
Dans ce travail, nous nous intéresserons principalement à la voie d’exocytose dite régulée. Nous suivrons donc chacune des étapes du mécanisme de transport et de triage des protéines empruntant cette voie et ce, de leur synthèse à leur destination finale dans les grains de sécrétion.
C
1.1.1 Transiocation co-traductionnelle dans la lumière du RER
La translocation ou l’insertion dans le réticulum endoplasmique rugueux (RER) est la première étape impliquée dans l’adressage intracellulaire de plusieurs protéines dans les cellules eucaryotes. Ces protéines incluent toutes les protéines sécrétées en plus des protéines résidentes du RER, de l’appareil de Golgi, des lysosomes, des endosomes et de la membrane plasmique. Cette translocation s’effectue tout au long de la synthèse des protéines. C’est pourquoi on fait référence
Cette première étape de ségrégation est réalisée par un « récepteur » spécifique qui reconnaît un signal de transiocation porté par la protéine naissante. L’hypothèse du signal fut proposée par Blobel et Doberstein en 1975. Ils démontrèrent alors que l’insertion des protéines dans le RER impliquait la reconnaissance d’un signal peptidique présent dans la séquence située à l’extrémité NH2-terminale des protéines.
Ce signal est en général composé d’une séquence de 15 à 3 1 résidus d’acide aminé
(Carne et Scheele, 1983) et est appelé peptide signal ou pré-séquence. Ces pré séquences possèdent une partie hydrophobe qui est impliquée dans la liaison au complexe ribonucléoprotéique SRP (signal recognition particle) (Walter et al., 1981; Walter et Blobel, 1981) et qui aurait également une implication au niveau de l’insertion du peptide signal dans la couche bilipidique de la membrane du RER. Un site de coupure protéolytique suit la partie hydrophobe du peptide signal. Ce site de coupure est reconnu par une endoprotéase associée à la membrane du RER qui libère
Ç
la protéine en synthèse du peptide signal, c’est la «signal peptidase»Les différentes étapes du processus de transiocation sont aujourd’hui bien connues. La synthèse des protéines débute dans le cytosol. Lorsque le peptide signal des protéines en synthèse émerge du ribosome, la particule de reconnaissance du signal (SRP) s’y lie, causant ainsi un arrêt de la traduction (Walter et Blobel, 1981). Cet arrêt aurait pour but d’empêcher la traduction complète de la protéine dans le cytosol. Le complexe ribosome-ARNm-chaîne naissante-SRP s’arrime alors à la membrane du RE par la liaison du SRP à son récepteur (Gilmore et coll., 1982 a, b). Le SRP est ensuite relâché moyennant l’hydrolyse de GTP (Rapoport, 1992; Gilmore, 1993, Kalies et coli., 199$). La synthèse de la protéine peut alors continuer ainsi que sa translocation au travers de la membrane du RER via un pore aqueux nommé transiocon (Rapoport et coll., 1996). Ce pore est composé de pltisieurs complexes protéiques dont les plus importants sont le complexe Sec 61 (Gôrlich et coll., 1992 b),
et la protéine TRAM (<translocating chain-associating membrane») (Gôrlich et col!. 1992 a). Ces deux éléments, ainsi que le récepteur $RP, sont suffisants pour la
translocation des protéines sécrétées dans des protéoliposomes reconstitués (Voight et coil., 1996).
1.1.2
Transit des protéines dans le RER
Une fois passées la barrière du translocon, les protéines nouvellement synthétisées se retrouvent dans la lumière du RER sous forme non-repliée. Celles-ci subiront plusieurs modifications structurales, de façon co- et post-traductionnelle, telles que la glycosylation sur certains résidus asparagine, la formation de ponts disulftires, l’adoption d’une structure secondaire et tertiaire et, quelquefois,
C
l’assemblage en complexes oligomériques. Les protéines doivent donc rencontrer certaines normes structurales avant d’être transportées vers leur destination finale. Certaines d’entre elles resteront dans le RER comme protéines résidentes, alors que d’autres seront transportées aux saccules du Golgi pour être ensuite dirigées soit versla surface cellulaire, les lysosomes, ou pour certains types cellulaires dans des grains de sécrétion.
1.1.2.1 Repliement des protéines dans le RER
Un bon repliement des protéines est essentiel à leur bon adressage et à leur activité propre. L’efficacité et la rapidité de ce phénomène sont attribuables à des protéines chaperons agissant au niveau du RER. Une des classes de chaperons est celle des protéines grp (glucose-regulated proteins) qui sont des protéines induites
lors d’un manque de glucose chez des fibroblastes en culture (Shui et coll., 1977). Les deux plus importantes sont la grp7$, aussi appelée BIP pour «immunoglobulin heavy chain binding protein» (Hendershot et coll., 198$; Munro et Pelham, 1986), ainsi que la grp94 (Sorger et Pelham, 1987). La protéine BIP (grp78) est une protéine soluble qui aide au repliement des protéines nouvellement synthétisées en se liant aux surfaces hydrophobes. évitant ainsi leur agrégation. Elle permet donc aux protéines d’adopter leur conformation finale (Pelham, 1986). Pour sa part, la grp94 s’associe avec les protéines complètement oxydées (Melnick et cou., 1994).
La cainexine et la calréticuline sont aussi deux autres importantes molécules chaperons du RER. La cainexine a été découverte par sa phosphorylation par le GTP et par sa capacité à lier le calcium, d’où son nom (Wada et coll., 1991). Il a été proposé que ce chaperon se lierait aux glycoprotéines n’ayant qu’un résidu glucose sur la chaîne oligosaccharidique originale (Ou et colI., 1993; Hammond et cou., 1994). La cairéticuline fut d’abord identifiée comme étant une protéine majeure localisée dans le RER et liant le calcium (Fliegel et coll., 1989; $mith et Koch, 1989).
Il a été récemment démontré que la calréticuline joue un rôle dans le repliement de la
rnyéÏoperoxidase. Cette interaction entre les deux molécules se fait dans la mesure où la myéloperoxydase est immature et sous forme glycosylée (Nauseef et coli., 1995). La calréticuline est aussi reconnue pour lier plusieurs autres protéines comme l’hérnagglutinine du virus de l’influenza. L’association des deux protéines dépend de la présence d’un seul glucose sur la chaîne oligosaccharidique originale de la protéine virale (Peterson et colI., 1995). La calnexine et la calréticuline contiennent des domaines lectine qui sont cruciaux pour leur fonction de protéines chaperons (Schrag
L’enzyme disuiphure isomérase est une autre protéine résidente du RER qui interagit avec les protéines non-repliées. Cette enzyme catalyse l’oxydation des résidus thiols, favorisant ainsi l’échange disulfure (freedman, 1984).
Les protéines chaperons qui s’associent de façon transitoire avec les protéines partiellement repliées et de façon plus permanente avec les protéines mal repliées ont amené Hammond et Helenius à proposer l’existence d’un contrôle de qualité qui préviendrait le ciblage d’une protéine mal repliée vers la surface cellulaire (Hammond
et Helenius, 1994, Helenius et cou., 1997, Ritters et Helenius, 2000). Ce serait par
l’association des chaperons avec les protéines insuffisamment ou mal repliées que ces dernières resteraient emprisonnées dans le RER (Hurley et Helenius, 1989). En effet, il a été démontré qu’un mutant de repliement de la protéine G du virus VSV sensible à la température ne peut être envoyé au-delà du cis-Golgi (Hammond et Helenius,
Ç
1994). Les protéines mal repliées retournent ensuite dans le cytoplasme via letranstocon pour être dégradées par le protéasome (Kostova et Wolf, 2003).
1.1.2.2 Rétention des protéines dans le RER
La théorie du transport protéique intracellulaire par défaut prévoit l’existence
de mécanismes de rétention pour les protéines résidentes des compartiments du
système vacuolaire central. Munro et Pelham (1987) ont comparé la séquence protéique de trois protéines solubles résidentes du RER et ont trouvé à leur extrémité C-terminale un tétrapeptide commun aux trois protéines. Cette séquence, composée des acides aminés Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL), est responsable de leur rétention dans le réticulum (Pelham, 1990). En réalité, cette séquence n’empêche pas ces protéines de se retrouver dans un autre compartiment post-RE mais assure un mécanisme de
récupération via la reconnaissance de la séquence KDEL. Chez la levure S.cereWsiae,
un mutant incapable de retenir les protéines résidentes du RER fut isolé par le groupe de Peiham. Le gène mutant est ERD2, qui code pour une protéine de 25 kDa à sept
passages transmembranaires. Cette protéine serait responsable de la rétention des protéines dans le RER (Semenza et coli., 1990). De plus, Lewis et Peiham (1990) ont caractérisé une protéine présente dans les cellules humaines (hERD2) qui démontre une homologie de 50 % avec ERD2, et qui se localise dans l’appareil de Golgi et dans
les vésicules qui se trouvent entre le RER et le Golgi. Ceci confirme la présence d’un
compartiment de récupération responsable de rediriger les protéines vers le RER.
Le système de rétention KDEL est utilisé principalement par les protéines
solubles. Chez plusieurs protéines membranaires de type I, on a identifié un motif consensus différent comme signal de rétention. Ce motif de rétention est exposé au
Ç
niveau de la queue cytoplasmique, donc du côté C-terminal, et est représenté par la séquence KKXX ou KXKXX (Jackson et coll., 1990). Les deux résidus lysines constituent les résidus les plus importants (Gayacol et cou., 1994). Ce motif de rétention semble interagir avec un complexe polypeptidique impliqué dans le transport vésiculaire et appelé coatomère (Cosson et Letourneur, 1994). Pour les protéines membranaires de type II, c’est-à-dire ayant l’extrémité N-terminale du côté cytoplasmique, un motif impliquant deux arginines serait responsable de leur rétention (Schutze et coll., 1994). Cependant, trop peu de protéines membranaires de type II et résidentes du RER sont connues pour en dériver une théorie sur leur mécanisme de rétention.1.1.3 Transport vésiculaire
Les protéines nouvellement synthétisées et bien repliées qui sont destinées à être sécrétées doivent quitter le réticulum endoplasmique et continuer leur transit à travers les différentes organelles du système vacuolaire central. Le transport des protéines entre ces différentes organelles ainsi que vers la membrane plasmique s’effectue via les vésicules de transport qui bourgeonnent de la membrane dii compartiment donneur et fusionnent à la membrane du compartiment accepteur. Le transport vésiculaire est assuré par trois types de vésicules: les vésicules enrobées de COPI, de COPII ou de ciathrine. Les deux premières assurent le transport entre le RER et le Golgi, entre chacune des saccules de ce dernier et entre le IGN et la membrane plasmique pour les protéines empruntant la voie constitutive. Les vésicules enrobées de COPII sembleraient impliquées exclusivement dans le transport antérograde, entre le RER et le cis-Golgi via le compartiment intermédiaire appelé
ERGTC (Kuehn et Schekrnan, 1997, Glick, 2001). Pour leur part, les vésicules
enrobées de COPI joueraient un rôle plus complexe (voir section 1.1.4) dans le transport antérograde et rétrograde entre le RER et le cis-Golgi et entre les différents saccules du Golgi (Schekman et Orci, 1997, Gaynor et coll.. 1998, Mironov et coll., 2001). Les vésicules enrobées de clathrine sont impliquées dans le transport à partir du TGN vers les lysosomes via le compartiment de tri endosomal ainsi que vers les grains de sécrétion pour les protéines empruntant la voie régulée.
1.1.3.1 Biogenèse des vésicules enrobées de COPI
La formation de chacun des types de vésicules dépend du recrutement de protéines cytosoliques qui agiraient comme dispositif mécanique afin de donner à la membrane du compartiment donneur, une forme sphérique vésiculaire. L’enrobage des vésicules COPI est composé d’une petite protéine liant le GTP, 1’ARF (ADP ribosylation factor; Serafini et cou., 1991) ainsi que de sept sous-unités (cx-,
[3
y-, E-, - et Ç-COP; $tenbeck et cou., 1993; Waters et cou., 1991) d’un complexe
protéique cytosolique stable qui est le coatomêre. L’ARE a son extrémité N-terminale modifiée par la présence d’une queue formée d’un acide myristique (Kahn et coli., 1993) et lie le GDP lorsqu’elle est soluble dans le cytosol. Lorsqu’il y a échange de GDP pour du GTP, la queue d’acide myristique s’ancre à la membrane. Cet échange est catalysé par un facteur d’échange nucléotidique appelé p619 (Rosa et coll., 1996), et est inhibé par le métabolite fongique brefeldine A (BfA; Donaldson et coil., 1990). La forme ARF-GTP ancrée à la membrane recrute alors les sept unités du coatomère (les COPs pour «coat proteins») qui s’associent de façon équimolaire (Walters et cou., 1991). Une fois l’ARF-GTP lié à la membrane et le recrutement des COPs terminé, le bourgeonnement peut avoir lieu sans aucune autre exigence (Orci et coil., 1993; Ostermann et coll., 1993). En présence d’un acide gras à longue chaîne comme
le palmityl-CoA, la fusion périplasmique ainsi entraînée conduit à la fission de la
vésicule enrobée de COPI nouvellement formée (Ostermann et coll., 1993; Pfanner et colI., 1989). Les composantes protéiques qui médient cette dernière étape ne sont pas encore connues.
Tandis que la machinerie cytosolique générale pour la formation du bourgeon
dernières années. En effet, un rôle possible a été mis en évidence pour la phospholipase D (PLD) dans le bourgeonnement ARF-dépendant des vésicules enrobées de COPI, ainsi que pour une nouvelle famille de protéines transmembranaires. En effet, il apparaît possible que l’ARF, en plus de diriger un recrutement GTP-dépendant des protéines COPs, joue un rôle en activant la PLD dans
le but de réorganiser l’environnement lipidique afin d’améliorer les conditions pour le
bourgeonnement (Nickel et Wieland, 1998). Une nouvelle famille, appelée la famille des protéines membranaires retrouvées dans les vésicules enrobées de COPI, a été caractérisée ces dernières années. Ces protéines appartiennent à la famille des protéines membranaires de type I avec un seul passage transmembranaire, un large domaine luminal et une courte queue cytoplasmique. Ces protéines lient efficacement
le coatomère via leur queue cytoplasmique (fielder et coll., 1996; Lowe et Kreis,
1995; $tamnes et coll., 1995) et seraient donc impliquées dans la formation du
C
bourgeon.Une fois le bourgeonnement terminé, la fusion à la membrane cible n’est possible que si la vésicule se débarrasse de son enrobage. L’enlèvement de ce dernier est effectué lorsque le complexe ARF-GTP s’hydrolyse en ARF-GDP. Puisque 1’ARF n’a pas d’activité GTPase en soi, il a été suggéré que l’hydrolyse est attribuable à une protéine nommée GAP pour «GTPase activating protein». Cette GAP a été purifiée et caractérisée (MakÏer et cou., 1995).
1.1.3.2 Biogenèse des vésicules enrobées de COPII
En 1994, une deuxième classe de vésicules non-enrobées de clathrine fut découverte, tant dans la levure qtie dans les cellules mammifères. Ces vésicules furent
nominées les vésicules enrobées de COPII. Même si ces vésicules sont similaires aux vésicules enrobées de COPI par leur morphologie, les sous-unités de l’enrobage de COPIIne sont pas structuralement reliées à celles présentes dans l’enrobage COPI. La présence de cinq protéines et des molécules d’ATP et de GTP serait suffisante pour amener un bourgeonnement du RER dans un système acellulaire (Barlowe et coil., 1994). La protéine Sarlp serait la protéine impliquée dans la liaison au GTP. Suite à la liaison du GTP par Sarlp, le recrutement de deux complexes protéiques formés par $ecl3p et Sec3lp ainsi que de Sec23p et Sec24p aurait lieu (Barlowe et coll., 1994). La protéine assurant l’hydrolyse du GTP pour le désenrobage serait Sec23p et le catalyseur d’échange de GDP pour le GTP de Sarlp serait une protéine liée à la membrane, la protéine Sec 12p (Barlowe et coll., 1994).
1.1.3.3 Biogenèse des vésicules enrobées de clathrine
Les vésicules enrobées de clathrine sont impliquées dans le transport des protéines à partir du TGN vers les lysosomes ainsi que vers la membrane plasmique pour les protéines de la voie de sécrétion régulée. Dans ce dernier cas, on parle plutôt de grains de sécrétion que de vésicules de transport. De plus, il a été démontré qu’il pouvait y avoir bourgeonnement à partir des grains immatures et que ce phénomène impliquait des vésicules enrobées de clatbrine. Cette dernière voie de bourgeonnement fut appelée voie «constitutive-like» par Arvan en 1992. Le bourgeonnement à partir de la membrane plasmique lors du processus d’endocytose implique aussi des vésicules enrobées de clathrine.
La protéine majeure constituant l’enrobage de clathrine est la clathrine elle même. Celle-ci est formée d’un complexe de trois grands polypeptides et de trois
petits formant un triskèle. Assemblés entre eux, plusieurs triskèles forment un panier
qui enrobe la vésicule. La deuxième composante majeure de ces vésicules est
l’adapteur. Ce dernier est requis pour lier la clathrine à la membrane et pour mobiliser certaines protéines transmembranaires dans la vésicule. Il existe deux types d’adapteur présents dans le TGN: les adapteurs AP-1 et AP-2. Le premier est associé
à la membrane des vésicules provenant du TGN et est formé d’une adaptine y, d’une
adaptine f3’, d’un polypeptide de 47 kDa (AP47 ou et d’un polypeptide d’environ
20 kDa (APY9 ou cr1). L’adapteur AP-2 est présent à la surface des vésicules
bourgeonnant de la membrane plasmique et comprend une adaptine u, une adaptine
f3,
un polypeptide d’environ 50 kDa (AP5O ou t2) et un autre polypeptide d’environ20 kDa (AP17 ou cr2) (Robinson, 1987; Ahie et cou., 1982). Les sous-unités
adaptines, y/f3 et
a/f3,
lient la clathrine directement tandis que les polypeptides et2 interagissent avec le motif YXXCD (où Y est un résidu tyrosine et C1, un acide
aminé à chaîne latérale hydrophobe) qui est présent sur plusieurs protéines transmembranaires (Ohno et col!., 1995; Davis et col!., 1989). L’adapteur AP-l, dans
les vésicules dirigées vers le lysosome, interagit aussi avec un motif présent dans la
queue cytoplasmique du récepteur de mannose 6-phosphate (Pearse et Robinson,
1990). Cependant, ce motif n’a pas encore été établi avec certitude.
1.1.3.4
fusion
Une fois le bourgeonnement terminé et le transport assuré, les vésicules de transport doivent être sélectives envers la membrane cible à laquelle elles fusionneront. Ceci suggère donc que chacun des types de vésicules doit avoir un marqueur de surface qui assure l’identification de leur origine et qui est reconnu par un récepteur complémentaire à la membrane réceptrice. En 1993, le groupe de
Rothman décida de concentrer sa recherche sur cette théorie de récepteur, et réussit à en démontrer l’existence. Il appela ces récepteurs les SNARE pour «SNAP receptor)). Le groupe isola trois différentes SNARE: la syntaxine, la synaptobrévine et la SNAP 25. Ces trois protéines étaient déjà connues comme des composantes des membranes synaptiques. C’est en réalité suite à la découverte du complexe NSf-SNAP que le groupe partit à la recherche du récepteur. En effet, c’est en observant que le transport était bloqué suite à un traitement au NEM (N-éthyl-maÏeimide) et qu’une accumulation de vésicules non enrobées en résultait près de la membrane cible, que la protéine sensible au NEM et appelée NSf pour «NEM sensitive factor» fut découverte (Malhotra et cou., 1988). Des études plus poussées sur cette protéine démontrèrent qu’elle était sous forme d’homotétrarnère de sous-unités de 76 kDa ayant chacune un site de liaison pour l’ATP (Block et cou., 1982). La protéine NSf aurait de l’affinité pour des protéines nommées SNAPs (pour «soluble NSf attachment protein»), et ce complexe se lierait aux vésicules. Les SNAPs sont présentés sous trois formes, soit les formes x,
13
et y. Les deux premières sont présentes dans tous les types cellulaires alors que la dernière est retrouvée seulement dans le cerveau (Whiteheart et coll., 1993).Le groupe de Rothman sépara les SNARE en deux groupes: les v-SNARE (y
pour «vesicle») comprenant la synaptobrévine, et les t-SNARE (t pour «target)>)qui comprennent la syntaxine et la SNAP-25. On avança donc l’hypothèse SNARE qui stipule que les vésicules du compartiment donneur contiennent les protéines y SNARE qui reconnaîtraient les protéines t-SNARE situées sur la membrane cible (Sôliner et coil., 1993a). Ceci assurerait donc la spécificité de la fusion. puisqu’à chaque v-SNARE serait associé un t-SNARE (Rothman et Wanen, 1994). De plus, il
a été démontré que le v-SNARE et le t-SNARE pouvaient former un complexe stable
système acellulaire composé de SNARE purifiés et incorporés dans des vésicules de phospholipides, la fusion avait lieu avec la seule présence d’un v-SNARE et d’un t SNARE associés sur deux vésicules différentes (Weber et coll., 199$). Le complexe très stable formé par le t-SNARE et le v-SNARE serait sous forme d’une structure de superhélice et est appelé SNAREpin. Il fut proposé que ce complexe seraitune source d’énergie permettant la fusion (Weber et coll., 199$), et que le complexe NSF-SNAP assurerait la dissociation de celui-ci afin de le soumettre à un second tour de fusion (Sôllner et cou., 1993b; Weber et cou., 199$).
Puisqu’on retrouve plusieurs organites formés de membranes dans la cellule, le processus de fusion doit être fortement sélectif. Des protéines appartenant à la famille des GTPases monomériques appelées les protéines Rab (pour «Ras related small GTP-binding proteins’>) furent mises en cause dans cette sélectivité (Rothman. 1994;
Ç
f ischer von Mollard et coll., 1994). Jusqu’à maintenant, une trentaine de cesprotéines ont été découvertes. Il a été proposé que les protéines Rab régulent la formation du complexe v-SNARE/t-SNARE (Bennett, 1995, Nielsen et coIl., 1999, Goud, 2002) et qu’elles favorisent la direction du transport antérograde versus rétrograde (Rothmans et Warren, 1994).
Une autre protéine accomplirait un rôle dans la fusion; cette protéine est appelée synaptotagmine. Cette dernière est présente sous huit isoformes et est une glycoprotéine transmembranaire ayant la capacité de lier le calcium et quelques phospholipides. On retrouve la synaptotagmine et ses isoformes dans les vésicules synaptiques et les grains de sécrétion des tissus exocrines et neuro-endocrines. Le rôle principal de la synaptotagmine 1, qui est la forme la plus étudiée, est la fonction de détecteur de calcium dans le système d’exocytose dépendant du calcium (Hudson et Birdaum, 1995; Kelly, 1995). Elle pourrait égalementjouer un rôle dans l’inhibition
de l’exocytose en se liant avec un t-SNARE de la membrane plasmique, empêchant
ainsi la fusion (Popov et Poo, 1993; Buckley, 1994).
1.1.4 Transit dans l’appareil de Golgi et le trans Golgi Network
Après avoir quitté le réticulum endoplasmique à bord de vésicules de transport, les protéines sécrétées empruntent l’appareil de Golgi après être passées par
le compartiment intermédiaire ERGIC. Morphologiquement, l’appareil de Golgi est
constitué d’une suite de saccules de forme allongée qui sont fonctionnellement divisées en trois régions distinctes: la région cis, la région médiane et la région trans (voir la figure 1.1). Ces régions se différencient selon la composition en enzymes qui assurent la glycosylation. Il semble bien établi que les vésicules provenant du RER ne
C
fusionnent qu’avec la région cis du Golgi et que le contenu de ces dernières quitte l’appareil de Golgi par le côté opposé formé par la région trans. C’est à l’aide d’expériences biochimiques et morphologiques en système acellulaire que l’on a élucidé les mécanismes de transport entre les saccules du Golgi. Les premières étudesin vitroeffectuéespar Rothman et coll. en 1984 ont démontré le caractère vectoriel de
ce transport qui s’effectue successivement de la région cis à la région médiane, et par
la suite, de cette dernière à la région trans. Cependant, deux modèles sont proposés afin d’expliquer la progression des protéines dans l’appareil de Golgi via les vésicules COPI (voir la figure 1.2). Le premier modèle, qui a longtemps prévalu, propose que le transport antérograde, autant que rétrograde, soit effectué par des vésicules COPI (Orci et cou., 2000). Le second modèle propose plutôt que seul le transport rétrograde soit assuré par les vésicules COPI et que le transport antérograde soit effectuépar une maturation des saccules (Mironov et coil., 2001). Dans ce
.
Figure 1.2: Modèles de transport intra-Golgien. Le modèle représenté en A
O
postule que le transport des protéines serait assuré seulement par des vésicules COPI.Le modèle B postule plutôt que le mouvement serait assuré par la maturation
progressive des saccules, dans le sens cis-trans par leur glissement vers la région distale de l’appareil de Golgi (feuillet trans). Le transport rétrograde serait le seul existant et serait assuré par les vésicules COPI. D’après Nickel et Wieland, (1998).
Q
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dernier modèle, la progression des protéines se faisant sans que celles-ci ne quittent la lumière du saccule.
Les protéines sécrétées voyagent donc de façon unidirectionnelle d’un compartiment à l’autre dans l’appareil de Golgi et aboutissent dans une structure complexe formée de tubules et de vésicules que l’on appelle réseau trans-golgien (TGN pour «trans-Golgi network»). Tout au long de ce voyage, ces protéines entreront en contact avec les protéines résidentes de ces compartiments afin d’acquérir leur forme mature.
1.1.4.1 La rétention dans l’appareil de Golgi
C
Les études récentes effectuées sur les protéines résidentes du Golgi ont démontré que ces protéines possèdent un signal de rétention dans leur domaine transmembranaire. Cependant, ce signal n’a pas été défini avec exactitude car dans certains cas, ce sont les régions situées de part et d’autre du domaine transmembranaire ou bien le domaine cytoplasmique qui augmentent l’efficacité de la rétention (Swift et Machamer, 1991; Niisson et cou., 1991; Munro, 1991; TeasdaÏe et cou., 1992; Wong et coll., 1993; Aoki et col!., 1992; Russo et col!., 1992; Tang etcol!., 1992; Burke et cou., 1992).
Un modèle de reconnaissance du signal de rétention fut proposé par Nilsson et Warren en 1994. Ce modèle est basé sur le phénomène d’oligomérisation. En effet, chaque enzyme serait un homodimère où les queues cytoplasmiques seraient liées entre elles et où les domaines transmembranaires des protéines du saccule
interagiraient entre eux. Ces complexes oligomériques seraient exclus des vésicules
de transport bourgeonnant, dû à leur trop grosse taille.
Suite à l’observation montrant que la région hydrophobe des domaines transmembranaires des protéines résidentes de l’appareil de Golgi était plus courte que celle des protéines de la membrane plasmique et sachant qu’il existe un gradient
de cholestérol dans l’appareil de Golgi (Orci et coIl., 1981) Bretscher et Munro
(1993) proposèrent un second modèle. Ce modèle suggère le rôle possible de l’épaisseur des membranes du Golgi dans le mécanisme de rétention. Le gradient de cholestérol amènerait un épaississement de la membrane de saccule en saccule, ce qui empêcherait les enzymes d’un compartiment de se retrouver dans le suivant.
1.1.4.2 La rétention dans le TGN
Les protéines résidentes du TGN ont souvent un mécanisme particulier de rétention, comme c’est le cas pour la ftirine, où l’on parle plutôt de récupération. En effet, tout comme la TGN3$, une autre protéine résidente du TGN, la furine voyage du TGN vers la membrane plasmique, puis retourne au TGN par la voie d’endocytose (Chapman et Munro, 1994). Deux signaux sont localisés dans son domaine
cytoplasmique: le premier est une séquence d’acides aminés acides qui seraient le signal de rétention dans le TGN, et le second est un tetrapeptide contenant une tyrosine et qui serait le signal de retour vers le TGN (Vorhees et cou., 1995). La séquence d’acides aminés acides médierait l’internalisation de la fùrine vers le TGN étant donné que cette séquence additionnée d’une sérine adjacente forme un site de phosphorylation par la caséine kinase II. L’état de phosphorylation de la furine modulerait donc son internalisation (Jones et cou., 1995).
C
1.1.5 Modifications post traductionneijes
Après leur traduction, les protéines ne sont pas tout à fait sous leur forme active car II s’avère souvent que leur activité biologique dépende de certaines modifications co- et post-traductionnelles. Ces modifications sont de plusieurs types
et s’effectuent dans divers compartiments cellulaires.
1.1.5.1 La N-glycosylation
La N-glycosylation s’effectue de façon co-traductionnelle lors de la transiocation des protéines naissantes dans le RER. Cette modification consiste en l’addition de chaînes oligosaccliaridiques sur la fonction amide des résidus
Ç
asparagines qui se trouvent dans un environnement Asn-X-Thr/Ser où X ne peut être une proline (Hart et coll., 1979). Cependant, ces séquences ne sont pas toutes glycosylées suggérant que d’autres composantes sont nécessaires pour que la glycosylation ait lieu. La chaîne oligosaccharidique est préformée sur un résidu lipidique appelé dolichol phosphate, et est séquentiellement formée de deux résidusde N-acétylglucosamine (GlcNac), de neuf résidus de mannose (Man) et de trois
résidus de glucose. Cet oligosaccharide ainsi formé sera transféré en bloc sur le résidu asparagine de la protéine et subira plusieurs modifications par une panoplie d’enzymes. Le schéma résumant les principales étapes de la maturation est montré à
la figure 1.3. Après le transfert en bloc, on observe l’élimination rapide de trois
résidus glucose par les glucosidases I et II du RER. Il y a ensuite l’enlèvement deun à quatre résidus de maimose par l’action combinée de la Œ1,2-mannosidase du RER et
Figure 1.3 : La N-glycosylatïon. Modification du bloc de sucre contenu sur le résidu asparagine (Asn) dans le réticulum endoplasmique (RE) et l’appareil de Golgi. Tiré
Q
de «Molecular Biology of the ceil », troisième édition, Albert et cou, 1994. UDPde la mannosidase I du cis-Golgi (Farquhar, 1985). La structure de l’oligosaccharide se trouve alors sous forme de haut contenu en mannose. La majorité des
glycoprotéines verront leur maturation se poursuivre vers une structure pius complexe. Lorsque ceci se produit, un résidu de GlcNac est ajouté par une transférase, puis vient la coupure de deux résidus mairnose (voir figure 1.3). Par la suite, il peut y avoir addition d’autres résidus de GlcNac, de fructose, de galactose et d’acide sialique (Komfeld et Kornfeld, 1985, Roth, 2002).
Les chaînes oÏigosaccharidiques semblent jouer plusieurs rôles une fois liées à
la protéine. En effet, ces chaînes jouent un rôle dans le repliement final des protéines
du RER car une protéine glycosylée mal repliée peut alors entrer en contact avec la cainexine et la calréticuline afin d’obtenir son bon repliement (voir section 1.1.2.1). De plus, pour certaines protéines de sécrétion ou de la membrane plasmique, le transport intracellulaire est perturbé lorsque l’on inhibe la glycosylation. En effet, il a
été démontré que lorsque l’on mute l’hormone de croissance, une protéine non
glycosylée, de façon à obtenir un site de glycosylation, on voit sa sécrétion sur le côté apical seulement dans des cellules polarisées. Il appert donc que dans certains cas, la glycosylation soit un signal de ciblage (Scheiffele et cou., 1995).
1.1.5.2 La O-glycosylation
La O-glycosylation s’effectue de façon post-traductionnelle au niveau de l’appareil de Golgi et consiste en l’addition de sucres sur la fonction hydroxyle des acides aminés sérine ou thréonine (Farquhar, 1985). L’ajout de sucre se fait de façon successive et chaque transfert de glucide est assuré par une glycosyl-transférase spécifique (Han et Martinage, 1992). Les chaînes ainsi formées peuvent comprendre
liaison d’un résidu de N-acétylgalactosamine à la protéine. Les autres sucres utilisés le plus fréquemment sont les résidus galactose et les résidus d’acide sialique. La fonction exacte de la O-glycosylation est encore méconnue. Cependant, il a été observé que cette modification post-traductioimelle entraînait une plus grande résistance aux protéases et influençait grandement la dimension et la structure tridimensionnelle de certaines protéines (Jintofi, 1990).
1.1.5.3 La sulfatation et la phosphorylation
La sulfatation s’effectue au niveau du trans-Golgi et du TGN sur la fonction hydroxyle de la tyrosine (Baeuerle et Huttner, 1987). Cette sulfatation des résidus tyrosine a pour but de moduler l’activité biologique des protéines cibles. Par exemple, l’activité de la gastrine est fortement augmentée par l’addition d’un groupement
Q
sulfate (Jensen et cou., 1980; Johnson, 1976).À
l’opposé, l’activité de la leu enképhaline et de la dermorphine est totalement inhibée si celles-ci sont sulfatées (Unsworth et coll., 1982). La sulfatation s’effectue aussi au niveau des chaînes d’oligosaccharides. En effet, la thyroglobuline est sulfatée sur ses tyrosines ainsi que sur ses sucres (Cauvi et coil., 2003). Les glycosaminoglycans (GAGs) sont aussi sulfatés durant leur passage dans le TGN (Hansen et coll., 1999).La phosphorylation au niveau du Golgi peut s’effectuer sur une chafne glucidique ou sur un acide aminé. Seules les enzymes lysosomales subiront une phosphorylation sur un résidu mannose de leurs chaînes d’oligosaccharides. Le rôle de cette modification consiste à cibler les enzymes vers les lysosomes (voir section 1.1.6.1). La phosphorylation des résidus sérine, thréonine et tyrosine est un phénomène très connu. La caséine et le neuropeptide ACTH sont phosphorylés lors
modification post-traductionnelle pour les protéines de sécrétion n’a pas encore été déterminé.
1.1.5.4 L’acétylation et l’amidation
L’acétylation est un processus qui s’effectue rarement sur les protéines sécrétées (Tsunasawa et Sakiyama, 1984). Quelques protéines de sécrétion comme l’hormone de croissance sont acétylées co-traductionnellement à leur extrémité N-terminale dans le RER. Par contre, cette modification s’effectue de façon post traductionnelle, au niveau des grains de sécrétion, pour la j3-endorphine et l’hormone mélanotrope (a-MSH) (Dores et cou., 1993). L’acétyÏation a pour rôle de moduler l’activité biologique de l’Œ-M$H et de la 3-endorphine, en activant et inactivant respectivement ces deux neuropeptides.
Q
L’amidation est aussi une modification post-traductionnellequi s’effectue dans
les grains de sécrétion. Cependant, seuls les tissus neuronaux et endocriniens
possèdent l’outillage nécessaire à cette modification.
À
titre d’exemple, la substanceP, Ï’oxytocine, l’a-M$H et le facteur de relâche de l’hormone de croissance sont des
protéines arnidées. Le processus d’amidation est catalysé par la «peptidyl-glycine alpha amidating monooxygenase» ou PAM qui clive le groupement glyoxylate d’un résidu glycine situé à l’extrémité C-terminale. Ceci résulte en une protéine amidée à son extrémité C-terminale par le groupement amine de la glycine (Eipper et Mains, 198$). Cette modification est importante pour l’activité biologique et la stabilité d’un
1.1.5.5 Maturation des précurseurs
Beaucoup de protéines incluant des hormones et des neuropeptides sont d’abord synthétisées sous la forme de précurseurs. Plusieurs de ces précurseurs contiennent dans leur séquence plus d’un peptide biologiquement actif Les séquences
de ces hormones ou neuropeptides sont délimitées par une arginine ou un doublet
d’acides aminés basiques (Lys-Arg, Arg-Arg ou Arg-Lys). La maturation des précurseurs, via des coupures protéolytiques spécifiques, est donc essentielle pour libérer l’hormone du précurseur. Cette maturation protéolytique est effectuée par une enzyme de type trypsine. La première enzyme de maturation de précurseur à avoir été caractérisée est la protéine Kex2. Cette enzyme provient de la levure $accharornyces
cerevisiae et libère le facteur a de son précurseur (Julius et coll., 1984). Kex2 est une protéase membranaire à sérine qui est dépendante du calcium. Elle a un pH optimal neutre et a plusieurs homologies de séquence avec les subtilisines, une classe de protéases bactériennes à sérine (fuller et coli., 1988). Plusieurs études ont démontré que la protéine Kex2 possède la capacité de maturer quelques protéines de mammifères telles la proalbumine humaine (Bathurst et coll., 1987) et la proopiomélanocortine (Thomas et cou., 1988; Zollinger et cou., 1990; Germain et cou.. 1990). Ces études suggèrent donc qu’une protéine homologue à Kex2 existerait dans les cellules de mammifères.
Suite au clonage de la furine humaine en 1986 par Robroek et ses collaborateurs, des études portant sur sa séquence ont montré qu’une partie de la furine possédait plus de 50% d’identité avec le site catalytique de la protéine Kex2, suggérant que la furine pourrait être une convertase à sérine (f uller et coll., 1989). De plus, plusieurs études vinrent montrer que la furine pouvait cliver plusieurs précurseurs tels le précurseur du facteur von Willebrand (Van de Ven et coll., 1990),
le facteur de croissance de pro-43NGF (Bresnahan et cou., 1990), la proalbumine
(Misurni et coU., 1990; Breiman et Peach, 1991) et l’hémagglutinine (Stieneke-Grober
et cou., 1992).
Depuis quelques années, plusieurs études se sont concentrées sur l’isolement des convertases de mammifères à l’aide de la technologie de l’amplification de l’ADN par PCR («polymerase chain reaction»). Utilisant des oligonucléotides dérivés des séquences conservées entre les protéines Kex2, furine et subtilisine, plusieurs convertases furent clonées. Jusqu’à maintenant, sept convertases spécifiques aux sites mono- et dibasiques ont été caractérisées, soit: la furine aussi appelée PACE, PCi aussi désigné sous le nom de PC3 (Seidah et coll., 1990; Seidah et coil., 1991; Smeekens et cou., 1991), PC2 (Seidah et coll., 1991; Smeekens et Steiner, 1990), PACE4 (Kiefer et coll., 1991), PC4 (Nakayama et colt., 1992; Seidah et colt., 1992a), PC5 (Lusson et cou., 1993) qui est aussi appelée PC6A (Nakagawa et cou., 1993a), PC6B qui serait une isoforme de PC6A (Nakagawa et cou., 1993b) et PC7 (Seidah et cou., 1996; Constam et coll., 1996). Récemment, deux autres convertases de type subtilisine furent caractérisées: SKI-1 et NARC-1 (Seidah et cou., 1999 ; Seidah et cou., 2003). Cependant, ces convertases ne sont pas spécifiques aux résidus basiques.
Ces convertases font partie de la famille des protéases à sérine du type subtilisine et contiennent toutes un domaine catalytique formé des acides aminés sérine, histidine et acide aspartique. De plus, un résidu asparagine situé près de la triade catalytique joue un rôle important dans le mécanisme catalytique.
chez
PC2, cette asparagine est remplacée par un acide aspartique. Cette substitution amène le pH optimum dans un environnement plus acide, ce qui rendrait PC2 plus efficace au niveau des grains de sécrétion. Les convertases ont toutes un peptide signal clivable, une région pro qui serait impliquée dans le repliement final de l’enzyme, un domainestructurel ainsi qu’un domaine C-terminal unique à chaque convertase. La firme, PC6B, SKI-1 et PC7 se différencient par le fait qu’elles comportent chacune un domaine transmembranaire. Les convertases sont elles-mêmes synthétisées sous forme de précurseur et leur maturation a lieu à l’intérieur de la voie de sécrétion. En effet, pro PCI est maturé en PCi à un pH optimal situé entre 7,0 et 8,0 de façon calcium dépendante. Ceci suggère que cette maturation s’effectue au RER. Cependant, une seconde protéolyse du propeptide dans le TGN permet l’activation maximale de l’enzyme. De plus, la mutation de l’acide aspartique de la triade catalytique inhibe cette maturation, démontrant qu’elle se produit de façon autocatalytique. Quant à la maturation de pro PC2, il semblerait qu’elle aurait lieu au niveau du TGN ou des grains de sécrétion étant donné que le pH optimum où alieu la
maturation se trouve entre 5,5 et 6,0 et est dépendante du calcium (Sheenant et cou., 1995). La localisation intracellulaire des convertases montre que la furine est localisée au niveau du TGN ainsi qu’à la surface cellulaire. Il a été démontré que la firme voyageait entre la surface cellulaire et le TGN et qu’elle se colocalisait avec TGN3$, une protéine résidente du TGN (Molloy et coll., 1994). Il fut aussi démontré que PCi
se localisait au TGN et qu’elle était transportée dans l’extrémité des extensions des
cellules AtT2O, plus précisément dans les grains de sécrétion (Hornby et coll., 1993).
Suite à l’analyse de la distribution des ARNm des différentes convertases, on a montré que chacune d’elles possédaient une distribution tissulaire unique (Seidah et coil., 1994). La furine, PACE4 et PC7 sont largement distribués à travers tous les tissus. Par contre, seulement la furine et PC7 sont vraiment ubiquitaires (Constam et coll., 1996). Les convertases PCi et PC2 sont principalement exprimées dans les cellules possédant des grains de sécrétion. PC4 se retrouve dans les cellules germinales des testicules. La PC5, quant à elle, se retrouve dans plusieurs lignées cellulaires avec ou sans grains de sécrétion, mais est moins exprimée que la furine et
PACE4 (Seidah et cou., 1994). Finalement, les convertases PCi et PC2 sont les deux principales enzymes impliquées dans la maturation des prohormones.
La spécificité de clivage de PCi et de PC2 a été étudiée à l’aide de virus recombinants de la vaccine exprimant ces deux enzymes ainsi que différents précurseurs et ce, dans diverses lignées cellulaires. C’est ainsi qu’on a démontré que PCi clive la proopiomélanocortine pour donner I’ACTH, la f3-lipotropine (BLPH), le joining peptide et le fragment N-termina! 1-$0. PC2 clive la proopiomélanocortine en 3-endorphine, Œ-MSH et en un fragment N-terminal 1-107 (Benjaimet et col!., 1991; Seidah et col!., 1992b). La prorénine humaine est clivée par PCi etnonpar PC2 dans
les cellules GH4 qui contiennent la voie de sécrétion régulée (Seidah et coll., 1993).
Lorsque l’on co-transfecte la prosomatostatine dans les cellules AtT2O avec différentes convertases, celle-ci est clivée par PC2 pour donner la somatostatine S-14
O
alors qu’elle est clivée par PACE 4 pour donner les formes S-2$ et S-14 dans les cellules LoVo qui ne possèdent pas de voie de sécrétion régulée (Brakch et col!., 1995). Cependant, la prosomatostatine est clivée par SKI-l pour générer l’antrine (PSST l-10) lorsque l’on co-transfecte ces deux protéines dans les cellules COS-l (Mouchantaf et cou., 2004). Cette coupure ne requiert donc pas le site Lys comme proposé (Pradaysol et col!., 1980; Rabbani et Patel, 1990).Après le clivage protéolytique du côté C-terminal des paires d’acides aminés basiques, une seconde étape implique l’enlèvement de ces résidus. Cette réaction est effectuée par l’enzyme carboxypeptidase E. Cette enzyme est une glycoprotéine d’environ 50 kDa, ayant un pH optimal entre 5 et 6, et est stimulée par le cobalt, ce qui la différencie des carboxypeptidases lysosomales (Fricker et Snyder, 1983). L’activité de cette enzyme est largement distribuée dans le système nerveux central et
sa séquence révèle une forte homologie avec les carboxypeptidases A et B (Fricker et
cou., 1986). Elle existe tant sous une forme soluble que liée à la membrane.
1.1.6 Ciblage à partir du TGN
Une fois que les protéines ont traversé l’appareil de Golgi, elles aboutissent dans un réseau complexe constitué de vésicules et de tubules appelé TGN pour «trans-Golgi Network». C’est au niveau de cette structure que s’effectue le mécanisme de triage des protéines en transit dans le système vacuolaire central. C’est donc dans ce compartiment que se départageront les protéines destinées aux
lysosomes, à la membrane plasmique ou à l’espace extracellulaire. Certaines cellules spécialisées telles les cellules exocrines, endocrines et neuronales ont développé des
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mécanismes de tri très spécifique au niveau du TGN qui permettent de diriger les protéines de sécrétion soit vers les vésicules de transport, qui les dirigeront très rapidement vers l’espace extracellulaire, soit vers les grains de sécrétion, où elles seront emmagasinées jusqu’à la stimulation de leur relargage. La façon par laquelle s’effectue ce triage pour les protéines de sécrétion est encore mal connue. On peut par contre imaginer que chaque molécule devant être triée au niveau du TGN possède un déterminant moléculaire précisant une destination finale et que ce déterminant puisse être reconnu par un récepteur spécialisé. Dans les prochaines sections, nous résumerons les connaissances actuelles à propos des mécanismes moléculaires régissant le triage des protéines solubles au niveau du TON.1.1.6.1 Ciblage des enzymes lysosomales
Les enzymes lysosomiales partagent la même voie de biosynthèse que les protéines de sécrétion et membranaires. Ces enzymes doivent donc être triées et acheminées vers les lysosomes. Reitman et Kornfeld (1981) ont identifié le déterminant moléculaire responsable de la ségrégation de ces enzymes. En effet, ils ont démontré que l’acquisition d’un phosphate sur un oligosaccharide en haut contenu
en mannose formait le déterminant responsable de la ségrégation. Cette structure est
ajoutée par une phosphotransférase qui transfert un résidu N-acétylglucosarnine 1-phosphate au carbone six d’un groupement mannose (Waheed et coli., 1981). Cette phosphotransférase assure la sélectivité de la modification aux enzymes lysosornales en reconnaissant une structure tridimensionnelle présente seulement sur ces enzymes (Reitman et Kornfeld, 1981). En effet, le groupe de Kornfeld a étudié cette structure
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avec comme modèle, des chimères de la cathepsine D et du pepsinogène. Ils ont démontré que certains résidus dispersés dans la séquence primaire se regroupaient tridimensionnellement et formaient ainsi un domaine potentiel de reconnaissance parla phosphotransférase (Baranski et cou., 1991).
Dans une deuxième étape, une phosphodiester Œ-N-acétylglucosaminosidase localisée dans l’appareil de Golgi enlève le résidu N-acétylglucosamine, ce qui permet d’exposer le signal de ciblage formé par le mannose 6-P04 (Waheed et cou., 1981; Deutscher et cou., 1983). Ce résidu sera reconnu par des récepteurs spécifiques situés au niveau du TGN (Kornfeld, 1986). Deux récepteurs ont été isolés et caractérisés. Ce sont des glycoprotéines transmembranaires de type I, qui possèdent respectivement une masse moléculaire de 275 kDa (Sahagian et coli., 1981) et de 46 kDa (Hoftack et Kornfeld, 1985). Le récepteur de 46 kDa lie son ligand de façon plus efficace en présence de cations bivalents. Le complexe ligand-récepteur sera emballé dans des
vésicules enrobées de clathrine et ciblé vers les endosomes pré-lysosomaux. La baisse
de pH dans ces organites assure la dissociation du ligand. Le récepteur sera ensuite
recyclé vers le TGN via des vésicules et le reste de l’endosome fusiomiera avec le lysosome (Brown et cou., 1986).
1.1.6.2 Ciblage vers la voie de sécrétion régulée
Suite à la comparaison de séquences de différentes protéines de la voie régulée, aucune séquence primaire homologue pouvant servir de signal de ciblage ne fut trouvée. Il est donc improbable que le signal responsable du ciblage vers la voie régulée soit de même nature que la plupart des signaux de ciblage ou de rétention trouvés jusqu’à maintenant. Il serait parcontre possible que certains résidus adjacents tridimensionnellement et régissant le ciblage soient séparés dans la séquence
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primaire. Ceci rendrait l’identification du signal très difficile. Jusqu’à maintenant, plusieurs études ont porté sur l’identification d’un tel signal de ciblage vers la voie de sécrétion régulée. Il fut démontré que ce signal n’était pas localisé au niveau du peptide signal dans le cas du préprotrypsinogène (Burgess et coll., 1987), de la préprosomatostatine (Sevarino et coll., 1929) et de la préprorénine (Chu et coll.,1990). Il ne semble pas non plus que ce signal puisse être inclus dans la région pro de
quelques protéines telles la protrypsinogène (Burgess et coll., 1987), la proinsuline (Poweli et coll., 1988), la prorénine (Chu et coll., 1990; Chidgey et Harrison, 1990),
la proenképhaline (Albert et Liston, 1993). Cependant, l’équipe de Sevarino a
pourtant proposé la région pro de la prosomatostatine comme responsable de son ciblage vers la voie de sécrétion régulée lorsque l’on fusionnait cette région pro avec une protéine de la voie constitutive (Sevarino et cou., 1989). Par la suite, ce même groupe a montré que plusieurs délétions effectuées dans la région pro n’influençaient pas le ciblage vers les grains de sécrétion et a suggéré la présence de signaux
redondants situés à la fois dans les régions pro et hormonales de la prosomatostatine (Sevarino et Stork, 1991). Plus récemment. il fut démontré qu’une hélice GL présente
dans la région N-terminale de la prosomatostatine était responsable de son ciblage vers la voie de sécrétion régulée. En effet, la délétion du segment contenant l’hélice résulte en la sécrétion constitutive du précurseur (Mouchantaf et coll.,2002). Il a aussi été démontré récemment que le site de clivage de la prorénine en rénine était responsable de son ciblage vers la voie régulée. En effet, la mutation de ce site, ou sa délétion, résulte en la sécrétion constitutive de ce peptide (Brechler et coli., 1996).
Une stratégie générale utilisée afin de localiser le signal de ciblage est l’expression hétérologue de différentes protéines de la voie de sécrétion régulée dans diverses lignées cellulaires endocriniennes ou neuronales. Les lignées généralement utilisées sont les cellules GH3 dérivées d’une tumeur de l’hypophyse de rat;
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les cellules GH4 dérivées des cellules GH3 par propagation sériée (ces deux types cellulaires sécrètent la prolactine, mais ont différents niveaux d’expression de l’hormone de croissance (Dairnies et Tashjian, 1973)); les cellules PC12 dérivées d’un phéochromocytome de rat et qui sécrètent la neurotensine ; les cellules Rin 5f dérivées d’un insulinome de rat et qui produisent de l’insuline ; les cellules Neuro 2Aqui proviennent d’un neuroblastome de souris et, finalement, les cellules AtT2O dérivées d’une tumeur du lobe antérieur de l’hypophyse de souris et qui sécrètent l’ACTH. Suite à l’application de cette stratégie, la conclusion tirée fut que le mécanisme de ciblage semblait universel car peu importe l’origine de la protéine (exocrine, endocrine ou neuroendocrine), celle-ci était correctement ciblée vers la voie de sécrétion régulée de cellules d’origine endocrine, exocrine ou neuroendocrine. Cependant, cette théorie universelle fut mise en doute par le groupe de Rindler qui démontra que la protéine GP-2, une protéine majeure de la membrane des grains du
