VoI.8 Outubroj83 485
ATNIDADE BIOLóGICA DO EXOPOLISSACARIDEOS DE XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. MANIHOTIS
JOSÉ TADEU ATHAYDE1
&
REGINALDO DA SILVA ROMEIR021Laboratório de Fitopatologia, EMCAPA, C. P.391, CEP 29.000 - Vitória - ES
2Departamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Viçosa CEP 36.570 - Viçosa-MG
(Aceito para publicação em 02/08/83) RESUMO
(São Paulo, 9-13 Julho de 1983)
Para se obter uma preparação crua do exopolissacarídeo (EPS) de Xanthomonas campes-tris pv. manihotis (Berthet
&
Bondar, 1915) Dye 1978, o patógeno foi cultivado em meio de cultura sólido a 280C/30 horas. O crescimento bacteriano foi então colocado em solução sa-lina tamponada e submetido à centrifugação a 10.000 g/20 minutos. Ao sobrenadante, adicio-nou-se o etanol 95% até a concentração final de 70%, obtendo-se um precipitado que foi dia-lizado contra água destilada.Plantas de mandioca das cultivares 'Chagas' e 'Branquinha' foram usadas para testar a atividade biológica do EPS. Brotações foram imersas pela base em diferentes diluições da pre-paração crua do EPS. O tempo para a ocorrência de murcha nas brotações foi inversamnte proporcional à concentração do EPS. Quando se removiam 0,5 em da base das brotações exibindo murcha eram transferidas para água destilada, a turgescência era recuperada.
PARTICIPE DO
179 CONGRESSO DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE FITOPATOLOGIA
Caso não tenha recebido circulares, entre em contato com: E. FEICHTENBERGER S. Doenças de Fruteiras Inst. Biológico Caixa Postal 7119 01000 São Paulo, SP
+Parte da dissertação submetida pelo primeiro autor ao Departamento deFitopatologia da Universidade Federal de Viçosa,para obtenção dotítulo deMestre em Fitopatologia.
486 FITOPATOLOGIA BRASILEIRA Vol.8
ABSTRACT
parecem existir em algumas interações
plan-ta-bactéria, como por exemplo: Erwinia
amylovora x Rosaceae (Huang et aI., 1975
e Stoffl, 1976) Pseudomonas solanacearum
x Solanaceae (Goodman et al., 1976 e
Se-queira
&
Graham, 1977), Xanthomonasphaseoli x Phaseolus vulgaris (Corey, 1975), Erwimia amylovora x Malus silvestris
(Good-man et al.,1974 e Romeiro, 1976) e
Xan-thomonas campestris pv. manihot esculenta
(Athayde
&
Romeiro, 1982).Em algumas doenças bacterianas de
plantas, pesquisas têm sugerido que o EPS
presente na cápsula da bactéria atua como
toxina, que pode reproduzir alguns dos sin-tomas similares aos observados em tecidos
afetados pelo patógeno. Sutton
&
Williams,1970, sugerem que o EPS produzido por
X. campestris, junto com a própria
bacté-ria, 1970, seja a causa primária do bloqueio
dos vasos do xilema em crucíferas.
Good-man et aI., 1974, isolaram uma toxina, a
que denominaram amlovorina, a partir de
exsudato bacteriano produzido em fatias
de maçã verde inoculadas com isolamento
virulento (capsulado) de E.amylovora.
Rela-taram que a amilovorina é um
exopolissa-carídeos capaz de ocasionar a murcha de
galhos de macieira suscetíveo à doença,
mas não de cultivares resistentes. Mais
tar-de, Goodman et aI., 1976, demonstraram,
ao microscópio eletrônico, que as
carac-terísticas de perturbação do tecido
hospe-deiro causadas pela amilovorina eram muito
similares às alterações estruturais causadas
pelo isolamento virulento do próprio
pató-geno, Ayers et al.,1979, também,
correla-cionaram a virulência de isolamento de E.
amylovora com a quantidade de EPS pro-duzido.
Várias pesquisas (Goodman et aI., 1976;
Huang et aI., 1975; Sequeira
&
Graham,1977; Sequeira et aI., 1977 e Sing
&
Sch-roth, 1977) têm sugerido que o EPS
pre-sente em isolamentos virulentos de bactérias
fitopatogênicas pode exercer um importante
papel no reconhecimento mútuo entre
plan-tas e bactérias fitopatogénicas. Visto que
iso-lamentos virulentos são capsulados e
isola-mentos avirulentos não o são, alguns autores
têm postulado que o EPS previne, de alguma
forma, a interação da célula bacteriana com
lectinas já existentes ou produzidas pela
planta, dificultando a imobilização da
bac-téria. Sequeira
&
Graham, 1977,purifica-ram uma lectina de tubérculo de batata,
ve-rificando que esta era capaz de agiu tina r , in
vitro, isolamentos avirulentos de P.
solana-cearum mas não os virulentos, a menos que o material da cápsula fosse removido.
Exopolissacarídeos (EPS) podem ser
obtidos de filtrados de cultura, usando o
etanol para a precitipação (Ayers et al.,
1979 e Huang et aI., 1975). O EPS contido
no precipitado é, então, separado por
cen-,trifugação e, eventualmente, purificado de
foma parcial por diálise ou mesmo,
croma-tografia de coluna (Goodman et al., 1974).
O objetivo deste trabalho foi
investi-gar a atividade biológica do
exopolissacarí-deo produzido por um isolamento virulento
(capsulado) de X. campestris pv manihotis .
Biological activity of exopolysaccharide of
Xanthomonas campestrispv.
manihotisA crude preparation of the exopolysaccaride (EPS) of Xanthomonas campestris pv.
manihotis (Berthet
&
Bondar, 1915) Dye 1978 was obtained by growing the pathogen onsolid culture medium for 30 h at 280C. The bacterial growth was harvested in PBS and the
suspension contrefuged at 10.000 g/20 mino Ethanol was added to the supernatant to a
con-centraction of 70% giving rise to a white precipitate that was dialysed against destilled water.
The dialysate wasconsidered the crude preparation of the EPS.
Cassava shoots ('Chagas' and 'Branquinha' cultuvars) were used to test biological
aciti-vity of the cru de EPS. The basal part of shoots was immersed in different dilutions of the
cru de EPS in destilled water. The time for wilting was inversely proportional to EPS
concen-tration. Turgescence recorver was observed when 0,5
em
of the basal part of the shoots wasre-mved ant the shoots transfered to destilled water.
INTRODUÇÃO
A cápsula está presente na camada
mais externa da superfície celular das
bacté-rias e é constituída de polímeros orgãnicos,
usualmente polissacarídeos (Stanier et aI.,
1976 e Stherland, 1977). A esse material,
que circunda a célula, têm sido atribuída
várias funções biológicas: primeiro, a
cáp-sula parece ter a função de proteger a
cé-lula contra as condições adversas do meio
(Kiraly, et aI., 1970); segundo, o
exopolis-sacarídeos (EPS) parece prevenir a
fagoci-tose e a opsonização (Brock, 1974;
Car-peenter, 1975; Kabat, 1968; Smith, 1977
e Sutherland, 1977). Finalmente, a cápsula
é um importante sítió de ligação para
bac-teriófagos (Adams, 1959 e Billing, 1960)
e, também, possui determinantes
antigê-nicos (Carpenter, 1975; Disch, 1962; Kiraly
et aI., 1970 e Smith, 1977). A importância
da cápsula bacteriana como fator de
pato-gênese tem sido investigada em animais
(Corey
&
Starr, 1957 e Stoffl, 1977) eplan-tas (Goodman et ai., 1974; Huang et al.,
1975 e KeIman, 1954). Por exemplo,
so-mente isolamentos capsulados de
Strepto-coccus pneumoniae são virulentos ao ser
humano (Brock, 1974). Essas mesmas
rela-ções entre virulência e presença de cápsula
MATERIAL E MÉTODOS
Na preparação do EPS, a partir de um
isolamento virulento de X. campestris pv.
Outubrolõ I 487
manihotis, foi adotado o procedimento
re-comendado por Ayers et ai. (1979), com
modificações. O isolamento capsulado e
vi-rulento, denominado UFV-06-A de X.
cam-pestris pv manihotis, foi obtido em meio de
cultura contendo cloreto de 2, 3, 5 -
trife-nil tetrazólio (Athayde
&
Romeiro, 1982).Em seguida, foi semeado em 120 placas de
Petri, de 51 x 2 em, que continha o
seguin-te meio: sacarose, lOg; caseína hidrolizada,
8 g;extrato de levedura, 4 g;K2HP04, 2 g;
MgS04.7H20, 0,3 g;agar-agar, 15 g; e água
destilada, 1.000 ml (Kado
&
Hesket, 1970.As placas foram inoculadas, durante
30 horas, a 280C. As células bacterianas
fo-ram recolhidas pela adição de 5 ml de solu
-ção salina tamponada (tampão de fosfato
0,1 M em NaCl a 0,85%, pH = 7) a cada
placa, com o auxílio da espátula de
Drigals-ky. A suspensão bacteriana concentrada foi
centrifugada a 10.000 x g,durante 20
minu-tos, descartando-se o precipitado. Ao
lí-quido sobrenadante foi adicionado etano1
(95% v/v), de modo que a concentração
fi-nal da solução fosse de 70% em etanol. A
mistura foi uncubada, duarante uma noite,
no refrigerados, a 50C. No dia seguinte,
a preparação foi centrifugada a 10.000 x g,
durante 30 minutos, e ao precipitado foi
adicionado um pequeno volume de água
des-tilada esterilizada. Em seguida, fez-se a
diá-lise, durante 48 horas, contra 400 volumes
de água destilada. O produto de diálise foi
mantido em congelador.
Hexoses totais foram estimadas pelo
método de antrona, e suas concentrações
medidas em equivalentes de galactose,
co-mo descrito por Dische, 1962. A
determina-ção de 2-ceto-3 deoxioctanato (KDO) foi
feita pelo método de Karkhanis et ai., 1978. O ensaio da atividade biológica da pre-paração crua do EPS foi realizado con~or:me
recomendação de Stoffl, 1976, com ligeiras
modificações. Foram utilizadas plantas do.s
cultivares de mandioca 'Chagas' e
'Branqui-nha' susceptíveis à X. campestris pv. ma
488
em casa de vegetação. Brotações jovens
(aproximadamente 10 em de comprimento),
no máximo com 20 dias de idade após o
plantio, foram colhidas. Suas bases foram imersas em água destilada esterilizada. Cor-tou-se Uma pequena porção da base de bro-tação, dentro d'água. Imdeiatamente depois de cortada, a parte basal das brotações foi
imersa em tubos que continham 5 ml de
solução-teste, que consistia em diferentes diluições do EPS. Foram testadas oito di-luições do EPS, entre 1024 e 8 J.lg/ml de equivalente de galactose. Como controle, foi utilizada água destilada esterilizada. O ensaio foi conduzido em condições de labo-ratório e as leituras foram realizadas após
00, 30, 60, 90, 120, 150 minutos, para
verificar a ocorrência de murcha.
RESULTADOS E
DISCUSSÃOA curva-padrão estimada para a con-centração de hexoses no exopolissacarídeo do isolamento virulento de X. campestris pv. manihotis foi Y = 62,2 x
+
0,5, em que Y = J.lg/ml de equivalentes de galactose e x = densidade ótima de 620nm. A prepara-ção crua do EPS continha 1953,4 J.lg/ml de equivalentes de galactose.Para KDO, a curva-padrão foi Y
=
20,7 x - 0,08, em que Y = J.lg/ml de KDO e x = densidade ótima a 548nm. A pesquisa da presença de 2-<:eto-3 desoxioctonato (KDO) na preparação crua do exopolissa-carídeo do isolamento virulento de X.
cam-pestris pv. manihotis revelou que a amostra
não continha essa substância, dentro dos li-mites de sensibilidade do teste. Assim, ve-rificou-se que a preparação do EPS não es-tava contaminada com LPS (lípopolíssaca-rídeo da parede celular).
Na atividade biológica do EPS do iso-lamento virulento de Xanthomonas
campes-tris pv. manihotis, o período de tempo para
o aparecimento dos sintomas de murcha nas plantas diminuía, à medida em que se
au-FITOPATOLOGIA BRASILEIRA Vol.8
LITERATURA CITADA
mentava a concentração doexopolissacarf-deo. Nas concentrações inferiores a 500 J.lg/ml equivalentes de galactose, ocorreram variações
n
õ
período de aparecimento dos sintomas de murcha entre as dez plantas componentes de cada tratamento por cul-tivar. Essas variações, provavelmente, estão relacionadas com a falta de uniformidade das brotações, oriundas de gemas de idade e posições diferentes nas hastes das plantas.Entretanto, em concentrações acima de
500J.lg/ml de equivalentes de galactose, ve-rificou-se maior uniformidade no
apareci-mento de sintomas; com 1.000 J.lg/ml de equivalentes de galactose, a murcha ocor-reu em trinta minutos, em 100% das plan-tas dos dois cultivares, após a imersão das hastes na solução de exopolissacarídeo., As brotações usadas como
testemu-nha, que foram imersas em água destilada esterilizada, permaneceram túrgicas por mais de setenta e duas horas. Após o murcha-mento das brotações imersas em solução do
EPS, removeu-se aproximadamente 0,5 em
de suas bases. Essas brotações foram imedia-tamente imersas em água destilada esterili-zada, verificando-se a recuperação da tur-gescência em 100% delas. Aparentemente, o EPS leva à murcha. Mas, com a recupera-ção da turgescêneia, verifica-se, que não houve translocação do fator de murcha, o que sugere um bloqueio dos vasos na base das brotações, ou por obstrução mecânica dos vasos, causada pelo EPS, ou por reação deste com susbstâncias presentes nos vasos
da planta, formando um complexo, que
obstrui os vasos. Estas hipóteses,
respecti-amente, estão de acordo com Goodman
et al.,1974, pois sugerem que, aparente-mente, o EPS leva à murcha, por ocasionar obstrução mecânica dos vasos condutores;
e, com Romeiro, 1980, que hipotetizou,
para a interação de Erwinia amy/ovora x
macieira, que lectinas de plantas
provavel-mente reagissem com o EPS do patógeno,
formando um complexo insolúvel,
seme-lhante a um gel,que obstrui os vasos.
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1 .. 2 2
H. A.DE CASTRO, T. L.KRUGNER ,C. H. F.IDERIHA , M.S.C.CAPPELL02
&
A. B. MARCHI21Escola Superior de Agricultura de Lavras - ESAL, Caixa Postal 37 - 37.200 - Lavras, MG
2Escola Superior de Agricultura "Luíz de Queiroz" - ESALQ/USP Caixa Postal 9 - 13.400 - Piracicaba, SP
(Aceito para publicação em 08/08/83)
RESUMO
Dois isolados de P. psidii de eucalipto, um de goiabeira e um de jambeiro (Syzygium
jambos), foram inoculados em mudas destes hospedeiros, tendo-se utilizado duas espécies
de eucalipto (E. grandis e E. cloeziana) e três seleções de goiabeira (Psidium guajava). As
plan-tas de jambeiro originaram-se de uma única árvore por sementes.
A avaliação do comportamento dos isolados do fungo frente aos hospedeiros, através dos parâmetros incidência de ferrugem, período latente, freqüência de infecção e intensidade de'infecção, demonstrou que as três espécies de plantas são hospedeiras de P. psidii originado de eucalipto, goiabeira ou jambeiro. Em alguns casos, entretanto, o fungo apresentou relativo grau de especificidade para com o hospedeiro de origem.
