N° d’ordre : 2784
THÈSE DE DOCTORAT
Présentée par
Dr. Abdennasser BENJELLOUN
Discipline : Biologie
Spécialité : Epidémilogie prédictive et Microbiologie
Titre
ETUDE EPIDEMIOLOGIQUE DE LA FIEVRE DU WEST NILE :
ANALYSE DES VARIABLES CLIMATIQUES ASSOCIEES AVEC
L’OCCURRENCE DE LA FIEVRE DU WEST NILE AU MAROC ET
ENQUETE DE SEROPREVALENCE CHEZ LE CHEVAL
Soutenue le : 15 Juillet 2015 devant le jury composé de :
Président- Pr. Abdelkarim FILALI-MALTOUF, Professeur de l‘enseignement supérieur, Faculté des Sciences de Rabat.
Rapporteurs
- Pr. Youssef BAKRI, Professeur de l‘Enseignement Supérieur, Faculté des Sciences de Rabat. - Dr Ouafaa FASSI-FIHRI, Professeur de l‘Enseignement Supérieur, IAV Hassan II, Rabat. - Dr. Mehdi El HARRAK, Directeur de Recherche et Développement à MCI.
- Pr. Bouchra BELKADI Professeur, Faculté des Sciences de Rabat. Invités
- Dr. Jamal MALIK, Président du Directoire Général de BIOPHARMA. - Dr. Chafiqa LOUTFI, Chef du Service de Virologie BIOPHARMA.
Faculté des Sciences, 4 Avenue Ibn Battouta B.P. 1014 RP, Rabat – Maroc Tel +212 (05) 537 77 18 34/35/38, Fax: +212 (05) 537 77 42 61, http://www.fsr.ac.ma
PRODUCTION SCIENTIFIQUE
Publications:
A. BENJELLOUN, M. EL HARRAK, B. BELKADI.WEST NILE DISEASE EPIDEMIOLOGY IN NORTHWEST AFRICA: Bibliographical review. Transboundary emerging diseases.
A. BENJELLOUN, M. EL HARRAK, P. CALISTRI, C. LOTFI, H. KABBAJ, A. CONTE, C. IPPOLITI, M. L. DANZETTA, B BELKADI. A preliminary attempt to identify areas at risk for WND inMorocco: a serosurvey in horses. Veterinary Medicine and Science.
P. CALISTRI, C. IPPOLITI, L. CANDELORO, A. BENJELLOUN, M. EL HARRAK, B BELKADI, M. L. DANZETTA; D. SABATIO. A. CONTE. Analysis of climatic and environmental variables associated with the occurrence of West Nile virus in Morocco. Preventive Veteretinary Medecine.
A. CONTE, L. CANDELORO, C. IPPOLITI, F. MONACO, F. D. MASSIS, R.. BRUNO, M. L. DANZETTA, A. BENJELLOUN, B. BELKADI, M. EL HARRAK, S. DECLICH, C. RIZZO, S. HAMMAMI, T. HASSINE, P.CALISTRI, G. SAVINI Spatio-temporal identification of areas
suitable for West Nile Disease in the Mediterranean Basin and Central Europe. PLOS Computational Biology.
Communications
1. A. BENJELLOUN, M. EL HARRAK, C. LOTFI, H. KABBAJ, B.BELKADI.
A preliminary attempt to identify areas at risk for WND in Morocco: a serosurvey in horses. Risk Analysis as a tool for control of animal diseases and zoonoses in the Mediterranean Basin; 5-7 Novembre 2013, Teramo, Italie.
2. A. BENJELLOUN,M. EL HARRAK, C. LOTFI, B.BELKADI. A WND in Morocco and prevention strategies. Emerging infections in the Mediterranean Basin and Eastern Europe. 20-21 Mai 2015, Erice (Trapani), Italie.
DEDICACES
Je dédie ce travail :
A la mémoire de mon père,
A ma mère Khadija,
A mon épouse Sabah et mes enfants Réda, Mohammed Amine et Iness,
A mon frère Younes, et mes sœurs Déya, Sakina, et Hanane,
A mes neveux,
A toute ma famille,
A tous mes amis,
A tous ceux qui m‘ont soutenu,
A tous mes collègues, mes confrères et mes camarades,
Et enfin à tous les miens.
AVANT - PROPOS
Le présent travail a été réalisé dans le Laboratoire de Microbiologie et Biologie moléculaire de la Faculté des Sciences, Université Mohammed V Agdal, sous la direction du Pr. Bouchra BELKADI et le Laboratoire National de BIOPHARMA (Société de Productions Biologiques et Pharmaceutiques Vétérinaires) sous le co-encadrement du Dr Mehdi EL HARRAK. Une partie des travaux a été réalisée à l‘Institut de Prophylaxie Animale IZS de Teramo, Italie (Istituto Zooprofilattico dell‘Abruzzo e del Molise ‗G. Caporale‘
Ce travail a également bénéficié du soutien de Monsieur le le Général de Corps d‘Armée, Hosni BENSLIMANE Responsable National de la lutte Contre la grippe avaiaire et H1.N1
Je tiens à exprimer toute ma gratitude :
A ma directrice de thèse le Professeur Bouchra BELKADI pour avoir encadré cette thèse, avec beaucoup de compétence et d‘enthousiasme, pour ses conseils avisés et son optimisme et ce malgré ses diverses occupations. Qu‘elle trouve ici une modeste expression de ma profonde reconnaissance.
A mon co-encadrant, Mr Mehdi EL HARRAK, Directeur de Recherche et Développement du Laboratoire Pharmaceutique Marocain M.C.I. Santé Animale, pour le choix pertinent du sujet, son soutien, ses conseils et sa disponibilité. Il a suivi de près toutes les étapes de l‘élaboration de cet ouvrage de recherche sur la Fièvre West Nile.
A Monsieur Abdlekarim FILALI-MALTOUF, Professeur à la Faculté des Sciences de Rabat, responsable du Laboratoire de Microbiologie et de Biologie Moléculaire, de m‘avoir fait le grand honneur d‘accepter la présidence du jury de thèse. Je lui exprime toute ma reconnaissance la plus sincère.
A Monsieur Youssef BAKRI, Professeur à la Faculté des Sciences de Rabat, pour avoir accepté de rapporter cette thèse qu‘il accepte mes sincères remerciements pour avoir consacré son temps àl‘analyse de mes travaux de recherche et d‘avoir exprimé ses jugements pertinents sur mon manuscrit.
A Madame Ouafaa FASSI FIHRI, Professeur à l‘Institut Agronomique et Vétérinaire Hassan II, qui a bien voulu consacrer de son temps pour être rapporteur de cette thèse, pour sa collaboration scientifique fructueuse et pour ses conseils pertinents qui m‘ont été d‘un grand intérêt dans l‘élaboration du document .
A Madame Chafiqa LOTFI pour son encadrement au sein du Laboratoire de Virologie de BIOPHARMA et dont la compétence n‘a d‘égal que son dévouement et sa gentillesse qui a bien voulu accepter d‘examiner ce travail.
Je remercie également le Dr Jamal MALIK, Président du Directoire du Laboratoire National d‘Analyses Biologiques BIOPHARMA qui a bien voulu accepter d‘examiner ce travail.
A Monsieur le Général de Corps D‘Armée Hosni BENSLIMANE, Commandant de la Gendarmerie Royale et Coordinateur National de la Lutte Contre La Grippe Aviaire et la grippe H1N1 ainsi qu‘à Mr le coordonateur-adjoint Mr Abdelaziz ARIFI et Mr le Colonel MOHAMED EL ARABI pour avoir soutenu ce travail.
Je remercie aussi toute l'équipe de l'Istituto Sperimentale Zooprofilattico dell'Abruzzo e del Molise IZS de Teramo (Italie) spécialement Paolo CALISTRI, Annamaria CONTE, Carla IPPOLITI et Maria Luisa DANZETTA pour leur collaboration et les enseignements qu‘ils ont bien voulu me fournir.
Je remercie également les confrères vétérinaires qui ont participé aux prélèvements à Rabat, Benslimane, Bouznika et Khémisset notamment le Dr Olga POPARCEA, le Colonel vétérinaire Mohamed KAIDI, et le Commandant vétérinaire Mohamed BOUKHARTA, de même que le personnel du Club Equestre Dar Essalem, les organisateurs des fantasias de Benslimane et Khémisset et de la station de monte de Bouznika.
Je remercie, le personnel du laboratoire d‘analyses de BIOPHARMA qui a mis à ma disposition tout le matériel et le savoir-faire nécessaires pour réaliser les tests de laboratoires en particulier, Mlle Ghislane SEBBAR et Madame Nadia CHAFFAI en leur qualité de biologistes spécialisées.
Je remercie l‘équipe du Laboratoire de Microbiologie et Biologie Moléculaire de la Faculté des Sciences, Université Mohammed V, notamment Mlle Chaimaa YATRIB pour sa précieuse contribution dans l‘élaboration de ce document.
RESUME
La Fièvre West Nile est une arbovirose transmise par des moustiques vecteurs à plusieurs espèces dont l‘Homme et le cheval. Au Maroc, la maladie a été signalée chez des équidés en 1996 causant la mort de 42 équidés et le décès d‘une personne. Elle est réapparue en 2003, causant la mort de 5 chevaux parmi 9 infectés puis en 2010, l‘infection a touché 17 chevaux dont 8 sont morts.
Les variables climatiques associées avec l‘occurrence des épizooties (la pluviométrie, l‘indice de végétation par différence normalisée et la température) ont été analysées. De même une enquête sérologique a été menée sur 870 chevaux provenant de quatre différentes écorégions.
Les années des épizooties ont montré des pluviométries et des NDVI relativement élevés par rapport aux autres années. La séroprévalence trouvée dans la zone bioclimatique du littoral atlantique : 40.58%, 51.18%) s‘est avérée plus élevée que la prévalence globale : 30,80%.
SUMMARY
The West Nile Disease is a mosquito born disease transmitted to many species including humans and horses. In Morocco, the first cases were reported in equids in 1996 killing 42 horses and one person. After an apparent epidemiological silence, the disease reappeared in 2003 causing the death of 5 of 9 infected horses cases. Finally, in 2010, the disease has led to the infection of 17 horses and the death of 8.
The climatic variables associated with the occurrence of the outbreaks (Rainfall, Normalized Difference Vegetation Index and temperature) were analyzed. Thus, a serological survey was conducted in 870 horses originating from four different eco regions.
Compared with other years, epizootic years exhibited higher NDVI and rainfall values. Similarly, the Atlantic coast showed a significantly higher prevalence (45.83%, 95% CI = (40.58%, 51.18%)) compared to the overall prevalence 30.80%.
SOMMAIRE
INTRODUCTION GENERALE ... 1
CHAPITRE I : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE ... 2
I. Généralités : ... 3 1. Définition : ... 3 2. Historique : ... 3 3. Répartition géographique: ... 4 a. Répartition mondiale: ... 4 b. La FWN au Maroc: ... 6
II.Etude du virus West Nile : ... 7
1. Classification : ... 7 2. Structure et génome : ... 7 3. Caractères physico-chimiques : ... 10 4. Diversité et virulence : ... 10 5. Propriétés biologiques : ... 12 5.1. Multiplication in vitro : ... 12 5.2. Multiplication in vivo : ... 12 6. Propriétés antigéniques: ... 13 6.1. Pouvoir antigénique: ... 13 6.2. Immunité: ... 14 III. Physiopathologie: ... 16 1. Symptômes cliniques : ... 16 1.1. Chez le cheval : ... 16 1.2. Chez l‘Homme: ... 18
1.3. Chez les oiseaux: ... 19
2. Lésions: ... 20 2.1. Lésions macroscopiques: ... 20 2.2. Lésions microscopiques: ... 20 3. Pathogénie: ... 16 IV. Epidémiologie: ... 22 1. Source du virus : ... 22 2. Les vecteurs ... 22
3. Les espèces hôtes ... 26
4. Cycle de transmission ... 28
4.1. Cycle oiseaux-moustiques-oiseaux ... 28
4.2. Autres voies d‘amplification ... 30
5. Ecologie de la FWN ... 35 5.1. Ecologie générale : ... 35 5.2. Ecologie de la FWN au Maroc ... 40 V.Diagnostic : ... 45 1. Diagnostic épidémio-clinique : ... 45 2. Diagnostic biologique: ... 46 2.1. Diagnostic direct ... 46
2.2. Diagnostic sérologique indirect: ... 47
VI. Traitement : ... 52 VII. Prophylaxie : ... 53 1. Prophylaxie sanitaire : ... 53 1.1. Mesures offensives: ... 53 1.2. Mesures défensives: ... 53 2. Prophylaxie médicale : ... 55 2.1. Le choix de la vaccination : ... 55
2.2. Le point sur les vaccins : ... 55
3. Mesures en cas de foyer : ... 56
3.1. Mesures individuelles : ... 56
3.2. Mesures collectives de police sanitaire : ... 56
CHAPITRE II : PARTIE EXPERIMENTALE ... 57
I. Matériels et Méthodes utilisés pour l’analyse des variables climatiques associées avec l’occurrence de la FWN au Maroc: ... 58
1. Données bibliographiques des épizooties de 1996, 2003 et 2010: ... 58
2. Les données climatiques de la télédétection spatiale: ... 58
2.1. Distribution des foyers: ... 58
2.2. Les données climatiques et analyse statistique: ... 59
II.Matériels et Méthodes de l’enquête sérologique ... 62
2 Echantillons: ... 64
3 Techniques immunologiques ... 64
3.1 ELISA compétition (IgG): ... 64
3.2 ELISA de capture (IgM) : ... 66
3.3 Séroneutralisation sur culture cellulaire: ... 68
4 Analyse statistique des résultats l‘enquête sérologique : ... 72
CHAPITRE III RESULTATS ... 73
I. Résultats de l’analyse des variables climatiques associées avec l’occurrence du virus de la FWN au Maroc : ... 74
1. Comparaison des NDVI dans les zones infectées: ... 74
2. Comparaison des données pluviométriques dans les zones infectées : ... 76
3. Comparaison des données de la température dans les zones infectées :... 79
II.Résultats de l’enquête de séroprévalence : ... 82
1. Résultats du test ELISA compétition IgG : ... 82
2. Résultats du test de séroneutralisation : ... 82
3. Résultats du test Elisa IgM de capture : ... 83
4. Séroprévalence globale : ... 84
5. Séroprévalence par zone bioclimatique : ... 85
CHAPITRE IV DISCUSSION ... 89
CHAPITRE V : CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES ... Erreur ! Signet non défini. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 107
LISTE DES ABBREVIATIONS
Abréviation Définition
AC Anticorps
Ae. Aedes
AMM Autorisation de mise sur le marché
Aqua MODIS Satellite Terra du système Modis pour observation de l‘Eau
ARNm Acide ribonucléique messager
BAB Tampon borate d‘albumine bovine
BHK Cellule de rein d‘hamster
Bp Paire de base (base pair)
C6-36 Cellules de moustique Aedes albopictus
CCL5 Chemokine (C-C motif) ligand 5
CDC Center for Disease Control
Cox-2 Cyclooxygenase 2
Ct Cycle Threshold ou seuil de cycle
Cx. Culex
DJ Degrés – jours
DICT50 Doses infectieuses du virus détruisant 50% de la culture tissulaire
DIII
DL50 Dose Létale 50
D-MEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
Dnase Désoxyribonucléase E enveloppe
E.coli Escherichia coli ECDC European Centre for Disease Control
Domaine III de la protéine d'enveloppe
DL50 Dose Létale 50
DN50 Dose neutralisante 50% des unités testées
D-MEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
dNTP Désoxynucléotides tri phosphates
dNTP désoxyNucléotides Triphosohates
DO Densité optique
E Enveloppe
ECDC European Centre for Disease Control
ECP Effet cytopathogène
EDTA EDTA EthylèneDiamnine Tetraacetic Acid
ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
ENV Envellope
EOS Earth Observing System (Système d‘observation de la Terre
FC Fragment constant des Immunoglobulines
FVR Fièvre de la vallèe du Rift
FWN Fièvre du West Nile
GPS Global positionning system
HRP Horseradish peroxidase
IC95% Intervalle de confiance à 95%
IFN Interférons
IgG Immunoglobuline G (IgG)
IgM Immunoglobuline M (IgM)
IHA Test d‘inhibition de l‘hémaglutination
IL-4 Interleukine 4
IL-6 Interleukin 6
iNOS Nitric oxide synthase
ITCZ Indice de convergence de la zone intertropicale
JAXA Agence Spatiale Japonaise
JEV Encephalitis Virus (Virus de l'Encéphalite Japonaise)
kb Kilobase
kDa Kilo Dalton
KUNV Kunjin Virus (Virus Kunjin)
LC Langerhans Cell (Cellule de Langerhans)
LCR Liquide Céphalo Rachidien
LST Température de la surface du sol
MEM Eagle's Minimum Essential Medium
MMP9 Matrix metallopeptidase 9
MO03 Souche Maroc 2003 du virus West Nile
MODIS Spectroradiomètre par imagerie à résolution modéré
Mor.1996 EQ Souche du virus West Nile isolée au Maroc en 1996 chez des équidés
Mor.2003 EQ Souche du virus West Nile isolée au Maroc en 2003 chez des équidés
MVEV Virus de l'Encéphalite de la Vallée de Murray
NASA Administration nationale américaine de l'aéronautique et de l'espace
NC Non Codant
NDVI Indice de végétation par différence normalisée
NS Proteines Non structurelle
NY99 Souche du virus West Nile New York 1999
OIE Office International des épizooties
OIE Office International des Epizooties
ONSSA Office National De Securite Alimentaire Des Produits
Alimentaires
PFU Plaque forming units
PCR Polymérase Chain Reaction
pH Potentiel d‘ hydrogène
prM Précurseur de protéines transmembrabaire
PRNT Plaque reduction neutralization test
PS Clone D Lignée cellulaire des fibroblastes de rein du porc
qRTPCR Réaction de Polymérisation en Chaine en temps réel suite à une Transcription Inverse
RE Réticulum Endoplasmique
RIMC Réponses imunitaire à médiation cellulaire
RIMH Réponses immuniaire à médiation humorale
RT-PCR Reverse Transcriptase Polymérase Chain Reaction
SIG Système d‘information géographique
SLEV Virus de l'Encepéhalite de Saint-Louis
SN Séroneutralisation
SNC Système nerveux central
SOI Indice d‘oscillation du sud (Southern Oscillation Index)
SVF Sérum de veau fœtal
TCD4 Les lymphocytes T auxiliaires
TCD8 Lymphocytes T cytotoxiques
Terra MODIS Satellite Terra du système Modis pour observation de la Terre
TLR3 Toll-like Receptor 3
TMB TMB (3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine)
TNFα Facteur de nécrose tumorale alpha
TRMM Tropical Rainfall Measuring Mission
TSCZ Indice de convergence de la zone intertropicale
USUV Usutu Virus (Virus Usutu)
VERO Cellules épithéliales extraites du rein de singe vert africain
VFVR Virus de la fièvre de la vallée du Rift
VWN Virus du West Nile
WN-Ag Antigène du virus West Nile
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1: Cas cliniques et mortalités dues au VWN aux USA rapportés par le CDC par an de 1999
à 2014 ... 6
Tableau 2: Espèces de Culex impliquées dans la transmission du VWN ... 24
Tableau 3: Réservoirs et vecteurs possibles dans diverses régions du globe ... 38
Tableau 4: Les espèces de moustiques rencontrés au Maroc ... 42
Tableau 5 : Variation interannuelle des effectifs d‘oiseaux d‘eau recensés dans les cinq régions marocaines pendant la période 1996-2000 ... 45
Tableau 6: Nombre et provenance des chevaux prélevés par zone et par localité. ... 64
Tableau 7 : Valeurs moyennes et ecart-type des NDVI de la période de mai à novembre par polygone et par année de 2001 à 2010 ... 75
Tableau 8: Les valeurs moyennes et écart-type des valeurs NDVI enregistrées de juin à novembre au cours de la décennie 2001-2010 pour chaque foyer de FWN ... 76
Tableau 9: Nombre de jours avec «précipitations extrêmes» de 2001 à 2010 enregistrées entre juin et novembre dans les zones touchées par la FWN. ... 76
Tableau 10: Dates du début et de la fin de l‘activité potentielle du moustique dans les aires d‘etudes 2003 et 2010 ... 80
Tableau 11: Résultats du test ELISA compétitive IgG ... 82
LISTE DES FIGURES
Figure 1: Répartition mondiale du VWN ... 4
Figure 2: Carte d‘isolement du virus de la FWN dans le monde ... 5
Figure 3: Apparence du virus West Nile en microscopie électronique ... 8
Figure 4: Structure VWN ... 8
Figure 5: Structure du génome du virus ... 9
Figure 6: Représentation de la structure de la protéine d‘enveloppe ... 9
Figure 7: Arbre phylogénétique du VWN . ... 11
Figure 8: Mode multiplication du VWN ... 13
Figure 9 : Cinétique des anticorps anti-VWN ... 15
Figure 10: Lésions microscopiques du thalamus gauche et de la corde cervicale spinale ... 21
Figure 11: Lésions microscopiques observées chez le cheval: ... 21
Figure 12 : Images de vecteurs de la FWN appartenant à la famille des Culicinae et Anophelinae ... 23
Figure 13: Cycle biologique de Culex pipiens. ... 25
Figure 14: Voies de migration des oiseaux dans la région méditerranéenne ... 27
Figure 15: Cycle de transmission du VWN. ... 28
Figure 16: Phases d'introduction, d'amplification puis d'émérgence du VWN ... 29
Figure 17 : Quelques espèces de tiques impliquées dans la transmission du VWN34 Figure 18 : Localisation des zones humides d'importance internationale du Maroc ... 41
Figure 19: Distribution au Maroc de quelques espèces de moustiques : ... 43
Figure 20: Schéma expliquant la méthode de fixation du complément ... 48
Figure 21: Schéma de la réaction d‘hémagglutination et inhibition de l‘hémagglutination ... 49
Figure 22: Principe de la technique ELISA compétitive pour la détection des IgG antiWN ... 49
Figure 23: Principe du test ELISA de capture pour la détection des IgM antiWN ... 50
Figure 24: Test de séroneutralisation : Observation de l‘effet cythopathogène sur culture cellulaire 51 Figure 25: Schéma de la plaque du test ELISA-compétitive ... 65
Figure 26: Plaque de manipulation pour ELISA par micro capture IgM. ... 67
Figure 27 : Schéma de plaque de microtitrage des sérums pour le test de séroneutralisation ... 70
Figure 28: Schéma de plaque de microtitrage pour lecontôle du test de séroneutralisation ... 71
Figure 29: Répartition géographique des foyers de FWN en 2003 et en 2010 ... 74
Figure 30: Données de précipitations de 3 jours d‘intervalle dans l‘aire d‘étude de 2003 ... 77
Figure 31: Données de précipitations de 3 jours d‘intervalle dans l‘aire d‘étude de 2010 ... 77
Figure 32: Valeurs maximales de pluies quotidiennes (en mm) ... 78
Figure 33: Températures journalières de jour et de la nuit et leur moyenne de 2001 et 2010 ... 79
Figure 34: Valeurs degrés-jours cumulées à partir du premier janvier de chaque année ... 80
Figure 35: Représentation graphique du début et de la fin de l‘accumulation d‘énergie par le vecteur pour la décennie 2001-2010. ... 81
Figure 36: Résultat synthétique des analyses sérologiques ... 82
Figure 37: Titre des anticorps séroneutralisants obtenus par SN dans les sérums positifs en IgG ... 83
Figure 39: Comparaison des taux de séroprévalence dans les quatre zones bioclimatiques moyennant une approche bayésienne. ... 87 Figure 40: Prévalences en anticorps anti WN par zone bioclimatique ... 88
1
INTRODUCTION GENERALE
L‘âgent de la Fièvre du Nile Occidental ou Fièvre du West Nile (FWN) est un arbovirus, de la famille de Flaviviridae. Ce virus a été découvert en 1937, en Ouganda, dans le sérum d'une jeune femme souffrant d'un syndrome fébrile bénin. Depuis cette date, il a été isolé à maintes reprises dans de nombreux pays, chez I 'homme, le cheval, les oiseaux et les moustiques.
Au niveau mondial, après une phase d'éclipse d'une dizaine d'années, cette maladie a ressurgi a la fin des années 90, notamment en Europe et aux Etats-Unis ou elle n‘avait jamais été signalée causant une morbidité et une mortalité importantes chez l‘homme et chez les chevaux ainsi chez d‘autres espèces.
Chez l‘Homme, la maladie est souvent asymptomatique. Cependant, environ 30% des personnes infectées développent des symptômes allant d'un syndrome grippal à des symptômes encéphalitiques, avec des taux allant de 3 à 17%. Dix pour cent des chevaux infectés par le VWN présentent des troubles neurologiques (Castillo-Olivares, et al., 2004, Sambri et al., 2013).
Les analyses phylogénétiques basées sur l'analyse des séquences nucléotidiques ont montré que les isolats du VWN de différentes régions géographiques sont classés en deux lignages majeures (1 et 2), présentant 25 à 30% de différences nucléotidiques (Berthet et al., 1997; Lanciotti et al., 2002).
Le lignage 1 regroupe des souches qui circulent en Afrique de l'Ouest, Moyen Orient, Europe de l'Est, Amérique du Nord et Australie. Le lignage 2 ayant une répartition géographique restreinte circule en Afrique sub-saharienne et Madagascar. Il a été retrouvé dernièrement en Europe et plus précisément, en Hongrie, en Grèce et en Italie (Bakonyi et al., 2006; Bagnarelli et al., 20 11; Papa et al., 2011).
En 1999 la souche virale du VWN appartenant au lignage 1 a été introduite en Amérique du Nord et s‘est répandue à travers le continent pour atteindre la côte ouest en trois ans. Ainsi entre 1999 et 2010 environ, 1.8 million de personnes ont été infectés par le virus, plus de 12000 cas de malades ont présenté des signes de méningite-encéphalitique et 1308 personnes sont mortes (Kilpatrick, A et al., 2011).
Le Maroc a connu en 1996, 2003 et 2010 trois épizooties de la maladie de la FWN. Le virus avait fait sa première apparition dans la région Nord-Ouest notamment les provinces de Kénitra et de Larache, dès lors, plusieurs cas ont été déclarés dans d‘autres provinces.
Les motivations qui nous ont poussé à nous intéresser à I' étude de cette maladie ont été tout d'abord le fait qu'il s'agisse d'une zoonose d'actualité mondiale en pleine expansion. C‘est une arbovirose émergente nouvellement signalée dans différents pays et plusieurs zones d‘ombre persistent encore sur les conditions et les mécanismes qui déterminent son apparition et sa réémergence.
Ces travaux se sont basés sur l‘analyse des données des précédentes épizooties qu‘a connu le Maroc, sur une enquête sérologique chez le cheval en vue d‘évaluer la distribution spatio-temporelle de l‘infection après ces épizooties et l‘étude de l‘association entre l‘occurrence des cas de FWN au Maroc et les données bioclimatiques de la télédétection spatiale telles que les valeurs du NDVI (indice de végétation normalisé), la pluviométrie et la température.
2
CHAPITRE I :
3
I.
Généralités :
1. Définition :
La Fièvre West Nile (FWN) est une maladie commune à plusieurs espèces, c'est une arbovirose émergente, le plus souvent asymptomatique, transmise à l'homme et à l‘animal par les moustiques. Elle peut néanmoins se manifester par un syndrome de type pseudo-grippal. Après 3 à 15 jours d'incubation des complications peuvent survenir et l'infection peut évoluer, dans moins de 15% des cas symptomatiques, vers une méningite aseptique et une encéphalite. La mortalité dépend de la virulence de la souche, du statut immunitaire et de l'âge des patients (Bunning et al., 2002).
Les oiseaux, qu'ils soient sauvages ou domestiques, constituent le réservoir principal du virus et les oiseaux migrateurs jouent un rôle essentiel dans sa dissémination, en permettant notamment son passage de l'Afrique vers les zones tempérées de l'Europe. Les moustiques s'infectent auprès des oiseaux, amplifient le virus et peuvent contaminer l'homme et les équidés lors de leur repas sanguin, (O.I.E, 2010). Ce virus a émergé, il y a quelques années, dans les régions tempérées d'Europe et d‘Amérique du Nord. Cette arbovirose présente des risques sérieux aussi bien pour la santé publique que pour la santé animale particulièrement pour les équidés et, depuis 1998, pour les oiseaux (Komar, 2000).
2. Historique :
Le virus West Nile (VWN) fut l'un des premiers virus responsables des arboviroses à être documenté. II fut isolé pour la première fois en 1937 par Smithburn et Burke à partir du sérum d'une femme adulte atteinte d'un syndrome fébrile bénin, habitant le district du West Nile en Ouganda. Ce n'est que dans les années cinquante que l'écologie de cette arbovirose a été mise en évidence en Egypte. Puis le VWN a été reconnu responsable de sévères méningo-encéphalomyélites humaines chez des personnes âgées en Israël en 1951-54 puis 1957. Ensuite, des cas de maladie chez des chevaux ont été observés en Egypte (Taylor, 1956) et d‘autres pays au début des années soixante.
Le virus a été détecté chez des oiseaux et des moustiques puis, il a été retrouvé chez l'Homme et l'animal dans de divers pays (Roumanie et Maroc en 1996, Tunisie en 1997, Italie en 1998). L‘apparition du VWN en Amérique du Nord en 1999, avec des cas d'encéphalites humaines et équines, semble représenter une étape importante dans l'histoire de I' évolution de ce virus (Komar, 2000; Peiris et Amerasinghe, 1994). Plusieurs pays tels qu‘Israël, la France, le Portugal et le Mexique ont rapporté des cas humains de l'infection par le VWN en 2003 ou 2004. En octobre 2003, un cas de méningo-encéphalite due au VWN est rapporté dans le département du Var dans le Sud-Est de la France. Il s‘agit du premier cas humain depuis 1964 (Mailles al., 2003).Le total des cas en France en 2003 s‘établit à six cas confirmés et un cas probable.
En juillet 2004, deux Irlandais développent des symptômes, une encéphalite et une fièvre, après un séjour au Portugal. Des investigations menées dans ce pays confirment la présence des moustiques infectées par le VWN (CDC, 2004).
Au Mexique, 6 personnes ont présenté une atteinte neurologique (Farfán et al., 2004). En juillet 2004, un cas a été rapporté dans l'état de Sonara à la frontière du Texas.
4 3. Répartition géographique:
a. Répartition mondiale:
Le virus circule de façon enzootique et endémique en Afrique et en Asie (Figure 1). Dans le reste du monde, notamment en Europe et en Amérique, il provoque régulièrement des épidémies et des épizooties (Zientara et Lecollinet, 2010). L‘émergence inattendue du virus en 1999 en pleine ville de New York, associant des cas humains d‘encéphalite mortelle et une mortalité aviaire importante (Tableau 1) et la diffusion rapide sur le continent Nord-américain mais également en Amérique Centrale et du Sud a entraîné un regain d‘intérêt pour cette virose. Ainsi en 10 ans et rien qu‘aux Etats-Unis, la propagation du VWN a entrainé plus de 29 000 cas chez l‘homme associés à 1157 décès et au moins 25 000 cas équins (Pradier, 2010)
Figure 1: Répartition mondiale du VWN
Source : http://www.moustiquesinfo.sante.gouv.fr/spip.php?rubrique39.
Le VWN a été reconnu comme un agent pathogène humain en Afrique au cours de la première moitié du 20ème siècle. Bien que plusieurs épidémies de FWN ont été décrites, l'encéphalite due à l'infection par le VWN chez les humains a est été rarement observée avant 1996, depuis lors, des épidémies d'encéphalite ont été signalés en Roumanie, la Russie, Israël, Amérique du Nord, la France, la Tunisie, l'Italie et la Grèce.
Pendant les années 1960, La FWN a été rapportée chez des chevaux d'Egypte et la France (Panthier et al., 1968; Schmidt & El Mansoury, 1963). Depuis 1998, des épidémies d‘encéphalite équine dues au VWN ont été signalées par l'Argentine, le Canada, la France, Israël, l‘Italie, le Maroc, l'Espagne et les États-Unis d'Amérique. En 2011, une épidémie d'encéphalite équine causée par le virus Kunjin, a été signalée en Australie.
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L'apparition de la maladie chez les humains et les animaux ainsi que des oiseaux et la surveillance des moustiques pour l'activité du VWN ont démontré que l‘étendue de la répartition du virus s‘est considérablement élargie, y compris en Amérique, en Europe, et autour du Bassin méditerranéen.
Cette endémisation du virus en Méditerranée est particulièrement nette en Italie où, chaque année depuis 2008, date de la réémergence du virus dans ce pays (Calistri et al., 2009), des cas de FWN chez l‘homme sont diagnostiqués dans les régions du Nord de l‘Italie (Vénétie, Lombardie et Emilie-Romagne) où co-circulent depuis 2012 les deux lignées du VWN (Capelli et al.,2013).
En effet, la lignée 1 a été responsable de la majorité des foyers identifiés en Europe avant, que ne soit isolé, en 2004, en Hongrie la lignée 2 (Bakonyi et al., 2006) qui s‘est depuis étendue à toute l‘Europe de l‘Est et à une partie de l‘Europe du sud. En ce qui concerne la surveillance des équidés en 2013, des cas ont été diagnostiqués principalement en Italie, Grèce et Espagne, dans des zones où le virus avait déjà été isolé en 2012 (OIE, 2012).
Cette implantation du VWN est aussi associée en 2013 à une extension de son aire de répartition à d‘autres régions d‘Europe. Cette extension est particulièrement visible dans les Balkans avec, en Serbie par exemple, 302 cas humains en 2013 pour 69 cas diagnostiqués en 2012. Néanmoins, le nombre de cas humains cumulés par année au niveau des pays européens et des pays voisins n‘est pas en faveur d‘une augmentation de l‘incidence du nombre de cas pour l‘année 2013.
Le VWN est donc bien implanté en Europe, avec de manière préoccupante une endémisation dans certains pays comme l‘Italie ou la Grèce, et une extension progressive de la maladie à de nouvelles régions (Sardaigne, Bulgarie, Macédoine, Albanie, Serbie, région de l‘Attique en Grèce,…).
Figure 2: Carte d‘isolement du virus de la FWN dans le monde (Calistri P. et al., 2010)
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Tableau 1: Cas cliniques et mortalités dues au VWN aux USA rapportés par le CDC par an de 1999 à 2014
Maladie Neuroinvasive Maladie non
neuroinvasive Total Année Nbre. de Cas Nbre. de Morts (%) Nbre. de Cas Nbre. de Morts (%) Nbre. de Cas Nbre. de Morts (%) 1999 59 7 12 3 0 0 62 7 11 2000 19 2 11 2 0 0 21 2 10 2001 64 10 16 2 0 0 66 10 15 2002 2,946 276 9 1,210 8 1 4,156 284 7 2003 2,866 232 8 6,996 32 (<1) 9,862 264 3 2004 1,148 94 8 1,391 6 (<1) 2,539 100 4 2005 1,309 104 8 1,691 15 1 3 119 4 2006 1,495 162 11 2,774 15 1 4,269 177 4 2007 1,227 117 10 2,403 7 (<1) 3,63 124 3 2008 689 41 6 667 3 (<1) 1,356 44 3 2009 386 32 8 334 0 0 720 32 4 2010 629 54 9 392 3 1 1,021 57 6 2011 486 42 9 226 1 (<1) 712 43 6 2012 2,873 270 9 2,801 16 1 5,674 286 5 2013 1,267 111 9 1,202 8 (<1) 2,469 119 5 2014 1,347 87 6 858 10 1 2,205 97 4
Total
18.810 1,641 9 22,952 124 (<1) 41,762 1,765 4Source: ArboNET, Arboviral Diseases Branch, Centers for Disease Control and Prevention b. La FWN au Maroc:
Le Maroc a connu trois épizooties dues au VWN en 1996, 2003 et 2010. En 1996, La maladie aurait débuté au mois de mars chez un cheval âgé de 6 ans qui a présenté une parésie du train postérieur et qui a finalement été abattu le 16 septembre 1996 dans la province de Benslimane.
Après un silence épidémiologique, la maladie est réapparue en juillet 1996 dans les provinces de Kénitra et Larrache (périmètre irrigué) puis en aout 1996 une mortalité en série s‘est déclarée dans différents douars au nord-ouest du pays avec une forte incidence durant la période de 23 aout au 07 septembre 1996. Une nette dimunition des cas et de la mortalité a été observée à partir de la dernière semaine du mois de septembre 1996. Le dernier cas déclaré date du 12 octobre de la même année.
Depuis le début de la maladie et jusqu‘au 30 novembre 1996, 94 équidés ont été atteints dont 42 sont morts. Un seul cas humain d‘encéphalite mortelle attribuée au VWN a été rapporté à la même époque
Des sérologies ont été effectuées et ont permis d‘exclure rapidement les maladies contagieuses classiques compte tenu du contexte épidémiologique. Le diagnostic s‘est d‘abord porté sur la forme nerveuse de la rhinopneumonie équine mais cette hypothèse a été écartée par la suite. Les analyses sérologiques de L‘Institut Pasteur de Paris, ainsi que les études virologiques et histologiques ont permis de suspecter le VWN (MAMVA, 1996).
7
En 2003, entre septembre et octobre, 9 cas équins avec des troubles neurologiques ont été observés dans la région du Gharb au nord-est de Kénitra dans les localités de Ouled Slama, Ameur Seflia et Mograne (Schuffenecker et al., 2003).
En 2010, entre le 20 juillet et le 17 août, seize foyers équins ont été identifiés au Maroc essentiellement dans la région de Benslimane. Sur 111 chevaux, 17 ont présenté des signes cliniques et 8 sont morts. (OIE, 2010).
Les souches qui circulent au Maroc ont une parenté génétique avec celles identifiées à l‘ouest du bassin méditerranéen et elles se caractérisent par une virulence importante pour les équidés. Le séquençage des isolats Mor.1996 EQ et Mor.2003 EQ montre une similitude nucléotidique de 98.9% par conséquent l‘hypothèse de la résurgence n‘est pas à exclure (Fassi-Fihri M.M., 2008).
Chez les équidés, plusieurs enquêtes sérologiques ont été menées dans les zones des épizooties. Ainsi à Kénitra en 2003, la séroprévalence en anticorps anti-VWN, était de 41.92%, (n=260) et dans la région de Laarache en 2006, elle était de 57% (n=251). Les chevaux ont montré une prévalence supérieure aux mulets et aux ânes Ces prévalences étaient respectivement de 86.52 %(n=89), 49,02 %(n=51) et 36,94 % (n=111) (Iraqui H. H .2006).
La circulation du VWN a été signalée chez des oiseaux sauvages comme les merles noires (Merulas Turdus), les moineaux (Passer domesticus) et les bouscarles de Cetti (Cettia Cetti)) au nord de Kénitra en 2008 (Figuerola et al., 2008)
Dans le cadre de la recherche du VWN dans l‘avifaune du Maroc, Le VWN a été détecté aussi dans les organes de 2 cormorans (famille des Phalacrocoracidés) originaires des régions de Boujdour et Dakhla (El Kerfaz, 2008). Ces provinces représentent des sites de halte sur le trajet migratoire des oiseaux sur la côte Atlantique
Chez l‘homme, en plus de la mort d'un personne, qui a été attribué à la maladie en 1996 (El Harrak et al., 1997), la preuve de la circulation virale chez l'homme a été établie en 2011 par la détection d‘anticorps séroneutralisants chez 59 personnes parmi 499 (11,8%) vivant dans les alentours de Meknès (4,7% (n=150)) , Rabat (12% (n=200)) et Kénitra (18,8% (n=149)) (El Rhaffouli et al., 2012).
Par ailleurs, une enquête sérologique chez le dromadaire a été menée sur 1392 sérums pour étudier la prévalence en anticorps dirigés contre certaines maladies virales dont la FWN entre 2003 et 2009 sur différents sites au sud du Maroc a montré que non seulement le dromadaire présentait les anticorps anti-VWN mais aussi que la séroprévalence des AC dirigés contre le VWN a augmenté au cours de cette période de 10 à 13% (Touil et al., 2012).
II.
Etude du virus West Nile :
1. Classification :
Le VWN est un virus enveloppé à ARN simple brin de polarité positive, appartenant au genre Flavivirus et à la famille des Flaviviridae. Ce genre regroupe de nombreux agents pathogènes importants pour l‘homme et transmis par des arthropodes, tels que les virus de l‘encéphalite japonaise, de la dengue, de la fièvre jaune ou de l'encéphalite à tiques. Pour les Flavivirus transmis par les moustiques, 7 sérogroupes ont été identifiés sur la base des réactions croisées observées au cours des tests d'inhibition de l'hémagglutination. Le VWN appartient au séro-complexe de l‘encéphalite japonaise, comprenant également le virus de l‘Encéphalite Japonaise (JE), le virus de l‘Encéphalite de la Murray Valley (MVE), le virus de l‘Encéphalite de Saint Louis (SLE), les virus Usutu (USU), Koutango (KOU), Cacipacore (CPC) et Yaounde (YAO).
2. Structure et génome :
En microscopie électronique, le VWN apparaît comme un virus à la surface irrégulière.C‘est t un virus enveloppé, d'environ 40-45 nm de diamètre, de forme sphérique ( Figure 3). Tout comme les autres flavivirus Le génome consiste en un ARN+ monocaténaire qui se situe dans une
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nucléocapside (protéine C) à symétrie icosaédrique. Deux protéines de surface sont enchâssées dans la bicouche lipidique de l'enveloppe : la protéine d'enveloppe virale E et la protéine de membrane M..
Figure 3: Apparence du virus West Nile en microscopie électronique (Source : Site internet Bioquest: Community Resources for problem solving in biology)
Figure 4: Structure VWN
(Source: Microbe http://viralzone.expasy.org/all_by_species/24.html)
La taille de cet ARN génomique est de 11300 nt (ou Il, 3 kb.) et il code pour 10 protéines virales. Les virions contiennent trois protéines qui sont codées à partir de l'extrémité 5' du génome et les sept autres protéines, qui sont non structurales, sont codées à partir de l'extrémité 3'.
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Figure 5: Structure du génome du virus
(Source : http://viralzone.expasy.org/all_by_species/24.html)
Les trois protéines structurales sont celles de la nucléocapside (C), celle d'un précurseur de protéines transmembranaires (prM) et celle des spicules glycoprotéiques de surface (E). (figure 5).
La protéine de capside (C) est une protéine hautement basique de 11 kDa (Lindenbach et al., 2007). Les résidus chargés sont situés dans les régions N- et C-terminales, séparées par une région interne hydrophobe impliquée dans la structuration de la capside (Ma et al., 2004). Le domaine C-terminal hydrophobe sert de peptide signal pour la translocation au réticulum endoplasmique (RE) de la protéine de membrane (M). Ce domaine est clivé de la protéine de capside mature par la serine protéase virale (NS3) (Lobigs et al., 1993). Il n‘est pas encore bien établi comment les dimères de C sont organisés au sein de la nucléocapside.
De nombreuses propriétés biologiques des Flavivirus, telles que le tropisme, l‘attachement et la fusion cellulaire, la virulence, l‘hémagglutination et l‘antigénicité sont associées à la protéine d‘enveloppe E. En effet, la protéine d‘enveloppe est la plus immunogène et induit la majorité des anticorps neutralisants (Sanchez et al.,.2005). Elle est constituée de trois domaines structuraux, parmi lesquels le domaine III est le plus immunogène. (Figure 6)
Figure 6: Représentation de la structure de la protéine d‘enveloppe (Forme homodimérique présente à la surface des particules virales matures)
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La figure montre une vue par-dessus et de côté de la protéine. La protéine d‘enveloppe possède trois domaines dont le peptide de fusion.
Les sept protéines non structurales, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B et NS5, varient selon leur poids, leur taille et leur fonction :
-NS1 n'a pas un rôle exact dans l'assemblage de virion mais elle aiderait dans le processus de réplication (Westaway E.G et al., 2002).
-NS2A, NS2B, NS4A, NS4B et inhibent la réponse immunitaire fuser contre l'infection virale dans le corps (Liu W.J.et al., 2004.)
- La protéine NS3: elle a des fonctions d'hélicase, de protéase et elle participe également au complexe de l‘ARN polymérase.
-La protéine NS5: il s'agit de l‘ARN polymérase, qui joue un rôle important dans la réplication virale (Fenner et al., 1993).
Les régions non-codantes (NC) se trouvent aux extrémités 5‘ et 3‘ possèdent une coiffe m7GpppA
qui est reconnue par la protéine cytoplasmique eIF4B (Facteur eucaryotique d‘initiation à la traduction) (Chui et al., 2005; Clyde et Harris, 2006). Ce complexe recrute la petite sous-unité ribosomale pour la traduction de la polyprotéine virale.
Les régions 3‘ non codante possède une structure en épingle à cheveux hautement conservée qui sert de promoteur de synthèse du brin ARN positif (+) (Shi et al., 1996), ainsi qu‘une séquence de cyclisation. Cette séquence induit l‘interaction entre les parties 5‘ et 3‘ du génome virale, ce qui est nécessaire pour la réplication (khromykh et al., 2009a ; Thurner et al., 2004 ; You et Padmanbhan, 1999).
3. Caractères physico-chimiques :
A l‘instar des autres Flavivirus, le VWN est peu stable dans l'environnement et il est facilement inactivé par la chaleur, par la lumière et par des désinfectants contenant des détergents ou des solvants lipidiques, c'est-à-dire tous les désinfectants communs. Les prélèvements organiques susceptibles de le contenir doivent être conservés à -70°C (Fenner et al., 1993).
4. Diversité et virulence :
Les relations antigéniques entre les Flavivirus ont été étudiées en utilisant les testsd‘inhibition de l‘hémagglutination et de séroneutralisation. Les études sur les anticorps monoclonaux ont révélé la complexité des relations entre les virus, montrant l‘existence de groupes de Flavivirus, sous-groupes, sérocomplexes avec des déterminants antigéniques spécifiques de type et de souche.
L‘identification et la classification de différentes souches de VWN ont été réalisées en utilisant les tests de séroneutralisation et d‘immunofluorescence indirecte, mais l‘analyse de la séquence nucléotidique du génome viral (à partir des gènes codant les protéines E ou NS5, ou le génome viral complet) a permis d‘identifier plus clairement les relations/distances entre les souches virales et de définir la notion de lignage de virus (avec des différences nucléotidiques d‘au moins 20-30% entre lignages (Castillo-Olivares, 2004).
Ainsi , des analyses phylogénétiques basées sur l'analyse des séquences nucléotidiques d'un fragment de 255 pb du gène codant pour la glycoprotéine E, ont montré que les isolats du VWN de différentes régions géographiques sont classés en deux lignages majeures (1 et 2), présentant 25 à 30% de différences nucléotidiques (Berthet et al., 1997; Lanciotti et al., 2002) et en plusieurs sous-clades ou clusters (Berthet etal., 1997; Lanciotti et al., 1999; Savage et al., 1999; Scherret et al., 2001; Charrel et al., 2003).
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Figure 7: Arbre phylogénétique du VWN. (Elena S et al. , 2009).
La barre d‘échelle indique le nombre de sibstitutions de base par site. Tous les isolats appartiennent à 1a lignée 1, sauf Kunjin (outgroup) qui appartient au 1b. (b) Détails de l‘arbre phylogénétique montre
(a), dans lequel la branche comprenant tous les isolats de la Méditerranée occidentales
Le lignage 1 regroupe des souches qui circulent en Afrique de l'Ouest, Moyen Orient, Europe de l'Est, Amérique du Nord et Australie. Le lignage 2 a une répartition géographique restreinte; il circule en Afrique sub-saharienne et Madagascar. Récemment, il a été retrouvé en Europe et plus précisément, en Hongrie, en Grèce et en Italie (Bakonyi et al., 2006; Bagnarelli et al., 20 11; Papa et al., 2011). D'autres souches du VWN ont été isolées et présentent des différences génétiques considérables par rapport aux deux lignages 1 et 2 (Lvov et al., 2004); le lignage 3 inclût le virus Rabensburg isolé en République Tchèque en 1997 (Bakonyi et al., 2005), le lignage 4 est représenté
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par une seule souche isolée en Russie (Bakonyi et al., 2005) et le lignage 5 correspond à une souche isolée en Inde en 1980 (Bondre et al., 2007).
Les souches de virus sont nommées avec les règles suivantes : des lettres correspondant au lieu où la souche a été isolée. (Exemple, It=Italie, Ro=Roumanie, Ken=Kenya, Tu=Tunisie, Hu=Hongrie, NY=New York, Is=Israël, Tx=Texas, Eg=Egypte,Chin=Chine, Ind=Inde, Rus=Russie, Rab=Rabensburg, Car=République d'Afrique Centrale, SA=Afrique du Sud, Ug=Uganda), 2 numéros correspondant à l'année d'isolement (ex:00=2000, 96=1996) et le numéro d'accès GenBank. Le virus de l'Encéphalite Japonaise (JEV), un Flavivirus proche du West Nile, a été utilisé pour constituer la racine de l'arbre phylogénétique.
Les différentes souches de VWN diffèrent en virulence et en pouvoir neuro-invasif. Etant donné que les souches neuroinvasives appartenaient plutôt au lignage 1, les souches de lignage 2 étaient auparavant considérées comme moins virulentes. Cependant des études récentes ont montré que des souches de lignage 2 très virulentes et neuroinvasives ont été détectées en Afrique du Sud (Venter et Swanepoel, 2010) et qu'elles étaient capables d'induire des signes cliniques chez les chevaux et les humains (Venter et al., 2009). Ces différences de virulence dans les souches circulantes de VWN ont été avancées pour expliquer en partie les situations épidémiologiques différentes entre les Etats-Unis et l'Europe ou l'Amérique Centrale et du Sud, en particulier les souches comportant un résidu proline au niveau d'un acide aminé critique de la protéine non structurale 3 (NS3-249), comme les souches nord-américaines, la souche hongroise de lignage 2 ayant émergé en 2004 (Brault et al., 2007) et la souche ayant sévi en Grèce en 2010 (Papa et al., 2011), pourraient être associées à une virulence accrue pour les oiseaux.
5. Propriétés biologiques : 5.1.Multiplication in vitro :
Le VWN se multiplie bien in vitro et provoque des effets cytopathiques sur de nombreux types de cellules de mammifères: les cellules Véro (Cellules épithéliales extraites du rein de singe vert africain), les cellules BHK-21 (Baby hamster kidney : rein de hamster nouveau-né), les fibroblastes embryonnaires de poussin et de canard et les cellules PS Clone D (Fenner et al., 1993). Ce virus se multiplie également sur des cellules de moustiques mais sans provoquer d'effet cytopathique, ce qui témoigne à la fois, de leur réceptivité et de leur résistance vis-à-vis de ce virus. Les cellules concernées sont les cellules C6/36, dérivées d‘Aedes albopictus et les cellules AP-61, dérivées de Aedes pseudoscutellaris ainsi que des cellules dérivées de Aedes aegypti (Peiris et al., 1994). Le VWN se multiplie aussi sur des cultures de cellules primaires et sur des lignées de cellules humaines et murines appartenant aux lignées des monocytes et macrophages.
5.2. Multiplication in vivo:
La réplication virale se passe dans le cytoplasme de la cellule hôte en étroite association avec le réticulum endoplasmique (Figure 8). Le VWN infectieux s'attache aux cellules susceptibles (monocytes, macrophages, neurones, etc.), puis pénètre dans celle-ci par fusion avec la membrane cytoplasmique de la cellule hôte soit par le dépôt de la nucléocapside dans le cytoplasme ou la formation d'une vésicule (endosome) par l'invagination de la membrane cytoplasmique. Il y a réplication de l‘ARN viral et synthèse des protéines en plusieurs copies par l'utilisation des mécanismes de réplication de la cellule hôte, l‘assemblage et la libération des virus matures de la
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cellule infectée se fait par bourgeonnement. (Gollins et Porte field, 1985). Le virus a un neurotropisme marqué (Burke et al., 2004).
Figure 8: Mode multiplication du VWN
Source http://www.nature.com/nrmicro/journal/v11/n2/fig_tab/nrmicro2950_F1.html
6. Propriétés antigéniques:
6.1. Pouvoir antigénique:
Le pouvoir antigénique est caractérisé par l'existence d'antigènes de groupe communs aux membres du complexe antigénique de l'encéphalite japonaise et d'antigènes spécifiques révélés notamment par des tests d'IHA et de neutralisation.
Comme la grande majorité des arbovirus, le VWN :
Est hémagglutinant et hémadsorbant sur globules rouges de poulet et d'oie, et suscite la formation d'anticorps inhibant l'hémagglutination.
Entraîne la synthèse d'anticorps fixant le complément, après le contact du virus avec un organisme sensible.
Provoque la formation d'anticorps neutralisants permettant les diagnostics sérologiques tardifs par réaction de séroneutralisation sur souris et sur culture cellulaire.
14 6.2. Immunité:
Les réponses humorale (RIMH) et cellulaire (RIMC) assurent une protection contre les diverses infections occasionnées par les flavivirus. Les effecteurs de l'immunité comprennent les lymphocytes T cytotoxiques, les anticorps neutralisants et non neutralisants ainsi que les anticorps à effet cytotoxique (Castillo-Olivares et Wood, 2004).
Pour le VWN, il ressort des études (King et al., 2007) que la RIMH est requise pour éliminer le virus du plasma et prévenir une dissémination future, alors que la RIMC intervient dans la clairance virale des tissus.
a. La réponse immunitaire à médiation humorale:
La réponse humorale est importante dans le contrôle de l'infection virale et de la dissémination. Pour le VWN, le tableau clinique de la maladie est accentué chez une souris à laquelle il manque des cellules de type B fonctionnelles, une situation qui peut être contrecarrée par le transfert passif d'anticorps provenant d'une souris de type sauvage immunisée (Diamond et al., 2003).
Des études sérologiques ont montré que les chevaux infectés naturellement développaient une forte réponse en anticorps neutralisants (Davidson et al., 2005). L‘essentiel de ce contrôle est supporté par les anticorps neutralisants (King et al., 2007), qui reconnaissent des épitopes localisés préférentiellement au niveau de la glycoprotéine virale E. Ces anticorps inhibent l'attachement viral. l'internalisation du virus et la réplication virale (Oliphant et al., 2005).
La protéine non-structurale 1 (NS1) est une protéine sécrétée qui est très conservée parmi les flavivirus. Les anticorps Anti NS1 protègent de la maladie induite par le flavivirus et peuvent être utilisés à des fins prophylactiques et thérapeutiques dans les modèles animaux (Falgout B et al., 1990).
Le mécanisme de protection fait intervenir la fixation du complément sur la partie constante (Fc) de l'anticorps. Un phénomène immunopathologique impliquant la réponse humorale aux flavivirus, connu comme "Antibody-dependant enhancement of infection" ou ADE, peut intervenir. Il se produit lorsque les complexes anticorps-virus sont internalisés dans les cellules via le segment Fragment Constant (Fc) des Immunoglobulines (Peiris et Porterfield 1979).
. Chez la souris, un épitope majeur T332 localisé sur la surface latérale du domaine DIII de la protéine de l‘enveloppe E du VWN joue une rôle majeur dans la réponse neutralisante (Beasley et Barrett, 2002, Oliphant et al., 2005). Chez le cheval, cet épitope joue un rôle important dans la réponse immunitaire mais il n'est pas immunodominant (Sanchez et al., 2007),. Ainsi la réponse en anticorps neutralisants chez le cheval apparaît comme variable et polyclonale, avec des épitopes présents aussi bien sur le domaine DIII de La protéine d‘enveloppe E que sur d'autres protéines.
En ce qui concerne la différence entre la RIMH suite à l'infection par un virus à lignage 1 ou à lignage 2, il a été montré que l'infection expérimentale entraîne une réponse avec un profil en anticorps sériques similaire en utilisant les techniques de séroneutralisation et ELISA. La réponse neutralisante en anticorps médiée par les IgG persiste plus longtemps que la réponse spécifique IgM (Zeller et al., 2004). (Figure 9), il n'y a pas de différence suite à une infection par un virus de lignage 1 ou un virus de lignage 2, puisque les sérums d'animaux infectés présentent une activité neutralisante comparable lors d‘infection par l‘un ou l‘autre lignage (Castillo-Olivares et al., 2011).
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Figure 9 : Cinétique des anticorps anti-VWN (Zeller et al., 2004).
Après inoculation du virus Le temps d‘incubation chez les équidés varie de 3 à 15 jours, une virémie de 6 à 7 jours est suivie d‘une production des IgM au bout de 8 à 10 jours, (Figure 9)
Ils persisteraient moins de 3 mois (Ostlund et al., 2001). Les anticorps IgG, responsables de la mémoire immunitaire, sont produits à partir du dixième jour post-infection.Ils persistent plus d‘une année.
Le rôle de la RIMH est considéré comme important, permettant d'éliminer le virus du sérum. Les caractéristiques précises de cette réponse chez le cheval restent encore à explorer.
b. La réponse immunitaire à médiation cellulaire :
Le VWN induit la production par le SNC d'une chémokine, cytokine dont le rôle principal est l'activation cellulaire et la stimulation de la migration des leucocytes (Burteau et al., 2007) nommée CCL5, qui recrute des lymphocytes T exprimant le récepteur CCL5 ainsi que des macrophages qui ont un effet protecteur dans le SNC aussi bien chez la souris que chez l'humain (Glass et al., 2005). D'autres cytokines telles que IFN-α IFN-β, IFN-ɣ sont également produites (Keller et al., 2006, Liu et al., 2006, Sitati et Diamond, 2006).
La vaccination de chevaux sains avec un virus inactivés induit une réponse antigénique spécifique cellulaire caractérisée par la production par les lymphocytes de CD4+ et CD8+ d'IFN-ɣ, par une prolifération cellulaire et par l'expression d‘IL-4 par les lymphocytes CD4+. En général, les réponses observées étaient augmentées par un rappel vaccinal. réponse lymphocytaires (Davis et al., 2008)
Les lymphocytes CD8+ sont particulièrement importants pour la clairance virale des tissus, le contrôle de l'infection et la prévention de la persistance virale (Shrestaet Diamond, 2004). Les lymphocytes CD4+ jouent un rôle de régulation de l'encéphalite à VWN et également dans la clairance de la maladie. Il semble également qu‘une communication croisée entre les lymphocytes CD4+ et CD8+ soit mise en place. (Burke et al., 2004). Ces réponses modulées par les lymphocytes T, bien qu'elles soient importantes pour la clairance virale, peuvent provoquer également des dommages chez l'hôte infecté. Les mécanismes immunopathologiques médiés par les cellules T contribuent à la maladie et il a été montré que les lymphocytes CD8+ ont à la fois un effet protecteur
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et délétère dans le modèle murin (Wang et al., 2003). Les lymphocytes B semblent également importants (King et al., 2007), mais leur rôle n'est pas encore défini. On peut donc affirmer que les lymphocytes B et T agissent de concert dans le cas d'une infection à VWN.
III. Physiopathologie:
1. Pathogénie:
Lors de la piqure d‘un moustique infecté, le VWN est déposé dans les tissus extravasculaires. La salive des moustiques contiendrait des composants (protéines) qui modulent les premières étapes de l‘infection en altérant la réponse immunitaire au site de piqure de l‘hôte. Au lieu d‘une dissémination rapide du VWN dans le courant sanguin, le VWN se développe d‘abord dans les tissus sous-cutanés spécifiquement dans les cellules de Langherhans (CL), les CL infectées migrent vers les nodules lymphatiques via les canaux lymphatiques pour atteindre le courant sanguin. La réplication virale est observée au bout de 12 à 24 heures dans les tissus lymphoïdes secondaires
La virémie primaire donne lieu à l‘infection des leucocytes et des tissus tels que la rate, le foie et les reins. La réplication virale dans les leucocytes infectés, les transforme en réservoir du virus et agissent par conséquent comme un cheval de Troie.Le pic de virémie est observé 4 à 6 jours après l‘infection
Des capteurs viraux (comme la TLR3) reconnaissentt le VWN et initient la production des métalloproteinases comme la MMP9, et les cytokines, comme la TNFα, qui sont connues toutes les deux le pouvoir d‘augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique et par conséquent de faciliter la dissémination du virus dans le cerveau. Les cellules microgliales répondent par la libération des médiateurs pro-inflammatoires qui causent des lésions létales des neurones. Ces médiateurs causent aussi une altération de la barrière hémato-encéphalique.LeVWN est détecté dans plusieurs sites du cerveau et les parties inférieures et supérieures de la moelle épinière, 4 jours après l‘inoculation. Cette neuro-invasion et la neuro-virulence facilitées par la protéine E de l‘enveloppe du virus causent une encéphalo-myélite aiguë et souvent fatale au bout de 9 à 10 jours post-infection (Chambers et Diamond, 2003).
2. Symptômes cliniques :
Tous les flavivirus appartenant au même sérocomplexe dit de l‘encéphalite japonaise y compris le VWN sont connus cliniquement par une forte fièvre et surtout des atteintes neurologiques. La symptomatologie varie selon les parties du système nerveux touchées : méninges, cerveau et moelle épinière. Les principales manifestations sont l‘altération de l‘état de conscience, la paralysie flasque et les troubles moteurs (Salomon, 2004).
2.1.Chez le cheval :
Chez le cheval, la virémie est faible et limitée, alors que la période d‘incubation est en général de trois à six jours, mais dans certains cas peut atteindre jusqu'à quinze jours (Flinois, 2000). Dans de nombreux cas, la contamination par un moustique infecté ne se traduira par aucun signe clinique mais uniquement par une séroconversion. Ce n‘est que lorsque le virus atteint le système nerveux central que les signes cliniques vont se manifester. Il semble que de nombreux facteurs conditionnent l‘intensité du tableau clinique tels que l‘âge, le mode d‘élevage, l‘état d‘entretien, la virulence de la
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souche virale, la susceptibilité génétique de l‘hôte et les infections antérieures par d‘autres Flavivirus (Zientara et al., 2004 ; Steinman et al., 2002). Par conséquent, la symptomatologie chez le cheval varie d‘une forme asymptomatique à une méningo-encéphalite mortelle en passant par un simple syndrome grippal.
Forme aiguë neurologique typique:
Cette forme évolue en plusieurs périodes: l‘incubation est en général de 3 à 6 jours pouvant atteindre 15 jours. Le tableau clinique comprend une fièvre biphasique, qui évolue sur deux ou trois semaines: le premier pic thermique est suivi d‘une réemission de quelques jours avant l‘apparition d‘un deuxième pic thermique. Ce dernier correspond à la phase d‘état de la maladie, c‘est-à-dire à la localisation névraxique du virus. On peut observer alors des symtomes liés à l‘atteinte de la moelle épiniaire, l‘encéphale ou des deux:
L‘atteinte de la moelle épinaire donne lieu à un syndrome de type myélitique, qui se caractérise surtout par une incoordination motrice et la parésie du train postérieur, ce qui attire l‘attention du propriétaire de l‘animal. Il présente alors une démarche ébrieuse et lourde, avec trébuchements, ataxie, des déplacements en rond difficiles et une faiblesse des membres, l‘examen des réflexes montre des perturbations importantes: la sensibilité cutanée est particulièrement ou totalement abolie, l‘animal ne réagissant plus à la piqure, que celle-ci soit superficielle ou profonde, et cela dans les parties postérieurs du corps. De même, les réflexes tendineux des membres postérieurs sont négatifs et les réflexes sphinctériens sont diminués. Ces signes nerveux évoluent vers la paralysie et sont parfois accompagnés d‘amaurose. Après un décubitus de quelques jours, le cheval peut mourir ou simplement guérir, avec ou sans séquelles (Flinois, 2000).
L‘extension de l‘infection au cerveau donne lieu à un syndrome encéphalomyélitique: les signes nerveux apparaissent dès le début, avec vacillements du train postérieur, le cheval peut tomber dès qu‘il doit tourner et il est souvent ataxique. Cette période dure entre 2 et 4 jours et cela sans signes généraux importants. L‘appétit reste normal, l‘hyperthermie peut être très forte. L‗atteinte encéphalitique se manifeste parfois par l‘agressivité et l‘hyperexcitabilité chez certains sujets ou l‘abattement et la dépression chez d‘autres. Les organes des sens sont généralement atteints: des signes de surdité apparaissent parfois, ainsi que des troubles visuels (amaurose plus ou moins complète). L‘examen ophtalmologique révèle une mydriase, une opacification du milieu de l‘œil et un tapis sombre gris et des vaisseaux mal délimités. Le reflexe d‘occlusion palpébral, parfois supprimé, est lent et incomplet, de même que le réflexe photomoteur. De plus des déviations ou des paralysies unilatérales de la tête, avec ptose palpébrale marquée peuvent être observées.
Même à ce stade les signes généraux restent discrets avec une faible hyperthermie et un appétit conservé. Cependant, pendant les périodes chaudes, l‘hyperthermie peut être très importante; elle est accompagnée d‘un ictère franc ou d‘un subictère, très visible sur les muqueuses oculaires.
Cette phase d‘état dure de 4 à 6 jours en moyenne. Alors que la phase terminale présente une évolution très variable: l‘animal est en parésie complète, après un coma, il survit avec des séquelles qui nécessitent en général l‘abattage (Flinois, 2000).
Il est a retenir que la présentation clinique de la forme nerveuse varie d‘un animal à l‘autre et pendant la progression de la maladie.En fonction de facteurs tels que l‘âge, la méthode d‘élevage, les
