Étude comparative de trois techniques de génotypage de la protéase et de la transcriptase inverse du VIH-1

Texte intégral

(1)Université de Picardie Jules Verne U.F.R. DE MEDECINE D'AMIENS Année 2016 Thèse 2016 - 44 MEMOIRE POUR LE DIPLOME D’ETUDE SPECIALISEES DE BIOLOGIE MEDICALE. THESE EN VUE DU DIPLOME D’ETAT DE DOCTEUR EN MEDECINE. Etude comparative de trois techniques de génotypage de la protéase et de la transcriptase inverse du VIH-1. Présentée et soutenue publiquement Le mardi 10 Mai 2016 Par Madame Victoria BOURDREL. Président du jury : Monsieur le Professeur Jean-Luc SCHMIT Membres du Jury : Madame le Professeur Anne TOTET Monsieur le Professeur Pascal SONNET Monsieur le Docteur Etienne BROCHOT Directeur de thèse : Madame le Professeur Sandrine CASTELAIN . .

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(3) Remerciements : A mon président de jury:. Monsieur le Professeur Jean-Luc SCHMIT, Professeur des Universités-Praticien Hospitalier (Maladies infectieuses et tropicales) Responsable du service des maladies infectieuses et tropicales Pôle "Médico-chirurgical digestif, rénal, infectieux, médecine interne et endocrinologie" (D.R.I.M.E) Chevalier dans l’Ordre des Palmes Académiques. Je tiens à vous remercier de m'avoir fait l'honneur de présider ce jury de thèse. Veuillez trouver ici l'expression de mes sincères remerciements et de mon plus grand respect.. . 3 .

(4) A mon jury:. Madame le Professeur Anne TOTET, Professeur des Universités-Praticien Hospitalier (Parasitologie et mycologie) Chef de service du laboratoire de Parasitologie et Mycologie médicales Pôle biologie, pharmacie et santé des populations. Vous m'avez fait l'honneur de siéger parmi les membres du jury. Soyez assurée de toute ma considération.. . 4 .

(5) A mon directeur de thèse:. Madame le Professeur Sandrine CASTELAIN, Professeur des Universités – Praticien Hospitalier (Bactériologie, virologie-hygiène hospitalière) Laboratoire de Bactériologie et Virologie Pôle biologie, pharmacie et santé des populations. Je tiens à vous exprimer ma profonde reconnaissance pour la confiance que vous m'avez accordée en acceptant d'encadrer ce travail doctoral, pour vos multiples conseils, votre grande disponibilité, et toutes les heures que vous avez consacrées à diriger ce travail. Veuillez trouver ici l'expression de ma profonde gratitude.. . 5 .

(6) A mon jury:. Monsieur le Professeur Pascal SONNET, Professeur des Universités Laboratoire de Glycochimie, des Antimicrobiens et des Agroressources (Pharmacie). Vous avez accepté d'être membre du jury de cette thèse. Soyez assuré de mon profond respect et de ma reconnaissance.. . 6 .

(7) A mon jury:. Monsieur le Docteur Etienne BROCHOT, Maître de Conférences des Universités-Praticien hospitalier (Virologie) Laboratoire de Virologie Pôle biologie, pharmacie et santé des populations. Je te remercie vivement pour l'honneur que tu me fais en acceptant de participer à mon jury. Sois assuré de mon amitié sincère.. . 7 .

(8) A Madame le Docteur Catherine ROUSSEL, Je t'adresse mes chaleureux remerciements pour m'avoir confié ce projet de thèse, pour tes conseils avisés, et ta grande disponibilité. Reçois ici le témoignage de ma profonde gratitude. A l'ensemble du laboratoire de virologie, J'adresse mes sincères remerciements à tous les techniciens de virologie pour leur accueil chaleureux, leur aide, leurs locaux, et leur grande disponibilité. Merci d'avoir pris le temps de répondre à mes nombreuses questions. A l'ensemble du laboratoire de biologie moléculaire, Je désire aussi remercier les techniciens de biologie moléculaire pour leur gentillesse et leur disponibilité. A ma famille, A toi maman qui a supporté mes sauts d'humeur au moment des examens et qui a toujours été présente lorsque j'en avais besoin. Papa et toi, vous avez fait de moi ce que je suis. Merci A papa, lorsque je suis née, ton laboratoire était tout petit. Tu avais cette envie de réussir, de toujours faire mieux et de toujours progresser. Tu nous as donné l'exemple de ta volonté et de ton courage. Nos projets se réalisent, je vais essayer de prolonger ton œuvre. Merci d'avoir veillé sur moi et de m'avoir guidée. A Edouard, mon grand frère, merci d'avoir toujours été là pour moi. A Titi et Piapia, vous aussi vous avez contribué à ce que je suis devenue par votre présence, votre écoute, votre disponibilité et tous ces moments inoubliables passés chez vous. A Guillaume, merci pour ta patience, ta présence et ton aide. A ma tante, à mes cousins, à mes petits cousins, à toutes nos vacances partagées. A mes co-internes, merci pour votre patience, et pour toute l'aide que vous m'avez apportée, notamment vos nombreuses heures de relecture et de dépannage informatique. A mes amis pour votre sincère amitié et votre confiance. A toutes les personnes qui m'ont aidée et soutenue. . 8 .

(9) Table des matières : Remerciements ............................................................................................................. p. 2 Table des matières ...................................................................................................... p. 8 Lexique ............................................................................................................................ p. 11 Introduction .................................................................................................................. p. 13 I). II). III). IV). Généralités sur le Virus de l'Immunodéficience Humaine (VIH) ............. A. Epidémiologie de l’infection par le VIH .............................................. B. Caractéristiques du virus ....................................................................... C. Cycle réplicatif ...................................................................................... D. Physiologie de l’infection à VIH .......................................................... E. Tropisme du VIH-1 ............................................................................... Différentes classes thérapeutiques ................................................................. A. INTIs .................................................................................................... B. INNTIs ................................................................................................. C. IPs ........................................................................................................ D. Inhibiteur de fusion .............................................................................. E. Inhibiteurs de l’intégrase ..................................................................... F. Antagoniste des CCR5 ......................................................................... Mécanismes de résistance liés aux IPs, INTIs et INNTIs ............................ A. Mécanismes de résistance aux INTIs .................................................. B. Mécanisme de résistance aux INNTIs ................................................. C. Mécanismes de résistance aux IPs ....................................................... Méthodes d’évaluation des résistances aux ARVs ....................................... A. Tests phénotypiques ............................................................................ B. Tests génotypiques ............................................................................... p. 13 p. 13 p. 14 p. 17 p. 19 p. 20 p. 21 p. 21 p. 22 p. 22 p. 22 p. 23 p. 23 p. 23 p. 24 p. 24 p. 24 p. 24 p. 25 p. 25. Objectif de l’étude ....................................................................................................... p. 26 Matériel et méthodes .................................................................................................. p. 27 I) II) III). IV). V) . Patients ............................................................................................................ Extraction des acides nucléiques ................................................................... Amplification et séquençage par la technique Trugene™ .......................... A. Transcription inverse et PCR ............................................................... B. Séquençage (= Réaction CLIP) ........................................................... C. Interprétation ....................................................................................... Amplification et Séquençage par la technique ViroSeq™ ......................... A. Transcriptase inverse ........................................................................... B. Addition du mix de PCR ..................................................................... C. Dépôt et migration des produits de la Nested PCR sur gel d’agarose . 1) Préparation du gel 1% ................................................................ 2) Dépôt et migration des produits ................................................. D. Purification des produits de PCR ......................................................... E. Réaction de séquence ........................................................................... F. Purification des ADN marqués ............................................................ G. Séquençage et analyse des résultats ..................................................... Amplification et séquençage par la technique ANRS ................................. A. RT-PCR ................................................................................................ p. 27 p. 27 p. 28 p. 28 p. 29 p. 29 p. 30 p. 30 p. 30 p. 31 p. 31 p. 31 p. 32 p. 32 p. 33 p. 33 p. 34 p. 34 9 .

(10) VI). B. Nested PCR ou PCR nichée ................................................................. C. Dépôt et migration des produits de la Nested PCR sur gel d’agarose . D. Purification des produits de PCR ......................................................... E. Réaction de séquence ........................................................................... F. Purification des ADN marqués ............................................................ G. Séquençage .......................................................................................... H. Alignement des séquences ................................................................... Interprétation des résultats ............................................................................ p. 35 p. 35 p. 36 p. 36 p. 37 p. 37 p. 37 p. 37. Résultats ......................................................................................................................... p. 38 I). II) III). Caractéristiques des patients et des souches analysées ............................... p. 38 A. Age et sexe ........................................................................................... p. 38 B. Nature des prélèvements ...................................................................... p. 39 C. Charge virale et sous-type viral ........................................................... p. 39 D. Notion de traitement ............................................................................. p. 40 Comparaison des trois techniques ................................................................ p. 41 A. Technique Trugene™ .......................................................................... p. 41 B. Technique ViroSeq™ .......................................................................... p. 42 Analyse comparative des séquences .............................................................. p. 42 A. Etape d’amplification .......................................................................... p. 43 1) Protéase ...................................................................................... p. 43 2) Transcriptase inverse .................................................................. p. 43 B. Analyse des séquences ......................................................................... p. 43 1) Etude de la variabilité sur le gène de la protéase ....................... p. 44 a- Comparaison ANRS/Trugene™/ViroSeq™ ........................ p. 44 b- Comparaison ANRS/Trugene™ .......................................... p. 44 c- Comparaison ANRS/ViroSeq™ .......................................... p. 44 2) Etude de la variabilité sur le gène de la transcriptase inverse .... p. 45 a- Comparaison ANRS/Trugene™/ViroSeq™ ........................ p. 45 b- Comparaison ANRS/Trugene™ .......................................... p. 45 c- Comparaison ANRS/ViroSeq™ .......................................... p. 45 C. Etude des mutations ............................................................................. p. 46 1) Mutations discordantes sur le gène de la protéase ..................... p. 46 a- Discordance entre les techniques ANRS/Trugene™/ViroSeq™ .............................................................................................. p. 47 b- Discordance entre les techniques ANRS/Trugene™ .......... p. 47 c- Discordance entre les techniques ANRS/ViroSeq™ .......... p. 47 2) Mutations discordantes sur le gène de la transcriptase inverse ... p. 48 a- Discordance entre les techniques ANRS/Trugene™ ........... p. 48 b- Discordance entre les techniques ANRS/ViroSeq™ ........... p. 49 D. Résistance aux traitements ................................................................... p. 50 1) Gène de la Protéase .................................................................... p. 50 2) Gène de la Transcriptase inverse ................................................ p. 50. Discussion ....................................................................................................................... p. 53 I). . Critères techniques ........................................................................................ A. Coût des réactifs .................................................................................. B. Durée d'exécution / Risques de contamination .................................... C. Modalités d'accréditation COFRAC .................................................... D. Taux d'échec ......................................................................................... p. 53 p. 53 p. 54 p. 54 p. 55 10 .

(11) II). III) IV). Critères interprétatifs .................................................................................. A. Concordance sur la protéase ................................................................ B. Concordance sur la RT ........................................................................ C. Retentissement sur la prise en charge thérapeutique ........................... Intérêt des nouvelles technologies de séquençage ...................................... Intérêt de la quantification de l'ADN proviral ........................................... p. 56 p. 56 p. 57 p. 57 p. 57 p. 58. Conclusion ..................................................................................................................... p. 59 Bibliographie ................................................................................................................. p. 60 Annexes ........................................................................................................................... p. 66 01: Les différentes molécules ARVs .................................................................................. 02 : Tableau d’interprétation de l’ANRS (Septembre 2014, version 24) ........................... 03 : Caractéristiques des patients ....................................................................................... 04 : Modèle de rendu électrophorégramme ........................................................................ 05 : Modèle de rendu Trugene™ ....................................................................................... 06 : Modèle de rendu ViroSeq™ ....................................................................................... 07 : Modèle de rendu ANRS .............................................................................................. 08 : Alignement des séquences de la protéase ................................................................... 09 : Alignement des séquences de la transcriptase inverse ................................................. p. 66 p. 67 p. 69 p. 71 p. 71 p. 72 p. 73 p. 74 p. 75. Résumé ............................................................................................................................ p. 77. . 11 .

(12) Lexique : 3TC = Lamivudine ABC = Abacavir AA = Acide Aminé ADN = Acide DésoxyriboNucléique ADNc = Acide DésoxyriboNucléique complémentaire ANRS = Agence Nationale de Recherche sur le Sida et les hépatites virales ARN = Acide RiboNucléique ARV = Antirétroviral ATP = Adénosine Triphosphate ATV = Atazanavir CA = Capside CCR5 = C-C Chemokine receptor type 5 CE = Conforme aux Exigences CHU = Centre Hospitalier Universitaire CI = Concentration inhibitrice CRF = Circulating Recombinant Form CTL = Lymphocyte T Cytotoxique CV = Charge Virale CXCR4 = C-X-C Chemokine receptor type 4 d4T = Stavudine ddl = Didanosine dNTP = déoxynucléotide triphosphate DRV = Darunavir DTG = Dolutégravir DTT = didéoxynucléotide triphosphate Ech = Echantillon EFV = Efavirenz Env = Enveloppe ESCRT = Endosomal Sorting Complex Required for Transport ETR = Etravirine EVG = Elvitégravir FPV = Fosamprenavir FTC = Emtricitabine Gag = Group specific antigen Gp = Glycoprotéine HAS = Haute Autorité de Santé HT = Hors Taxe HTLV = Virus T Lymphotropique Humain IDV = Indinavir INNTI = Inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse INTI = Inhibiteurs nucléosidiques/nucléotidique de la transcriptase inverse IP= Inhibitor Protease LCR = Liquide Céphalo-Rachidien LPV = Lopinavir LT = Lymphocyte T LTR = Long Terminal Repeat MA = Matrice MuLV RT = Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase MVC = Maraviroc NC = Nucleocapside Nef = Negative regulation factor . 12 .

(13) NFV = Nelfinavir NGS = Next Generation Sequencing NSI = Non-Syncytium Inducing NVP = Nevirapine PCR = Polymerase Chain Reaction PM = Poids Moléculaire Pol = Polymérase RAL = Raltégravir Rev = Regulator of Viral Expression RPV = Rilpivirine RT-PCR = Reverse transcription Polymerase Chain Reaction RTV = Ritonavir SI = Syncytium Inducing SIDA = Syndrome d’Immunodéficience Acquise SIV = Simian Immunodeficiency Virus SQV = Saquinavir TAM = Thymidine Analog Mutations Tat = HIV trans-activator Tampon TBE = Tampon Tris, Borate, EDTA TDF = Tenofovir TI = Transcriptase Inverse TPV = Tipranavir UV = Ultra-violet VHB = Virus de l’Hépatite B VHC = Virus de l’Hépatite C Vif = Viral Infectivity Factor VIH = Virus de l’Immunodéficience Humaine Vpr = Viral Protein R Vpu = Viral Protein U ZDV = Zidovudine. . 13 .

(14) Introduction : I). Généralités sur le Virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH) : A. Epidémiologie de l’infection par le VIH: Après la découverte des premiers cas de patients présentant une immunodéficience. associée à des infections opportunistes en Juin 1981 aux Etats Unis, l’infection s’est ensuite largement répandue sur l’ensemble des continents africain, asiatique [1], américain ainsi qu’en Europe [2]. Des travaux ont montré que l’infection par le VIH était déjà présente en Afrique centrale à la fin des années 70 et début des années 80 notamment chez les femmes prostituées de Nairobi (Kenya) [3]. L’épidémie africaine s'est ensuite complexifiée par la découverte d’un second virus le VIH-2, les premiers cas ayant été rapportés en Afrique de l’Ouest en 1986 [4]. Les premières personnes touchées étaient les homosexuels masculins à partenaires multiples. D’autres populations infectées ont ensuite été identifiées chez les hétérosexuels, les patients hémophiles, les patients transfusés, les usagers de drogue intraveineuse, les personnels exposés au sang, et les enfants nés de mères séropositives [5]. Il a alors été établi que la contamination se faisait essentiellement par voie sanguine et sexuelle. La voie de contamination la plus fréquente reste sexuelle, les relations hétérosexuelles correspondent à environ 70% des contaminations par le VIH-1 dans le monde [6]. Néanmoins les relations homosexuelles chez les hommes exposent plus à un risque de transmission que lors de relations hétérosexuelles [7]. La contamination materno-fœtale a également été documentée au cours de la grossesse, lors de l’accouchement et pendant l’allaitement. Au cours des années 80, une étude a montré un risque de transmission de 21% d’une mère infectée vers son enfant au cours de la période périnatale [8]. La prolongation de l’allaitement maternel augmentait le risque de 14% [9], résultant d’un risque global de transmission de 30-45% [10]. La prévention de la transmission materno-fœtale, a été dès lors un véritable enjeu de santé publique.. . 14 .

(15) Parallèlement, la transmission sanguine par voie percutanée, principalement rencontrée chez les usagers de drogue intraveineuse reste un mode de contamination majeur, notamment dans certaines régions telles que l’Europe du Sud, l’Europe de l’Est et le Sud et Sud-Est asiatique [11]. Grâce à la mise en place des dépistages systématiques des anticorps anti-VIH dès 1985 [12], les transmissions par transfusion ont été drastiquement diminuées et sont devenues très rares aujourd’hui. La transmission dépend principalement de la charge virale dans le sang et les secrétions génitales du sujet source [13]. En 2014, on comptait environ 36,9 millions de personnes infectées dans le monde, avec 2 millions de nouvelles infections [14]. La région la plus touchée est l’Afrique subsaharienne avec 25,8 millions de personnes atteintes par le VIH. Aujourd’hui, on estime que seulement 51% des personnes infectées par le VIH connaissent leur statut. 15,8 millions de personnes vivant avec le VIH bénéficiaient d’une trithérapie antirétrovirale en juin 2015 [14]. En 2011, on recensait 1,7 million de décès dû au SIDA [15]. En France en 2013, 6 220 personnes ont découvert leur séropositivité VIH, dont 43% d’hommes homosexuels, 37% d’hétérosexuels nés à l’étranger, 18% d’hétérosexuels nés en France et 1% d’usagers de drogues. La part des infections à VIH-2 était de 1,2% et celle des infections à VIH-1 de sous-types non B de 42% [16].. B. Caractéristiques du virus : Le Virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH) est un virus à ARN, enveloppé, appartenant à la famille des Retroviridae, et au groupe des Lentivirus. La particule virale a une taille de 100 nm environ [17].. Figure 1 : Structure du VIH [17].. . 15 .

(16) Le virus présente une grande variabilité génomique avec deux types principaux: - le VIH-1 le plus répandu, est lui-même divisé en 4 groupes [18] [19] : M (majoritaire, divisé en 9 sous-groupes : A, B, C, D, F, G, H, J, K), O (outlier), N (non-M/nonO), et P. Le groupe P est de découverte relativement récente, en 2009 par l’équipe du Pr Plantier à Rouen chez une patiente d’origine Camerounaise. L’origine de ce nouveau groupe P serait probablement liée à un passage du virus SIVGOR du gorille à l’homme, lors de la manipulation de viande de chimpanzés infectés [20]. Le sous-type prédominant en France est le sous-type B, alors que dans le reste du monde, c‘est le sous-type C. Tous les sous-types sont capables de se recombiner, c’est pour cette raison que circule une grande proportion de virus recombinés dans les pays occidentaux de type CRF 02 AG, originaire d’Afrique subsaharienne [21]. - le VIH-2 découvert en 1986 en Afrique de l’Ouest. Les premières transmissions à l’homme seraient liées à un contact par morsure avec des singes en Afrique. Ces animaux étaient préalablement infectés par le SIVs (Simian Immunodeficiency Viruses) appartenant au groupe des Lentivirus. Deux de ces virus auraient ensuite mutés pour donner naissance au VIH, capable d’infecter l’homme. Le VIH-1 est lié au SIVCPZ de certains chimpanzés du Cameroun [22], alors que le VIH-2 serait issu du SIVSM des mangabeys présents en Afrique de l’ouest [23]. Le génome de VIH est complexe ; il est composé de trois gènes principaux :. gag. (protéine de structure), pol (polymérase) et env (enveloppe) et de gènes accessoires (rev, vif, vpr, vpu, et nef). La transcription. de. ses. gènes est régulée par l’activité du LTR (Long Terminal Repeat), où se. Figure 2 : Génome du VIH [24]. . trouvent les sites de liaison des facteurs de transcription.. . 16 .

(17) Gènes. Protéines et fonctions -gp 120 : liaison entre CD4 et le Corécepteur. Enveloppe. env. Group specific antigen. gag. Protéines de structure : p17, p24 et p7. Polymérase. pol. Enzymes : Transcriptase inverse, Intégrase et Protéase. Regulator of Viral Expression. rev. Transport de l’ARN messager du noyau vers le cytoplasme. Viral Infectivity Factor. vif. Liaison de la protéine APOBEC3G empêchant la désamination de l’ADN viral. - gp 41 : fusion des membranes. - Transport de l’ADN viral au noyau Viral Protein R. vpr. - Augmentation de la production virale - Contrôle du cycle cellulaire. Viral Protein U. vpu. Negative Regulation Factor. nef. Diminution de l’expression des CD4 - Augmentation de la réplication virale - Diminution de l’expression des CD4 Table 1 : Régions génomiques du VIH-1.. Le précurseur de la protéine Gag comprend la matrice (MA), la capside (CA), les nucléocapsides (NC), un domaine p6, et 2 peptides SP1 et SP2. Chaque domaine joue un rôle bien particulier : la matrice joue un rôle dans la reconnaissance de la membrane plasmique et dans l’incorporation des glycoprotéines d’enveloppe dans le virion. La capside participe à l’assemblage de Gag, à la formation de la capside, et à la régulation de l’importation de l’ADN viral. SP1 joue aussi un rôle dans l’assemblage de Gag. La nucléocapside participe à l’assemblage de Gag, ainsi qu’à l’encapsidation des ARNs. Le domaine p6 recrute ESCRT (endosomal sorting complex required for transport). Le précurseur Gag est clivé par la protéase pour obtenir la protéine Gag mature composée de MA, !" # $ "CA, % &NC et p6. $3)#456076089:;;& %4<=,>60?:9`4@?6,&60. A0<=,7;>?609:60B=,. /012. /012. "-. "# r9C?89<?,8=<608 r9"=>5,?0=95607608 r9D0E960F;,&;,?<6;0 Protease. . The viral enzyme that cleaves multiple sites in Gag and GagPol during maturation.. Reverse transcriptase The viral enzyme that converts. ()1. ()*. "+, $# r9C?89?GG=>5:+ r9$;,=9H;,>?<6;0 r9.=8I:?<6;09;H90IF:=?,96>&;,<. %$. &'. r9.%#9=0F?&G67?<6;0 r9D($.J9,=F,I6<>=0< r9C?89?GG=>5:+ r9K&,960F;,&;,?<6;0 r9.%#9F@?&=,;0= C?89?GG=>5:+. (KIWTG^!"#$%&'()&('*$"+,$-(+)&./+%0$ !"#$%&'()*+,")-.(,&+/,+&'(.)0.,$'.123)&.4)12"-(.)0.52#.6.12,&"7.89:;<./2=("4. 8>:;<.-+/*')/2=("4.8?>;.2-4.=@.6.2&'.=&'('-,'4.)A'&.2.*"-'2&.4'="/,")-.)0.,$'.52#.=&'/+&()&.=)*B=&),'"-C.D$'.123)&. Figure 3 : Fonction et Structure de Gag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

(18) Le gène d’enveloppe (env) code pour 2 protéines : La gp 120 responsable de l’attachement du virus à la cellule, et la gp 41 nécessaire à la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane plasmique, résultant de l’entrée du virus dans la cellule [25]. Figure 4 : Structure du gène d'enveloppe [25].. Le gène pol code quant à lui pour les enzymes essentielles au cycle viral telles que la transcriptase inverse, l’intégrase et la protéase [26]. . Figure 5 : Structure du gène gag/pol [26]. C. Cycle réplicatif : Le cycle de réplication du VIH-1 se divise en deux grandes phases : une phase précoce, et une phase tardive : La phase précoce commence par l’attachement puis la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane cellulaire de l’hôte grâce à des récepteurs membranaires spécifiques [27]: la protéine d’enveloppe virale gp120 se lie au récepteur primaire CD4 de la cellule hôte entrainant une modification conformationnelle de la gp120 alors capable de se fixer au corécepteur membranaire CXCR4 ou CCR5 [5]. Il s’ensuit un réarrangement de la protéine d’enveloppe virale gp41 qui permet la fusion des membranes virale et cellulaire. Cela permet l’entrée du virus dans la cellule. L’ARN viral sera transformé en ADN proviral par la rétrotranscription dans le cytoplasme grâce à la transcriptase inverse. Celle-ci est fréquemment responsable d’erreurs (1/10 000 copies de virus), d’où la grande variabilité génétique du virus [28]. Vient ensuite la décapsidation du virus, suivi de l’importation de l’ADN proviral dans le. . 18 .

(19) noyau de l’hôte afin que l’ADN viral puisse s’intégrer au génome humain grâce à son intégrase. La phase tardive du cycle fait référence à l’expression des gènes, ainsi qu’à l’assemblage, la maturation et la libération des nouveaux virions [29]. L’ADN proviral est transcrit en ARN messager et en ARN génomique par l’ARN polymérase de la cellule hôte. La traduction de l’ARN messager permet la synthèse des précurseurs des protéines Gag, Pol, de l’enveloppe virale, et des protéines accessoires. Le clivage protéolytique des précurseurs notamment grâce à la protéase virale va permettre l’obtention des protéines matures impliquées dans l’assemblage et l’encapsidation de l’ARN viral, ainsi que l’incorporation des glycoprotéines. d’enveloppe.. Les. nouvelles. particules. virales. seront. libérées. par. bourgeonnement à la surface de la cellule hôte. La réplication virale est intense : 1 à 10 milliards de virions peuvent être produits chaque jour chez une personne non traitée.. Figure 6 : Cycle réplicatif du VIH [30] . . 19 .

(20) D. Physiopathologie de l’infection à VIH : Le. virus. se. réplique. activement dans l’organisme dès la primo-infection.. Il. va. pouvoir. échapper au système immunitaire par intégration de son génome au sein de la cellule hôte. Les cellules cibles du VIH sont les Lymphocytes T CD4 (LT. CD4),. les. macrophages, dendritiques,. monocytes les. les. et. cellules cellules. de. Langerhans, et les cellules de la microglie cérébrale. Figure 7 : Evolution de l’infection au cours du temps [31].. Initialement cette réplication a lieu dans les organes lymphoïdes (tissus lymphoïdes, ganglions). A ce stade l’amplification est modeste, et la diversité du VIH est limitée. Les LT infectés se propagent ensuite dans la circulation sanguine, ce qui résulte d’une amplification virale secondaire massive au niveau du tractus digestif, de la rate et de la moelle osseuse. Cela correspond au pic virémique et se traduit par le début des symptômes cliniques [31]. Cette phase dure quelques semaines. Le risque de transmission est très important en raison de la virémie élevée (106 – 107 copies/mL de plasma). Pendant cette phase le taux de LT CD4 diminue, et il n’y a pas encore de réponse spécifique du système immunitaire contre le VIH. Puis s’enchaine la phase asymptomatique qui peut durer plusieurs années, avec une faible réplication virale. Elle conduit à la sélection de variant échappant aux réponses immunes de l’hôte. Au cours de cette phase, la virémie diminue, et le taux de LT CD4 est stabilisé. Cette phase est caractérisée par la production de LT cytotoxiques CD8+ (CTL), et des anticorps spécifiques dirigés contre le VIH-1. L’histoire naturelle de l’infection se termine par l’entrée en stade SIDA (Syndrome d’Immunodéficience Acquise) du patient infecté. Il y aura une nouvelle ascension de la virémie, et une chute des LT CD4. Les infections opportunistes apparaissent dès la décroissance des LT CD4 sous 200 cellules/mm3. . 20 .

(21) E. Tropisme du VIH-1 : Avant la découverte du rôle des corécepteurs CCR5 et CXCR4 sur l’entrée du VIH dans les cellules cibles, le tropisme était initialement défini par la capacité des virus à induire des syncytia en culture cellulaire MT-2. Les virus produisant des syncytia sont appelés SI (Syncytia Inducing) et les virus dépourvus de cette capacité, NSI (Non Syncytia Inducing). Mais la découverte des corécepteurs d’entrée a apporté un lien entre les caractéristiques cytopathiques et le tropisme cellulaire des différentes souches virales. Les souches SI utilisent généralement le corécepteur CXCR4 et les souches NSI le corécepteur CCR5 [32] [33]. La concordance entre les phénotypes SI et X4 et les phénotypes NSI et R5 est bonne. En revanche, la concordance entre le tropisme lymphocytaire ou macrophagique et les phénotypes SI/NSI ou R5/X4 n’est pas totalement prouvée [34]. Une nouvelle classification est proposée reposant sur la nature du corécepteur utilisé, on distingue : - les virus à tropisme R5 utilisant le corécepteur CCR5, - les virus à tropisme X4 utilisant le corécepteur CXCR4, - les virus à double tropisme R5X4, capables d’utiliser les deux corécepteurs.. Figure 8 : Histoire naturelle des corécepteurs {35}.. Les virus qui utilisent exclusivement CCR5 comme corécepteur d'entrée prédominent au début de l'infection et durant la phase asymptomatique de l’infection. La majorité des patients infectés sont initialement infectés par des souches R5 ce qui suggère un possible avantage de ces souches dans les mécanismes de transmission [36]. Les virus X4 ou R5X4 sont rares au début de la maladie mais apparaissent durant les phases tardives de l’infection chez environ 50 % des patients [37]. L’émergence des virus X4 est associée à la déplétion en LT CD4+ et une progression plus rapide de la maladie [38]. Les virus X4 «purs» sont rares (< 1%), ceci signifie que les virus R5 sont toujours présents même à un stade avancé de la maladie [37].. . 21 .

(22) II). Différentes classes thérapeutiques :. Les traitements antirétroviraux (ARVs) ont pour but de diminuer et de maintenir une charge virale indétectable, de restaurer une défense immunitaire en augmentant le nombre de LT CD4+, d’allonger l’espérance de vie, de diminuer le risque de comorbidités associées au VIH, et donc d’améliorer la qualité de vie des patients, et de réduire le risque de transmission [39]. Il est fortement conseillé d’associer trois ARVs [40] (dont aux moins deux inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (INTIs)) adaptés au génotype de résistance du virus. L’observance thérapeutique est primordiale pour une bonne activité du traitement. Ce traitement doit être maintenu à vie [40]. Il existe beaucoup de drogues ARVs, réparties en différentes classes thérapeutiques (Annexe 01) [41]. A. INTIs : Inhibiteurs nucléosidiques/nucléotidique de la transcriptase inverse : Ils correspondent à la première classe d’ARVs développés. Ils sont actifs sur le VIH-1 et VIH-2. Ce sont des analogues de bases nucléiques. Ce sont des pro-médicaments qui doivent être phosphorylés dans le milieu intracellulaire pour être actifs. Ils pourront ensuite entrer en compétition avec les substrats naturels de la transcriptase inverse, afin d’inhiber l’action de cette dernière. En résumé, ils bloquent la synthèse de l’ADN pro-viral. L’utilisation des premières molécules est restée limitée en raison des nombreux effets indésirables : La zidovudine (ZDV) (analogue de la thymidine) associe une toxicité médullaire (neutropénies, anémies) et des myopathies. La stavudine (d4T) (analogue de la thymidine, et la didanosine (ddl) provoquent des neuropathies périphériques et des pancréatites. Dans certains cas, les effets indésirables peuvent être létaux soit par stéatose hépatique, soit par acidose lactique. Les autres INTIs sont l’abacavir (ABC), le tenofovir (TDF), la lamivudine (3TC) (analogue de la cytidine) et l’emtricitabine (FTC). Ils présentent beaucoup moins d’effets indésirables. Ces traitements sont éliminés par voie rénale. Ils requièrent un dosage régulier pour adapter le traitement à la fonction rénale. Ils ne sont pas administrés en monothérapie.. . 22 .

(23) B. INNTIs : Inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse : Cette classe thérapeutique n’est active que sur le VIH-1. La différence avec les INTIs, c’est qu’ils ne nécessitent pas de phosphorylation intracellulaire pour exercer leur action antivirale. Ce sont des inhibiteurs non compétitifs de la transcriptase inverse. Ils entrainent un changement de conformation qui perturbe le site catalytique de l’enzyme. La sélection de mutants résistants est importante. Leur pharmacocinétique est caractérisée par un métabolisme important du cytochrome p450. Ce sont des inducteurs enzymatiques avec une élimination rénale. Parmi les effets secondaires, on peut noter des éruptions cutanéo-muqueuses, des atteintes hépatiques et certains troubles neurologiques. Les molécules de cette classe sont la névirapine (NVP), l’efavirenz (EFV), l’etravirine (ETR), et la rilpivirine (RPV). C. IPs : Inhibiteurs de la protéase: Les IPs ont une action tardive sur le cycle de réplication du VIH, en entrainant une production de particules virales immatures et non infectieuses. Ils peuvent agir sur le VIH-1 ou le VIH-2 suivant le type de molécules [42]. Ils sont à l’origine de la trithérapie (2 INTIs et 1 IP) et ont permis de modifier considérablement le pronostic de la maladie. Les résistances aux IPs s’observent principalement lors de l’arrêt et à la reprise d’un traitement. Les principaux effets indésirables répertoriés sont des lithiases urinaires, des troubles digestifs, des éruptions cutanées. Les principales molécules sont l’indinavir (IDV), le ritonavir (RTV), le saquinavir (SQV), le nelfinavir (NFV), le fosamprenavir (FPV), le lopinavir (LPV), le tipranavir (TPV), l’atazanavir (ATV) et le darunavir (DRV). Le RTV est souvent associé à une autre molécule anti-protéase. Il sert de booster. D. Inhibiteur de fusion : Cette classe thérapeutique empêche l’entrée du virus dans la cellule LT CD4. La molécule de référence est l’enfuvirtide, encore appelée T-20 [43] [44]. C’est un peptide qui se fixe sur la gp41 et qui empêche la fusion des membranes.. . 23 .

(24) sur le Marché (AMM) ou en Autorisation Temporaire d’Utilisation (ATU) en France, mais la poursuite des recherches pour mettre à disposition de nouvelles molécules reste primordiale. La raison en est doubleþ: l’émergence continue de mutations de résistance du VIH d’une part, les toxicités à E. Inhibiteurs l’intégrase : longde terme des médicaments existants d’autre part, notamment métaboliques et lipodystrophiques. La classe des inhibiteurs d’entrée a été inaugurée par ® l’arrivée sur le marché en 2003 del’insertion l’enfuvirtide du (Fuzeon ), Les inhibiteurs de l’intégrase empêchent matériel inhibiteur de fusion ciblant la gp41. L’inhibition de l’entrée s’étend à de de petites molécules antagonistes dans les cellules hôtes parmaintenant inhibition l’enzyme intégrase.duLe co-récepteur CCR5. On en compte actuellement trois ayant l’elvitegravir (EVG) et fait le dolutegravir (DTG)randomisés ont montré efficacité l’objet d’essais cliniques chez une l’hommeþ: le maraviroc (Celsentri®), qui vient d’obtenir une AMM europeu d’effets indésirablespéenne, [45]. le vicriviroc et l’aplaviroc. Le mode d’action particulier de ces molécules amène à penser de nouvelles modalités d’utilisation et de monitorage et justifie une vigilance soutenue quant :à leur innocuité. F. Antagonistes des CCR5. Chez ces derniers, les doubles populations R souches duales R5/X4 sont beaucoup plus fré contrées que les souches purement X4 [3]. pisme X4, on observe une progression pl maladie et vers le stade Sida [4, 5]. La patients dont le plasma contient des souches à la baisse du taux de lymphocytes CD4 [6].. génétique du virus. 3. Molécules ciblant le CCR5. raltégravir (RAL),. Les bases nécessaires pour le développe nistes du terme, CCR5 reposent à long avec sur la découverte teurs des chimiokines étaient des co-récepte capacité des chimiokines à bloquer l’entrée cellule et l’observation que les patients po CCR5 muté (Delta32) étaient moins susc contaminés par le VIH et présentaient un d‘évolution de la maladie une fois acquise [7 patients hétérozygotes Delta 32 pour le CCR une meilleure réponse virologique sous antir 2. Mécanismes d’entrée du VIH dans la cellule Enfin,la la cellule charge virale est corrélée à la densi Les antagonistes des CCR5 sont des inhibiteurs d’entrée du virus dans [46]. du co-récepteur CCR5 à la surface lymphoc Après la fixation du VIH sur le récepteur CD4, des inteLesde antagonistes CCR5 sont de petites m ractionstrouvons ont lieu entre virus et des co-récepteurs protéi-inhibent Parmi ces molécules nous le leMaraviroc (MVC). Elles façon du non fixent de façon non compétitive sur la partie tra ques, faisant partie de la famille des récepteurs des compétitive le corécepteur CCR5.enL’utilisation préalable ces médicaments nécessite de du co-récepteur et induisent alors une m chimiokines, particulier le CCR5 et le de CXCR4 [1] domaines extracellulaires du co-récepteur (Fig.þ1). L’utilisation préférentielle de l’un ou l’autre des coconnaître le tropisme durécepteurs virus. Il ne le sera possible que (X4). les patients ayant un virus fixation de la gp120 [12]. définit tropisme CCR5de (R5)traiter ou CXCR4 Trois molécules antagonistes du CCR5 o Certaines souches peuvent s’unir aux deux co-récepteurs et avec un tropisme CCR5.sont dites duales (R5/X4), et certains patients sont porteurs des essais cliniques randomisés de phases II de souches virales R5 et X4 (de tropisme mixte R5/X4). – aplaviroc L’association de ces molécules aux autres ARVs a permis d’améliorer la réponse Quel que soit le mode de transmission, les virus R5 sont préMalgré une activité antivirale intéressant férentiellement retrouvés au moment de la primo-infection à GlaxoSmithKline a dû arrêter les essais en antirétrovirale chez les patients en échec thérapeutique. VIH. Ces souches R5 prédominent pendant la plus grande breþ2005, en raison de la constatation de 4 aiguë, certes rares mais parfois graves [13]. – vicriviroc Suite aux premiers essais sur le composé 351125), qui fut le premier antagoniste du C trer une efficacité antirétrovirale chez l’ho avec des doutes sur une bonne tolérance car ratoire Schering-Plough a développé le vicri Lors d’un essai de phase II chez des pat teurs de souches de tropisme CCR5 (R5) re vement 25, 50 et 75þmg administrés en pendant 2 semaines, on observait une réduc de 0,9 à 1,3 log/ml de la charge virale (CV) V au placebo [15]. Le vicriviroc a été également évalué ch prétraités avec un virus de tropisme R5 dans Fig. 1. Fixation du VIH sur la cellule-hôte via le récepteur CD4 et le coFigure 9: Fixation du VIH sur CCR5. la cellule cible via les récepteurs CD4 et les corécepteurs CCR5 [46].à 48 semaines de cet es 5211. Les résultats récepteur randomisé en double aveugle testant 3 doses Fig. 1. Fixation of HIV on the host cell via the CD4 receptor and the CCR5 chez 118 patients, ont été présentés au der coreceptor.. III) Mécanismes de résistance liés aux IPs, INTIs et INNTIs: L’efficacité du traitement ARV dépend de l'émergence de résistances aux différentes molécules antivirales [47]. En cas de résistance aux ARVs, on peut se retrouver face à des échecs thérapeutiques. La mise en route d’un traitement nécessite au préalable, de déterminer par séquençage les possibles mutations de résistance présentes sur le gène de la protéine virale ciblée. Les résistances peuvent s’acquérir au cours d’un traitement prolongé [48] ou se transmettre de novo par une souche déjà mutée lors de la contamination [49].. . 24 .

(25) Les recommandations actuelles [50] préconisent de réaliser un génotypage VIH chez tous les nouveaux patients infectés avant la mise sous traitement, et chez les personnes en échec thérapeutique. Cela permet au clinicien de choisir un traitement optimal pour le patient tout en suivant les recommandations [51]. A. Mécanismes de résistance aux INTIs: Ils existent deux mécanismes de résistance: - Soit la diminution de l’incorporation des nucléotides ou nucléosides artificiels au profit de nucléotides naturels. - Soit l’excision de l’analogue nucléosidique déjà incorporé conférée par des mutations appelées TAM (Thymidine Analog Mutations). Ces mutations favorisent l’accès de l’ATP au site de polymérisation qui réagit avec l’analogue nucléosidique en le détachant de la chaine d’ADN virale en formation. B. Mécanisme de résistance aux INNTIs : La résistance aux INNTIs est conférée par une seule mutation au niveau de la poche hydrophobique étroite et proche du site actif de l’enzyme. Une seule mutation entrainerait une modification conformationelle de la poche hydrophobique, et donc une perte d’affinité avec les INNTIs. C. Mécanismes de résistance aux IPs : Les résistances aux IPs sont liées à des mutations situées au niveau des sites actifs de l’enzyme, ainsi qu’à des mutations sur des sites à distance de ce site. Les mutations des sites actifs sont dites primaires. Elles empêchent la fixation de l’IP au niveau du site actif, alors que les autres mutations sont dites secondaires, et elles renforcent la résistance.. IV) Méthodes d’évaluation des résistances aux ARVs: Il existe 2 types de tests pour évaluer les résistances aux ARVs: les tests phénotypiques, et les tests génotypiques.. . 25 .

(26) A. Tests phénotypiques : Les tests phénotypiques mesurent in vitro les concentrations de la drogue inhibant 50% ou 90% de la réplication virale (CI50, et CI90). Ces tests utilisent des virus recombinants, incluant la protéase et/ou la transcriptase inverse du patient. Ce sont des techniques automatisées, assez chères réalisable uniquement dans un laboratoire de confinement de niveau 3 selon l'HAS. En pratique clinique, il est plus simple de réaliser des tests génotypiques. B. Tests génotypiques : Les tests génotypiques reposent sur une amplification et un séquençage des gènes d’intérêt du VIH-1 par RT-PCR. Il existe des tests commercialisés tels que Trugene™ HIV-1 Genotyping Assay (Siemens,USA) [52] et Celera ViroSeq™ HIV-1 Genotyping System (Abbott) [53] et de nombreux protocoles « maisons » basés sur les recommandations de l’Agence Nationale de Recherche contre le Sida (ANRS). Dans un cas comme dans l’autre, la réalisation et l’interprétation du test nécessite une charge virale supérieure ou égale à 1000 copies/ml dans le plasma. Ces tests ne détectent que les mutations majoritaires (> 20–30% des variants). Ils sont plus rapides et moins chers que les tests phénotypiques.. . 26 .

(27) Objectif de l’étude : Suite à l’arrêt de la commercialisation du kit Trugene™ (Siemens) pour le génotypage de résistance du VIH-1 en mars 2015 utilisé au CHU d’Amiens depuis 2004, le laboratoire a dû s’orienter vers une nouvelle technique. Le but de l’étude est de comparer trois techniques de génotypage des gènes de la protéase et de la transcriptase inverse du VIH-1, afin d’évaluer leurs spécificités. Les trois techniques sont : - Trugene ™ - ViroSeq™ - Technique maison dite « ANRS ». !"#$%$"&#' ()$%$*+,#' -"+)'./' !)"%0/#,1 456 955 ;5< ?5> =B6 4B8 @D6 9DB 4DD 7D> 78> ;8A ?8F ;<6 G<D ;<8 I<F @>6 ;>B 4>D J>C EA5 ?AD 3A8 4A> 9AA 9FB ;F8 ;F< KFF 4FC 4C6. !"#$%$"&#' ()$%$*+,#' -"+)'./'231 785 :88 =>< @>A 3>C =A6 4A8 9A< 9C6 ECF 4566 =565 =56D 956> H55< :5DF I5<5 95AC H5F5 75F8 H5FF ?5C6 4B56 3B5< =B5C JBB5 !BB< 7BD6. Nous nous sommes intéressés au gène de la protéase (297 nucléotides soit 99 AA), et de la transcriptase inverse (entre les AA 40 et 240) [47]. Le protocole technique est exposé dans le chapitre Matériel et Méthodes. En France, l’ANRS a établi un tableau d’interprétation des génotypages, en relevant les sites critiques, ainsi que les mutations attendues sur le gène de la protéase et de la transcriptase inverse du VIH (Annexe 02). Ce tableau permet de savoir, en fonction des différentes mutations de la séquence, si elles sont associées à des résistances prouvées ou possibles aux ARVs. Il existe 32 positions critiques sur le gène de la protéase pouvant être responsable de résistances aux IPs, ainsi que 28 positions critiques associées à des résistances prouvées ou possibles aux INTIs et aux INNTIs. . Table 2 : Positions critiques pour la protéase et la RT.. . 27 .

(28) Matériel et Méthodes : I) Patients : Cette étude a été menée du mois de novembre 2014 au mois d’avril 2015 au laboratoire de Virologie du CHU d’Amiens. Nous avons inclus 161 échantillons issus de 78 patients (Annexe 03) provenant du CHU d’Amiens et des centres hospitaliers de Compiègne, Beauvais, Saint-Quentin et Soissons. L’inclusion n’était pas randomisée et ne prenait pas en compte le stade d’évolution de la maladie. Les échantillons ont été sélectionnés en fonction de leurs charges virales et de leurs sous-types. Pour ces 78 patients, une demande de génotypage a été prescrite au CHU d’Amiens. Les cinq premiers ont été analysés avec les trois techniques. Parmi ceux-ci, il y avait quatre contrôles externes de qualité. Les trente-cinq suivants ont été testés en parallèle sur les techniques Trugene™ et ANRS. Les trente-huit derniers ont été séquencés par les techniques ViroSeq™ et ANRS. !"#$%&'(&)*(&+,'"-.&)*./0")$&)1* '()*+,-./010+23-4*05#. '()*+,-./010#. '()*+23-4*05#. !"# $&"# $%"#. Figure 10 : Différentes techniques utilisées. II) Extraction des acides nucléiques: La première étape d’extraction des acides nucléiques à partir du plasma, du sang total ou du LCR des patients est commune aux trois techniques. Au laboratoire de virologie, nous réalisons les extractions des acides nucléiques sur l’automate NucliSENS™ EasyMag™ (Biomérieux) selon les recommandations du fournisseur. Dans la majorité des cas, nous avons pris les mêmes extraits pour comparer les techniques deux à deux. Si nous n’avions plus assez d’extraits, nous repartions du tube de sang mère pour refaire une seconde extraction. Les aliquots obtenus étaient congelés à -80°C entre les différentes utilisations. . 28 .

(29) III). Amplification et séquençage par la technique Trugene™ : La trousse Trugene™ (Siemens) permet le séquençage des gènes de la protéase et de. la transcriptase inverse pour le VIH-1 [54]. Après une étape de transcription inverse, les gènes étudiés sont amplifiés par PCR. En raison de la nature extrêmement polymorphe du VIH-1, un mélange de plusieurs amorces ciblées sur les variants viraux les plus fréquents est utilisé. A. Transcription inverse et PCR: L’amplification se déroule en deux étapes successives: transcription inverse (TI ou RT) puis amplification de la matrice. La RT a pour objectif de transformer l’ARN simple brin en ADN complémentaire double brin (ADNc). Sont mélangés aux 9µL de mix réactionnel I contenant les amorces, les dNTPs, le DTT et le RNAse inhibiteur, 17µL d’extrait d’ARN. Cette étape se fait à une température de 50°C pendant 5 minutes permettant l’hybridation spécifique des amorces et l’élongation du néo brin d’ADNc formé. L’amplification nécessite d’ajouter 14µL de mix réactionnel II (tampon RT-PCR, RNase inhibiteur, RT-enzyme, DNA polymérase) dans chacun des tubes de RT après les cinq premières minutes à 50°C. Dans cette technique, il n’y a pas de contrôle d’amplification sur gel. Le thermocyclage se déroule comme précisé dans le tableau N°3. Processus. Température. Temps. Nombre de cycles. Activation initiale. 90°C. 2 min. 1. Transcription inverse. 50°C. 5 + 55 min. 1. Dénaturation enzymatique. 94°C. 2 min. 1. Dénaturation. 94°C. 30 sec. Hybridation. 57°C. 30 sec. Elongation. 68°C. 2 min. Dénaturation. 94°C. 30 sec. Hybridation. 60°C. 30 sec. Elongation. 68°C. 2,5 min. Elongation finale. 68°C. 7 min. 4°C. En attente. 20. 17 1. Table 3 : Paramétrage du thermocycleur.. . 29 .

(30) B. Séquençage (= réaction CLIP): Cette étape permet le séquençage simultané des deux brins d’ADN. Un mix réactionnel est préparé à l’aide des enzymes CLIP, du tampon correspondant, et des amorces spécifiques (protéase, P2, RT début, et RT milieu). Les amorces sens et anti-sens sont marquées par des fluorochromes différents (respectivement Cy5,5 et Cy5), permettant ensuite d’être détectées par la caméra après excitation par le laser lors de l’électrophorèse. 5µL de produits d’amplification sont ajoutés au mix réactionnel. Les tubes sont ensuite placés dans le thermocycleur selon la programmation ci-dessous : Processus. Température. Temps. Nombre de cycles. 94°C. 5 min. 1. Dénaturation. 94°C. 20 sec. Hybridation. 56°C. 20 sec. Elongation. 70°C. 1,5 min. Elongation finale. 70°C. 5 min. En attente. 4°C. Activation initiale. 30 1. Table 4: Programmation du thermocycleur.. L’électrophorèse des produits de séquençage nécessite ensuite l’addition de 14µL de tampon de chargement dans chaque puits puis un chauffage de 2 minutes à 95°C. 1,5µL de chaque réaction sont ensuite déposés dans les puits de la MicroCel™. C’est une double plaque de verre entre laquelle a été injecté du gel de polyacrylamide polymérisé sous UV. La migration des réactions des séquences se fait dans les puits de ce gel vertical.. Figure 11 : Tour Siemens. C. Interprétation : Le kit de génotypage du VIH-1 Trugene™ et le système de séquençage de l’ADN OpenGene™ sont basés sur le système d’exploitation iMac OSX. C’est un produit de marquage CE. Les séquences VIH sont analysées par le logiciel HIV-1 Starter Module, selon les dernières recommandations de l’ANRS. Cela permet d’améliorer le suivi des patients, et d’optimiser leurs traitements. . 30 .

(31) En annexe 04 et 05 sont présentés un exemple d’électrophorégramme, ainsi qu’un rendu de résultats.. IV). Amplification et séquençage par la technique ViroSeq™ : A. Transcription inverse : Un mix réactionnel constitué de MuLV Reverse Transcriptase, de HIV RT-mix, de. RNAse inhibitor et de DTT est préparé selon les modalités du tableau ci-dessous (Tableau N°5) et en fonction du nombre d’échantillons à traiter. Les quantités sont exprimées en µL. 1 éch. 5 éch. 6 éch. 7 éch. 8 éch. 9 éch. 10 éch. HIV RT-Mix. 8. 40. 48. 56. 64. 72. 80. RNAse inhibitor. 1. 5. 6. 7. 8. 9. 10. MuLV RT. 1. 5. 6. 7. 8. 9. 10. DTT. 0,4. 2. 2,4. 2,8. 3,2. 3,6. 4. Volume final. 10,4. 52. 62,4. 72,8. 83,2. 93,6. 104. Table 5 : Quantités en µL pour le mix réactionnel. Après agitation sur vortex, sont ajoutés 10µL d’ARN extrait dans chaque tube afin d’obtenir un volume final de 20µL. Les tubes sont ensuite placés dans le thermocycleur pour débuter le processus. Ci-dessous le programme : Processus. Température. Temps. Dénaturation. 65 °C. 30 secondes. Refroidissement : température optimale de l’enzyme. 42 °C. 5 minutes. Transcription inverse. 42 °C. 60 minutes. Inactivation de la MuLV RT. 99 °C. 5 minutes. En attente. 4 °C. > 10 minutes. Pause manuelle. Table 6 : Programmation thermocycleur. La pause manuelle a permis d’ajouter dans chacun des tubes, 10µL de mix RT à température ambiante et de centrifuger les tubes. Elle ne doit pas dépasser les 10 minutes. Les tubes sont ensuite replacés dans le thermocycleur pour reprendre le programme. B. Addition du mix de PCR : L’étape d’amplification nécessite la préparation d’un mix de PCR contenant : . 31 .

(32) 1 éch. 5 éch. 6 éch. 7 éch. 8 éch. 9 éch. 10 éch. HIV PCR-Mix. 29,5. 147,5. 177. 206,5. 236. 265,5. 295. AmpliTaq Gold. 0,5. 2,5. 3. 3,5. 4. 4,5. 5. AmpErase UNG. 1. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Volume final. 31. 155. 186. 217. 248. 279. 310. Table 7 : Quantités en µL pour préparation du mix.. Sont ajoutés 30µL de PCR Master Mix dans chaque tube provenant de la RTPCR. Les tubes sont ensuite replacés dans le thermocycleur après agitation et centrifugation. Processus. Température. Temps. Nombre de cycles. Activation UNG. 50 °C. 10 min. 1. Activation AmpliTaqGold. 93 °C. 12 min. 1. Dénaturation. 93 °C. 20 sec. Hybridation. 64 °C. 45 sec. Elongation. 66 °C. 3 min. Elongation finale. 72 °C. 10 min. 1. 4 °C. En attente. -. 40. Table 8: Programme du thermocycleur. C. Dépôt et migration des produits de la Nested PCR sur gel d’agarose : Cette étape permet d’évaluer la qualité et la quantité des ADN amplifiés. 1) Préparation du gel 1% (1 gel à 12 puits = 11 échantillons + 1 témoin de bas PM) : 0.6g d’agarose sont ajoutés à 60mL de tampon de migration TBE 0,5x. La solution est chauffée au micro-ondes jusqu’à dissolution complète de l’agarose. Pour permettre la visualisation des produits d’amplification sous lumière UV à la fin de la migration, est ajouté 0,5µg de produit intercalant d’ADN (Gel Star™). 2) Dépôt et migration des produits : Après solidification du gel, celui-ci est placé dans une cuve de migration contenant du tampon de migration TBE 0,5x. Dans chacun des puits, est déposé 18µL de mix contenant le produit d’amplification ou un témoin de bas poids moléculaire (Smart Ladder) associé à un marqueur coloré (6x Orange) permettant le maintien de l’ADN dans le puits. . 32 .

(33) 6x Orange DNA. 3µL. Produit de PCR ou Smart Ladder. 5µL. Eau. 10µL. Table 9 : Préparation du mix:. Après une migration d’environ 45 minutes, le gel est analysé sous UV à l’aide du système ChemiDoc™ (Biorad) et du logiciel Quantity one™ (Biorad).. Figure 12 : Contrôle d'amplification sur gel.. D. Purification des produits de PCR : La purification est réalisée grâce au kit PCR Cleanup Reagent SNP-IT sur portoir réfrigéré. 3µL de réactifs sont ajoutés dans chacun des tubes contenant 45µL de produit d’amplification. Après agitation et centrifugation, les tubes sont disposés dans le thermocycleur selon le programme ci-dessous : Température. Temps. Cycles. 37°C. 15 min. 1. 80°C. 15 min. 1. 4°C. En attente. -. Table 10 : Programme du thermocycleur. E. Réaction de séquence : A partir de la quantité d’ADN estimée à la lecture du gel d’agarose, une dilution des produits d’amplification pouvait être nécessaire afin d’atteindre la concentration optimale définie par le fournisseur. Le séquençage de la protéase et de la transcriptase inverse utilise sept amorces différentes : - Amorces sens (A, B, C, et D) - Amorces anti-sens (F, G, et H) . 33 .

(34) Le mix de séquençage se réalise en plaque 96 puits selon le schéma ci-dessous (Table 11). Aux 8µL de produit d’amplification, nous ajoutons 12µL de chaque HIV-1 SEQ mix contenant chacun une amorce spécifique (A, B, C, D, F, G et H), des dNTPs, des DTT marqués par des fluorochromes différents, une Taq polymérase. Patient/Amorce. A. B. C. D. F. G. H. Ech 1 Ech 2 … Table 11 : Schéma de plaque. La plaque de séquençage est ensuite placée dans le thermocycleur selon le programme suivant : Processus. Température. Temps. Dénaturation. 96°C. 10 sec. Hybridation. 50°C. 5 sec. Elongation. 60°C. 4 min. 4°C. Mise en attente. Nombre de cycles 25 -. Table 12 : Programme thermocycleur. F. Purification des ADN marqués : Les réactions de séquence sont purifiées en plaque 96 puits à l’aide du kit de Purification BigDye XTerminator™ (Applied Biosystems). Pour chaque réaction est ajoutée 110µL de solution de purification contenant 90µL de solution SAM et 20µL de BigDye XTerminator. La plaque est ensuite agitée sur un Thermomixeur IKA MS3 Digital pendant 30 minutes à 2500 tr/mn et centrifugée pendant 2 minutes à 1000 tr/mn à 21.6°C. A partir de cette purification, 20µL de surnageant sont analysés. G. Séquençage et analyse des résultats: Le séquençage se réalise sur l’automate ABI 3130 (plateforme d’oncobiologie moléculaire), et l’analyse des résultats se faisait avec le logiciel ViroSeq v2.8. En annexe 06 est présenté un modèle de rendu des résultats.. . 34 .

(35) V). Amplification et séquençage par la technique ANRS : A. RT-PCR :. Dans cette technique, les étapes de transcription inverse et d’amplification des régions codant pour la protéase et la transcriptase inverse sont réalisées successivement. Les amorces utilisées sont : - Pour la protéase : Amorce sens 5’prot1 : 5’- TAATTTTTTAGGGAAGATCTGGCCTTCC- 3’ Amorce anti-sens 3’prot1 : 5’-GCAAATACTGGAGTATTGTATGGATTTTCAGG- 3’ - Pour la transcriptase inverse : Amorce sens MJ 3 : 5’ – AGTAGGACCTACACCTGTCA-3’ Amorce anti-sens MJ 4 : 5’- CTGTTAGTGCTTTGGTTCCTCT – 3’ 10µL d’ARN précédemment extrait sont ajoutés au mix réactionnel constitué comme suit : RNase free water. 24,30µL. 5XQiagen OneStep RT-PCR buffer. 10,00µL. dNTP mix (10mM de chaque dNTP). 2,00µL. Amorce sens (50pmol/µL). 0,60µL. Amorce anti-sens (50pmol/µL). 0,60µL. Qiagen OneStep RT-PCR Enzyme mix. 2,00µL. RNase inhibitor APPLIED 20 u/µL. 0 ,50µL. Volume final. 40µL. Table 13 : Composition du mix pour un échantillon.. Le programme de thermocyclage est indiqué ci-dessous. Processus. Température. Temps. Nombre de cycles. Transcription inverse. 50°C. 30 min. 1 Cycle. Activation initiale. 95°C. 15 min. 1 Cycle. Dénaturation. 94°C. 30 sec. Hybridation. 55°C. 30 sec. Elongation. 72°C. 1min 30sec. Elongation finale. 72°C. 10 min. 40 Cycles 1 Cycle. Table 14 : Programme du thermocycleur:. . 35 .

(36) B. Nested PCR ou PCR nichée : Cette deuxième PCR est réalisée à partir des amplicons précédemment obtenus. Elle a pour but d’amplifier la matrice. Les amorces utilisées sont : - Pour la protéase : Amorce sens 5’prot2 : 5’- TCAGAGCAGACCAGAGCCAACAGCCCCA- 3’ Amorce anti-sens 3’prot2 : 5’-AATGCTTTTATTTTTTCTTCTGTCAATGGC- 3’ - Pour la transcriptase inverse : Amorce sens A (35) : 5’ - TTGGTTGCACTTTAAATTTTCCCATTAGTCCTATT-3’ Amorce anti-sens NE1(35):5’- CCTACTAACTTCTGTATGTCATTGACAGTCCAGCT - 3’ 9µL de produit de RT-PCR sont ajoutés au 41µL de mix réactionnel utilisant le « Hot Start PCR master mix » (Biotech Rabbit) complété des amorces.. RNase free water. 15µL. Amorce sens (50pmol/µL). 0,50µL. Amorce anti-sens (50pmol/µL). 0,50µL. Enzyme Hot Start PCR master mix. 25µL. Volume final. 41µL. Table 15 : Volumes pour un échantillon:. Le programme de thermocyclage est indiqué ci-dessous. Processus. Température. Temps. Nombre de cycles. Activation initiale. 94°C. 5 min. 1 Cycle. Dénaturation. 94°C. 30 sec. Hybridation. 55°C. 45 sec. Extension. 72°C. 1min 30sec. Extension finale. 72°C. 5 min. 40 Cycles 1 Cycle. Table 16 : Programme du thermocycleur. C. Dépôt et migration des produits de la Nested PCR sur gel d’agarose : Cette étape est identique à la technique ViroSeq™.. . 36 .

(37) D. Purification des produits de PCR: Cette étape de purification utilise le protocole du kit QIAquick PCR Purification (QIAGEN). Brièvement, 250µL de Buffer PB sont ajoutés à 50µL de produit de PCR puis centrifugés pendant une minute afin de fixer l’ADN à la membrane de silice. Les colonnes sont ensuite lavées par 750µL de Buffer PE et centrifugées deux fois. L’élution de l’ADN est réalisée grâce à l’addition de 50µL de Buffer EB dans la colonne puis centrifugation finale afin d’obtenir l’ADN purifié. E. Réaction de séquence: Le marquage des ADN est réalisé à l’aide du kit ABI PRISM BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing (Méthode de Sanger) en utilisant quatre amorces différentes : - Pour la protéase : Amorce sens 5’prot2 (3.2pmol/µL) : 5’- TCAGAGCAGACCAGAGCCAACAGCCCCA- 3’ Amorce anti-sens 3’prot2 (3.2pmol/µL):5’-AATGCTTTTATTTTTTCTTCTGTCAATGGC-3’ - Pour la transcriptase inverse : Amorce sens A (20) (3.2pmol/µL) : 5’-ATTTTCCCATTAGTCCTATT-3’ Amorce anti-sens NE1 (20) (3.2pmol/µL) : 5’-ATGTCATTGACAGTCCAGCT-3’ Le mix réactionnel est fonction de la quantité estimée d’ADN amplifié. La quantité d’ADN peut varier de 1 à 5µL nécessitant d’adapter la quantité d’eau de 9 à 13µL. Mix cycle sequencing big dye. 4µL. Tampon Buffer. 2µL. Amorce (3,2pmol/ µL). 1µL. H2O. 9µL, 11µL, ou 13µL. ADN. 5µL, 3µL, ou 1µL. Volume final. 21µL. Table 17 : Mix réactionnel BigDye Terminator pour un échantillon.. Le programme du thermocyclage est présenté ci-dessous : Processus. Température. Temps. Nombre de cycles. Activation initiale. 96°C. 1 min. 1 Cycle. Dénaturation. 96°C. 10 sec. Hybridation. 50°C. 5 sec. Extension. 60°C. 4 min. En attente. 4°C. -. 25 Cycles -. Table 18 : Programme du thermocycleur. . 37 .