Étude comparative à court terme d'une diète riche et faible en gras sur le profil lipidique, la taille des particules LDL et l'expression des gènes impliqués dans le métabolisme intestinal des lipoprotéines

VALERIE GUAY

ETUDE COMPARATIVE A COURT TERME D'UNE

DIÈTE RICHE ET FAIBLE EN GRAS SUR LE

PROFIL LIPIDIQUE, LA TAILLE DES PARTICULES

LDL ET L'EXPRESSION DES GÈNES IMPLIQUÉS

DANS LE MÉTABOLISME INTESTINAL DES

LIPOPROTÉINES

Mémoire présenté

à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval dans le cadre du programme de maîtrise en nutrition

pour l'obtention du grade de maître (M.Sc.)

DEPARTEMENT DES SCIENCES DES ALIMENTS ET DE NUTRITION FACULTÉ DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION

UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC

2010

Résumé

L'alimentation peut faire varier la réponse lipoprotéique. Les diètes faibles en gras comparativement à celles riches en gras tendent à diminuer la taille des LDL, augmentant le risque de maladies cardiovasculaires. Le temps nécessaire pour induire ce changement n'est pas déterminé. Afin de permettre de telles modifications, une variation dans l'absorption des acides gras et dans la production des chylomicrons pourrait avoir lieu. Aucune étude, à notre connaissance, n'a évalué l'effet d'une variation dans la composition nutritionnelle sur l'expression des gènes intestinaux. L'objectif de ce mémoire est de comparer les effets d'une diète faible et riche en gras sur la taille des LDL ainsi que sur l'expression des gènes intestinaux impliqués dans le métabolisme des lipoprotéines après seulement trois jours d'intervention alimentaire. Les résultats indiquent qu'une diète faible en gras de trois jours diminue la taille des LDL ainsi que l'expression des gènes intestinaux comparativement à une diète riche en gras.

Avant-propos

Au cours des derniers 20 mois, j'ai eu la chance de connaître des personnes exceptionnelles qui m'ont permis d'évoluer et de grandir dans cette belle et grande aventure qu'a été la maîtrise.

Je veux tout d'abord remercier mon directeur de recherche, Dr Patrick Couture, qui m'a permis de réaliser ce beau projet. Malgré son horaire très chargé, allant de la pratique en tant que clinicien à la recherche, en passant par la direction du programme de médecine interne, il a su prendre le temps nécessaire pour permettre mon épanouissement tout au cours de ma maîtrise. Dès le début du projet, il m'a fait confiance et m'a permis d'être autonome dans ce cheminement. Il m'a encouragée dans mes différents projets et m'a laissé toute la liberté dont j'avais besoin. Merci beaucoup pour tout!

Mon codirecteur, Dr Benoit Lamarche a également joué un grand rôle dans l'aventure des derniers mois. Tout d'abord, je tiens à le remercier puisqu'il a cru en mes capacités de réaliser une maîtrise. Il m'a également intégré dans son équipe de travail, une équipe extraordinaire. Il m'a finalement transmis son enthousiasme contagieux pour la recherche. Sincères remerciements!

Deux professionnels de recherche m'ont particulièrement permis de grandir au cours de cette maîtrise, soit André Tremblay et Amélie Charest. André m'a expliqué et réexpliqué des dizaines de concepts de lipidologie et de génétique qui ne faisaient pas du tout partie de mon bagage en tant que nutritionniste. Il a également été très patient avec moi en laboratoire et surtout, il m'a fait confiance. Amélie, quant à elle, a été la personne grâce à qui j'ai vraiment choisi de faire ma maîtrise, une des plus belles décisions que j'ai prises. Elle a, elle aussi, répondu à mes innombrables questions, particulièrement en lien avec la nutrition, toujours avec le sourire. Sans elle, cette aventure aurait été beaucoup moins agréable. Merci du fond du cœur!

Je tiens également à remercier tous les gens qui ont participé à l'avancement de mon projet de recherche. Merci à Sandra Gagnon et à Marie-Pier Devost qui ont préparé les

aliments pour les participants de l'étude. Merci également à nos infirmières Danielle Aubin et Marjolaine Lapointe ainsi qu'aux gastroentérologues, Francisco Trelles et Valéry Lemelin qui ont collecté les échantillons sanguins et les biopsies suite aux interventions alimentaires. Merci aussi à tous ceux qui ont travaillé en laboratoire, soit Johanne Marin et Pascal Dubé. Finalement, je remercie les participants qui ont accepté de faire l'intervention. Sans eux, cette étude n'aurait pas pu être réalisée. Merci!

Les équipes Couture, Lamarche et Lemieux ainsi que 1TNAF comportent de nombreuses personnes, toutes aussi sympathiques les unes que les autres. Je tiens à toutes les remercier autant pour leurs explications de divers concepts que pour le temps passé à leurs côtés. Grâce à eux, le quotidien était si agréable que j'avais hâte de venir travailler pour les revoir. J'ai eu la chance de connaître de merveilleuses personnes qui sont devenues des amies et qui, je l'espère, le resteront longtemps. Un grand merci!

Finalement, mes plus grands remerciements vont à ma famille, mes amis et à mon amoureux qui m'ont soutenue tout le long de cette belle et grande aventure, qui ont cru en mes capacités, non seulement pour ma maîtrise, mais également dans tout le reste. Merci de m'avoir encouragée et de m'avoir changé les idées. Merci de m'épauler dans tous mes projets. Merci de m'aimer comme je suis!

Table des matières

Avant-propos

Liste des tableaux v Liste des figures vi Liste des abréviations ix CHAPITRE I : Introduction générale 1

CHAPITRE II : Problématique 3 1- Métabolisme des lipoprotéines 3

1.1- Les lipoprotéines 3 1.2- Voies exogènes 4 1.3- Voie endogène 5 1.4- Transport inverse du cholestérol 7

1.5- Les maladies cardiovasculaires 7 1.6- Effet de la composition nutritionnelle sur le diamètre des LDL 8

1.7- Lien entre changements alimentaires et risque de MCV 9 1.8- Temps nécessaire pour induire changement alimentaire 10

2- Coup d'oeil sur la digestion 11 3- Gènes intestinaux impliqués dans le métabolisme des lipoprotéines 14

3.1- Gènes modulant l'absorption des sterols 15 3.2- Gènes modulant la formation et l'excrétion des chylomicrons 17

3.3- Les facteurs de transcription 18 3.4- Effet de la composition nutritionnelle sur l'expression des gènes intestinaux 19

3.5- Marqueurs d'absorption et de synthèse du cholestérol 20

4- Les chylomicrons 21 4.1- Synthèse et sécrétion des chylomicrons 21

4.2- Clairance des chylomicrons 21

5- Hypothèses et Objectifs 23 CHAPITRE III : Effet d'une diète riche en gras de trois jours comparativement à une diète faible en

gras sur la taille des LDL 24 CHAPITRE IV : Conclusion 51

Liste des tableaux

Tableau 1 : Caractéristiques physico-chimiques des lipoprotéines 4

Liste des figures

Figure 1 : Structure d'une lipoprotéine 4 Figure 2 : Métabolisme des lipoprotéines 6 Figure 3 : Digestion des lipides alimentaires 13 Figure 4 : Gènes impliqués dans l'absorption des acides gras et du cholestérol dans

Liste des abréviations

ABCG5: Transporteur à cassette G5 liant l'ATP (ATP-binding cassette transporter G5) ABCG8: Transporteur à cassette G8 liant l'ATP (ATP-binding cassette transporter G8) Apo : Apolipoprotéine

ARNm : Acide ribonucléique messager

CETP : Protéine de transfert des esters de cholestérol (Cholesterol ester transfer protein) C-HDL : Cholestérol des lipoprotéines de haute densité

C-LDL : Cholestérol des lipoprotéines de faible densité

FABP : Protéine de liaison des acides gras (Fatty acid binding protein)

FATP4: Protéine de transport 4 des acides gras (Fatty acid transport protein 4) HDL : Lipoprotéine de haute densité (High density lipoprotein)

HMGCoA: 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A

HNF4a : Facteur nucléaire hépatocytaire -4a (Hepatocyte nuclear factor 4 alpha) IDL : Lipoprotéine de densité intermédiaire (Intermediate density lipoprotein) INAF : Institut des nutraceutiques et des aliments fonctionnels

LCAT : Lécithine cholestérol acyle transferase

LDL : Lipoprotéine de faible densité (Low density lipoprotein) LH : Lipase hépatique

LPL : Lipoprotéine lipase

LRP : Protéine apparentée aux récepteurs des LDL (LDL receptor-related protein) LXR : Récepteur X hépatique (Liver X receptor)

MCV : Maladie cardiovasculaire

MTP : Protéine de transfert microsomal des triglycérides (Microsomal triglyceride transfer protein)

NCEP ATP III : Programme national d'Education sur le cholestérol Traitement pour Adultes III (National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III) NPC1L1 : Transporteur de sterol Niemann-Pick Cl-like 1

PPAR : Récepteur actif par les proliférateurs des peroxysomes (Peroxisome proliferator actived receptor)

RXR : Récepteurs aux rétinoïdes (Retinoid X receptor)

SAR1B : Protéine de trafic membranaire SAR115 (Secretion-Associated and Ras-superfamily-related gene)

SR-B1 : Récepteur « éboueur » classe B type 1 (Scavenger receptor class B type 1) SREBP : Protéine liant l'élément de réponse aux sterols (Sterol response element binding protein)

CHAPITRE I : Introduction générale

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la manifestation clinique la plus importante de l'athérosclérose et demeurent une des principales causes de mortalité et de morbidité dans les sociétés industrialisées. En effet, l'épidémie de MCV observée aux États-Unis et ailleurs devant s'étendre sur plus de 50 ans selon les spécialistes, s'est déroulée en 10 à 15 ans [1]. Selon une estimation effectuée par Santé Canada sur les maladies du cœur, 1,6 million de Canadiens sont atteints de MCV [2]. La pression grandissante sur le système de santé pour le traitement des MCV et ses complications ont favorisé les recherches dans le domaine afin de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents aux MCV.

En ce sens, de nombreuses évidences ont associé certains facteurs de risque aux MCV. Au cours des dernières décennies, des changements au niveau des habitudes de vie, notamment l'augmentation de l'alimentation rapide, du stress, de l'âge de la population, du tabagisme et de l'inactivité physique ont résulté en une prévalence plus importante des MCV. Parmi les facteurs de risque en lien avec la diète, on retrouve les calories consommées par rapport à celles dépensées, la consommation des gras saturés et trans, l'insuffisance de fruits et légumes ainsi que la consommation de sodium [3]. Santé Canada recommande, entre autres, une consommation de gras totale allant de 20 à 35% de l'énergie globale de même qu'une réduction des gras saturés et trans [4].

Ces recommandations découlent de nombreuses études. En effet, dès le début des années 1950, Kinsell [5] et Ahrens [6] ont démontré qu'une substitution des gras animaux pour des huiles végétales pouvait réduire le cholestérol plasmatique, lequel constitue un important prédicteur pour les MCV [7, 8]. Depuis ce temps, d'autres études, dont l'étude des sept pays a rapporté que la consommation de gras saturés était associée à un cholestérol sérique élevé [9]. Les gras saturés sont donc un déterminant majeur pour le niveau de cholestérol [10]. En effet, certaines analyses montrent qu'à chaque augmentation de 1% des calories provenant des gras saturés, le cholestérol (C) contenu dans les lipoprotéines de faible densité (LDL) augmente de 2% [11, 12]. Les gras trans augmenteraient également les niveaux de C-LDL, ce qui accroîtrait le risque de MCV [13]. De nombreuses études ont

montré que lors de changements alimentaires, la consommation de gras est substituée par des glucides [14]. Une telle situation entraîne une diminution du C-LDL et du cholestérol des lipoprotéines de haute densité (C-HDL) ainsi qu'une augmentation des triglycérides [12, 15], qui sont également liés positivement à l'incidence de MCV [16, 17].

Les mécanismes d'action, en lien avec l'alimentation, en phase aiguë, favorisant l'apparition des facteurs de risque de MCV au point de vue lipidologique ainsi que ceux menant à l'absorption des macronutriments au niveau intestinal sont présentement très peu explorés chez les humains. Une évaluation de ces derniers s'avère nécessaire afin de mieux saisir le développement des MCV.

Dans cette optique, nous avons réalisé une étude d'intervention clinique en chassé-croisé et à double insu à l'Institut des nutraceutiques et des aliments fonctionnels (INAF) de l'Université Laval, dans laquelle une étude du métabolisme des lipoprotéines et des gènes duodénaux impliqués dans l'absorption du cholestérol a été réalisée. L'objectif de cette étude a donc été de mieux comprendre l'implication d'une diète à court terme sur la taille des LDL et l'expression de certains gènes intestinaux impliqués dans le métabolisme du cholestérol.

Ce mémoire est constitué de plusieurs sections, dont une revue de littérature portant sur le métabolisme des lipoprotéines en lien avec l'alimentation ainsi que sur les gènes, au niveau intestinal, impliqués dans l'absorption du cholestérol et la sécrétion des chylomicrons. Ensuite, un des deux articles scientifiques qui sera soumis pour publication sous peu est présenté. Cet article décrit l'effet d'une diète riche en gras, comparée à une diète faible en gras à court terme sur la taille des LDL. Finalement, la conclusion de ce mémoire résumera les résultats importants de l'étude et comportera une discussion des différentes retombées possibles de notre étude.

CHAPITRE II : Problématique

1- Métabolisme des lipoprotéines

Le métabolisme des lipoprotéines est un facteur primordial pour une bonne gestion des lipides plasmatiques, faisant en sorte qu'il est impliqué très étroitement dans le risque de MCV. Les lipoprotéines sont très diversifiées, notamment au point de vue de leur taille et leur densité et ont différents rôles dans la prévalence de MCV. Divers facteurs sont impliqués dans la régulation des lipoprotéines, notamment l'alimentation qui a un rôle clé dans leur métabolisme de même que sur le risque de développer une MCV [1].

1.1- Les lipoprotéines

Les lipoprotéines sont des particules composées de lipides et protéines ayant comme rôle d'effectuer le transport des lipides. Elles sont composées, entre autres, d'une couche de phospholipides, de cholestérol libre, de protéines ainsi que d'un noyau de lipides (ester de cholestérol et triglycéride) (Figure 1). Elles sont hydrophiles à l'extérieur et hydrophobes à l'intérieur. Différentes classes de lipoprotéines ont été établies (Tableau 1), selon leur contenu en protéines et en lipides, ainsi que le type de protéines qu'elles portent, déterminant leur rôle métabolique. Les lipoprotéines ont différentes apolipoprotéines (apo) à leur surface qui interagissent avec les lipides dans la lipoprotéine ainsi qu'avec le milieu dans lequel ils circulent. Ces dernières ont un rôle important pour la structure et la taille des lipoprotéines [18]. Certaines apolipoprotéines sont non-échangeables et fortement insolubles, soient les apo B100 et B48, alors que d'autres sont échangeables (apo A, C et E) [18].

Figure 1 : Structure d ' u n e lipoprotéine [19] Apoprotein» ^ m ^ ^ ^ Ê j ' i fm^ j ^ " Apoprotein» Surface polaire ^ ^ B k Cholestérol libre J É | 1 " ^ ■ ^ ■ L ' ^ ^ ^ 2 Phospholipides ^ -_-~^_~rr _'" ' J \ *

Tableau 1 : Caractéristiques physico-chimiques des lipoprotéines [19]

Lipoprotéines Densité Diamètre Lipides Apolipoprotéines (g/dL) (nm) (% des composants totaux) principales

TG Chol PL Chylomicrons <0.95 75-1200 80-95 2-7 3-9 B48, C-II-E VLDL 0.95-1.006 30-80 55-80 5-15 10-2 B-100, C-II, E IDL 1.006-1.019 25-35 20-50 20-40 15-2 B-100, E LDL 1.019-1.063 18-25 5-15 40-50 20-2 B-100 HDL 1.063-1.21 5-12 5-10 15-25 20-30 A, C-II

Adapté de : Lamarche, B. Métabolisme des lipoprotéines. Cours : lipidologie 1 : métabolisme des lipoprotéines, Université Laval. 2009.

1.2- Voies exogènes

L'absorption des nutriments alimentaires, dont le cholestérol et les triglycérides, se fait au niveau du tractus gastro-intestinal. De nombreux gènes sont impliqués dans leur absorption et dans la formation des chylomicrons. Les chylomicrons sont des lipoprotéines

qui veillent au transport des lipides et des vitamines liposolubles vers le foie par les canaux lymphatiques [18]. Ils sont les seules lipoprotéines constituées d'une apo B48, faisant en sorte que son dosage reflète la quantité de particules et de résidus de chylomicrons en circulation [18]. Ces derniers sont étroitement régulés par leur synthèse, leur sécrétion ainsi que par leur captage. Les niveaux d'apo B48 à jeun ne prédisent pas seulement les réponses postprandiales, mais reflètent également la concentration des résidus de chylomicrons, lesquels sont considérés comme étant une forme de lipoprotéines pro-athérogènes [20, 21]. La formation de résidu de chylomicrons s'effectue dans le milieu intravasculaire par la lipoprotéine lipase (LPL) qui hydrolyse le contenu en triglycéride, libérant ainsi des acides gras libres [22]. Les résidus de chylomicrons sont finalement captés au niveau hépatique par les récepteurs membranaires suite à une interaction avec l'apo E [23]. Il existe un lien étroit entre les résidus de chylomicrons et certains lipides plasmatiques à jeun, tels les triglycérides [20].

1.3- Voie endogène

1.3.1- Synthèse des lipoprotéines

Les niveaux de lipoprotéines dans l'organisme varient selon de nombreux facteurs, dont l'alimentation. Le foie a un rôle central dans la balance du cholestérol de l'organisme, non seulement parce qu'il reçoit la majorité du cholestérol absorbé au niveau intestinal, mais également parce qu'il est le site de dégradation et d'excrétion du cholestérol à travers la bile. En effet, le foie régule les taux de cholestérol et de triglycérides plasmatiques, par la sécrétion et la captation des chylomicrons, des lipoprotéines de très faible densité (VLDL), des lipoprotéines de densité intermédiaire (IDL), des LDL et des HDL. Ce sont les VLDL qui exportent les lipides hépatiques et exogènes vers les tissus périphériques. Chacune des particules de VLDL qui sont sécrétées porte une apo B100. Afin d'avoir des VLDL en circulation, une production d'apo B100 est nécessaire, laquelle dépend étroitement de la disponibilité du cholestérol, des esters de cholestérol, de triglycérides et des phospholipides au niveau hépatique [24].

De nombreuses étapes se succèdent dans le métabolisme des lipoprotéines, en voici une synthèse (Figue 2) : suite à l'hydrolyse des triglycérides des VLDL plasmatiques par la

LPL, une augmentation de la densité accompagnée d'une diminution du diamètre des VLDL est observée, formant ainsi des résidus de VLDL, nommés IDL [22]. Ces IDL sont quant à elles hydrolysées par la lipase hépatique (LH), menant à la formation des LDL qui sont des lipoprotéines de petite taille. Ainsi, les LDL sont pauvres en triglycérides et riches en cholestérol, faisant d'elles les principaux transporteurs de cholestérol dans l'organisme. Les LDL, comme les VLDL contiennent une seule molécule d'apo B100 par particule [18].

Figure 2 : Métabolisme des lipoprotéines [19]

CHYLO

Constituants de CHYLOet VLDL

Tiré de : Lamarche, B. Métabolisme des lipoprotéines. Cours : lipidologie 1 : métabolisme des lipoprotéines, Université Laval. 2009.

1.3.2- Clairance des lipoprotéines

La clairance des lipoprotéines est assurée au niveau hépatique, notamment par les récepteurs-LDL, qui sont des récepteurs membranaires reconnaissant l'apo B100 à la surface des LDL ainsi que l'apo E des IDL [18]. Ainsi, une certaine quantité de IDL est directement éliminée sans être convertie en LDL. Une fois captée par les récepteurs

hépatiques, une endocytose se produit, faisant en sorte que le contenu des particules est dégradé au foie.

Une grande diversité de taille et de densité est observée au niveau des lipoprotéines, notamment auprès des LDL. Une variation de la taille des LDL induit des changements dans la conformation de l'apo B100, faisant en sorte que les LDL petites et denses sont moins bien reconnues par les récepteurs LDL, variant leur vitesse de clairance [25].

1.4- Transport inverse du cholestérol

Le transport inverse du cholestérol, assuré par les HDL, consiste au retour du cholestérol des tissus extrahépatiques vers le foie [18, 26] où il est ensuite sécrété dans la bile [27]. La principale protéine des HDL est l'apo AI. Les HDL sont formées à partir des pré-fï-HDL qui sont des HDL immatures acquérant du cholestérol provenant des cellules périphériques [18]. Grâce à l'afflux de cholestérol cellulaire, les HDL3 sont formées. La maturation des HDL3 permet leur conversion en HDL2, qui sont des particules ayant acquis du cholestérol libre qui ont un plus grand diamètre et qui sont moins denses [18]. Ce cholestérol est ensuite estérifié par l'action de la lécithine cholestérol acyle transferase (LCAT) et peut être échangé, entre autres, par la protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP) contre des triglycérides contenus dans les LDL et les VLDL [18, 28]. De nombreux mécanismes sont utilisés par le foie afin d'éliminer les HDL, notamment l'interaction avec le récepteur « éboueur » classe B type 1 (SR-BI) et l'endocytose [28, 29]. 1.5- Les maladies cardiovasculaires

Une altération des concentrations de lipides et de lipoprotéines plasmatiques augmente les risques de MCV et est associée à de nombreuses pathologies cardiovasculaires. L'athérosclérose fait partie des conséquences de cette altération. Elle est une atteinte des artères de l'organisme qui peut mener à une obstruction des vaisseaux par la formation de dépôts, appelée plaque d'athérosclérose. Cette dernière est une pathologie qui mène au développement des MCV.

L'hypercholestérolémie est le principal facteur de risque pour le développement de l'athérosclérose, lequel correspond en un dérangement de l'homéostasie du cholestérol

pouvant avoir lieu dans le captage intestinal, la synthèse et le métabolisme endogène, le transport des particules de lipoprotéines et l'excrétion biliaire.

Les niveaux de LDL, plus spécifiquement le niveau d'apo B et le nombre des particules LDL sont des déterminants primaires dans le développement de l'athérosclérose [30]. Cet effet peut être induit par une augmentation de la production hépatique et/ou une diminution du catabolisme des particules LDL. Les LDL sont éliminées de la circulation par les récepteurs-LDL au niveau hépatique, qui seraient les déterminants principaux des concentrations plasmatiques de LDL [31].

Une augmentation du nombre et une diminution de la taille des particules pourraient contribuer au-delà du C-LDL total au développement de l'athérosclérose et au risque de MCV [32, 33]. En effet, les particules LDL plus petites et plus denses sont plus étroitement impliquées dans l'athérosclérose que les grosses particules de LDL [18, 34]. Les particules de LDL petites et denses peuvent traverser la barrière endothéliale, entrer dans 1'endothelium, engendrer l'inflammation, ce qui favorise la transformation de la plaque athéromateuse. En plus de rester plus longtemps en circulation, les LDL petites et denses sont davantage captées par les macrophages que par les récepteurs-LDL, augmentant l'athérosclérose et le risque de MCV [35, 36]. Les différences dans la taille et la composition des particules LDL et HDL proviennent de plusieurs voies métaboliques et peuvent être influencées, entre autres, par l'alimentation. Il y a également une étroite association entre l'athérosclérose et les triglycérides des VLDL ainsi qu'une association inverse avec le C-HDL [1, 37]. Finalement, les résidus de chylomicrons seraient, eux aussi, particulièrement athérogéniques [38].

1.6- Effet de la composition nutritionnelle sur le diamètre des LDL

Tel que mentionné précédemment, la taille des LDL a une influence importante dans le développement de l'athérosclérose. Celle-ci est modulée par de nombreux facteurs, dont l'alimentation.

Des études à long terme ont montré un lien étroit entre la consommation de glucides et la réduction de la taille des LDL. De plus, une diète riche en glucides augmente le

nombre de particules LDL petites et denses [39, 40]. Cet effet est directement proportionnel à la quantité de gras qui est remplacée par des glucides [41]. Selon de nombreuses études, l'augmentation des triglycérides suite à la consommation de sucres simples corrèle négativement avec la taille des LDL, expliquant jusqu'à 60% de la variation [42, 43]. Ces changements de taille viendraient du fait que les grosses particules LDL seraient transformées en petites particules, sans variation dans le nombre total [44]. La magnitude des changements serait plus grande chez les personnes ayant préalablement de petites particules [44].

Des études d'intervention et d'observation ont également montré qu'une diète riche en gras saturé est associée à une augmentation de la taille des LDL ainsi qu'à des particules LDL plus grosses [45-47]. En effet, des études d'une durée de 6 semaines effectuées avec des hommes en santé ont montré que les gras saturés étaient associés positivement avec la masse de plus grosses particules LDL [45, 48]. Une autre étude, effectuée sur une période de 4 semaines, a également montré qu'une diète riche en gras saturé augmentait la taille des LDL comparativement à une diète riche en glucides [49]. Finalement, une diminution de la taille des LDL est observée suite à une intervention alimentaire réduite en gras à moins de 10% de l'énergie pendant une période de 10 jours [50]. Les diètes riches en gras mono et polyinsaturés, quant à elles, ne font pas varier la taille des LDL [48], alors que les gras trans tendent à la diminuer [51].

1.7- Lien entre changements alimentaires et risque de MCV

Au cours des dernières années, il y a eu une augmentation des préoccupations concernant les dyslipidémies causées par l'alimentation, caractérisées par une élévation des triglycérides et des particules LDL petites et denses ainsi qu'une diminution de la concentration de C-HDL [52]. Ce profil métabolique est un contributeur majeur à l'augmentation du risque de MCV. Autant l'augmentation de l'adiposité [53] qu'une consommation élevée de glucides [54] ont été montrées comme augmentant la magnitude de ce profil. Le type de glucides consommés (simple ou complexe) pourrait également affecter les lipoprotéines [55, 56], particulièrement les sucres simples qui créeraient un état métabolique favorisant une élévation des triglycérides, une réduction du C-HDL et une augmentation des concentrations de particules LDL petites et denses et des résidus de

chylomicrons à jeun [40, 54]. Ainsi, une charge glycémique élevée est associée à un risque de MCV élevé indépendant des autres facteurs de risque connus [57] [58].

Vu son effet sur les concentrations de C-LDL ainsi que sur les autres lipoprotéines plasmatiques, une alimentation riche en gras saturé affecte, elle aussi, les risques de MCV [12]. En ce sens, la consommation de cholestérol alimentaire et de gras saturés, particulièrement ceux à chaînes longues, sont des déterminants importants impliqués dans le développement de l'athérosclérose [1]. Les taux de cholestérol consommés dans la diète modulent l'effet des gras saturés sur la concentration de C-LDL. Ainsi, une faible consommation en cholestérol engendre un effet minimal des gras saturés sur le C-LDL, alors qu'une consommation élevée en cholestérol favorise une élévation des concentrations de C-LDL avec les mêmes taux de gras saturés [59].

Ainsi, Santé Canada et l'Association américaine du coeur recommandent une consommation de gras totale entre 20 et 35%, une réduction de la consommation des gras saturés, une consommation de glucides alimentaires variant entre 45 et 65% ainsi qu'un apport en cholestérol alimentaire de moins de 300 mg/jour [4, 13, 14]. Malgré ces recommandations, une étude publiée en 2000 a montré que 53% de l'énergie des Canadiens provenait des glucides et plus de 30% provenait des lipides, dont 10% des gras saturés [60].

1.8- Temps nécessaire pour induire changement alimentaire

L'athérosclérose est un processus qui débute dès l'enfance. La période d'incubation pour le développement de l'athérosclérose dans les artères coronariennes vers une maladie clinique est très longue [61]. Par contre, le temps nécessaire pour induire un changement au niveau des facteurs de risque de MCV n'est pas encore clairement établi. Bien que certaines études se sont intéressées à l'effet d'une alimentation à court terme sur certains paramètres du bilan lipidique [62-65], aucune d'entre elles n'a évalué l'effet d'un changement au niveau alimentaire sur la taille des LDL.

Une consommation de gras saturés augmente les concentrations de grosses particules de LDL enrichies en cholestérol, alors qu'une réduction des concentrations du C-LDL total est observée avec de faibles apports en gras saturés. [66]. Cet effet apparait en

moins d'un mois et est indépendant de la perte de poids. La plupart des études d'intervention cherchant à identifier l'effet d'une alimentation sur la taille des LDL se déroulent sur quelques semaines. Par contre, la durée requise pour induire une telle variation n'est pas définie.

2- Coup d'œil sur la digestion

L'équilibre des sterols (cholestérol et phytosterol) de l'organisme est délicatement régulé par le tractus gastro-intestinal et le foie. De nombreux efforts sont actuellement faits afin de mieux comprendre la physiologie du transport des gras au niveau intestinal étant donné la relation entre le cholestérol absorbé, le cholestérol plasmatique et les MCV [67, 68]. Dans le tractus gastro-intestinal, le cholestérol provient de la diète (300-500 mg /jour), de la bile (800-1200mg /jour) et de la desquamation cellulaire (300mg /jour). L'absorption des différents lipides alimentaires est très efficace, alors que celle du cholestérol, qui est également un type de lipides, varie de 30 à 80% [69]. Chez les humains, les deux tiers du cholestérol absorbé viennent de la bile alors qu'un tiers provient de l'alimentation. Le cholestérol est essentiel au fonctionnement des membranes cellulaires, il est un précurseur des hormones stéroïdiennes et des acides biliaires et joue également un rôle dans la signalisation moléculaire ainsi que dans la régulation de la transcription génique [70-73]. Un délicat équilibre est maintenu entre le cholestérol absorbé, synthétisé et excrété au niveau fécal.

La digestion intestinale du cholestérol ne diffère pas beaucoup de celles des gras alimentaires dans la mesure où les sels biliaires et les enzymes pancréatiques du petit intestin sont requis pour la formation de micelles et l'hydrolyse enzymatique [74]. Le petit intestin est une voie majeure dans l'entrée des acides gras et du cholestérol dans l'organisme. Ainsi, l'alimentation a un rôle clé dans la lipémie. L'alimentation est constituée de différents macronutriments, de micronutriments ainsi que de vitamines et de minéraux. Les aliments consommés doivent subir certaines transformations physiques et chimiques afin d'être absorbés.

Bien que la digestion alimentaire soit complexe, elle peut se résumer ainsi. Les aliments subissent une déformation physique par la mastication dans la bouche. C'est à cet

endroit que la digestion débute par les enzymes salivaires, dont 1'amylase, les sels salivaires et les protéines salivaires. La nourriture est ensuite dirigée vers l'estomac où le broyage et la transformation chimique se poursuivent. Les sels gastriques, la lipase gastrique, la pepsine ainsi que d'autres enzymes entrent alors en jeu et une emulsion des gras alimentaires s'y produit de façon importante. Le bol alimentaire est finalement dirigé vers le petit intestin où il sera mélangé aux sels biliaires et pancréatiques afin de maximiser l'absorption des micro et des macronutriments, qui se déroule dans le petit intestin, particulièrement au niveau du jéjunum.

Les lipides sont hydrophobes, faisant en sorte qu'ils ne se mélangent pas au bol alimentaire s'ils ne subissent pas de nombreuses transformations afin d'être absorbés. Ainsi, le broyage au niveau de l'estomac et la présence des sels gastriques et hépatiques permet la formation de micelles (figure 3) [75]. Les micelles sont hydrosolubles, permettant aux lipides de circuler librement avec le bol alimentaire dans le tractus gastro-intestinal. Une hydrolyse par les sels pancréatiques permet une diminution de la taille des micelles et ainsi, facilite l'absorption du glycerol et des acides gras [75]. Finalement, les multiples villosités au niveau intestinal permettent aux micelles de transférer les acides gras et le glycerol aux entérocytes. Quelques acides gras, ceux à courtes et moyennes chaînes peuvent diffuser passivement afin d'aller directement à la veine porte, sans être incorporés aux chylomicrons, mais la majeure partie doit être absorbée par des transporteurs spécifiques afin d'être absorbés.

Bouche:

pH 5-7, protéines salivaires, sels,

amylase

Figure 3 : Digestion des lipides alimentaires

Estomac: pH 1-3, sels, pepsine, lipase gastrique, mucine Petit intestin: pH 6-7.5 sels, bile, pancreatine (lipase, protease) Emulsions

•r %

Traduction libre et adaptation de . Singh, 2009 [75]

Une fois incorporés dans la cellule, le glycerol et les acides gras sont transformés en triglycéride dans le reticulum endoplasmique avant d'être incorporés au préchylomicrons. Ces derniers quittent le reticulum endoplasmique dans des vésicules de transport vers l'appareil de Golgi, pour finalement être transportés vers la membrane basolatérale où ils seront expulsés par exocytose [76]. Les cellules intestinales sécrètent principalement des chylomicrons, mais produisent également des VLDL et des HDL [77, 78]. Bien que tous les mécanismes ne soient pas tous clairement définis, de nombreuses étapes du processus menant à la synthèse des chylomicrons ont été éclaircies au cours des dernières années.

3- Gènes intestinaux impliqués dans le métabolisme des lipoprotéines

Encore récemment, il était assumé que l'absorption intestinale du cholestérol/stérol était un processus énergie-indépendant, de diffusion passive à travers la bordure en brosse allant de la lumière intestinale vers l'entérocyte. Maintenant, les scientifiques s'entendent pour dire que ce n'est pas le cas. Plus d'une cinquantaine de gènes ont été identifiés comme jouant un rôle dans la différenciation cellulaire des entérocytes. Parmi ceux-ci, un grand nombre sont impliqués dans la biologie et le transport des lipoprotéines [79]. Grâce à la découverte de la molécule à la base d'un rare désordre génétique chez l'humain, la sitostérolémie, ainsi que le mécanisme d'action d'un médicament, l'ezetimibe, de nombreuses molécules ont été identifiées comme étant des transporteurs clés du cholestérol et des phytostérols [80, 81].

L'assemblage des lipoprotéines intestinales est crucial pour l'absorption des lipides alimentaires [82]. Les cellules intestinales de 1'endothelium ont une habileté unique à assembler et sécréter des chylomicrons, le véhicule majeur pour le transport des lipides alimentaires [83-85]. La formation des chylomicrons est complexe et requiert tout d'abord la captation des produits de la lipolyse, la ré-estérification et la translocation des groupes de lipides cellulaires, la synthèse et les modifications posttranslationnel d'apo et finalement l'assemblage des lipides et de l'apo [86, 87]. Plusieurs évidences supportent le concept que de nombreuses protéines sont requises pour l'absorption des sterols, la formation et le transport des chylomicrons ainsi que différents facteurs de transcription (figure 4).

Figure 4 : Gènes impliqués dans l'absorption des acides gras et du cholestérol dans l'entérocyte • Phytosterol • C-libre 0 Acides gras • Phospholipides t . Glycerol ê J_w àf* Whim. • " • ^ ^ ENTEROCYTE A I AIV Chylomicron

Traduction libre et adaptation de . Lévy, 2007[74] 3.1- Gènes modulant l'absorption des sterols

Les acides gras sont transportés sous forme de triglycérides et sont hydrolyses en glycerol et en acides gras libres afin d'être absorbés par l'entérocyte [88]. Par contre, il y a très peu de connaissance actuellement sur l'effet des différentes diètes sur l'expression des gènes des entérocytes. Actuellement, quelques gènes impliqués dans l'absorption du cholestérol et des phytostérols sont connus.

Parmi ceux-ci, la protéine du transporteur de sterols Niemann-Pick Cl-like 1 (NPC1L1), découverte en 2000, est exprimée dans la membrane apicale de l'entérocyte,

notamment au niveau du jéjunum proximal ainsi qu'au niveau hépatique [89, 90]. Son inhibiteur spécifique, l'ezetimibe, a permis l'identification de ce gène pour son rôle dans l'absorption du cholestérol et des phytostérols. Lally a suggéré que l'augmentation de NPC1L1 résultait d'une augmentation de l'absorption du cholestérol biliaire et possiblement de la synthèse de novo du cholestérol dans l'intestin [91]. La présence d'élément régulant les sterols dans la région promotrice suggère que NPC1L1 est régulée par les sterols tels que le sont de nombreux autres gènes impliqués dans la synthèse et le métabolisme du cholestérol [92].

D'un autre côté, les gènes des transporteurs à cassette G5 et G8 liant l'ATP (ABCG5 et ABCG8) régulent également l'homéostasie du cholestérol par l'excrétion du cholestérol et des phytostérols dans la lumière de l'intestin [80, 90, 93]. Ces derniers sont également retrouvés au niveau de la bordure en brosse du petit intestin [81, 94]. Une très forte association est observée entre ABCG5 et ABCG8 qui travaillent en tandem pour le retour du cholestérol et des phytostérols vers la lumière intestinale [91, 95]. De nombreuses études montrent également une corrélation inverse entre NPC1L1 et ABCG5/8 suggérant une coordination de leur mécanisme dans la régulation de l'homéostasie du cholestérol [91, 96]. Une augmentation de l'expression de TABCG5 et ABCG8 est observée avec une augmentation de la sécrétion du cholestérol biliaire réduisant l'absorption du cholestérol et augmentant la synthèse hépatique du cholestérol [94]. L'excrétion des phytostérols, par ces protéines, est préférée à celle du cholestérol. Une anomalie dans la protéine de PABCG5/8 entraîne une maladie nommée sitostérolémie, résultant en une augmentation de l'absorption intestinale du cholestérol et des phytostérols [97]. L'identification du locus de cette maladie, en 1998 [98], a permis à deux équipes, en 2000, d'identifier les gènes ABCG5 et ABCG8[81,99].

D'autres protéines transmembranaires, retrouvées dans l'intestin proximal, dont la protéine de liaison des acides gras 2 (FABP2) et 4 (FABP4) et la protéine de transport des acides gras (FATP4) jouent un rôle dans l'absorption des acides gras à chaînes longues [100-102]. En effet, l'expression des FABPs est augmentée chez le rat avec une diète riche en gras [103]. Le FABP2 serait impliqué dans le transport intracellulaire des acides gras à chaînes longues, alors que les FABP4 ne capteraient pas les mêmes acides gras [104].

FATP4, quant à lui, serait responsable des plus de 60% de la captation des acides gras à longues chaînes dans la lumière intestinale [105].

3.2- Gènes modulant la formation et l'excrétion des chylomicrons

De nombreux gènes sont impliqués dans la formation et le transport du chylomicron notamment celui de l'apo B48 qui synthétise la protéine de l'apo B nécessaire à la formation du chylomicron, celui de la protéine de transfert microsomal des triglycérides (MTP) qui assemble le chylomicron et celui de la protéine de trafic membranaire SAR1B (SAR1B) qui transporte le chylomicron.

Chez le singe, une alimentation modérée en cholestérol pour une période de 5 ans augmente l'expression du gène de l'apo B de 30%. De plus, la diète riche en gras saturé tend à augmenter l'expression de ce gène comparativement à une diète riche en gras polyinsaturé. Ces résultats suggèrent que l'expression du gène de l'apo B reflète la production et la synthèse des chylomicrons [31]. Il est important de se rappeler que le gène de l'apo B dans l'intestin produit une apolipoprotéine incomplète à son extrémité N-terminal à 48% de la traduction du gène total de l'apo B, alors que le gène de l'apo B au niveau hépatique produit une apolipoprotéine complète à 100% [76]. C'est pour cette raison que l'apo B produite au niveau intestinal est nommée apo B48, alors que l'apo B synthétisée au niveau hépatique est appelée apo B100.

Une fois l'apo B48 formée, cette dernière peut être utilisée afin de former un chylomicron. Pour produire cette lipoprotéine, le gène MTP est nécessaire. La protéine MTP assemble les lipoprotéines riches en triglycérides, soit les chylomicrons dans l'entérocyte et les VLDL au foie [106]. En effet, son absence cause une maladie nommée abétalipoprotéinémie qui résulte en une incapacité de l'organisme à former des chylomicrons et toutes les autres lipoprotéines contenant de l'apo B [107]. Certaines études tendent à montrer une relation positive entre le gène MTP et l'absorption des sterols ainsi qu'une diminution de son expression avec une augmentation de l'insuline [91, 108, 109]. Afin de former le chylomicron, le gène MTP assemble du cholestérol préalablement estérifié, des triglycérides, des phospholipides et une molécule d'apo B48 [85, 110]. Le cholestérol disponible dans l'entérocyte peut venir de sa captation par la protéine NPC1L1

ou par les récepteurs-LDL de la cellule ainsi que de sa synthèse endogène. Le chylomicron est ensuite transporté par la protéine produite par le gène SARI 13 du reticulum endoplasmique vers l'appareil de Golgi [91, 109].

3.3- Les facteurs de transcription

De nombreux facteurs gouvernent l'homéostasie des acides gras dans les cellules intestinales par leur implication dans la régulation des gènes impliqués dans le métabolisme des sterols tels que la protéine liant l'élément de réponse aux sterols (SREBP) et les récepteurs activés par les proliférateurs de peroxysomes (PPAR) [88, 90].

Les SREBPs sont divisés en deux grandes familles, soit la SREBP 1 qui régule la synthèse des triglycérides et des phospholipides et la SREBP2 qui régule la synthèse du cholestérol. Les études montrent que SREBP2 joue un rôle majeur dans l'expression des gènes NPC1L1, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A (HMGCoA) reductase et récepteur-LDL [111, 112]. En ce sens, l'expression et l'activité de NPC1L1 chez les humains sont modulées par le cholestérol à travers le mécanisme dépendant de SREBP2 [111]. Il est important de noter que les gènes SREBP2 et HMGCoA reductase sont possiblement gérés par des mécanismes post-transcriptionnels puisque dans certains cas, l'expression de la protéine peut changer sans qu'il y ait altération de l'ARNm [88].

Les PPARs sont également des facteurs de transcription comportant plusieurs membres, donc les PPARa et les PPARy. Les PPARs régulent le métabolisme du glucose et des acides gras. Les récepteurs nucléaires de la famille des PPARs peuvent être affectés par les acides gras à longues chaînes vu leurs propriétés ressemblant à des hormones [113]. PPARy est donc activé par de nombreux ligands alimentaires [114] et est régulé de façon post-transcriptionnelle [115]. Suite à la liaison avec un ligand, il forme un hétérodimère avec le récepteur aux rétinoïdes (RXR), menant à la régulation de la transcription de certains gènes. Il peut agir en tant que coactivateur ou corépresseur de l'expression de différents gènes [116].

Un autre facteur de transcription, le facteur nucléaire hépatocytaire-4a (HNF4a) a également été trouvé dans la région promotrice de NPC1L1 [117]. D'autres facteurs de

transcription sont actuellement connus, dont la voie du récepteur X hépatique (LXR) qui module les niveaux d'expression des transporteurs ABC [81, 94]. Par contre, ils ne feront pas l'objet du présent travail.

3.4- Fffet de la composition nutritionnelle sur l'expression des gènes intestinaux De nombreuses études ont évalué l'effet de l'alimentation sur l'expression de différents gènes chez les humains. Parmi celles-ci, des interventions ont montré une augmentation de 15 à 56% ou une absence de changement dans l'expression des gènes impliqués dans le métabolisme des lipides, des glucides et de l'énergie du tissu adipeux avec une diète moyennement riche en gras ainsi qu'une diminution ou une absence de changement avec une diète faible en gras [118]. Une autre étude, effectuée chez une quarantaine de cyclistes, a montré des changements dans l'expression des gènes des muscles squelettiques suite à la consommation d'une diète riche en gras, comparée à une diète faible en gras d'une durée de 5 jours [119]. Chez les humains, aucune étude n'a évalué l'effet d'une variation alimentaire sur l'expression des gènes intestinaux.

Depuis de nombreuses armées, des chercheurs s'intéressent à l'effet de l'alimentation sur l'expression des gènes dans l'intestin sur différents modèles cellulaires et animales. En 1974, une étude a montré que l'expression intestinale de FABP était augmentée chez les animaux maintenus sur une diète riche en gras comparativement à une diète faible en gras [120]. Une diminution des sterols ainsi que l'augmentation de l'insuline résulteraient en une régulation négative de MTP [121]. Dans une autre étude, un traitement des cellules entérocytes Caco-2/TC-7 avec des gras saturés, polyinsaturés et monoinsaturés n'a montré aucun changement sur l'expression d'ARNm de NPC1L1, mais une diminution de l'expression protéique avec les gras polyinsaturés [122]. Chez les souris, une alimentation riche en gras pour une période de 3 semaines comparativement à une diète contrôle, montre une stimulation de l'expression de plusieurs gènes jouant un rôle dans la captation des acides gras à chaînes longues (FATP4, FABP2/4) et dans la synthèse des lipoprotéines [123]. Selon une autre étude d'intervention de 7 jours chez le rat, une augmentation de l'expression des gènes impliqués dans l'assemblage des lipoprotéines (MTP, Apo B) de même qu'une activation de SREBP 1 ont été observées suite à une diète riche en gras [124]. La consommation de certains gras spécifiques, dont les gras

polyinsaturés diminuerait la transcription de SREBP1, mais n'aurait pas d'effet sur SREBP2 chez les rats et les hamsters [125, 126]. Ces derniers seraient des ligands nucléaires directs de la famille des PPARs [127]. Autant chez les animaux que dans les cultures cellulaires, l'exposition excessive de cholestérol résulterait en une inhibition de SREBP1 et SREBP2 [128, 129].

3.5- Marqueurs d'absorption et de synthèse du cholestérol

Une diète riche en gras favorise une excrétion biliaire augmentée, faisant en sorte que la production hépatique de cholestérol doit être augmentée. En fait, il est possible de mesurer cette production grâce à un marqueur de synthèse nommé le lathostérol. En fait, les niveaux de lathostérol plasmatique, qui est un précurseur du cholestérol, sont positivement reliés à la synthèse de cholestérol total [130].

Il est également possible de connaître les taux d'absorption de cholestérol par la mesure des phytostérols qui ne sont pas synthétisés par l'organisme. Il existe plus de 200 types de phytostérols. Ces derniers ressemblent beaucoup au cholestérol, mais proviennent uniquement des plantes. Leur consommation alimentaire est d'environ 0.3 à 0.4g/ jour. Afin d'avoir des effets bénéfiques sur les niveaux des lipides sanguins, il faut une consommation quotidienne cinq fois plus importante [131]. De plus, les phytostérols sont absorbés en faible proportion dans l'organisme (moins de 5%) comparativement au cholestérol alimentaire (moins de 50%) [69, 130, 132]. Les taux plasmatiques de phytostérols ne reflètent pas toujours la quantité de cholestérol absorbé, mais ils corrèlent généralement bien avec celle-ci. En effet, Racette a observé que l'augmentation de la consommation de phytostérols alimentaires entraînait une augmentation des concentrations plasmatiques de phytostérols des sujets à l'étude tout en diminuant leur pourcentage d'absorption de cholestérol mesuré par isotope. Ainsi, les concentrations plasmatiques de phytostérols reflètent plus le pourcentage d'absorption du cholestérol [133]. Deux types de phytostérols sont particulièrement abondants dans l'alimentation, soit le campestérol et le B-sitostérol. En ce sens, en 1986, Tilvis et collaborateurs ont montré une étroite corrélation entre le ratio sérique de campestérol/cholestérol et le pourcentage d'absorption du cholestérol [134]. Lorsque l'absorption de cholestérol est diminuée ou qu'il y a une accélération de la perte de cholestérol, la synthèse de celui-ci est augmentée, faisant en

sorte qu'une augmentation de l'absorption du cholestérol est normalement associée avec une diminution de la synthèse [94].

4- Les chylomicrons

Les chylomicrons sont les véhicules majeurs des gras alimentaires [77, 84, 85]. Suite à la production des chylomicrons par les entérocytes, ces derniers sont mis en circulation par le canal lymphatique. De nombreux facteurs sont impliqués dans la synthèse, la sécrétion et l'élimination de ces derniers. Très peu d'information est présentement disponible en ce qui a trait à l'effet de l'alimentation sur la production et la sécrétion des chylomicrons. Par contre, des évidences montrent une étroite relation entre l'état d'insulino-résistance et un retard dans l'élimination des résidus de chylomicrons. En ce sens, des études ont montré une production augmentée et une clairance diminuée des chylomicrons chez des sujets insulino-résistants et des diabétiques de type 2, faisant en sorte que les concentrations plasmatiques de ces derniers sont en plus élevées chez ces personnes [135, 136].

4.1- Synthèse et sécrétion des chylomicrons

La biogenèse des chylomicrons débute tout d'abord, par l'assemblage d'une apo B48, des phospholipides, de cholestérol et de triglycérides. La particule ainsi formée est dense. La partie la plus importante de cette lipoprotéine est l'apo B48. Une fois construite, la survie de l'apo B48 dépend de la disponibilité des lipides dans le reticulum endoplasmique [76].

4.2- Clairance des chylomicrons

Les chylomicrons demeurent peu de temps en circulation. En effet, leur clairance se fait en 3 à 5 heures [137, 138]. Par contre, des résidus de chylomicrons peuvent être retrouvés à jeun. Ces résidus sont très athérogènes. La clairance se fait par les récepteurs-LDL grâce à une interaction avec l'apo E portée par le chylomicron. D'autres récepteurs peuvent aussi les capter, dont la protéine apparentée aux récepteurs des LDL (LRP) et les récepteurs-VLDL [23]. La captation semble être influencée par la production hépatique de VLDL. En effet, les lipoprotéines riches en triglycérides hépatiques et intestinales sont en

compétition pour leur élimination puisqu'elles sont captées par les mêmes récepteurs. L'état métabolique peut également influencer leur captation. En effet, l'insulino-résistance ralentit la clairance des chylomicrons. Cet effet est aussi observé à long terme avec les diètes riches en glucides, particulièrement en sucres simples, qui favorisent un état semblable à celui observé avec l'insulino-résistance.

5- Hypothèses et Objectifs

La taille des LDL est fortement liée à la quantité de triglycérides plasmatiques. En effet, plus les triglycérides plasmatiques augmentent, par exemple suite à une diète riche en sucres simples comparativement à une diète riche en gras saturé, plus les LDL deviennent petites et denses. Grâce aux études de cinétique, il est possible de savoir que le temps de résidence des particules LDL est de moins de 2 à 3 jours et que les taux de triglycérides changent en quelques heures, nous poussant à nous questionner sur l'effet d'une intervention alimentaire de trois jours sur la taille des LDL. Ainsi, nous avons émis l'hypothèse qu'une diète riche en gras, à court terme, pourrait faire augmenter la taille des LDL comparativement à une diète faible en gras.

L'épithélium du petit intestin change continuellement, favorisant un changement complet des cellules en 3 à 5 jours [139, 140]. Des progrès importants ont été faits dans les dernières années afin d'élucider les mécanismes responsables pour la régulation de l'absorption intestinale du cholestérol et des lipides alimentaires. Par contre, aucune étude, à notre connaissance, n'a comparé l'effet d'une diète sur les gènes intestinaux chez l'humain en santé. Pour cette raison, nous avons émis l'hypothèse qu'une alimentation riche en gras, à court terme, pourrait augmenter l'expression de certains gènes impliqués dans le métabolisme du cholestérol, au niveau du duodénum, comparativement à la diète faible en gras. De plus, une diète riche en gras comparativement à une diète faible en gras pourrait favoriser une meilleure absorption du cholestérol et diminuer la synthèse endogène de ce dernier. Ses résultats de recherche ne feront par contre pas l'objet du présent mémoire.

CHAPITRE III : Effet d'une diète riche en gras de trois

jours comparativement à une diète faible en gras sur la

taille des LDL

L fleet of a three days high-fat diet compared with a low-fat diet on LDL particle size

Valérie Guay1, Benoît Lamarche1, Amélie Charest1, André J Tremblay1 and Patrick Couture2

Institute on Nutraceuticals and Functional Foods, Laval University, Québec, Canada Lipid Research Center, CHUL Research Center, Québec, Canada

RESUME

La diète riche en gras est associée à une élévation des concentrations plasmatiques de cholestérol (C) et à la formation de grosses particules LDL. Cependant, la durée nécessaire pour induire ce changement n'est pas clairement définie. Objectif: Évaluer l'effet d'une intervention alimentaire à court terme sur la taille des particules LDL. Méthode : Étude randomisée, à double insu en chassé-croisé chez 12 hommes en santé ayant un profil lipidique normal. Les participants ont consommé successivement deux diètes isocaloriques de 3 jours, soit une diète riche en gras (37% de gras - 15% saturés, 3.5% trans -50% glucides) et une diète faible en gras (25% de gras - 6% saturés, 0% trans -62% glucides). Les analyses ont été faites sur les échantillons sanguins prélevés à jeun à la fin de chacune des interventions de 3 jours. Les particules LDL ont été caractérisées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec un gradient de 2 à 16%. Résultats : Comparativement à la diète faible en gras, le C plasmatique, le C-LDL et le C-HDL ont augmenté de +7.4% (P=0,02), +16.9% (P=0.005) et +9.3% (p=0.002) respectivement, suite à la diète riche en gras. Les niveaux de triglycéride ont diminué de -31.8% (P=0.001) suite à cette intervention. La diète riche en gras a également été associée à une augmentation significative de la taille des particules LDL (riche : 255.86 vs faible : 255.02 Â ; P=0.008) et une diminution de 12.0% de la proportion de petites LDL (< 255.0 Â ; P=0.02). Les changements dans les niveaux de triglycéride sont corrélés avec les changements dans la proportion des petites particules LDL (r=0.66, P=0.02). Conclusion : Comparativement à la diète faible en gras, l'augmentation du cholestérol plasmatique de la diète riche en gras est associée à la formation de grosses particules LDL après seulement 3 jours d'intervention.

EFFECT OF SHORT-TERM LOW- AND HIGH-FAT DIETS ON LDL PARTICLE SIZE IN NORMOLIPIDEMIC SUBJECTS

Authors

Valérie Guay1, Benoît Lamarche1, Amélie Charest1, André J Tremblay1 and Patrick

Couture From the:

1 Institute on Nutraceuticals and Functional Foods, Laval University, Québec, Canada

2 Lipid Research Center, CHUL Research Center, Québec, Canada

Running footline: LDL size, plasma triglycerides, LDL phénotype, dietary fat

Address for correspondence: Patrick Couture, MD, FRCP(C), PhD Lipid Research Center

CHUL Research Center 2705 Laurier boulevard, S-l02 Québec, Qc, Canada G1V4G2 Tel. : 418-654-2106 Fax:418-654-2277 E-mail : patrick.couture(a>crchul.ulaval.ca Word count : 6353

Word count of abstract : 295 Number of figures and tables : 5

Abstract

High-fat low-carbohydrate diets have been shown to raise plasma cholesterol levels, an effect associated with the formation of large low density lipoprotein (LDL) particles. However, the impact of dietary intervention on time-course changes in LDL particle size has not been investigated. To test whether a short-term dietary intervention affects LDL particle size, we conducted a randomized, double-blind, cross-over study using a short-term, intensive dietary modification in 12 healthy men with normal plasma lipid profile. Participants were subjected to two isocaloric 3-day diets: high-fat diet (37% energy from fat - 15% from saturated fat, 3.5% from trans fat - and 50% from carbohydrates), and low-fat diet (25% energy from low-fat - 6% from saturated low-fat, 0% from trans low-fat - and 62% from carbohydrates). Normal foods were provided. Plasma lipid levels and LDL particle size were assessed on fasting blood samples after 3 days of feeding on each diet. LDL particles were characterized by polyacrylamide gradient gel electrophoresis. Compared to the low fat diet, plasma cholesterol, LDL-cholesterol and high density lipoprotein cholesterol were increased by 7.4% (P=0.02), 16.9% (P=0.005) and 9.3% (P=0.002), respectively, following the 3-day high-fat diet. Plasma triglycerides and fasting apolipoprotein B48 levels were decreased by 31.8% LP=0.001) and 39.5% (P=0.003) after the high-fat diet compared with the low-fat diet. The high-fat diet was also associated with a significant increase in LDL particle size (255.86 vs 255.02 Â ; /M).008) and a 12.0% decrease in the proportion of small LDL particle (< 255.0 Â) (P=0.02). Changes in plasma triglyceride levels following high-fat diet were positively correlated with concurrent changes in the proportion of small LDL particles (r=0.66, P=0.02). In conclusion, as compared with a low-fat diet, the cholesterol-raising effect of a high-fat diet is associated with the formation of large LDL particles after only 3 days of feeding.

Introduction

Low density lipoprotein (LDL) particles are heterogeneous in terms of density, size, lipid composition, electrical charge, and pathogenic properties [1] and it is now being recognized that small dense LDL particles are associated with an increased risk of coronary heart disease (CHD) [2] even in the presence of relatively normal plasma LDL-C concentrations [3]. Intrinsic properties of small, dense LDL particles have been suggested to be biologically responsible for increasing the risk of developing CHD and, in fact, several characteristics link small LDL subfractions to atherogenesis, these include: enhanced susceptibility to oxidation [4], long residence time in plasma and enhanced capacity to bind to intimai proteoglycans associated with increased permeability through the endothelial barrier [5, 6]. Furthermore, subtle variations in LDL particle composition and diameter have been shown to induce important conformational changes of apoB-100, which may alter epitope exposure, and cause changes in LDL receptor binding affinity [7, 8]. Together, these findings support the hypothesis that small, dense LDL particles contribute to an increased risk of future CHD, and that the distribution and concentration of these atherogenic lipoproteins may be used to evaluate response to lipid therapy [9].

Several lines of evidence suggest that heterogeneity in LDL particle size is most likely attributable to a complex network of genetic, metabolic, and environmental factors including dietary composition [10-13]. In general terms, most studies that have compared low-fat and high-fat diets consumed under isocaloric conditions have shown an association between increases in dietary carbohydrates and reductions in LDL size [13]. Indeed, the metabolic effects of low-fat, high-carbohydrate diets are complex and include not only a reduction in LDL particle size but also increased plasma levels of triglyceride-rich lipoproteins, reduced high density lipoprotein (HDL) cholesterol concentrations, and increased insulin levels [14], a constellation of factors associated with increased cardiovascular risk [15]. So far, the reduction in LDL size associated with low-fat, high carbohydrate diets have been reported in the context of long-term dietary intervention. By contrast, little is known about early changes of LDL particle size that could occur in response to short-term dietary intervention. These potential changes deserve to be characterized, especially when considering the significance of small, dense LDLs as a cardiovascular risk factor. For this study, which intended to analyze whether such early

changes in LDL particle size occurred, we conducted a randomized, double-blind, crossover intervention using a short-term, intensive dietary modification in 12 healthy men with normal plasma lipid profile.

Subjects and Methods Subjects

Twelve healthy men were recruited in the Québec city metropolitan area to participate in the study. The participants were aged between 18 and 50 years, were non-smokers, had a body mass index between 20.0 and 30.0 kg/m2 and had normal plasma LDL-cholesterol, HDL-cholesterol and triglyceride levels. None of the subjects was vegetarian or had some extreme dietary practices. Subjects were excluded if they had monogenic hyperlipidemia, such as familial hypercholesterolemia; had a history of cardiovascular events or taking medications known to affect lipoprotein metabolism; had diabetes mellitus; had history of cancer; had hematologic, digestive or central nervous system disorders; had impairment of renal function, dysproteinemia, nephritic syndrome or other renal disease; had coagulopathy; had human immunodeficiency virus; or had history of mental instability, drug and alcohol abuse. The participants were maintaining their current physical activities throughout the study. The characteristics of the subjects at the time of screening are shown in Table 1. The research protocol was approved by the Laval University Medical Center ethical review committee and written informed consent was obtained from each subject.

Experimental design

The study was performed as a double-blind randomized, crossover intervention with two experimental phases where the participants received a high-fat diet and low-fat diet in random order. Each experimental phase consisted of 3 feeding day periods, each separated by a 2-week washout period where participants returned to their habitual ad libitum diets. Meals were prepared at the Institute of Nutraceuticals and Functional Foods Research Unit of Laval University for consumption on site of at least two of the three meals including breakfast. The other meal was available for take-out. The subjects were instructed to consume their entire meal provided to them and not to supplement their diet with any other food or drink except water and a maximum of two cups of coffee per day. Subjects were required to not consume any drugs throughout the study. A validated food-frequency questionnaire was administered to the participants by a registered dietitian at the beginning of the study to estimate the energy intake required to keep the body weight constant [16].

Each participant was then assigned to a level of energy intake. Fasting blood samples were obtained after each dietary phase.

Experimental diets

During each experimental phase, subjects consumed a solid food diet typical of those consumed in North America. The high-fat diet reflected as closely as possible current North American men averages [17, 18] The low-fat diet represented the recommendations of the NCEP ATPIII [19]. Both diets were identical in terms of menu, calories, proteins, fibers, monounsaturated and polyunsaturated fatty acids (see Table 2). The quantities of vegetable and animal protein, soluble and no soluble fibers were also identical between the two diets. Experimental diets were formulated by using NUTRITION DATA SYSTEM (NDS) software (version 4.0331 ; nutrition coordinating center, Minneapolis, MN).

Anthropometric measurements and blood pressure

Body weight and waist circumference were measured according to standardized procedure [20] at the beginning of the intervention. At the same time, systolic and diastolic blood pressures were taken after a 10-min rest in the sitting position. It was measured on the right arm using an automated blood pressure monitor (BPM 300-BpTRU: Vital Signs Monitor).

Plasma lipids, lipoproteins and apoproteins

Venous blood samples were collected from an antecubital vein into Vacutainer tubes containing K3EDTA (1 mg/ml, final concentration) after a 12-hour fasting period. Samples were then immediately centrifuged at 4°C for 10 minutes at 3000 rpm to obtain plasma and were stored at 4°C until processed. Cholesterol and triglycerides levels were determined in plasma and lipoprotein fractions were quantified by enzymatic methods (Randox Co., Crumlin, UK) using a RA-500 analyzer (Bayer Corporation Inc., Tarrytown, NY), as previously described [21]. Heparin and manganese chloride [22] were added to precipitate apolipoprotein (apo) B-containing LDL, leaving the HDL in solution. The LDL-C was calculated according to the equation described by Friedewald et al. [23] [LDL-CFried] = [Total cholesterol] - [HDL-C] - [TG]/2.2. Plasma apolipoprotein (apo) AI and apo B levels were measured using a Behring Nephelometer BN-100 (Behring Diagnostic, Westwood, MA) with reagents and calibrators (Dade Behring, Mississauga, ON) provided

by the manufacturer. Plasma apo B48 was assessed by a sandwich ELISA method using monoclonal antibody (Shibayagi Co, Ltd, Gumma, Japon) [24].

Measurement of glucose, insulin and free fatty acids

Plasma glucose was measured enzymatically, whereas plasma insulin was measured by radioimmunoassay with polyethylene glycol separation [25, 26]. Free fatty acids levels were measured with an enzymatic detection kit (ZenBio, Research Triangle Park, NC, USA).

Cholesterol ester transfer protein measurements

Plasma cholesterol ester transfer protein (CETP) mass concentration was determined by a commercial sandwich ELISA immunoassay kit (Wako Chemicals Inc., Richmond, VA) as previously described [27]. Plasma CETP mass concentration and plasma CETP activity are strongly correlated [19].

LDL particle size characterization

Nondenaturing 2% to 16% PAGGE was performed as described previously [3]. LDL particle size was determined on 8x8-cm polyacrylamide gradient gels prepared in batches in our laboratory. Aliquots of 3.5 uL of whole plasma samples were mixed in a 1:1 volume ratio with a sample buffer containing 20% sucrose and 0.25% bromophenol blue and loaded onto the gels. A 15-minute prerun at 75 V preceded electrophoresis of the plasma samples at 150 V for 3 hours. Gels were stained for 1 hour with Sudan black (0.07%) and stored in a 0.81% acetic acid/4% methanol solution until analysis by the Imagemaster 1 -D Prime computer software (Amersham Pharmacia Biotech). LDL size was extrapolated from the relative migration of 4 plasma standards of known diameter. The estimated diameter for the major peak in each scan was identified as the LDL-Peak Particle Diameter (LDL-PPD). An integrated (or mean) LDL diameter was also computed by using a modification of the approach described previously [3]. This integrated LDL particle size corresponds to the weighted mean size of all LDL subclasses in each individual. It was calculated as a continuous variable and was computed as the sum of the diameter of each LDL subclass multiplied by its relative area. Analysis of pooled plasma standards revealed that measurement of LDL-PPD was highly reproducible, with an interassay coefficient of variation of <2%. The relative proportion of LDL having a diameter <255 Â (LDL%<255 Â) was ascertained by computing the relative area of the densitometric scan <255 Â [28].

The absolute concentration of cholesterol among particles <255 Â (LDL-C<255 A) was calculated by multiplying the plasma LDL-C levels by the relative proportion of LDL with a diameter <255 Â [28]. A similar approach was used to assess the relative and absolute concentrations of cholesterol in particles with a diameter between 255 and 260 Â or >260 Â (LDL%255-260 A, LDL-C255-260 A and LDL%>260 À, LDL-C>26oA, respectively).

Statistical Analysis

LDL-PPD and LDL integrated size were normally distributed. Spearman correlation coefficients were determined to assess the significance of associations. All analyzes were performed using JMP Statistical Software (version 8.0.1, SAS Institute, Cary, NC). Non parametric Wilcoxon test for continuous measures was used to assess differences between the two dietary interventions.

Results

Characteristics of the subjects

Subject baseline characteristics at screening are presented in Table 1. The mean age and body mass index of participants were 27.1+3.9 years and 25.2+3.0 kg/m , respectively. The mean plasma lipid levels were between the 40th and the 75th percentiles for men aged 25-34 years [29] with total cholesterol, LDL-C, HDL-C and triglyceride concentrations at 4.70+0.59 mmol/L, 2.72+0.64 mmol/L, 1.43+0.34 mmol/L and 1.20+0.58 mmol/L, respectively.

Plasma lipid, lipoprotein and apoprotein concentrations

Table 3 shows the lipid/lipoprotein profile of subjects following each treatment phase with low-fat and high-fat diets. High-fat diet led to significant increases in the concentrations of plasma cholesterol (7.4%; P=0.02), LDL-C (16.9%; P=0.005), HDL-C (9.3%; .P=0.02) and was associated with significant reductions in plasma triglyceride (31.8%, i>=0.01) and fasting apo B48 levels (39.5%, P=0.003). However, the high-fat diet had no significant impact on plasma apo B and apo A-I levels. High-fat diet decreased insulin and free fatty acids levels by 18.4% and 7.3% respectively, but these reductions did not reach statistical significance. Finally, the high-fat diet led to a significant increase in CETP mass (11.7%, P=0.008).

Electrophoretic characteristics of LDL particles

As shown in Table 3, high-fat diet significantly increased LDL particle size by 0.33% (p=0.008) as compared with the low-fat diet while no change was observed for the LDL-PPD. The high-fat diet also increased the percentage of large>26oA and medium255A-260Â LDL particles and decreased the percentage of small <255À LDL particles. The amount

of cholesterol in the large>260A and the medium255A-26oA LDL particles has been increased by the high-fat diet as compared with the low-fat diet, without any change in the amount of cholesterol in the small<255A LDL particles. Figure 1 shows a negative correlation between changes in plasma triglyceride levels and changes in LDL-LPD (r=-0.93, P= O.0001). Furthermore, a positive association has been observed between changes in percentage of small<255Â LDL particles and concurrent changes in plasma triglyceride levels (r=0.66, P=0.02) (Figure 2).